（发育生物学专业论文）人类锌指蛋白家族新基因znf383的克隆与功能研究.pdf

摘要 在u 甫乳动物中，锌指蛋白可能是最庞大的转录因子家族。m a p k 信号途径在真核细胞信号调控中是最为广泛的机制之一。已知有许多 的转录因子是非常重要的m a p k 靶基因，锌指蛋白就是中间的一类。为 了鉴定控制心脏发育和疾病发生的新基因，我们从心脏c d n a 文库中克 隆了一个人类锌指蛋白家族新基因，经国际基因命名委员会批准命名 为z n f 3 8 3 。幼甓粉全长为2 2 2 0 个碱基，定位于染色体1 9 q 1 3 1 2 它含 有一个长为1 4 2 8 个碱基的开放阅读框，编码一个含4 7 5 个氨基酸的蛋 白质，蛋白质分子量大约为5 4 6 千道而顿。该基因在n 端含有一个高 度保守的k r a b 型结构域，并且在其c 端具有1 1 个连续的c 2 h 2 型锌指结 构单元。n o r t h e r n 杂交结果表明办船扔在成体和胚胎的大部分组织中 都有表达，其中在骨骼肌有较强烈的表达。在c o s 一7 细胞中，z n f 3 8 3 定 位于细胞核和细胞质。当含有幻嬲伪和g a l 4 一b d 结构域的融合蛋白与 v p 1 6 一起转染c o s 一7 细胞时，表现出较强的转录抑制活性。结构域片 段分析表明是k r a b 框决定了z n f 3 8 3 的转录抑制活性。孙甄馏多盔c o s 一7 细胞中过表达能激活转录因子a p l 与s r e 的活性，结果表明新基因 幼弼钌可以是m a p k 信号转导途径的一个转录抑制子。 关键词：z n f 3 8 3 ：转录抑制予；m a p k 信号转导途径；细胞定位 a b s t r a c t i nm a x m a l s ，z i n c f i n g e rp r o t e i n sc o n s t i t u t et h el a r g e s t i n d i v i d u a l f a m i l y o f t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t o r s m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ( m a p k ) s i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y s a r ea m o n gt h em o s tw i d e s p r e a dm e c h a n i s m so f e u k a r y o t i cc e l l r e g u l a t i o n m a n yt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s a r e i m p o r t a n t m a p k t a r g e t s ，a n dz i n cf i n g e rp r o t e i niso n eo ft h e m w it ht h ea i m o fi d e n t i f y i n gn o v e lg e n e si n v o l v e di nh u m a nh e a r td e v e l o p m e n t a n dd i s e a s e s ，w eh a v ei s o l a t e dan o v e lz i n c f i n g e rg e n ef r o m h e a r tc d n al i b r a r y t h eg e n ei sn a m e dz n f 3 8 3t h a ti sa p p r o v e d b yh u m a ng e n o m eo r g a n i z a t i o n ( h u g o ) z n f 3 8 3m r n ai s2 2 7 0b p ， m a p p i n g t oc h r o m o s o m e 1 9 q 1 3 1 2 t h e c d n a s e q u e n c e o fi t c o n t a i n sa no p e nr e a d i n gf r a m eo ft 4 2 8b p ，e n c o d i n gap u t a t i v e p r o t e i no f4 7 5a m i n oa c i dr e s i d u e sw i t hap r e d i c t e dm o l e c u l a r m a s so f5 4 。