（蔬菜学专业论文）番茄叶片和果实中糖代谢及其遗传研究.pdf

摘要 本实验选择由中国农业大学农学与生物技术学院蔬菜系经多代自交育成的6 个无限生长的大 果型鲜食番茄品系，在叶片和果实生长发育过程中测定蔗糖、果糖、可溶性总糖和淀粉的含量以 及与蔗糖代谢相关的蔗糖磷酸合成酶( s p s ) 、蔗糖合成酶( s s ) 、酸性转化酶( 越) 、中性转化 酶( n i ) 的活性，分析叶片与果实生长发育过程中糖的代谢与番茄产量和品质的关系。同时利用 这6 个品系配杂交组合，研究糖和蔗糖代谢相关酶的遗传特性。结果表明： 1 、淀粉、蔗糖、总糖的含量在幼叶期较高，之后含量下降功能叶时期含量回升；而果糖 在幼叶时含量最高，之后下降，并维持在较低的水平。在叶片生长过程中s p s 和s s 的活性幼叶 期较低，功能叶时期最高；a i 和n i 的活性前期较低，在叶片老化期迅速升高。 2 、存番茄果实的生长发育过程中果糖和总糖的含量和n l 的活性逐渐增加；而淀粉的含 量和s s 、s p s 的活性则为逐渐下降。 3 、品种间单果重与果实生长发育的前四个时期时果糖含量分别存在显著负相关；单果重、 小区产量与果实迅速膨大期叶片和果实之间蔗糖浓度梯度显著正相戈。单果重和小区产量与糖代 谢的其它指标只在个别时期有相关性。 4 、番茄果实中果糖含量的一般配台力效应值在0 4 9 3 5 0 4 3 9 7 之间，其中亲本3 和4 的一 般配合力效应值为最高：特殊配合力效应值在一0 4 9 8 0 4 3 3 之间，其中s * 的特殊配合力效应值 最高。番茄果实中果糖含量的广义遗传力为8 5 8 ，狭义遗传力为6 7 9 。 5 、番茄果实中a i 的活性一般配合力效应值在04 8 0 0 3 4 5 之间，其中亲本3 、4 的一般配 合力效应值最高；特殊配合力效应值在一0 1 9 0 0 ，2 4 0 之间，其中s z t 的特殊配合力效应值较高。 番茄果实中a i 活性的广义遗传力为3 6 8 ，狭义遗传力为2 1 7 。 关键词：番茄，叶片和果实，糖代谢，遗传 a b s t r a c t t h i sd i s s e r t a t i o nu s e ds i xr e di n d e t e r m i n a t et o m a t ol i n e sf r o ma g r o n o m ya n db i o t e c h n o l o g y c o l l e g eo fc a u ，w h i c hh a v eb e e nf i x e db ys e l l i n gs e v e r a lg e n e r a t i o n s i no r d e rt oa n a l y z et h er e l a t i o n b e t w e e ns u g a rm e t a b o l i s ma n dt h eo u t p u q u a l i t yo ff r u i t , w ed e t e c t e dt h ec o n t e n t so fs u g a ra n dt h e a c t i v i t yo fs s ，s p s ，a i ，n i w ea l s os t u d i e dt h ei n h e r i t a n c eo fs u g a rc o n t e n t sa n dt h ea c t i v i t i e so f e n z y m e so fs p s ，s s ，a 1 ，n iu s i n gt h es i xl i n e sa sp a r e n t s n er e s u l t sa sf o l l o w i n g ： 1s u c r o s e ，s t a r c ha n dt o t a ls u g a rh a v eh i g h e rc o n t e n t si nt h et o m a t oy o u t hl e a v e s ，a f e rd e c r e s i n g t h e yi n c r e a s ei nt h ef u n c t i o n a ll e a v e s w h n et h ec o n t e n to ff r u c t o s ei sh i g h e s ti nt h ey o u t hl e a v e s t h e n i td e c r e a s e sa n dm a i n t a i n si nal o w e rl e v e l t h ea c t i v i t i e so fs p sa n ds sa l el o w e ri nt h ey o u t hl e a v e s a n dh i 【g h e s ti nt h ef u n c t i o