（营养与食品卫生学专业论文）定向酶解大豆蛋白及其ace抑制肽研究.pdf

摘要 摘要 通过s w i s s p r o t , g s c 等蛋白序列数据库网站的查询，获得大豆蛋白、大豆7 s 球蛋白及l l s 球蛋白的氨基酸序列，补充到蛋白质数据库，搜索近年来国内外发表的关 于a c e 抑制肽的文献，更新a c e 抑制肽数据库，以及从酶命名数据库中搜索、完善了 更多的蛋白酶到蛋白酶数据库，并利用v i s u a lb a s i c 在“定向酶解制备活性肽分析系 统 中添加疏水性氨基酸含量计算程序、双酶水解程序、预测潜在活性肽程序和水解片 段分子量计算程序。 利用疏水性氨基酸含量计算程序分析大豆蛋白、大豆7 s 和l l s 球蛋白，初步筛选 合适的蛋白质，再结合“定向酶解制备活性肽分析系统一模拟水解，以水解出的活性肽 段相对较多的碱性蛋白酶以及胃蛋白酶+ 胰蛋白酶对大豆分离蛋白以及大豆7 s 球蛋白 进行水解。 实验比较碱性蛋白酶与胃蛋白酶+ 胰蛋白酶水解大豆分离蛋白与大豆7 s 球蛋白水 解产物a c e 抑制活性的大小，结果显示，碱性蛋白酶水解物a c e 抑制活性较胃蛋白酶 + 胰蛋白酶高，大豆分离蛋白与大豆7 s 球蛋白水解产物的a c e 抑制活性相当。以大豆 7 s 球蛋白的碱性蛋白酶水解产物做分子量分布，其重均分子量分布与模拟水解产物的 重均分子量进行相关性分析，结果线性关系显著，相关性较好。 以7 5 乙醇为洗脱液，采用d a 2 0 1 c 型大孔吸附树脂对水解液进行疏水性氨基酸 的富集，产物疏水性提高2 ：2 6 ，富集产物以2 0 0m g m l 的浓度，1 0m l 的上样量， 0 2 5m l m i n 的流速，0 0 2m o l lh a e n a a e 缓冲液( p h4 0 ) 通过s e p h a d e xg 1 5 分离，所得活性最高组分经半制备r p h p l c 分离后得到高抑制率的单一活性组 分，其抑制率达到9 6 5 7 ，经l c m s 鉴定可知，从原料蛋白中分离出的a c e 抑制肽 氨基酸序列可能含有p h e s e r i f s ) 、t y r - i l e ( y 1 ) 或t y r - l e u ( y l ) ，其中t y r - l 饥在大豆7 s 球蛋白中所占比例为0 0 0 9 3 9 6 。 关键词：数据库，a c e 抑制肽，蛋白酶，大豆蛋白，7 s 球蛋白，相关 a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , t h ea m i n oa c i ds e q u e n c e so fs o y b e a np r o t e i n , 7 sg l o b u l i na n dllsg l o b u l i n c a l lb er e f e r r e df r o ms w i s s - p p r o t , g s ce ta lw c b s i t e sa n db ec o m p l e m e n t e di nt h ep r o t e i n d a t a b a s e s e a r c h e dt h er e c e n tl i t e r a t u r e sa b o u ta c ei n h i b i t o r y ( a c e i ) p e p t i d e sh o m ea n d o v e r s e a sa n dr e n e w e dt h ea c e id a t a b a s e m e a n w h i l es e a r c h e da n dp e r f e c t e dt h ep r o t e a s e si n t h ed a t a b a s ef r o me n z y m ew e b s i t e s o t h e r w i s eu t i l i z e dt h em sv i s u a lb a s i ct oc o m p i l et h e p r o g r a ma b o u tt h ec o n t e n tc a l c u l a t i o no fh y d r o p h o b i ca m i n oa c i d s ，h y d m l y z a t i o nw i t ht w o p r o t e a s c s ，f o r e c a s tl a t e n tp e p t i d e sa n dm o l e c u l a rw e i g h tc a l c u l a t i o no fh y d r o l y s a t e sw h i c h w e r ea d d e dt ot h e a n a l y t i c a ls y s t e mf o ra c t i v ep e p t i d e sp r e p a r e dw i t hd i r e c t i d e se n