6k d a t h en - t e r m i n u so ft h ez n f 3 8 3c o d i n gr e g i o n h a saw e l 卜c o n s e r v e d k r u p p e l a s s o c i a t e db o x ( k r a b ) d o m a i n w h e r e a st h ec - t e r m i n u sc o n t a i n sl lc z h 2z i n cf i n g e rm o t i f si n t a n d e ma r r a y s n o r t h e r nb l o ta n a l y s i si n d i c a t e st h a tz n f 3 8 3i s d e t e c t e di nm o s to ft h ee x a m i n e dh u m a n a d u l ta n d e m b r y o n i c t i s s u e sw i t hah i g h e rl e v e li ns k e l e t a lm u s c l e i nc o s 7c e l i s z n f 3 8 3p r o t e i ni sl o c a l i z e dt on u c l e u sa n dc y t o p l a s m z n f 3 8 3 isat r a n s c r i p t i o nr e p r e s s o rw h e nf u s e dt og a l 一4d n a b i n d i n g v d o m a i na n dc o t r a n f e c t e dw i t hv p 一1 6 d e l e t i o n a n a l y s i s i n d i c a t e st h a tt h ek r a bb o xo fz n f 3 8 3i sr e s p o n s i b l ef o rt h e t r a n s c r i p t i o n a lr e p r e s s o ra c t i v i t y 0 v e r e x p r e s s i o no fz n f 3 8 3 i nc e l l si n h i b i t st h et r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t i e so fa p 一1a n d s r e ，s u g g e s t i n gt h a tz n f 3 8 3m a ya c ta san e g a t i v er e g u l a t o ri n m a p k m e d ia t e dsig n a li n gp a t h w a y s k e y w o r d s ：z n f 3 8 3 ：t r a n s c r i p t i o n a lr e p r e s s e r ：m a p ks i g n a l i n g p a t h w a y ；c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n ； v l 前言 人类基因组计划图谱绘制工作已经完成，世界各国关于基因的 研究焦点正转向确定基因功能、解析其结构等方面，更多的是将基冈 用于实际临床应用，尤其是在医学诊断和治疗方面，人类对基因研究 进入以功能研究为主的后基因时代。功能基因组学以揭示基因组功能 及调控机制为目标，相对于检测基因组的碱基对排序而言前进了一大 步，因此又被称为“后基因组学”。在医学上，它包括致病基因、疾病 相关基因以及具有重要生物功能基因的分离、克隆和功能研究。 以人类基因组为大背景研究疾病状态和发病过程中基因型变化 规律将是揭示基因组功能奥秘的最佳突破途径，可由此率先建立“疾 病基因组学”的理论和技术体系，并使“功能基因组学”在实质上得到 具体体现和理论的升华。“功能基因组学”研究在科学上的优势在于可 更加明确地揭示：人类所有疾病或健康状态都是与基因直接或间接相 关，每种疾病都有其相应的致病基因或易感基因存在，疾病发生过程 则是相关基因与内外环境相互作用的结果。因此，尽可能多地克隆人 类心脏发育相关基因并研究其功能，从中筛选出心脏疾病相关基因， 开发基因药物，对于预防及治疗先天性心脏疾病将有巨大的价值。 心脏发育的基因调控机制是发育生物学的一个重要研究内容。 心血管疾病严重损害人类身体，已成为导致疾病性死亡的头号杀手。 