（微生物学专业论文）a、b型流感病毒血凝素基因抗流感关键序列解析.pdf

摘要 流感病毒血凝素( h e m a g g l u t i n i n ，h a ) 位于流感病毒包膜上，在 流感病毒吸附和穿入宿主细胞的过程中起着重要作用。h a 是流感病 毒最主要的表厦抗原，它能够诱导机体产生相应的中和抗体以中和 病毒。h a 一般含有五个抗原决定簇，流感病毒的流行与其抗原结构 的变化密切相关。已有研究表明，流感病毒h a 基因d n a 疫苗能够保 护小鼠抗致死量流感病毒攻击。为了进一步了解h a 基因抗流感的关 键序列，本实验用p c r 的方法分别从57 端或37 端对a p r 8 3 4 流感病毒h a 基因( 全长1 7 0 1 b p ) 和b i b a r a k i 2 8 5 流感病毒h a 基因( 全长1 7 5 8 b p ) 进行部分缺失，构建了一系列编码部分缺失片 段的质粒，将这些质粒用肌肉注射的方法免疫小鼠，免疫后的小鼠 分别用致死量a p r 8 3 4 流感病毒或b i b a r a k i 2 8 5 流感病毒攻 击，通过观察小鼠的存活率、血清中保护性抗体水平和肺部病毒量 来寻找h a 基因抗流感的关键序列。 实验结果表明：( d a 型流感病毒h a 基因从5 端缺失1 2 个核苷 酸或从37 端缺失8 8 2 个核昔酸，编码缺失片段的质粒就不能保护 小鼠抗致死量流感病毒攻击：而从5 端缺失6 个核苷酸或从37 端 缺失8 7 6 个核苷酸，编码缺失片段的质粒仍然可以保护小鼠抗致死 量流感病毒攻击。( 2 ) b 型流感病毒h a 基因从57 端缺失1 5 个核苷酸 或从3 端缺失8 8 8 个核苷酸，编码缺失片段的质粒就不能保护小 鼠抗致死量流感病毒攻击：而从5 端缺失6 个核苷酸或从3 端缺 失8 8 2 个核苷酸，编码缺失片段的质粒仍然可以保护小鼠抗致死量 流感病毒攻击。这意i 睐着在核酸疫苗的硼f 究ih i我们j 以川1 i 剑全 长序列一半的关键序列代替全序列，减少一些非必需序列的十扰。 关键词：流感病毒；核酸疫苗；血凝素；关键序列 a b s t r a c t t h eh e m a g g l u t i n i n ( h a ) i st h em a j o rs u r f a c eg l y c o p r o t e i n o fi n f l u e n z av i r u st h a tm e d i a t e st h ea t t a c h m e n ta n d p e n e t r a t i o no ft h ev i r u si n t oh o s tc e l l s t h eh ai st h em a j o r s u r f a c ea n t i g e no fi n f l u e n z av i r u s ，w h i c hc a ni n d u c et h e p r o d u c t i o no fn e u t r a l i z i n g a n t i b o d i e st on e u t r a l i z et h e i n f e c t i v i t yo ft h ev i r u s a n dt h e r ea r ef i v ea n t i g e n i cs i t e s m a p p e do nt h eh a a n t i g e n i cc h a n g e so fh ap l a ya ni m p o r t a n t r o l ei ni n f l u e n z av i r u sv a r i a t i o n t h ei m m u n er e s p o n s ei n d u c e d b vh ad n ai nm o u s em o d e lh a sb e e np r o v e dt ob ea b l et op r o v i d e ac o m p l e t ep r o t e c t i o na g a i n s tt h ec h a l l e n g ew i t hh o m o l o g o u s v i r u s t od e t e r m i n et h ee s s e n t i a ls e q u e n c er e l a t i n g t o p r o v i d i n gp r o t e c t i o nw i t h i nt h e h ag e n e ，w ec o n s t r u c t e da s e r i e so fh ap l a s m i dt r u n c a t e sb yp c r ，w i t ht h en u c l e o t i d e s a t5 7 o r37 一t e r m i n a lo fa p r 8 3 4 ( h i n i ) h a ( 1 7 0 1 b pf u l 1 l e n g t h ) a n db i b a r a k i 2 8 5h a ( 1 7 5 8 b pf u l1 