n a ll e a v e s 1 r h ea c t i v i t yo fa 1a n dn ia nl o w e ri nt h ee a l i e rp h a s eo fl e a v e s d e v e l o p m e n t ，a n dc r e a s e dg r a d u a l l yi nt h ee l d g eo f l e a v e w s 2t h ec o n t e n t so ff r u c t o s e ，t o t a ls u g a ra n dt h ea c t i v i t i e so fa i ，n ii n c r e a s eg r a d u a l l yi nt h e d e v e l o p m e n to ft o m a t of r u i t s a tt h es a n l et i m e ，t h ec o n t e n to fs t a r c ha n dt h ea c t i v i t i e so fs sa n ds p s d e c r e a s eg r a d u a l l yi nt h ed e v e l o p m e n to f t o m a t of r u i t s 3t h ew e i g h t sp e rf r u i ti nt h el i n e sh a v es i g n i f i c a n tn e g a t i v er e l a t i o n s h i p sw i t ht h ec o n t e n t so f f r u c t o s ei nt h ef 0 曲p h a s eo ft o m a t od e v e l o p m e n t t h e r ea r es i g n i f i c a n tp o s i t i v er e l a t i o n s h i p sb e t w e e n t h ew e i g h t sp e rf r u i t ，t h eo u t p u tp e rb l o c ka n dt h es u c r o s e sg r e n t so fl e a v e sa n df r u i t si nt h ep h a s eo f f r u i ts w e l l i n gq u i c k l y t h e r eh a v ec o r r e l a t i o n sb e t w e e nt h ew e i g h tp e rf r u i t ，t h eo u t p u tp e rb l o c ka n d o t h e r si n d e x e so fs u g a rm e t a b o l i s mo n l yi nt h es e p a r a t ep h a s oi nt h et o m a t od e v e l o p m e n t 4t h eg e n e r a lc o m b i n i n ga b i l i t yo ff r u c t o s eo ft o m a t of r u i ta m o n g - 0 4 9 3 5 0 4 3 9 7a n dt h ep a r e n t 3a n d4h a v et h eb e s tg c a ，t h es p e c i a lc o m b i n i n ga b i l i t yb e t w e e n - 0 4 9 8 0 4 3 3 ，t h e $ 4 6h a v et h eb e s t s e a ，t h eb r o a ds e n s eh e r e d i t a b i l i t yo f f r u c t o s ei nt o m a t of r u i ti s8 5 8 ，t h en a r r o ws e n s e b e r e d i t a b i l i t yi s6 7 9 5t h eg e n e m lc o m b i n i n ga b i l i t yo f a ii nt o m a t of r u i ta m o n g - 0 4 8 0 0 3 4 5a n dt h ep a r e n t3a n d4 h a v et h eb e s tg c a ，t h es p e c i a lc o m b i n i n ga b i l i t yb e t w e e n - 0 1 9 0 0 2 4 0 , t h es 2 4h a v et h eb e s ts c a t h eb r o a ds e n s eh e r e m t a b f l i t yo