z y m e h y d r o l y z i n g m e t h o d ” a c c o r d i n gt ot h ep r o g r a ma b o u tf h e c o n t e n tc a l c u l a t i o no fh y d r o p h o b i ca m i n o a c i d s ，a n a l y s e ds o y b e a np r o t e i n , 7 sg l o b u l i na n dllsg l o b u l i na n ds c r e e n e do u tt h e a p p r o p r i a t ep r o t e i n t h e ns i m u l a t e dh y d r o l y z a t i o nu s i n gt h e a n a l y t i c a ls y s t e mf o ra c t i v e p e p t i d c s 脚a r e d 诵md i r e c t i d e se n z y m eh y d r o l y z i n gm e t h o d ，f i n a l l ya c c o r d i n gt ot h e a m o u n t so fa c t i v i t yp e p t i d ef r o ms i m u l a t e dh y d r o l y z a t i o n ，u s e da l c a l a s ea n dp e p s i n + p a n c r e a t i n t oh y d r o l y z es o y b e a np r o t e i na n d7 sg l o b u l i n c o m p a r e dt h ea c e ia c t i v i t yo fh y d r o l y s a t e sb ya l c a l a s ea n dp e p s i n + p a n e r e a n t i nf r o m t h es o y b e a np r o t e i ni s o l a t e sa n d7 sg l o b u l i n , t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h ea c e ia c t i v i t yo f a l c a l a s e h y d r o l y s a t e s w a sm o r e h i g h e r t h a nt h e a c t i v i t y o f h y d r o l y r s a t e sb y p e p s i n + p a n c r e a n t i n , a n dt h ea c t i v i t yo f7 sg l o b u l i nw a sa sm u c ha st h es o y b e a np r o t e i n i s o l a t e s t h ec o r r e l a t i o na n a l y s i sw a sd o n eo nt h ew e i g h t - a v e r a g em o l e c u l a rw e i g h t d i s t r i b u t i o nb e t w e e ne x p e r i m e n t a la n ds i m u l a t i v e h y d r o l y s a t e sb ya l c a l a s ef r o m 7 s g l o b u l i n ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h el i n e a rr e l a t i o nw a ss i g n i f i c a n ta n dt h ec o r r e l a t i o nw a s w e l l f o rt h es a k eo f e n r i c h i n gt h eh y d r o p h o b i ca m i n oa c i d ，u s e dt h em a c r o p o r o u sa d s o r b i n g r e s i nd a 2 01 ca n dt h eh y d r o p h o b i cp r o p e r t yo f7 5 e t h a n o le l u t i o n f r a c t i o ni n c r e a s e d 2 2 6 t h e nt h ee n r i c h m e n tp r o d u c t sw a so ns e p h a d e xg 一15c o l u m n ：s a m p l ec o n c e n t r a t i o n , 2 0 0 m e d m l ；i n