有人预言，到2 0 2 0 年，心血管疾病将成为全球范围内引起死亡的最 普遍疾病。而先天性心脏病( c o n g e n i t a l h e a r td e f e c t s ， c h d ) 是导致人 x 体功能不全、引起其他合并症的主要原因，由于其危害人、先天性等 特殊性，以至诊断和治疗的难度大，死亡率高。目前，先天性心脏痫 的病因还不甚明确，但遗传学研究显示约6 的先心病患者有染色体 的畸变和单个基因的突变。多基因突变引起的心脏发育缺陷比例将会 更大。 遗传信息的实现过程离不开基因表达的调控。至今为止发现的转 录调控因子中有很多含有锌指模体( z i n c t s n g e rm o t i f ) 结构。由于其自 身的结构特点，可以选择性地通过与d n a 相互作用而特异性地结合到 靶序列上，因而锌指蛋白在基因的表达调控、细胞分化、胚胎发育、 分化、成熟等生命过程中发挥重要作用。虽然其功能还不是特别清楚， 但已经发现有一百多种锌指蛋白与心血管系统有关。本研究通过筛选 人类心脏e d n a 文库，采用快速扩增e d n a 末端( 5 r a c e ) 技术结合 生物信息学相关知识克隆了一个与人类心脏发育相关的新基因 z n f 3 8 3 , 并对它进行了全长e d n a 克隆，表达分析和生物学功能的初 步研究。 x i a p - 1 b s a 英文缩写词简表 激活因子1 ( a c t i v a t i o np r o t e i n1 ) 牛血清白蛋白 c f o s s r ec f o s l k 清应答元件 _ 5 m i n 。( 5 ) 6 0 0 0 r p m 1 5 m i n ( 或1 2 0 0 0 r p m 5 m i n ) 。 ( 6 ) 吸上清移入新e p 管，等体积酚氯仿抽提一次，v o r t e x ， 1 2 0 0 0 r p m 1 5 r a i n 。( 7 ) 吸上清移入新e p 管，等体积氯仿抽提，v o r t e x ， 1 2 0 0 0 r p m 5 m i n 。( 8 ) 重复步骤7 ) 1 - 2 次。( 9 ) 吸上清移入新e p 管， 0 7 倍体积异丙醇沉淀，v o r t e x ，1 2 0 0 0 r p m 1 5 m i n 。( 1 0 ) 弃上清，l m l 7 0 酒精洗涤1 2 次，1 2 0 0 0 r p m 5 m i n 。( 1 1 ) 弃上清，空气中干燥。( 1 2 ) 加 入1 0 2 0 1 t l 灭菌d d h 2 0 溶解。( 1 3 ) 加入适量r n a s e a ，3 7 。c 温育。 菖磊人类锌指蛋白家族新基因z n f 3 8 3 的克隆与基因研究湖南师范大学硕j 。学位论文 2 3 8 质粒酶切 取测序正确的克隆，重新摇菌、提质粒，然后用b a m t t i 进行单酶 切。酶切条件为：质粒2 m ，1 0 x k b u f f e r1 出，r n a 酶o 5 9 l ，b a m h l 内切 酶o 2 9 l ，用超纯水讲酶切总体积增至1 0 i _ t l 。放置3 7 恒温箱2 个小时后， 取2 山酶切产物用1 5 琼脂糖凝胶电泳检测。 2 3 9z n f 3 8 3 基因o r f 的克隆 根据已公布的人类新基因z n f 3 8 3 的o r f 序列( i l n l 1 5 2 6 0 4 ) 和常用 引物设计软件p r i m e r 5 0 ，设计两条引物： p r i m e r l ：5 - g g g 工鱼鱼g a ct a ac c at c tg c a a t ac t a 一3 p r i m e r 2 ：5 - c g c 鱼鱼里g c tt t at t a g t at g aa t tc c c 一3 p r i m e r l 的5 端引入x h o i 酶切位点( 单下划线处) ，p r i m e r 2 的3 端引 入b a m h i 酶切位点( 单下划线处) 。引物由上海博亚公司合成。以心脏 c d n a 文库为模板进行p c r 扩增，反应条件为：9 4 0 c 变性4m i n ；9 4 0 c 3 0s ，5 8 0 c3 0s ，7 2 0 c2m i n ，反应1 0 个循环；9 4 0 c3 0s ，5 5 0 c3 0 s ，7 2 0 c2m i n ，反应2 0 个循环；7 2 0 c 延伸8m i n 。所得p c r 产物经纯 化与t 载体连接过夜，转化大肠杆菌d t t f a ，涂板，3 7 0 c 生长过夜，挑 单克隆菌培养，提取质粒，3 7 0 c 酶切鉴定后，测序分析。 