l e n g t h ) d e l e t e d s e r i a ll y b a l b cm i c e w e r ei m m u n i z e dw i t h t h ep l a s m i d t r u n c a t e sb yi n t r a m u s c u l a ri n j e c t i o na n dc h a l l e n g e dw i t h h o m o l o g o u sv i r u sa tal e t h a ld o s a g e t h ee s s e n ti a l s e q u e n c e o fh ad n at op r o v i d ep r o t e c t i o na g a i n s ti n f l u e n z av i r u sw a s e x p l o r e db yo b s e r v i n gt h es u r v i v a lr a t e s s e r u mh aa n t i b o d y t i t e r sa n dl u n gv i r u st i t e ro ft h em i c e t h ed a t as h o w e dt h a t ( 1 ) h a d n ao f i n f l u e n z aav i r u s d i d n tl o s ti t sp r o t e c t i o na g a i n s ti n f l u e n z av i r u s w h e n6 n u c l e o t i d e sa t 57 一t e r m i n a lo r 8 7 6n u c l e o t i d e s a t 37 一t e l ，m i n a lw e r ed e l e t e ds e r i a l l y b u th a d n ao fi n f l u e n z a a v i r u sl o s ti t s p r o t e c t i o n w h e n1 2n u c l e o t i d e s a t 57 一t e r m i n a lo r8 8 2n u c l e o t i d e sa t3 一t e r m i n a lw e r ed e l e t e d i i s e r i a ll y ( 2 ) h a d n ao fi n f l u e n z abv i r u sd i d n tl o s ei t s p r o t e c t i o na g a i n s ti n f l u e n z av i r u sw h e n6n u c l e o t i d e sa t 5 一t e r m i n a lo r8 8 2n u c l e o t i d e sa t3 一t e r m i n a lw e r ed e l e t e d s e r i a l l y b u th a d n ao fi n f l u e n z abv i r u sl o s ti t sp r o t e c t i o n w h e n1 5n u c l e o t i d e sa t57 一t e r m i n a lo r8 8 8n u c l e o t i d e sa t37 一 t e r m i n a lw e r ed e l e t e ds e r i a l l y t h er e s u l t si n d i c a t e t h al e s s e n t i a ls e q u e n c eo fh a d n am a ys u b s t i t u t et h ew h o l eh a d n a i ns t u d yo nt h ef u s i o nd n av a c c i n e k e yw o r d s ：i n f l u e n z a ：d n av a c c i n e ：h e m a g g l u t i n i n ：e s s e n t i a l s e q u e n c e ； 一王i 卜 缩写 全称中文翻译 h a h e m a g g l u t i n i n n a o d m 2 n p p c r s p f e l i s a n e u r a m i n i d a s e o p t i a ld e n s i t y m a t r i xp r o t e i ni i n u c l e o p r o t e i n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c tio n s p e c i a lp a t h o g e nf r e e e n z y m e 一1i n k e di m m u n o a d s o r b e n ta s s a y 衄凝素 神经氨酸酶 光吸收值 基质蛋白2 核蛋白 多聚酶链式反应 无特异性病原菌 酶联免疫吸附实验 l d 5 0 l e t h a ld o s e s5 0 半数致死量 - 5 8 - 1 流感病毒的基本特征 黼前言 流感是一种由流感病毒感染宿主呼吸道后引起的急性呼吸道疾 病。