j e c t i o n v o l u m e ，1 o m l ；f l o w r a t e ，0 2 5 m l m i n ；e l u a n l 0 0 2 m o l lh a c - 】n a a c b u f f e rs o l u t i o n0 h4 o ) f u r t h e rf r a c t i o n a t i o nw a sp e r f o r m e do nr p - h p l ca n dt h eh i g h e s t a c t i v i t yw a s9 6 5 7 o nl c m st h ea m i n oa c i ds e q u e n c e sw e r ep h e s e r ( f s ) ，t y r - i l e ( ) o r t y r - l e u ( y l ) ，f u r t h e r m o r e ，t h ep r o p o r t i o no f y lt os o y b e a n7 sg l o b u l i nw a so 0 0 9 3 9 6 k e yw o r d s ：d a t a b a s e ，a c ei n h i b i t o r yp e p t i d e ，p r o t e a s e ，s o y b e a np r o t e i n ，7 sg l o b u l i n ， c o r r e l a t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签 名：重晕， ：导师签名： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 生物活性肽是能够调节生物机体的生命活动或具有某些生理活性作用的一类肽。自 从1 9 7 5 年h u g h e s 等【l 】首先报道从动物组织中发现了具有类吗啡活性的小肽以来，已 经从动、植物和微生物中分离出多种多样的生物活性肽，如酪蛋白肽、乳清肽、血清肽、 大豆肽、小麦肽、胶原肽、玉米肽、大米肽和谷胱甘肽等。它们的结构从简单的二肽到 较大分子的多肽，具有多种多样的生物学功能，如激素作用、免疫调节郾】、抗血栓1 4 5 1 、 抗氧化【6 7 】、抑制血管紧张素转化酶( a c e ) 活性【蜊、降胆固醇f 9 】、降血脂【埘、阿片抑 制作用f l l ，1 2 1 、抑制细菌 1 3 , 1 7 、病毒和抗艾滋病毒【1 5 1 、抗癌作用【16 1 7 1 、改善元素吸收和矿 物质运输、促进生长、调节食品风味、口味和硬度等等。 为了获得较高活性的生物活性肽，研究主要集中在蛋白源和蛋白酶筛选以及酶解条 件优化上。但是，对于选择何种蛋白以及何种酶，往往是随机的。迄今，研究者往往先 通过确定一种蛋白，然后选择几种蛋白酶水解，进行条件优化，水解后检测水解物中具 有何种生理功能，最后再进行分离纯化，这个过程存在太多盲目和不确定的因素，如果 是为了获得某种生理功能的活性肽，且希望活性最大，实验需要同时筛选蛋白质和蛋白 酶，工作量和不确定程度增加一倍。 1 1 定向酶解制备生物活性肽研究现状 随着生物信息学的发展及生物活性肽研究的不断深入，越来越多的蛋白质一级结构 及活性肽的氨基酸序列得到阐明，免疫学的发展使得蛋白酶的酶切位点也越来越明确， 这为从原料蛋白质中寻找已知氨基酸组成序列的生物活性肽提供了基础。研究表明， 具有特定生物活性的肽具有相似的结构特征，而其活性与肽的理化性质相关。因 此，根据活性肽的氨基酸组成结构信息和不同蛋白酶的水解位点特异性可以利用 计算机使用特定酶模拟定向的释放活性肽，对生产具有高活性的肽类以及进一步 研究其活性与结构的关系，具有重要的意义。目前，已经有一些研究者在这一方面 做了初步尝试。黎观红、乐国伟、施用晖等1 1 8 2 0 0 3 年建立活性肽数据库，数据库中包 括常见的部分序列已清楚的生物活性肽，有a c e 抑制肽、免疫调节肽、阿片肽等，但 是由于没有建立蛋白质数据库、蛋白酶数据库以及应用系统，活性肽数据库无法单独使 用，故无法真正实现计算机定向模拟蛋白酶水解。v a n e s s av e r m e i r s s e n 等 1 9 1 2 0 0 4 年建 立豌豆蛋白质、乳清蛋白质数据库以及a c e 抑制肽数据库，并在d o s 下编写软件分析 豌豆蛋白质、乳清蛋白质中的a c e 抑制肽含量并进行了验证，实验取得了初步成果。 陈征松、乐国伟、施用晖等【2 0 1 2 0 0 7 年在黎观红研究基础上建立蛋白质数据库、蛋白酶 数据库，并编写“定向酶法制备活性肽分析系统”，达到在目标蛋白中搜寻活性肽以及 水解功能，并通过碱性蛋白酶水解小麦蛋白，并以胰蛋白酶做对比，初步验证了“定向 酶法制备活性肽分析系统”的可行性。但是该系统由于缺少预测目标蛋白含有潜在活性 江南大学硕士学位论文 肽条数的功能，就存在对某一蛋白所含有某种生理活性肽肽段多少的不完全认识，可能 对后续实验目标蛋白的选取造成一定的影响，有可能最终影响活性肽功能的大小。