2 3 1 0z n f 3 8 35 r a c e 的扩增 取人胚胎心脏文库为模板，采用快速扩增c d n a 末端( r a p i d a m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s ，r a c e ) 技术扩增来获得基因的末端完整序 列。设计了四对特异性的引物： p r i m e r 3 ：5 - c g ga a tt t gg 1 ag c ag a ag g 3 曹磊人类锌指蛋白家族新基因z n f 3 8 3 的克隆与基闲研究湖南师范大学颂f ：学位论文 p r i m e r 4 ：5 。一g a ac a j 。c a ct g at c c c t ca g 一3 p r i m e r 5 ：5 - c a gt c tg g t t g ag c cc t aa 3 p r i m e r 6 ：5 - g c ca t gg c tt c ta g ta t tg c 3 其中p r i m e r 5 和p r i m e r 6 为5 r a c e 外引物；p r i m e r7 和p r i m e r8 5 r a c e 内引物。引物由上海博亚公司合成。5 r a c ep c r 反应：反应 体系同前，外引物反应条件为9 4 4 m i n 一个循环，( 9 4 。c3 0 s ，5 4 。c3 0s ， 7 2 2m i n ) 3 0 个循环， 7 2 8r a i n 一个循环。完成以后，以外引物扩 增的p c r 产物为模板，用内引物进行第二次扩增。反应体系同前，反应 条件为9 4 4 m i n 一个循环，( 9 4 。c3 0 s ，5 5 。c3 0s ，7 2 。c2m i n ) 3 0 个循 环，7 2 8m i n 一个循环。反应结束后，取5 u l 上样于2 琼脂糖凝胶 电泳，观察结果。然后分别连接到p m d l 8 t 载体，转化进入大肠杆菌 d h 5 c t ，分别利用x h o i 进行酶切检测。然后送到上海博亚公司测序，测 序结果经生物信息学分析被确证为该基因5 端未知序列。 2 4z n f 3 8 3 基因的序列特征分析结果 2 4 1z n f 3 8 3 的全长c d n a 序列及蛋白质序列特征分析 如前面所述的方法，我们通过i n t e r n e t 查询g e n b a n k ，搜索到一未知基因。设计 图2 1z n f 3 8 3 5 - r a c e p c rp c r 反应引物获得该基因的开放阅读框 扩增结果。其 中1 号泳道为( o r f ) 后，在其5 端设计一个嵌套 5 0 0 b p 左右的 5 - r a c e p c r 5 r a c ep c r 的引物进行5 r a c e 扩增， 产物纯化结 果；2 号泳道 结果获得一个长度约为5 0 0b p 的p c r 产物 为3 k bd n a m a r k e r 。 图2 1 。经纯化，p m d l 8 t 载体连接，转 化，测序，从而获得完整的基因c d n a 序 曹磊人类锌指蛋白家族新基闻z n f 3 8 3 的克隆与接i 矧研究湖南师范人学硕i j 学位论文 列。该基因全长为2 2 2 0 b p ，3 端2 0 9 4 。2 0 9 8 b p 处有一个加尾信号a t a a a 。 5 端有5 3 3 b p 的非翻译区，3 端有2 5 7 b p 非翻译区。全基因含7 个外显 子，6 个内含子，外显子和内含予的边界与传统的拼接信号一致，5 端 有g t 二核苷酸，3 端有a g 二核苷酸序列 表2 - l 】。所得全氏序列提交到 h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v 数据库中心，获得g e n b a n k 编号为 a y 3 4 8 6 4 8 。此基因共编码4 7 5 个氨基酸，蛋白质大小约5 4 6 k d 。起始 密码子开始于5 3 4 ，终止密码子位于1 9 6 0 ，其核苷酸和蛋白质序列图 2 2 a 1 。据s m a r t 程序分析，此基因编码的蛋白质在n 末端有1 个k r a b 框，在c 末端有1 1 个连续的锌指 图2 - 2 b ，搜索h t t p ：g e n o m e t l c s c e d u 可知该基因定位于染色体1 9 q 1 3 1 2 的位置，属于锌指蛋白家族 k r a b c 2 h 2 亚家族的成员。根据核苷酸和蛋白质的特征，经国际基因命 名委员会批准，命名为z f 3 8 3 。 表2 1 ：z n f 3 8 3 基因的基因组结构 表2 1 ：表示z n f 3 8 3 基因在基因组上的内含子、外显子交界剪切保守序列。