f a ii nt o m a t of r u i ti s3 6 8 t h en a r r o ws e n s eh e r e d i t a b i l i t yi s2 1 7 k e yw o r d s ：t o m a t o ( l y c o p e r s i c u me s c u l e n t u mm i l l ) ，l e a v e sa n df r u i t s ，s u g a rm e t a b o l i s m , h e r e d i t y 缩略词 a d p g 腺苷二磷酸葡萄糖 d l a p 磷酸二羟丙酮 e d t a 乙二胺四乙酸 r u b p l 5 一二磷酸核酮糖 u d p g 尿苷二磷酸葡萄糖 b s a 牛血清蛋白 d t t 二硫苏糖醇 f b p 二磷酸果糖 g l y 甘氨酸 i v r 转化酶 l y s 赖氨酸 p v p 聚乙烯吡咯烷酮 p g a 3 一磷酸甘油酸 s e t 丝氨酸 s p p 磷酸蔗糖磷酸化酶 s p s 蔗糖磷酸合成酶 a i 酸性转化酶 n i 中性转化酶 s s 蔗糖合成酶 独创性声明 y 7 7 4 3 4 3 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：雳i 以萄时间：2 ，卵t 年乡月j 7 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：刻以葡时间：砂j 年z 月 导师签名： 膨 时间： 知鑫6 月 7 日 中国农业大学硕士论文 第一章前言 1 1 研究意义 第一章前言 叶片是进行光合作用、合成光合产物的主要器官，作物要有较高的产量不仅要求功能叶具有 较强的光合能力，而且要求叶片中的光合产物能有效的进行运输和分配，也就是说作物的经济产 量不仅取决于同化物的多少，而且取决于同化物向产品器官运输和分配的量。所以研究同化物的 运输与分配不仅具有理论意义，而且具有重要的实践意义。 蔗糖是植物光合作用的产物，是植物体内碳水化合物运输的主要形式。蔗糖代谢影响着光合 同化产物的分配运输、果实的膨大与生长速率，进而影响着作物的产量与品质。植物细胞中蔗糖 合成与降解的平衡主要依赖于蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶和转化酶三种酶的协同作用。国内外 在蔗糖代谢方面作了大量的研究工作：国内的研究重点在小麦“。“、水稻”。、甘蔗”和果树。“ ”甘薯”1 中上，在蔬菜上研究较少，相关研究主要集中在马铃薯”1 、番茄“上。国外的研究开始 的较早，对蔬菜作物蔗糖代谢的研究较多，主要集中在菠菜”“”1 、番茄“上，但是对番茄蔗糖 代谢的研究侧重于对番茄品质( 主要是糖) 的影响，对于糖代谢对产量的影响研究的也较少。其 中对野生番茄果实内糖的代谢研究较深入，但在栽培番茄中的代谢和应用研究较为薄弱。番茄叶 片和果实中糖的代谢影响到番茄植株的生长和果实的生长发育；番茄果实中的糖，作为果实内部 的储存物质，最后影响到果实的甜度、糖酸比，进一步影响到番茄果实的风味，最终影响到果实 的产量和品质。因此本实验以叶片和果实不同生长发育时期的糖代谢为出发点，研究糖代谢与番 茄产量和品质的关系以及遗传特性，为番茄高产优质育种提供理论依据。 1 2 番茄果实中的糖 1 2 1 番茄果实中糖的种类和分布 番茄果实细胞的中央大液泡占细胞体积的8 0 - 9 0 ，它是果实中可溶性糖的主要储存场所。 成熟番茄果实中全糖含量约占鲜重的3 ，占到番茄干物质重的5 0 左右，丈部分为果糖和葡萄 糖( 还原性单糖) ，还有部分的蔗糖( 双糖) 。葡萄糖和果糖二者所占的比例相似，总和可以r i 到 可溶性固形物的7 5 t x 5 1 。尽管蔗糖是碳水化合物在植物体内进行长距离运输的主要形式，但是 在成熟番茄果实中所占的比例相当少，一般认为占到干物质重的5 左右1 1 “。番茄果实中不同部 位糖的种类和含量不同，在花梗和果柄维管束中主要含有蔗糖，而果实的其它部位则主要含有葡嫡 糖和果糖；在果皮组织和果实维管束中葡萄糖和果糖含量较高，果胶质和隔壁中含糖量较低【l 。 1 2 2 番茄果实中糖的积累和功能 不同番茄品种成熟时积累不同比例的糖分：栽培品种一般积累葡萄糖和果糖为主。但积累果 糖与葡萄糖的比例也不相同；有的野生番茄种类( 厶c h m j e l e w s k i i ) 积累蔗糖的比例较大。积累 不同种类的糖分对番茄有不同的作用。由于果糖的甜度是葡萄糖的两倍，因此改变果实中果糖与 葡萄糖的比率就可以改变果实的风味。蔗糖的积累对番茄的作用就更重要了。首先由于蔗糖在代 谢时依赖较少的酶，所以有较低的生物学活性，可以在植物体内快速的改变其含量。蔗糖降解后 为果糖和葡萄糖“”，冈此积累蔗糖与积累其他单糖相比可以在短时间内就能达到快速改变渗透势 的目的。由此可见积累较多的蔗糖，可以提高品种在抗逆方面( 高、低温胁迫) 的能力。