同时， 也没有对模拟水解与实际水解得到的片段就分子量或氨基酸组成方面的拟合程度做讨 论研究，故不能确定利用该系统模拟水解与实际水解结果的相似程度。 本课题在陈征松研究基础上，就预测潜在活性肽条数以及拟合程度做进一步研究。 由于做出全部水解片段的氨基酸组成工作量非常大，且难度也较高，故采用计算机模拟 水解所得片段与实际水解所得片段的分子量进行拟合，研究二者的拟合程度。目前对生 物活性肽的研究较多、较为深入的是a c e 抑制肽，黎观红、陈征松等人建立的活性肽 数据库是以a c e 抑制肽为重点进行定向模拟的研究，本课题在搜集和总结已发表的关 于a c e 抑制肽的国内外文献报道中，将新发现的肽段补充到活性肽数据库中，目前为 止，活性肽数据库中a c e 抑制肽为3 9 9 条。 1 2 a c e 抑制肽 血管紧张素转化酶( a n g i o t c n s i o n - c o n v e r t i n ge n z y m e , a c e ，e c 3 4 1 5 1 ) 是一种含锌的 二肽羧酶，在肾素血管紧张素系统( r 朗j n - a n g i o t e n s i ns y s t e m , r a s ) 和激肽释放酶激肽 系统( k a l l i k r c i n - k i n i n s y s 螂s ) 中，对机体血压和心血管功能起着重要的调节作用。 a c e 抑制肽属于a c e 抑制剂的一种，是对a c e 活性区域亲和力较强的竞争性抑 制剂，与a c e 的亲和力比血管紧张素i 或舒缓激肽的强，且不易从a c e 结合区释放， 从而阻碍a c e 催化水解血管紧张素i 成为血管紧张素，及催化水解舒缓激肽成为失 活片段的两种生活反应过程，起到降血压作用。然而，a c e 抑制肽不能称为降血压肽， 只有经动物实验或人体实验证明具有抗高血压作用的肽类物质称为降血压肽，而经体外 活性检测方法证明的称为a c e 抑制肽。降血压肽和a c e 抑制肽并不完全一致，降血压 肽强调对人体的作用，能够使高血压患者血压降低，而a c e 抑制肽只是在体外对a c e 有抑制作用，它并不一定能保证经口服或其它方式进入人体后一定具有降血压作用。一 些在体外实验中a c e 抑制活性并不高的肽，却能显著降压，许多学者认为这是由于这 些肽类物质经过人体消化道时会被体内的蛋白质水解酶水解，可能被水解成抑制活性较 高的片段，而一些具有较高a c e 抑制活性的肽可能会被水解成抑制活性较低或几乎没 有活性的小片段。a c e 抑制肽与其它a c e 抑制剂比较有一个很大的优点，a c e 抑制肽 不会有副作用，当人体服用a c e 抑制肽后血压降低到正常水平后血压不会因继续服用 a c e 抑制肽继续降低，而是把血压维持在正常水平。 a c e 抑制肽结构与活性关系研究表明，底物或抑制剂的c 末端三肽强烈影响其与 a c e 的结合，这也进一步被这一事实所证实：当在二肽抑制剂n 末端以适当氨基酸延 长时，所得的相应三肽活性比二肽高。a c e 倾向于c 末端三肽的每个位置含有疏水性 氨基酸( 如芳香族氨基酸和支链氨基酸) 的底物或抑制剂，故c 末端为t r p 、p h c 、t y r 和p r o 而n 末端为支链氨基酸的二肽或三肽具有强的a c e 抑制活性【2 1 盈，2 3 甜，2 5 ，2 6 1 。a c e 对c 末端为二羧基氨基酸如g l u 的底物或抑制剂具有较小的亲和力。但也有的抑制肽 并不符合以上规律，研究表明，肽c 末端氨基酸a r g 和l y s 的侧链胍基或一氨基对其 ， 第一章绪论+ 活性有很大的贡献1 2 7 2 8 2 9 , 3 0 j 。高亲水性末端无法使肽接近a c e 活性部位而导致较弱活 性或无活性。a c e 抑制肽的活性强度也受c 端p r o 残基临近氨基酸的影响，对于高活 性的肽，临近氨基酸应该是疏水性氨基酸，故肽的疏水性也是影响其活性的重要因素 【2 2 1 o 应用a c e 抑制肽结构与活性的关系，首先对原料蛋白中疏水性氨基酸含量进行统 计，再根据蛋白酶的水解位点，寻找合适的蛋白酶进行水解，以期望最大程度的水解出 具有a c e 抑制活性的片段且活性较高。同时，根据“当在二肽抑制剂n 末端以适当氨 基酸延长时，所得的相应三肽活性比二肽高一以及对已证实的具有a c e 抑制活性的肽 段的统计分析，编写水解预测程序，获得目标蛋白中潜在的a c e 抑制肽条数。 1 3 大豆贮藏蛋白和a c e 抑制肽蛋白源 研究者最初获得a c e 抑制肽是从蛇毒液中发现的【3 ，肽长度一般为5 1 3 个氨基酸， 大多数肽的n 端为谷氨酸，c 端为脯氨酸，且往往成对出现，含a l a - p r o 和p r o - p r o 较 多，其中p y r - t r p - p r o - a r g - p r o g l n - i l e p r o - p r o 对高血压动物的降压效应最强，并曾经用 于体外注射治疗人高血压【3 2 1 。o s h i m a 等1 9 7 9 年报道了用细菌胶原酶水解明胶获得了6 种活性较强的a c e 抑制肽，并解析了其氨基酸组成【3 3 】，这是首次用蛋白质酶体外水解 食物蛋白质获得a c e 抑制肽。