内含子、外显子拼 接信号用g t 和a g 用黑色加粗表示。 曹磊人类锌指蛋白家旗新基凶z n f 3 8 3 的克隆与基凼研究湖南师范人学硕l 学位论史 a 1(cgga6tttcgctgttgttgfccaggctggg ”t g c a t a 6 c g c a 1 t c o g c t c a c ( 、( 从c cr c c g c c i cc c c0 g 11 c a a g ca t t c tc c t g c c t c a o c ct t c c t a g t a o c t g o g l l7 r r c a g 6 c g t gt g t c a c c c g c c c t g c t a t tt t o t a tt t t c a ( jt a o a g 0 0 g tt ”t c c 研o r r o a r c a o g c t g 0 1 1 o 2 0 i c ct c c c c a c c t c g a t a g t a g c t o t a g t c c a a 1 a c c t r t o a t ct g c t c 0 t c t g 6 a c c a c a a g 从a g c ct g o c a tc t c 2 8 5 t c t t c c t t t t r ct t c g c t c t g c tc t c o t c m g a g a o 兀 c c c g g g 从g a a t g g c l 研1 弓a c c a cc t c a g f ，6 9o g ( h c t c c t c i u t t g c c c 6 c t 0 0 o t o c a g t o o c t o ar c t c 0 c t c c t o c a o c ct c t o c tt c c c 0 0 0 t t c a a o c o a t t 4 弱c t ct t o c c tc a o c c t c c t o a gt a o c t o o b t t ac a g g a ga c g o c c t c a g o a a g a ct a ac c at c t g c a 1 c t g a o r c 5 “ t a o c t o g g g a t c 0 t 0 t 0t t c g t o a t o t o t c c a t a g a c 丌ct c t c a 0 0 o g 0 t g 0 0 a ct o c c t g g a c c c t g t t c a g a g g imaeg s v mfsdvsidfs q eewdcldpv qq 6 1 8g a c t t a t a c a g a g t g t g t gt 1 b g a g a c t a c o g c a a t c l u u l t t c a 1 g g g a c t t t a c a c t c c t o c c tc g t o a t ct f c 2 9dlyrdvmlenyonlvsmglytpkpq vi q 7 0 21 1 a t l 6 0 a c 从g 0 3 a a a o g c o c t 0 a t 0 0 n6 g c a g a 0 gc t t a c a o a g g cc t g t g t t c a g a l 。c t 0 0 t 【a t qt o t ( i a 5 7lleogkepwm ivg reltr glcs dlesmcf 7 8 6 c c o m r r a t 盯帆m g a a o g a g 丌t 耵g a 1 a o a a t r a t 6 c c a g g g g g t 椰6 g c 丌 c aa 0 c r o g c c t t b 5tkllslkke vyeielforelmoltkhgl 8 7 0g a 0 1 c t c c g t 九t o o a o t 0 1 tt t g g a t a ta 6 a a g cc a f f t t g c 从c a a c t o 1 霄r c c a a r g c a l lt 1 t a o t f a a 1 l ，eyss f odvle vrsh【，k o l g ypnohfs 0 9 h g a a 1 a t t c c t c c t o a 1 a ca 1 gc c c a c t t ta 1 tc a c a ga c t t c c t t c tc t fc a l 。