流感病毒属正粘病毒科，根据流感病毒内部蛋白抗原性的不同分 为甲( a ) 、乙( b ) 、丙( c ) 三型。a 型流感常可造成大流行，b 型常 是局部爆发，c 型主要侵犯婴幼儿。此外，根据病毒颗粒表面h a 和 神经氨酸酶( n e u r a m i n i d a s e ，n a ) 的差别，甲型流感病毒又进一步分 为不同的亚型【l 。】。迄今所发现的甲型流感病毒有1 5 个h a 亚型 ( h l h 1 5 ) ，9 个n a 亚型( n 1 一n 9 ) ，而能够感染人的h a 亚型有：h 1 、 h 2 、h 3 、h 5 、h 7 和h 9 3 1 。 a 、b 型流感病毒的基因组是单股分节段的负链r n a ，共有8 个独 立的r n a 片段，c 型流感病毒仅有7 个r n a 段，每个节段编码1 到2 个蛋白。其中a 、b 型流感病毒的h a 都由r n a 节段4 编码 2 1 。典型的 病毒粒子呈球形，直径8 0 1 2 0 n m ，在电镜下可以观察到流感病毒表 面有蛋白突起，包括h a 、n a 、基质蛋白i i ( m a t r i xp r o t e i ni i ，m 2 ) ， 这些突起形态不一，排列无特征。但c 型流感病毒不同，其突起呈正 六角形，排列规则。 由于流感病毒基因组由r n a 组成，这使得它极易发生自发点突 变。这种突变称为抗原漂移( a n t i g e n i cd r i f t ) ，多由基因点突变或多点 突变所造成。而基因重组是流感病毒发生抗原转变( a n t i g e n i cs h i f t ) 的主要原因。目前，多数人认为抗原转变是以前流行于人和动物的流 感病毒基因片段重组的结果。流感病毒的抗原漂移一般造成中小型流 行，而抗原转变极易造成大流行【1 】。 2 流感病毒表面抗原血凝素 流感病毒h a 由r n a 节段4 编码，以a a i c h i 2 6 8 ( h 3 n 2 ) 毒株为 例，其r n a 节段4 由1 7 6 5 个核营酸组成。开放阅读框( 0 r f ) 编码 5 6 6 个氨基酸，在此之前的5 端非编码区含2 0 个核苷酸，在此之后 的37 端非编码区含4 7 个核苷酸【3 】。h a 具有凝集多种动物红细胞的性 质，主要有三个功能：( 1 ) 在感染之前与细胞表面病毒特异性受体结 合；( 2 ) 介导病毒外膜与核内体膜的融合：( 3 ) 刺激机体产生中和抗 体，进而产生免疫保护作用。h a 分子的变异能使病毒逃脱免疫监视 而导致流感疾病的流行【2 1 。 2 1h a 的结构 h a 是典型的i 类膜蛋白，其一级结构含有4 个结构域：信号肽 ( 前导序列) 、胞浆域、跨膜域和胞外域。信号肽介导新合成的肽链 进入内质网，在通过内质网时被信号肽酶切掉。h a 以三聚体的形式 镶嵌在病毒包膜上，每个单体糖蛋白由两个经二硫键连接的蛋白亚单 位组成，它们来自于条前体链( h a o ) ，经蛋白水解酶的切割而形 成，分别命名为h a l 和h a 2 ，其中h a l 含3 2 8 个氨基酸残基，h a 2 含2 2 1 个氨基酸残基，两者之间的二硫键在h a l 的4 位和h a 2 的1 3 7 位的半胱氨酸之间形成。h a l 负责病毒与宿主细胞表面唾液酸受体 的结合。病毒吸附完成以后，病毒粒子通过宿主细胞的内吞作用进入 细胞。在内体的酸性环境中，h a 2 的疏水性融合多肽转移到膜的靶 位上，从而介导内体膜与病毒包膜的融合【7 】。 以去污剂处理流感病毒粒子或病毒感染的细胞，可以获得完整 的h a 颗粒。以菠萝蛋白酶处理病毒体，可以获得一种可溶性三聚体， 称为b h a 。它由全部h a l 和h a 2 的头1 7 5 个氨基酸组成【2 j 】。利用x 射 线晶体衍射技术，研究发现流感病毒的h a 蛋白以三聚体( t r i t e r ) 的形式存在于双层类脂膜上，即h a 纤突由三个h a 单体分子组成，单 体全长1 3 4 n m 。它可分为两部分，一部分是呈球状的头部，由i - i a ! 组成，含有受体结合位点和抗原决定簇；另一部分为柄，由h a 2 和部 分h a l 组成，与囊膜相连，长约7 6 n m 。h a 2 氨基末端与h a l 羧基末 端相距2 ，l n m ，这个区域的结构改变将引起前体h a 。蛋白的水解酶切。 h a 2 氨基末端位于分子的三聚体交界面，与病毒膜相距3 n m ，保守的 疏水氨基末端区域参与了膜的融合活动，它富含有甘氨酸残基，形成 一个不同寻常的螺旋结构延伸出三聚体的交界面。在h a 头部和茎部 各单体之间有局部接触，这样形成的三聚体更加稳定瞵j 。 流感病毒h a 受体结合位点( r b s ) 位于h a 蛋白的头部，呈口袋 状。