随后，大量的a c e 抑制肽从不同食物蛋白质水解物中被 分离鉴定出来，这些食物蛋白质包括酪蛋白【2 2 3 4 1 、乳清蛋 3 5 3 6 】、鱼蛋白f 3 7 3 引、猪鸡 肌肉【3 9 1 、鸡蛋蛋白【4 0 1 、血红蛋白f 4 、血浆蛋白【4 2 1 、胶原蛋白【4 3 1 、荞麦蛋白m 】、小麦 蛋白【4 5 1 、玉米蛋白4 6 1 、大豆蛋白f 4 7 1 、小红豆蛋白【4 8 1 等。 大豆蛋白氨基酸组成平衡性较好，是一种优质的植物蛋白源。近年来，越来越多的 研究者将大豆蛋白作为重点研究对象，随着蛋白质组学、生物遗传学的发展，大豆蛋白 质一级结构不断被发现，且越来越清楚，这对大豆营养特性的研究提供了一定的理论依 据。 大豆贮藏蛋白占总蛋白的8 0 以上，其主要成分是7 s 球蛋白和l l s 球蛋白，分别 占总蛋白质含量的4 3 和4 3 6 。二者均由多条不同的多肽组成，称之为亚基( s u b u n i t ) 。 7 s 球蛋白的主要形式是争球蛋白，由三个亚基( a 、a 和b ) 组成，分子量分别为8 3 0 0 0 、 7 6 0 0 0 和5 6 0 0 0 。7 s 球蛋白在离子强度发生变化时是不稳定的，甚至发生聚合和析离作 用。其有两种形式p 伴大豆球蛋白和丫伴大豆球蛋白，前者在二乙胺乙基纤维素聚葡 萄糖凝胶a 5 0 色谱柱上，能析离出6 种异构体( p 1 p 6 伴大豆球蛋白) ，而只占3 的y 伴大豆球蛋白，在0 1 离子强度下不能发生聚合作用。二者合起来占7 s 球蛋白的9 5 。 7 s 球蛋白有6 种异构体( b 1 b 6 ) ，其各亚基组成是：b 1 ：0 t 1 3 ( 1 ：2 ) ，b 2 ：a 1 3 ( 1 ：2 ) ，b 3 ： 吣1 3 ( 1 ：1 ：1 ) ，b 4 ：0 【p ( 2 ：1 ) ，b 5 ：o , 0 l ( 2 ：1 ) ，b 6 ：a ( 3 ) 。c a t s i m p o o l a s ( 1 9 7 6 ) 和b a d l e y ( 1 9 7 5 ) 研究表明，1 1 s 球蛋白分子量为3 0 2 0 0 0 3 7 5 0 0 0 ，含1 2 个亚基，酸性亚基( a 1 、a 2 、 a 3 、a 4 、a 5 和a 6 ) 分子量3 7 0 0 0 4 2 0 0 0 ，碱性亚基( b i 、b 2 、b 3 、b 4 、b 5 和b 6 ) 分 子量1 7 0 0 0 2 0 0 0 ，1 2 个亚基通过静电或氢键作用组成两个相同的六角形结构，形成了 一个中间空的扁圆柱体。在六角环内，亚基之间相互作用，被认为是酸性( a ) 和碱性 江南大学硕士学位论文 ( b ) 交错排列的。酸性亚基a 1 、a 2 、a 3 的等电点分别为p h 5 1 5 、p h 5 4 0 、p h 4 7 5 ， 碱性亚基b l 、b 2 、b 3 的等电点为p h 8 0 、p u s 2 5 、p u s 5 1 4 9 , 5 0 。表1 - 1 所示为通过 s w i s s p r o t 蛋白序列数据库网站【5 1 1 ，获得的大豆蛋白、7 s 球蛋白和l l s 球蛋白部分 氨基酸序列。 表l - i 大豆蛋白、7 s 球蛋白和l l s 球蛋白部分氨基酸序列 t a b 1 1s e g m e n t a m i n oa c i ds e q u e n c e so f s o y b e a np r o t e i ni s o l a t e s ，7 sa n di l sg l o b u l i n a c e 抑制肽结构与活性关系研究表吲5 2 】，疏水性氨基酸残基占6 0 以上，且c 末 端的氨基酸种类如果是芳香族氨基酸或疏水性氨基酸残基，则与血管紧张素转换酶 ( a c e ) 结合能力强，则a c e 抑制活性强。利用自编的疏水性氨基酸含量计算程序， 对大豆蛋白、7 s 球蛋白和l l s 球蛋白中疏水性氨基酸进行计算，结果如表1 - 2 所示。 表1 - 2 大豆蛋白、7 s 球蛋白和1 1 s 球蛋白中疏水性氨基酸含量 t a b 1 - 2t h ec o n t e n to f h y d r o p h o b i ca m i n oa c i do f s o y b e a np r o t e i ni s o l a t e s ，7 sa n dl i sg l o b u l i n 由表l - 2 可以看出，大豆蛋白中疏水性氨基酸含量较7 s 和1 1 s 球蛋白多，而在后 两者蛋白中的含量相当。 1 4 课题立题意义和主要内容 研究表明活性肽的功能与其氨基酸组成及其排列直接相关，不同蛋白质的一级结构 潜在含有不同功能的活性肽片段。因此，在酶法水解蛋白质制备生物活性肽的过程中， 蛋白质原料的选择是生产相应功能活性肽的物质基础，而具有不同酶解位点的蛋白质水 解酶的选择是制备活性肽的关键。目前的研究现状是从大量的原料蛋白和蛋白酶中进行 筛选，工作量大，存在一定的盲目性与不确定性。