c a a t a a 丌a t a f 6 a a o a ca o a c c c 1 4 1eif tp eym ptfl 0o 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c c o g ct c a m gc t t g 丌c a c a t c o a g 1 1 c t a c t g g t g a g 从a c c c l 3 l l 臣一丘丘工卫上卫上玉上上丑l l u tgbkp芏 1 5 4 8 0 o t a c 从g o a t g t g g c a a g c c t t t a o t 0 t o g ct c g c c t t c t a a t c a t c a 0 o t t c a c c t g g io a g a c c ct a r 3 3 9e _ 工点_ + j l 旦点j j l l 旦量上上j l i l 卫上 tgekp 羔 1 6 3 2 0 t t g t m o o a t o t o g a a 0 0 c t m a c t c g g c t c a c g c t t c o tc a c t c a g 6 丌c c 6 c t g o t o a 从c c ct t t 3 6 7 亚- j 乙旦王j l 娶上j l j l 置_ 量_ 卫上卫且一卫l _ j age kp 1 6 0 a t g t c t t 6 从t o t o g g 从g g c ct 兀 c t c g 从c t c a c 从c 1 t t t c c g c a l c a o a o 丌c t c g t a a a a c c a t a t 3 9 ，旦h l 卫上l l l 卫立型j l l 旦旦| j l l td ekp 芏 1 8 0 0 g t o t r g a t o t o g a a o o c ct t t a a t a t a ct c a cc 1 1 a c t c g a c 1 c t o a o a m c c c t g o t a a 从g c c ct a t 4 2 ，e 世l j l _ l j l 工型上j _ 啊j l l 上上j f tg exp 芏 1b 8 4 a c l n t 从0 g 从t g t g 6 g a g g c tt t t a g t o t 0 6 ct c g g tc t ca t t c 6 t c a t c g 0 0 1 丌c t a c t t 从1 mt a a a a 4 5 l 丛墨上上正墨直j _ _ j l 置旦上卫上j 上点殳卫上丛 tnk 1 9 6 bt t a gc c cc t o t c a c c t t c ct c a t tt t t 从c c a a t c a t g t c t a t a g tt c c c t c t t c c g t a 0 1 t r mt t a 从c t t 2 2 t g ta ”t a a t tt 1 u t t ( = c a 从t g t 1 t r c a tt c c a g o 丌a t a t t c o o g t c l a g t o a c a t l cc t ct c t c c cc c a g t ( 2 1 3 6a t t c c g t g cc 0c wt t ct t a tt c t 丌c t tc a tt g t t n 6 t tc t ac t tt c t t o gt o c c a t t t c ” t gt t ta t b 图2 2 ( a ) 人类锌指基因z 乃韶的核酸序列及其编码的蛋白序列。其蛋白质含4 7 5 个氨基酸e 起 始密码子a t g 和终止密码子t a a 用阴影标示。蛋白质序列的k r a b 框也用方框框了起来， 1 1 个 锌指则用下划线标示出来。核酸序列的加尾信号a t a a a 也用阴影标示。( b ) z n f 3 8 3 蛋白的结构。 最大的紫色方框表示k r a b 框( a a6 _ 6 6 ) ；1 1 个篮色的方框表示1 1 个c 2 h 2 锌指( a a1 7 0 - 1 9 2 ， 1 9 8 2 0 ，2 2 6 ”8 ，2 5 4 7 6 ，2 8 2 - 3 0 4 ，3 l o - 3 3 2 ，3 3 8 - 3 6 0 ，3 6 6 * 3 8 8 ，3 9 4 - 4 1 6 ，4 2 2 4 4 4 ，4 5 0 - 4 7 2 ) 。 