口袋底部由9 8 位的酪氨酸和1 5 3 位的色氨酸侧链构成；后壁由 1 8 3 位组氨酸、1 9 0 位谷氨酸、1 9 4 位亮氨酸的侧链组成；左侧壁由 2 2 5 2 2 8 位氨基酸构成；前壁由1 3 1 1 3 7 位氨基酸组成；右壁为一长 槽形，以1 5 5 位苏氨酸结尾，其中1 8 3 位氨基酸突入袋中与9 8 位氨 基酸之间形成氢键，而1 9 0 、1 9 4 位氨基酸从后壁顶部a 螺旋结构中 垂下，也伸进受体结合位点的凹陷中【孙。在不同亚型病毒的h a 蛋白 中，受体结合部位的第9 8 位的酪氨酸残基，1 5 3 位的色氨酸残基， 1 8 3 位的组氨酸残基，1 9 0 位的谷氨酸残基和1 9 4 位的亮氨酸残基是 高度保守的【9 】。唾液酸( n e u a c ) 是a 型流感病毒细胞受体的一个主 要成分，从人分离的h a 亚型的一个共同特征是唾液酸通过q 一2 ，6 键 连接到半乳糖上。野生型h 3 在h a l 的2 2 6 位点有一个亮氨酸( l e u ) 残基，如果亮氨酸( l e u ) 突变成谷氨酸( g l n ) ，它就会通过a 一2 ，3 一 半乳糖键更有效的连接到唾液酸上。q - 2 ，6 和q - 2 ，3 识别受体特异 性的分子基础还不清楚l l0 1 ，可能是q 一2 ，6 和q 一2 ，3 唾液酸半乳糖构 型上有小的差异，目前得知的差异小于3 a 。由于人类、禽类以及马 的受体结合特性各不相同，因而限制了流感病毒的跨种属传播1 1 1 1 2 】。 h a 是一种糖蛋白，每一个h a 单体分子上至少有7 个寡糖链， 所有的寡糖链都是通过n 葡萄糖苷键连接在天冬酰胺残基上，在 h 3 n 2 亚型中，有6 个寡糖基在h a 残基上，1 个在h a 2 的残基上， 糖基链的数目和位点随不同的病毒株和不同的亚型而变化。寡糖侧链 对于稳定三聚体的结构有一定的作用p j 。h a 是流感病毒最主要的表 面抗原，它能够诱导机体产生相应的中和抗体以中和病毒的感染，流 感病毒的流行与h a 的变异关系极为密切 8 】。其中h a l 上有h a 蛋白 上所有的5 个抗原决定簇，它们分别是a 、b 、c 、d 和e 【i 引。位点a 集中在残基1 4 0 1 4 6 的突出环周围，残基1 3 8 ，1 3 9 ，1 4 7 和1 4 8 是保守 的，因而维持着位点结构。位点b 位于分子的极性膜末端，集中在残 基1 5 5 1 6 0 的环上和位于受体连接边缘的残基1 8 8 到1 9 8 的a 螺旋上。 位点c 位于h a l 反向平行链的球状区域基部。位点d 位于分子顶部 的h a l 球状区域的三聚体界面附近。位点e 在位点c 和a 之间的球 状末端区域的底部1 1 4 - 1 6 。 2 2h a 膜融合特。睦 为了将病毒的基因转移进细胞里，脂膜必须与宿主细胞膜融合， 流感病毒使用内吞的细胞途径。有许多证据表明，h a 是负责膜融合 活动的蛋白质【1 7 9 】。基本过程如下：流感病毒的受体结合位点与细胞 表面的受体结合，然后病毒被吞入核内体，形式内吞体，经质子泵酸 化到特殊的p h 值( 5 - 6 ) 时，h a 结构发生变化，三聚体的聚合力下 降，带有融合序列的h a 2 的n 端暴露出来，介导病毒膜与核内体膜的 融合，病毒基因组得以释放进入细胞，在那里开始转录。近年来已有 人通过观察人造脂质体融合的方法，发现融合在3 7 ，p h 值为5 时， 3 分钟内完成，但可以通过增加p h 值或降低温度来减慢融合速度 【9 1 h a 在酸性p h 条件下，释放出疏水的融合肽，从而促使病毒膜与 核内体膜的融合。因此，可以认为低p h 条件下的h a ( 低p h 形式) 与自然条件下的h a ( 中性形式) 相比，是更为稳定的形式【2 。对h a 的这两种形式进行比较后发现：中| 眭形式h a 的h a 2 亚基，其7 6 1 2 6 氨基酸形成个长q 螺旋、5 6 7 5 氨基酸形成一个突出环、3 8 5 5 氨 基酸则形成一个短q 螺旋；而低p h 形式h a 的h a 2 亚基，其4 0 1 0 5 氨基酸形成一个三股q 螺旋、1 0 6 1 1 2 氨基酸形成一个突出环( 在中 性形式中是螺旋的) 2 q 。对h a 膜融合的研究非常广泛，也取得了 一定的进展，如：在膜融和过程中，疏水的融和肽可以插入到宿主细 胞膜的脂质双分子层中【2 2 1 、h a 的完全融和，需要跨膜区的参与【2 3 l 、 膜融合需要一些三聚体形成活性的融合通道【24 1 、在膜融合过程中，h a 结构的变化必需发生在特定的时间和特定的部位瞄】。但是，对于病毒 脂膜与宿主细胞膜融合的具体机制还不很清楚，需要进一步的研究。 2 3 裂解位点序列 h a 。分子水解为h a l 和h a 2 两条多肽是决定病毒有无感染的先决 条件1 2 6 。各亚型病毒h a 蛋白裂解位点的氨基酸组成不同，如人h 1 、 h 2 及h 3 型病毒h a 蛋白的裂解位点只有一个单独的精氨酸残基( r ) ， 而另外一些病毒的h a 蛋白，特别是禽流感病毒h a 的裂解位点则有数 个碱性氨基酸1 2 7 - 2 9 】。根据对禽h 5 及h 7 亚型h a 的研究发现，低致病 性病毒的h a 裂解位点含有卜2 个碱性氨基酸，比如序列r x x r k ( x 为其它非碱性氨基酸残基) ，而致病性病毒的h a 裂解位点至少由 4 个碱性氨基酸组成，比如序列r - e r r r k k r 。