随着蛋白质一级结构越来越清楚以及 生物活性肽研究的不断深入，建立了活性肽定量构效关系模型，利用现代生物学与计算 机科学，通过建立蛋白质、蛋白酶和活性肽数据库，利用程序语言编写酶解程序，达到 定向模拟酶解的功能，就可以有针对性的进行酶解，工作效率有一定程度的提高。其中， 蛋白质数据库以及活性肽数据库要及时更新，对使用系统定向酶解提供了更加可靠和广 阔的背景，定向酶解系统要做功能完善，对其可行性要做更深一步的探讨。 本课题在陈征松等人研究定向酶解制备活性肽的基础上，选择蛋白质一级结构较为 6 第一章绪论 清楚的大豆蛋白为研究对象，通过s w i s s p r o t 蛋白序列数据库网站获得大豆蛋白、 大豆7 s 和1 l s 球蛋白的氨基酸序列并补充到蛋白质数据库中，同时编写疏水性氨基酸 含量计算程序，得到各蛋白中所含疏水性氨基酸含量，对初步选择原料蛋白有一定的指 导意义，接着利用水解预测功能，通过与a c e 活性肽库中已证实具有a c e 抑制活性的 肽段对比，对模拟水解出的片段预测其潜在含有a c e 抑制肽的条数，并编写分子量计 算程序对水解出的各个片段的分子量进行快速计算，随后以大豆贮藏蛋白中的7 s 球蛋 白和大豆分离蛋白为蛋白源，以模拟水解后所含a c e 抑制肽条数最多的碱性蛋白酶和 胃蛋白酶+ 胰蛋白酶，后者为模拟人体胃肠道消化过程，进行实验水解，并通过理论水 解得到产物的重均分子量与实验水解所得产物的重均分子量进行相关性分析，得出两者 之间的相关系数，并将对最终实验水解物鉴定出的氨基酸序列反馈信息到蛋白质库和 a c e 抑制肽数据库中，对系统可行性做更深一步的验证。 课题主要内容 1 将大豆蛋白、大豆7 s 和1 1 球蛋白氨基酸序列补充到蛋白质数据库中，更新a c e 抑 制肽数据库以及添加常见的蛋白酶的水解位点到蛋白酶数据库。添加疏水性氨基酸含量 计算程序、双酶水解程序、预测潜在a c e 抑制肽程序和水解片段分子量计算程序到“定 向酶解制备活性肽分析系统 中。 2 以模拟水解时所得a c e 抑制肽片段较多的碱性蛋白酶和胃蛋白酶+ 胰蛋白酶，后者为 模拟人体胃肠道消化过程，对大豆分离蛋白与大豆7 s 球蛋白进行实验水解，就理论水 解所得产物与实验水解所得产物进行相关性分析。 3 对水解产物分离纯化，并通过氨基酸分析和质谱鉴定得到包含可能存在的a c e 抑制 肽的氨基酸序列，将信息反馈到蛋白质数据库以及活性肽数据库，以进一步验证系统的 可行性，为系统应用到实际应用提供有效依据 江南大学硕士学位论文 2 1 前言 第二章大豆贮藏蛋白数据库的建立 蛋白质经消化道酶的作用后，释放出大小不等的肽片段，这些小肽直接被肠道吸收， 其中许多肽具有生物活性作用，可以调节生理活动，例如抗高血压f 8 , 9 , 5 4 1 、免疫调节【2 ，3 1 、 抗血栓【4 ，5 】、阿片等 1 1 , 1 2 】。作为获得生物活性肽途径之一且安全的酶法水解，越来越受 到研究者的重视。由于活性肽的功能与其氨基酸组成及排列直接相关，不同蛋白质的一 级结构潜在含有不同功能的肽片段，因此，在酶法水解蛋白质生产生物活性肽的过程中， 蛋白质原料的选择和不同酶切位点蛋白酶的选择至关重要。随着生物信息学、免疫学的 发展及生物活性肽研究的不断深入，基于生物活性肽的氨基酸组成结构信息和不同蛋白 酶的酶切位点特异性，可以利用计算机定向模拟蛋白酶水解特定蛋白质，获得具有一定 生物功能的活性肽，研究者们正在这一方面做着努力的尝试，其中黎观红、乐国伟、旄 用晖、v a n e s s av e r m e i r s s e n 以及陈征松等都在试图寻找一种可以利用现代科学，建立蛋 白质、蛋白酶以及活性肽数据库，并利用计算机科学在蛋白酶数据库与蛋白质数据库之 间架起沟通的桥梁，进行模拟水解，理论寻找活性肽，指导实验，且均取得了一定成效。 本章在前人研究的基础上，更新大豆蛋白、补充大豆贮藏蛋白的氨基酸序列到蛋白 质数据库中，编写疏水性氨基酸含量计算程序、双酶水解程序、预测水解程序以及分子 量计算程序。 2 2 大豆蛋白数据库的更新及系统功能的完善 随着信息的不断更新，数据库在使用一段时间以后，要进行完善，特别是蛋白质数 据库和活性肽数据库。世界各地的研究机构每天都有学者做着蛋白质和基因的研究，新 的蛋白质序列在不断的被发现，所以蛋白质数据库需要不断地更新。由于大豆蛋白研究 较多，氨基酸序列研究也较为深入和清楚，故首先对大豆蛋白数据库进行更新。 国内外各种学术杂志上不断发表关于生物活性肽的文章，并且有很多是新发现的具 有某种生物功能的氨基酸序列，这就要求活性肽数据库也要不断的扩充。本课题就目前 研究较多的a c e 抑制肽为研究对象，对它的数据库进行更新。“定向酶法制备活性肽分 析系统在使用的过程中需要不断改进、修改存在的错误，增加新的功能，才能使程序 的功能越来越强大，最后能真正应用到实际水解蛋白质中。 2 2 1 大豆蛋白质数据库的完善 从s w i s s p r o t 5 1 】和g s c 5 5 1 等网站上收集大豆贮藏蛋白以及大豆蛋白氨基酸序列及其 相关信息，并把整理后的名称、链长、分子量、一级序列等信息导入蛋白质数据库。