2 7 曹磊人类锌指蛋白家族新基因z n f 3 8 3 的克隆与基斟研究 湖南师范大学硕士学位论文 2 4 2z n f 3 8 3 与同源基因的同源性比较及进化分析 分别利用z n f 3 8 3 的k r a b 框和锌指区氨基酸序列在n c b i 数据库 中进行b l a s t p 搜索，我们发现这两个区域的氨基酸序列都是高度保守 的。图2 - 3 a 是其k r a b 框与其同源基因的k r a b 序列对比图；图2 - 3 b 是z n f 3 8 3 蛋白的11 个锌指与其它锌指基因的锌指序列对比图。从比较 结果可以看出，z n f 3 8 3 的k r a b 框与多种其它锌指转录因子的k r a b 同源，锌指区域也与其他锌指基因有较高的同源性。然后，我们还分析 了z n f 3 8 3 蛋白与同源基因及其他锌指基因之间的进化关系【图2 3 c 】， a z n f 2 0 8 z n f 5 4 6 z n f 3 8 3 z n f 5 6 6 g i o t l c o n s e n s u sv m fd v s i d f s q e e w e c l do r d l y r d v m l e n y s n l v s l g l s i p k pv l s l l e q g k e p w m b z n f 4 2 0 z n f 3 4 5 z n f 2 8 3 z n f 2 0 8 z n f 3 8 3 c o t l s e n s h s y e c k e c g k a f sg s q lq h 。r l h t g e k p y e c k e c g kf s g s1 t h h q r l h t g e k p y e c k z n f 4 2 0 z n f 3 4 5 z n f 2 8 3 z n f 2 0 8 z n f 3 8 3 c o f l s e n s h se c g k a f sg sl t r h q r i h t g e k p y e c k e c g k t f s fsl i q r i t g e k p y e c k e c g k z n f 4 2 0 z n f 3 4 5 z n f 2 8 3 z n f 2 0 8 z n f 3 8 3 c o n s e n s u s a f g s q lq hr i t f t g e k p y e c k e c g k a f tg s h l s q h o r i h t g e k p y e c k e c g k a f s 曹磊 人类锌指蛋白家族新基因z n f 3 8 3 的克隆与罐圜研究湖南师范大学硕二i ：学位论文 z n f 4 2 0 z n f 3 4 5 z n f 2 8 3 z n f 2 0 8 z n f 3 8 3 c o n s e n s u s g s a l i q h q r i l t g e k p yc k e c g k a fg s q l t q h q r i h t g e k p y e c k e c g k a f g sl z n f 4 2 0 z n f 3 4 5 z n f 2 8 3 z n f 2 0 8 z n f 3 8 3 c o n s e n s u s i q h q r i h t g e k p y e c k e c g k a f t sl th q r i h t g e k p yc k e c g k a f t s g sl i q h q z n f 4 2 0 z n f 3 4 5 z n f 2 8 3 z n f 2 0 8 z n f 3 8 3 c o n s e n s u sr i h c m 3 1 r 1 r _ r 1 7 _ r 1 瑚j 瑚竹” 52 图2 - 3z n f 3 8 3 在进化上是保守的。( a ) z n f 3 8 3 蛋白的k r a b 框与其同源蛋白z n f 2 0 8 ， z n f 5 4 6 ，z n f 5 6 6 ，和g i o t l 蛋白的k r a b 框的序列比较。其中被鉴定的保守氨基酸由黑色阴影 部分标记。( b ) 图b 为z n f 3 8 3 蛋白的g 2 h 2 锌指区域与其同源蛋白z n f 2 0 8 ，z n f 4 2 0 ，z n f 2 8 3 ， 和z n f 3 4 5 蛋白的c 2 h 2 锌指区域的序列比较。被鉴定的保守氨基酸也由黑色阴影部分标记。( c ) 为与z n f 3 8 3 相关的c 2 - h 2 型锌指蛋白的u n - r o o t e d 进化树分析。 所有这些序列分析显示z n f 3 8 3 的k r a b 框和c 2 h 2 型锌指在进化上是保 守的。