裂解位点序列的 突变，有可能使低致病的禽流感毒株转变为高致病的毒株【2 1 1 。研究 发现 3 2 - 3 5 ，在h 5 和h 7 亚型的禽流感毒株中，蛋白酶识别的最短裂解 序列是r x k ( r ) 一r ，而且这几个氨基酸必须出现在裂解位点的正确位 置。与高致病毒株a t u r k e y e n g l a n d 5 0 9 2 9 1 ( h 5 n 1 ) 的r k t r 裂解序列相比可以发现，只要发生一个点突变，低致病毒株就有可能 转变为高致病毒株。如编码第2 位苏氨酸的密码子a c a 突变为编码精 氨酸的密码子a g a ，或者编码第3 位谷氨酸的密码子g a a 突变为编码 赖氨酸的密码子a a a 。因此，在研究中对低致病的禽流感毒株也应保 持足够的关注，因为它们转变为高致病毒株的潜能非常大。 3 流感病毒核酸疫苗 核酸疫苗是近十几年发展起来的一种新型疫苗。1 9 9 2 年t a n g 等 【3 6 】将表达人生长激素的质粒d n a 导入小鼠皮内，小鼠产生特异性抗 体，提出了基因免疫的概念。1 9 9 3 年u l m e r 等弘7 i f 实小鼠肌肉注射 含有编码a 型流感病毒核蛋白( n p ) 的重组质粒后，可有效地保护小 鼠抗不同亚型、分离时间相隔3 4 年的流感病毒的攻击。随后的大量 动物实验都说明在合适的条件下，d n a 接种后既能产生细胞免疫又能 引起体液免疫。因此，1 9 9 4 年在日内瓦召开的专题会议上将这种疫 苗定名为核酸疫苗。核酸疫苗是指利用基因重组技术直接将编码某种 抗原蛋白的外源基因( d n a ) 与质粒重组后，直接导入动物细胞内， 并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋 白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的【3 引。核酸疫苗包括d n a 疫苗( d n av a c c i n e ) 和r n a 疫苗( r n av a c c i n e ) ，其中研究最多的 是d n a 疫苗，它由于不需要任何化学载体，故又称为裸d n a 疫苗( n a k e d d n av a c c j n e ) 。 与传统的灭活疫苗、亚单位疫苗相比，核酸疫苗具有以下特点： ( 1 ) 核酸疫苗接种后，它们所编码的蛋白在宿主细胞内表达，直接 与组织相容性复合物m h ci 或i i 类分子结合，能够诱导机体产生持久 和全面的免疫应答，同时引起细胞和体液免疫，其保护性免疫应答对 不同亚型的病原体具有交叉抵御作用 3 9 , 4 0 ；( 2 ) 核酸疫苗作为一种重 组质粒，易在工程菌内大量扩增，提纯方法简单，质粒d n a 稳定性好， 便于贮存和运输，无须冷藏。( 3 ) 可将编码不同抗原的基因构建在同 一个质粒中，或将不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价 核酸疫苗【4 ，而且核酸疫苗可以产生持久的免疫应答【4 2 1 ，一次接种可 获得长期免疫力，无需反复多次加强免疫，这样就可以避免多次接种 带来的应激反应并大大减少人力、物力和财力。( 4 ) 接种核酸疫苗后， 蛋白质抗原在宿主细胞内表达，具有与天然抗原相同的构象和抗原 性，没有减毒、灭活疫苗可能引起的危险，如病毒力返祖或残留病毒 颗粒引发疾病，也不会引起机体的不良反应；( 5 ) 核酸疫苗既有预防 作用，也有治疗作用h 引。 流感病毒核酸疫苗是指将含有流感病毒基因的表达质粒，通过肌 肉注射、基因枪注射等方法将其导入体内，在机体内表达抗原蛋白， 从而激发机体免疫系统产生针对流感病毒编码蛋白的特异性免疫应 答反应。核酸疫苗模仿自然的病毒感染，生成的抗原具有天然的构象， 经m h ci 类和i i 类分子的提呈，分别引发c t l 反应和其他免疫反应， 如产生抗体【4 4 l 。1 9 9 3 年u l m e r 等发现小鼠肌注编码a 型流感病毒 ( a p r 8 3 4 ) 核蛋白( n p ) 的载体质粒后，其产生的c t l 可有效保 护小鼠抵抗另一亚型流感病毒( a h k 6 8 ) 的攻击37 1 。此项研究开辟 了核酸疫苗特别是流感病毒核酸疫苗研究的新纪元。 已有的研究表明，用肌肉注射或基因枪方法，以流感病毒h ad n a 免疫小鼠，产生了很显著的免疫应答，所产生的中和抗体可以中和流 感病毒，免疫后的小鼠可以抗致死量流感病毒攻击，而且抗体可以持 续1 5 年1 4 5 , 4 6 。而且将编码h a 、n p 和m 1 的核酸疫苗混合在一起，以 肌肉注射的方式免疫小鼠，与传统的灭活疫苗和亚病毒疫苗相比，它 们可以显著提高小鼠抗异种流感病毒株攻击的能力。但是，以同样的 方式单独免疫n p 或者m l 的核酸疫苗，不能给小鼠提供保护。在陈则 等的研究中，将病毒株a p r 8 3 4 ( p r 8 ) ( h 1 n 1 ) 的基因克隆n 4 , 鸡的 b 一肌动蛋白表达载体( p c a g g s ) 上，得到分别编码h a 、n a 、m 1 、n p 及 n s l 的质粒d n a ，在b a l b c 小鼠中比较各质粒d n a 抗流感的能力 4 5 , 4 7 。 