如 图2 一l 所示为进入蛋白质数据库的页面，其中添加了大豆7 s 球蛋白以及1 1 s 球蛋白， 并将大豆蛋白氨基酸序列进行更新，由原来的1 9 3 2 条更新到2 7 8 1 条( 此条数是截至网 第二章大豆贮藏蛋白数据库的建立 站数据库最新更新时间显示的内容) 目冒俸 刍 赶9 4 自| 刍4 ，- i ， 蔓【| 誓 固朗a * a 盈睦* 固月自 d & 固m k 巍憾n 睦& j 大米 j2 # 2 2 2a c e 抑制肽数据库的完善 图2 - 1 蛋白质数据库 f i 9 2 一it a t a b 黜o f p r o t e i n 从已公开发表的国内外文献资料中收集a c e 抑制肽的氨基酸序列、主要的理化性 质( 等电点) 、氨基酸构成等，并入a c e 抑制肽数据库，做到及时更新信息，为全面的 模拟水解提供条件。图2 - 2 为搜集到的部分a c e 抑制肽，目前为止，已从各种文献资 料中搜集3 9 9 条具有a c e 抑制活性的肚段。 纛 一 、i”og骜ii棼 鬣一簿j；|繁撼蒸黧 蟊 围2 之a c e 抑制肤数据库 f i g 2 2 a c e i n h i b i t o r y p e p f i d e sd a t a b a 魁 2 2 3 蛋白酶数据库的完善 从明尼苏达大学生物催化和生物降解数据库、酶命名数据库川、l i g a n d 数据 库 5 7 j 、限制酶数据库卯1 等网站收集蛋白质水解酶的系统名称、酶切位点、文献、名称、 来源、酶切位点、作用条件及其它相关信息等，其中包括胃蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋 白酶、酸性金属蛋白酶、中性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草芽孢杆菌 中性蛋白酶、蛋白酶k 、胰凝乳蛋白酶等，整理后导入蛋白酶数据库，并将各种蛋白酶 的酶切位点写入“定向酶法制各活性肚分析系统”程序中，使之具有相应蛋白酶的模拟 水解功能。如图2 - 3 所示为蛋白酶数据库 图2 - 3 蛋白酶数据库 f i g2 3t a l a b a s e o f p r o t e a s e 第二章大豆贮藏蛋白数据库的建立 2 2 4 系统功能的完善 在陈征松研究的“定向酶法制备活性肽分析系统一基础上，对系统的“模拟水解功 能进行如下完善 2 2 4 1 疏水性氨基酸含量计算程序 对已证实的a c e 抑制肽的统计分析可知，疏水性氨基酸残基所占比例大，且c 末 端的氨基酸是芳香族氨基酸或疏水性氨基酸残基，。其a c e 抑制活性较高j 故据此利用 v i s u a lb a s i c 编写疏水性氨基酸含量计算程序，即对疏水性值较大的丙氨酸( a l a ) 、缬 氨酸a 1 ) 、亮氨酸( l e u ) 、异亮氨酸( i l e ) 、脯氨酸( p r o ) 、苯丙氨酸( p h e ) 、色 氨酸( t r p ) 、蛋氨酸( m e t ) 和酪氨酸( t y r ) 九种氨基酸含量进行计算，可判断并初 步选择合适的蛋白质进行水解。 2 2 4 2 两种蛋白酶共同水解 计算机模拟水解不受温度以及p t q 的影响，在模拟复酶或者多种蛋白酶水解的过程 中，哪一种蛋白酶先水解蛋白质对模拟水解的结果没有影响，但是实际水解时如果两种 蛋白酶的最适温度、p h 不同，要单独水解，先后顺序不会影响最终产物。 模拟人体胃肠道消化过程，即以胃蛋白酶结合胰蛋白酶水解添加入系统的“水解酶 选择一中，其中先编写胃蛋白酶水解时酶切位点后编写胰蛋白酶的，编写好程序后，对 选择的目标蛋白质进行酶切，即把从蛋白质库中选中的蛋白质水解成肽段，随后升成结 果文件，保存在c 盘根目录下。 2 2 4 3 水解酶预测程序 对于经过蛋白酶水解的片段，以“当在二肽抑制剂n 末端以适当氨基酸延长时，所 得的相应三肽活性比二肽高”为理论依据，添加水解酶预测功能，此功能是将搿水解 得到的蛋白质肽段逐个与活性肽库中的肽段比对，如果肽库中已存在此相同的肽序列， 则作为“证实活性一输出；如果肽库中不存在此相同的肽序列，程序则根据该肽与已知 功能的活性肽序列重合度判断该肽是否可能含有该功能，但仅能作简单的对比，如两种 肽长短差别不多，而大部分都相同，则可以说两种肽功能相同，例如，a c e 抑制肽中 的r p f h p w 与r p f h p f ，r p w h p w 与r p i h p w 有一个氨基酸不同，却具有相同的功 能，故通过比对推测两种肽中大部分序列相同而仅仅部分不同，两者具有相同的功能， 这种与肽库中不同的肽序就作为“潜在活性输出，对选择蛋白具有一定的指导意义。 2 2 4 4 水解片段的分子量计算程序 通过系统模拟水解得到的众多肽段，如果手工计算，工作量非常大，但是通过编入 每一个氨基酸的分子量以及计算程序，批量计算每一条水解肽段的分子量，快速准确。 图2 4 所示为添加了上述四种功能后的“定向酶法制备活性肽分析系统”，页面简 单明了，功能更加完备。 