序列对比和进化树都是用d n a s t a r 软件进行分析的。 曹磊人类锌指蛋白家族新基因z n f 3 8 3 的克降与基因研究湖南师范大学硕士学位论文 2 5z n f 3 8 3 基因的表达分析 2 5 1n o r t h e r n 膜的制备 用传统的酚，氯仿抽体方法从6 个月人类早期胚胎组织中提取r n a ， 用d e p c 抑n r n a 的降解，每一电泳泳道取总r n a 2 0 i x g 进行l 甲醛变性 琼脂糖凝胶电泳，按常规方法转印至尼龙膜后，8 0 0 c 2 h 烘干。 2 5 2n o r t h e m 杂交 以从重组质粒p m d l 8 t - z n f 3 8 3 a 2 酶切下来水i d n a 片段为探针，用 t a k a r a 公n 随机引物标记试剂盒对探针进行 旺一3 2 p d c t p 标记，用标记 a g 担捐镏篷 0 超篷蠡盎啦韭篷 b 基溪 蒙 龌坦 赢 姗篮盏啦堑坦曹餐韫 一2 2k b 一i - a e t h l 一2 2k b 十p - a e t i n g 目2 - 4 z n f 3 8 3 的n o r t h e r n 表达分析。在成人( a ) 及6 个月胚胎( b ) 的许多组织中都检测到z n f 3 8 3 的转录产物( 2 2 k b ) 。特别是在成体骨骼肌、胚胎骨骼肌中有较强表达。 曹磊人类锌指蛋自家族新基因z n f 3 8 3 的克隆与基冈研究湖南师范大学硕十学位论文 好的探针与人体不同发育时期的胚胎n o r t h e m 膜进行杂交。膜先在预杂 交液( 5 0 甲酰胺，2 x s s c ，i s d s ，1 0 硫酸葡聚糖，o 1 m g m lh u m a n d n a ) 中进行4 2 0 c 预杂交。然后，标记好的探针经变性处理后在杂交液 ( 5 x s s c ，5 x d e n h a r d t 溶液，2 0 m m 磷酸缓冲液 p h = 7 o 】，1 0 硫酸葡聚糖和 5 0 甲酰胺) 中杂交过夜。第二天，用1 s d s ，2 s s c 溶液在4 2 0 c 沈膜 二次，每次1 5r a i n ，再用2 x s s c ，i s d s 溶液洗膜二次，每次1 5r a i n ， 直至合适的信号反差时止，室温稍晾干后置于曝光夹内8 0o c 下放射自 显影，隔天冲第一张x 光片，然后依据信号强弱选择第二张x 光片的冲 洗时间。最后得至l j n o r t h e m 杂交结果。上述同样方法标记过的1 3 - a e t i n e d n a 探针进行同样的杂交作为阳性对照。 2 5 3n o r t h e r n 杂交结果分析 为了确认z n f 3 8 3 转录产物的大小及该基因的表达情况，我们利用 z n f 3 8 3 的o r f 为探针，用成体n o r t h e r n 膜和6 个月胚胎n o r t h e r n 膜进 行杂交，方法如前一节所述。结果显示，z n f 3 8 3 基因的转录产物约为 2 2k b 。在成体中z n f 3 8 3 在骨骼肌强烈表达，且在心脏、胎盘、肝和 胰腺中有表达，而在脑、肺和肾脏中没有表达( 图2 - 4a ) 。z n f 3 8 3 在 6 个月胚胎骨骼肌中的表达和在成体中表达相似，而在6 个月胚胎睾丸、 肾脏、心脏、肠和前列腺中也检测到了z n f 3 8 3 的表达，但是在肺、肝 和脑中却没有表达( 图2 4 b ) 。 2 6z n f 3 8 3 基因在亚细胞结构中的定位分析 2 6 1e g f p n 1 ，z n f 3 8 3 重组质粒构建 曹磊人类锌指蛋白家族新基因z n f 3 8 3 的克隆与基凶研究湖南师范大学硕士学位论文 剿涨蝴鞭笋。躲掣黼粼艚肌6 讳 ? 警?：8 ：警：。 嗽 靠i h ，l 。w ”轴；瞎呷靴i 为了研究z n f 3 8 3 基因编码产物的特性和在活细胞内的定位与表 达，决定构建p e g f p n 1 z n f 3 8 3 重组质粒。p e g f p n i 载体可在哺乳 动物细胞中表达e g f p 一外源蛋白的融合蛋白。将外源目的基因与e g f p 阅读框一致地克隆入p e g f p n 1 ，所形成的表达重组质粒在c m v 启动 子的启动下，表达e g f p 和目的蛋白的融合蛋白。该融合蛋白保持了 e g f p 的荧光特性，可对融合蛋白进行活细胞内定位( 图2 5 ) 。之前在克 隆z n f 3 8 3 编码序列( 0 r f ) 时已经考虑到了z n f 3 8 3 编码序列所含限 制性内切酶位点与p e g f p n 1 载体克隆位点的限制性内切酶位点的