每种d n a 注射2 次，间隔3 周，以每只小鼠1 d n a 的剂量用基因枪 的方法转移到小鼠皮下。第二次免疫7 天后，用同种病毒攻击小鼠， 以攻击感染后3 天肺部病毒量的降低和3 周后存活率的增加来确定 d n a 保护小鼠抗流感的能力。结果表明，用h a 或n ad n a 免疫的小鼠 可以得到抗攻击感染保护，小鼠在感染3 天后肺部病毒量明显低于对 照组，且3 周后的存活率达1 0 0 。在本实验条件下，肺部病毒滴度 的明显降低( 低于1 0 “9 e i d 。m 1 ) 与小鼠长的存活期是相关的。用m 1 、 n p 或n s ld n a 免疫的小鼠不能得到抗流感保护，尽管其中m 1 和n pd n a 免疫后能检测出抗体应答。已有报道证明，针对m 1 和n p 的抗体应答 是不参与抗流感保护的 3 7 , 4 8 。就h a 基因而言，编码a p r 8 3 4h a 的 核酸疫苗，以基因枪的方式，单次免疫0 0 4ugd n a ，加强免疫0 0 0 4 ugd n a ，可以为小鼠提供完全保护，而在n p 基因的核酸疫苗研究中， 以基因枪的方式，0 4ugd n a 初免，再以5 0ugd n a 皮内或肌肉 注射的方式加强免疫，仍然不能为小鼠提供保护。但是通过提高d n a 剂量、增加免疫的次数以及降低致死量攻击时病毒的数量，可以为免 疫后的小鼠提供保护。在u l m e r 的研究中，以高剂量的d n a 进行免疫， 以低剂量的致死性病毒进行攻击，编码a 型流感病毒n p 的质粒d n a 以肌肉注射的方法免疫，为b a l b c 小鼠提供了亚型间交互的c t l 介 导的保护【37 1 。这些研究结果表明，流感病毒表面糖蛋白h a 和n a 是核 酸疫苗最为有效的成分，而保守的n p 的加入，则可以增强疫苗诱导 c t l 反应以及提供交叉保护的能力。 尽管对a 型流感病毒d n a 疫苗已有较多的研究，而b 型流感病毒 d n a 疫苗的研究还是空白。因为b 型流感病毒仅引起每年的地方性流 行，而a 型流感病毒往往引起全世界范围的大流行。严重b 型流感病 毒感染( 指要住院治疗的) 的几率大约是a 型流感病毒感染的四分之 一，但b 型病毒的感染有时也会造成严重的疾病，如心肌炎、瑞氏综 合症等 4 9 - 5 1 1 。因而，要防止这类流感的爆发，对b 型流感病毒核酸疫 苗的研究不容忽视。研究有效的b 型流感病毒核酸疫苗的第一步是决 定哪一种病毒蛋白是核酸疫苗的最有效成分，能提供最有效的保护。 在陈则等的研究中【5 甜，将编码流感病毒株b i b a r a k i 2 8 5 2 8 5 的 h a 、n a 、n b 和n p 的质粒d n a 免疫b a l b c 小鼠，比较了各实验组小 鼠对抗致死量b 型流感病毒感染提供保护的能力 5 2 - 5 4 】。免疫的程序是： 每种d n a 接种2 次，间隔3 周，每次剂量为每只小鼠1 心，用基因枪 的方法将d n a 转移至皮下；或每次剂量为每只小鼠3 0 腿，用电击的 方法将d n a 转移到肌肉。第二次免疫3 周后，用致死量的同源病毒攻 击小鼠。结果显示，h a 和n ad n a 可以对抗致死量病毒的攻击提供保 护，并伴随着高水平的特异性抗体应答。尽管用基因枪法免疫诱导产 生的抗h a 和抗n a 抗体的效价稍低于电击法免疫所得的抗体效价，但 两种方法得到的结果基本一致诤殂。上述结果说明，即使是相对低水平 的抗h a 和抗n a 抗体效价也足以阻止病毒复制。同时，n b 和n pd n a 免疫虽然能检测到抗体应答，但不能够提供抗感染保护。因此，针对 b 型病毒n b 和n p 的抗体应答与上述针对a 型病毒m 1 和n p 的抗体应 答一样，似乎并不参与抗流感保护【j 】。 4 本论文研究目的 流感病毒感染后在短期内能导致机体的呼吸道综合症，但是机体 针对流感病毒产生的免疫反应不足以防止病毒在体内的扩散以及临 床症状的恶化。因此预防流感的最好方法就是在流感流行前对人体进 行疫苗接种。传统的流感病毒疫苗主要有裂解疫苗、亚单位疫苗、全 病毒灭活疫苗等。由于h a 是流感病毒最主要的表面抗原，流感病毒 的流行与姒抗原结构的变化密切相关，因此，在流感病毒疫苗的研 究中h a 占有重要的地位。以去污剂裂解病毒，使病毒灭活，可以制 备成裂解疫苗，疫苗的主要成分是h a 。业单位疫苗可以从裂解的病 毒中提取纯化，也可以用其他表达系统直接表达，如杆状病毒系统【5 6 1 。 现在临床上使用的流感病毒疫苗是一种三联全病毒灭活疫苗，它由 h 1 n 1 、h 3 n 2 和b 型病毒三种成分组成，其中h a 成分占到了4 8 。传 统的疫苗能够有效预防与其h a 分子有着相同或交叉反应表位的流感 病毒株。但是流感病毒不断发生抗原漂移，为了有效预防流感，这些 疫苗的成分不得不经常更换。由于传统疫苗从病毒株分离到疫苗制备 完成，需要4 6 个月时间，在短时间内难以生产出大量的疫苗 5 7 1 ，因 此不能有效抵御突发性的流感流行，比如由抗原转变造成的大流行以 及可能出现的新型禽流感病毒在人类中的流行。 在1 9 5 7 年和1 9 6 8 年分别出现了由h 2 n 2 和h 3 n 2 毒株引发的流感大 流行，对这两种病毒的研究表明，它们都是由禽和人的流感病毒重组 形成的。