图2 4 定向酶法制备活性肚分析系统 f i g 2 - 4 a i l a l y d c a ls y s t e m f o r a c t i v ep e p t i d e sp r e p a r e d w i t hd i r e c f i d e se n z y m e h y d r o l y z i n g m e t h o d 2 3 分析系统使用 以养麦为研究对象使用分析系统进行计算机模拟水解。 2 3 1 疏水性氨基酸舍量计算 利用“定向酶法制各活性肽分析系统”中的疏水性氨基酸含量计算程序分析荞麦， 从“蛋白选择”中选择“植物蛋白”中的“葬麦”，再点击“疏水性氨基酸含量计算” 按钮，即可进行计算，结果以文本文档形式保存在c 盘根目录下。结果如表2 - 1 所示， 从表中数据可以看出，养麦中疏水性氨基酸含量较高的为亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和 苯丙氨酸，这几种氪基酸的疏水性值分别为1 0l k j m o l 、1 24 f - j t o o l 、70 5f j m o l 和 1 1 i k j m o l ，由此可知养麦疏水性值较高，有可能含有的a c e 抑制肽较多。 表2 - l 养麦疏水- 眭氧基酸含量 t a b2 - i t h ee o n t e l l t o f h y d m p h o b i ca m i n oa c i do f b u c k w h e a t 2 3 2 蛋白酶模拟水解 从“定向酶法制各活性肽分析系统”中“水解酶选择”的复选框中选择蛋白酶，随 第= 章大豆贮藏蛋白数据库的建立 后进行“水解”，当水解完成后，进行“水解酶预测”。图2 - 5 为模拟水解的界面。当水 解结束后，生成各个蛋白酶水解后所得片段的文本文档，保存在c 盘根目录下。图2 - 6 所示为碱性蛋白酶水解养麦蛋白后所得的部分片段，图2 7 为根据水解片段及已证实 a c e 抑制肚所得到的预测结果。 图2 - 5 模拟蛋白醇水解过程 f i g2 5s i m u l a l i o n o f p t o t e 趣e 时d r o l y z e 誊豇一蠢+ “一， 二 瓣鬟篓。| $ * 月十镕e 镕np l 揪鼬8 警：弩；竺 出2 - 6 部升蛋白酶水解后献段 f i 9 2 s e g m e m o f p r o t e g e h v d r o l y z i n g 通过模拟各种蛋白酶水解荞麦蛋白 件进行汇总后，如表22 得到如下信息 目2 7 预测文档片段 f i 9 2 - 7 d 0 c u m e n ts e g m e m o ff o r e c a s t i n g 生成各个蛋白酶水解和预测的结果文件，对文 表2 - 2 模拟水解鲒果 t a b 2 - 2a b er e s u l t o f s i m u l a t i o nh y d r o l y z e 从表中可以看出，以嗜热菌蛋白酶水解产物中所含已证实a c e 抑制肽条数最多，胰 蛋白和木瓜蛋白酶的较少，但预测潜在活性的条数较多。 2 3 3 肤段分子量计算 以养麦蛋白的碱性蛋白酶水解物为例，做肽段分子量计算，并将结果保存在c 盘 根目录下，结果如图2 - 8 所示，计算每条水解片段的分子量，快速准确。 目一昌鐾。誉i 黪鏊誊。4 篱l陆g 嚣o 静嚣；：要i 图2 8 水解h 段分子量计算 f i 9 2 8 m o l e c u l 盯w e l g h tc a l c u l a t eo f h y d r o l y z e ds e g m e n t s 2 4 本章小结 1 添加大豆7 s 球蛋白和1 1 s 球蛋白氨基酸序列到蛋白质数据库，并对大豆蛋白氨基酸 ， l 口m l lh!oo u 第二章大豆贮藏蛋白数据库的建立 序列进行更新，补充蛋白酶数据库以及更新a c e 抑制肽数据库。对信息达n t 及时更 新，及时完善的目的。 2 添加并编写疏水性氨基酸含量计算程序、双酶水解的程序，以及蛋白酶预测程序，使 “定向酶法制备活性肽分析系统一更加完备，对更加有针对性的选择蛋白酶以及选择何 种酶有一定的指导意义。 3 完成了水解片段分子量计算程序，对水解后的每条片段进行分子量的计算，达到省时、 准确的作用。 4 以荞麦蛋白为例，使用分析系统模拟水解。 江南大学硕士学位论文 3 1 前言 第三章大豆蛋白定向酶解及其相关性分析 蛋白质是人类饮食结构的重要成分，在人体的新陈代谢中具有极为重要的生理功 能。随着营养学的发展，传统认为的蛋白质在体内是经体内蛋白酶水解出氨基酸形式被 吸收的理论得到进一步更新，近年来的研究成果表明，蛋白质在体内消化并不是完全以 氨基酸形式吸收，还有短肽形式，且其消化吸收性能明显优于单个氨基酸。这些被成为 生物活性肽的物质除具有营养功能外，还具有广泛的生理调节功能，如促进钙吸收、降 血压、降低胆固醇、免疫调节等。在生物活性肽的研究中，由于血管紧张素转化酶 ( a n g i o t e n s i o n - c o n v e r t i n ge n z y m e , a c e ) 抑制肽对高血压患者具有降压作用但对正常血 压者无影响，a