在受体结合特性方面，禽流感h a 分子从q 一2 ，3 唾液酸半乳 糖构型转变为d - 2 ，6 唾液酸半乳糖构型是产生抗原转变株的前提条 件，而且这种构型的改变只需要卜2 个氨基酸的改变，这意味着这种 构型转变的可能性是非常大的【5 8 j 。1 9 9 7 年在香港最先发现禽流感病 毒( h 5 n 1 ) 能够突破种属的限制，直接从动物传到人类，其中1 8 人 感染，有6 人死亡【5 9 l 。随后又出现了h 9 n 2 和h 7 n 7 禽流感感染人的情 况 4 , 5 1 。2 0 0 3 年2 月1 9 日，针对新出现的感染人的禽流感病毒 a h o n g k o n g 2 1 3 0 3 ，世界卫生组织极为少见的发出了预防大流行的 警报【6 1 l ：研究表明，香港出现的新型禽流感病毒( h 5 n 1 ) ，它的高毒 力与p b 2 蛋白的6 2 7 位氨基酸、n a 基因的序列( n a 柄部的长短等) 、 h a 序列的本身及其糖基化以及裂解位点有关 6 0 l 。由于这些感染人的 禽流感病毒在扩增时会杀死鸡胚，因此在传统疫苗的生产中，只有用 其他方法对病毒进行减毒。w e b b y 等使用反向遗传学技术，改变了病 毒的裂解位点序列，得到一种不具致病性的疫苗株，并且可以在鸡胚 中稳定传代 6 2 1 。这一减毒方法只用不到4 周的时间，就获得了稳定的 疫苗株，大大缩短了传统疫苗制备所需的时间。h e h m e 等使用单价铝 盐作为佐剂，在志愿者身上进行实验，结果表明可以大大减少裂解疫 苗使用的剂量，在流感大流行时可以用有限的传统疫苗接种更多的人 群6 3 1 。这些研究虽然在一定程度上提高了传统疫苗应对突发性流感流 行的能力，但是仍然不足以有效控制流感。 综上所述，控制流感的最好方法就是在流感流行前对人体进行疫 苗接种。传统的疫苗只能预防与其h a 分子有着相同或交叉反应表位 的流感病毒株，而且制备周期长，不能有效抵御突发性的流感流行。 鉴于h a 在疫苗研究和抗原变异中的重要性，为了应对可能出现的流 感大流行，有必要对h a 进行更为深入的研究，了解h a 基因抗流感的 关键序列。本实验用p c r 的方法分别从57 端或3 端对a p r 8 3 4 流感病毒h a 基因( 全长1 7 0 l b p ) 和b i b a r a k i 2 8 5 流感病毒h a 基 因( 全长1 7 5 8 b p ) 进行部分缺失，构建了一系列部分缺失质粒，将这 些质粒免疫小鼠，分别用致死量a p r 8 3 4 流感病毒或 b i b a r a k i 2 8 5 流感病毒攻击，通过观察小鼠的存活率、血清中抗 h a 抗体的效价和肺部病毒量来寻找h a 基因抗流感病毒的关键序列。 1 引言 h a 是流感病毒最主要的表面抗原，它能够雳导机体产生相应的 中和抗体以中和病毒。流感病毒的流行与h a 抗原结构的变化密切相 关1 6 4 4 “。在流感病毒疫苗的研究中h a 占有重要的地位。传统的疫苗 只能预防与其h a 分子有着相同或交叉反应表位的流感病毒株，而且 制备周期长，不能有效抵御突发性的流感流行。鉴于h a 在疫苗研究 和抗原变异中的重要性，为了应对可能出现的流感大流行，有必要对 h a 进行更为深入的研究，了解h a 基因抗流感的关键序列。 研究表明，流感病毒的h a - d n a 用基因枪法或肌肉注射免疫都能 诱导小鼠、雪貂、鸡产生特异性免疫反应，并提供抗流感保护【6 7 。2 i 。 也就是说，完整的h a 基因是流感病毒核酸疫苗的有效成分。本实验 用p c r 的方法分别从57 端或37 端对a p r 8 3 4 流感病毒h a 基因( 全 长1 7 0 1 b p ) 进行了部分缺失，构建了一系列部分缺失质粒，将这些质 粒免疫小鼠，用致死量a p r 8 3 4 流感病毒攻击，通过观察小鼠的存 活率、血清中抗h a 抗体的效价和肺部病毒量来寻找h a 基因抗流感病 毒的关键序列。 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 大肠杆菌菌株 大肠杆菌菌株x l l 一b l u e 为本实验室保存。 2 1 2 载体和质粒 载体：表达载体p c a g g s p 7 来源于由n i w a 等构建的 p c a g g s 73 l ，将多克隆位点k p n l ，x h o l ，c l a l ，e c o r v ，s m a l ，n o t l 和 s a c l 插入p c a g g s 的e c o r l 位点得到p c a g g s p 7 ，见图2 1 。质粒 p c a g g s 含鸡的b 一肌动蛋白启动子成分和s v 4 0 的复制起始部位 ( o r i ) 。 图2 - 1 表达载体p c a g g s p 7 图谱 2 1 3 动物、病毒和细胞 实验动物：4 - 6 周龄b a l b c 雌性小鼠( s p f 级，购自湖北省预防 医学科学院动物中心，合格证号：s c x k ( 鄂) 2 0 0 3 0 0 0 5 ) ，在本研 究室s p f 动物房进行动物学实验。 病毒：a p r 8 3 4 ( h 1 n 1 ) 小鼠肺适应株，在鸡胚中扩增得到。 细胞：m d c k ( 购自湖北省预防医学科学院) 。 2 1 4 主要试剂 流感病毒a p r 8 3 4 灭活疫苗由上海生物制品研究所制备；小 牛血清购自杭州四季清公司；m e m 购自i n v i t r o g e n 公司；青霉素购 自哈药集团制药总厂；卡那霉素购自江苏省涟水制药厂；生物素标记 山羊抗鼠i g g ( y 链特异性) 抗体购自s o u t h e r n b i o t e c h 公司；碱性 一1 2 磷酸酶( a p ) 标记的链菌蛋白s t r e p t a v i d i n 购自s o u t h e r n b i o t e c h 公司；对磷酸硝基苯酚( p n p p ) 购自s o u t h e r n b i o t e c h 公司；牛血 清白蛋白( b s a ) 购白北京夏斯生物有限公司；细胞培养瓶购自g r e i n e r b i o o n e 公司；2 4 孔培养板购自j e tb i o c h e m i c a l s 公司；9 6 孔酶标板 购自浙江拱东医用塑料厂；盐酸氯胺酮注射液购自江苏恒瑞医药股份 有限公司；盐酸洛贝林购自北京市永康制药厂；l b 所用试剂：酵母 抽提物，蛋白胨：英国o x o i d 公司：琼脂糖：上海化学试剂公司； d o 一1 6 2 l k bd n am a r k e r ( 鼎国生物公司) ；1k bd n al a d d e r ( f e r m e n t a s ) ；d l 2 0 0 0 ( t a k a r a ) ；s d 0 0 5 2 0 0 0 m a r k e r ( 鼎国生物公司) ； t a q 酶、p f u 酶、t 4d n a 连接酶，x h o i 、s m a l 、p s t l 和n o t l 等内切 酶( t a k a r a 公司) ；s d s ，t r i sb a s e ，n a h 2 p 0 4 ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ， m g c l 2 6 h 2 0 ，n a c i ，n a o h ，t r i s 饱和酚，d n t p ，a m p ，硼酸( 上海 生工进口分装) ；乙醇，异丙醇，冰醋酸，c h c l 3 ，n a a c ，硼酸，甘 油均为国产：d n a 片段回收试剂盒和d n a 小量提取试剂盒( 鼎国生 物公司) ；质粒大量抽提试剂盒( p l a s m i dm a x ik i t ) ：q i a g e n 公司； 测序所用试剂：p r i s m ，u r e a ，5 0 l o n gr a n g e rg e ls o l u t i o n ，t e m e d ， a p s ，a c r y l b i sp r tm i x e dp o w e r 购于b i o r a i d ；t b e 试剂自 己配置；其他药品试剂均为国产分析纯 2 1 5 主要仪器设备 2 3 31p c r 仪( m a s t e r c y c l e rp e r s o n a l ，e p p e n d o r f 公司) ；电击仪g e n e p u l s e ri ie l e c t r o p o r a t i o ns y s t e m ( b i o ，r a d 公司) ；3 k 18 高速冷冻离 心机( s i g m a ) ；a m a 2 4 0 全自动高压灭菌锅( a s t e l l ) ；3 1 3 1 型卧式 超低温冰箱( f o r m a ) ；3 7 7 d n a 测序仪( a p p l i e db i o s y s t e mc o m p a n y ) ； d y y - i i i ：1 l 型三恒电泳仪、d y y _ i i i 型电泳槽( 北京市六一仪器厂) ； g l 2 1 m 冷冻离心机( 长沙天创仪器制造有限公司) ；t g l 6 a w 高速 台式离心机( 长沙天创仪器制造有限公司) ；紫外光栅分光光度计( 上 海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂，7 5 2 ) i 分光光度计( 上海精 密科学仪器有限公司，7 2 2 s ) ：g i s 1 0 0 0 数码凝胶图像分析系统( 上 海天能科技有限公司) ；t h z 8 2 a 气浴恒温震荡器( 江苏省金坊市医 疗仪器厂) ；r t z q q 震荡器( 东联电子技术开发有限公司) ；隔水式 电热恒温培养箱( 上海跃进医疗仪器厂) ；h j 3 恒温磁力搅拌器( 江 苏医疗仪器厂) ：旋涡混合器( 江苏海门市麒麟医用仪器厂) ：超净工 作台( 苏净集团安泰公司) ；p h 计和电子天平( 梅特勒公司) ；活体 基因转化仪e c m 玛3 0 ( b t x 公司) ；酶标仪、洗板机m u l t i s k a na s c e n t ( l a b s y s t e m s 公司) ；c 0 2 培养箱( f o r m a 公司) 。 2