另外蔗 糖是高等植物光合作用的主要产物，是碳水化合物运输的主要形式，是“库”代谢中的主要基质 “。蔗糖也是许多果实中糖积累的主要形式，是果实品质形成的因子。此外，它还是细胞代谢的 调节因子，可能通过影响基因表达发挥作用”。k o c h ”和s m e e k e n s ”提出在植物体内运输的蔗 糖具有信号功能，可以使一些基因被诱导，使另外一些基因被阻遏。过高浓度的蔗糖，在“源” 中导致与光合作用相关的一些基因表达水平降低，在“库”中可以使与蔗糖水解、植株生长和呼 吸相关的基因提高表达水平。 1 3 蔗糖代谢关键酶与番茄糖代谢 目前许多研究者在研究植物体内糖分含量和种类的同时，对能够调节蔗糖代谢的酶也进行了 更为深入的研究，现在已经进入了分子水平。番茄果实中的糖代谢总体要经过三个阶段：蔗糖在 “源”即叶片中的合成、蔗糖的运输和蔗糖在果实内部的代谢。蔗糖从叶片内合成到进入果实代 谢具体经历了下列复杂的过程：( 1 ) 叶绿体同化c o 。生成磷酸丙糖；( 2 ) 磷酸丙糖经磷酸丙糖转运 蛋白( t r o i s ep h o s p h a t et r a n s l o c a t o r , t p t ) 介导运输到叶肉细胞的细胞质中；( 3 ) 在细胞质中合成 蔗糖；( 4 ) 合成的蔗糖经短距离运输到韧皮部地装载区；( 5 ) 蔗糖装载入韧皮部；( 6 ) 蔗糖在筛 管中长距离运输；( 7 ) 蔗糖从韧皮部卸出；( 8 ) 蔗糖经韧皮部后运输( p o s t p h l o e mt r a n s p o r t ) 进 入果实代谢和储藏牡2 1 ，这些步骤相互关联，相互协调( 图卜1 ) 。与蔗糖代谢有重要关系的酶主要 有蔗糖磷酸合成酶( s p s ) 、转化酶( i v r ) 和蔗糖合成酶( s s ) 三种。 1 3 1 蔗糖磷酸合成酶 1 3 1 蔗糖磷酸合成酶简介 蔗糖磷酸合成酶( s u c s e p h o s p h a t es y n t h a s e ，e c 2 4 1 1 4 ) 是一种存在于细胞质中的可溶性酶， 催化反应的最适宜p h 值约为7 0 。同时s p s 在光合组织和非光合组织中均具有活性，但却是一 种低丰度的可溶性蛋白，含量不到可溶性蛋白的o 1 ，并且相对不稳定。s p s 催化如下可逆的 反应：u d p g + 6 - 磷酸果糖j 两一磷酸蔗糖+ u d p 。上述反应的生成物6 一磷酸蔗糖通常由s p p ( 磷酸蔗糖磷酸化酶) 迅速降解成蔗糖和磷酸根离子；而s p s 和s p p 又是以复合体的形式存在于 2 图1 1 蔗糖的合成与转运过程 f i g 1 - 1 t h e p t o c e a s o f s u c x o s es y n t h e s i z i n g a n d t r a n s p o r t i n g a d p g ：腺苷二磷酸葡萄糖d f l a p ：磷酸二羟丙酮p g a ：3 - 磷酸甘油酸s p s ：蔗糖磷酸合成酶s s ：蔗糖合成酶f ： 果糖g ：葡萄糖f b p ：二磷酸果糖r u b p ：1 ，5 - 二磷酸核酮糖 研究者九十年代初在菠菜和玉米中纯化了s p s ，它由分子量1 1 7 k d - 1 3 8 k d 的眶基构成，为 二聚体或四聚体。在1 9 9 1 年玉米1 2 4 1 中s p s 的c d n a 被克隆之后，菠菜、柑桔、苹果、甜菜、水 稻中的s p s 基因也相继被克隆。这些基因片断有较高的l 面源性：菠菜与烟草之间的s p s 有7 5 的同源性，菠菜与玉米之间的s p s 有7 4 的同源性，烟草与玉米之间的s p s 在多肽水平上也有 5 4 的同源性。 s p s 的活性在光下和夜里有明显差别，能够进行光丑音调节，主要的调节方式有以下儿种：( 1 ) 调节位点磷酸化陋j 。菠菜叶片s p s 中s e r l 5 8 位点磷酸化为其失活的有效特征同时也是必需特征， 玉米中的s p s 的调节位点为s e r l 6 2 。尽管不同作物中的s p s 调节位点磷酸化区域虽然不完全保 守，但调节区域都有相似的s e r 残基，这些区域可能在激酶蛋白的识别上起作用；( 2 ) s p s 激酶 调节口“。用基于磷酸化位点区域合成所的肽，通过层析可以从菠菜叶片中分离出两个s i s 的激酶 蛋白体，大小分别为4 5 k d 和1 5 0 k d 。小激酶可能由单亚基组成，而大激酶则有一个6 5 k d 的亚 基，他们的不同之处在小激酶对c a 2 + 有很强的依赖性，大激酶则对c a 2 + 独立。在玉米叶片中s p s 的活性依赖于细胞质c a 2 + 浓度，浓度越低酶的活性就越高，c a 2 浓度白天比夜间低；( 3 ) s p s 蛋 白焦磷酸化 z 7 1 。p h o s p h o s p s 通过类2 a 蛋白磷酸酶( s p s - p p ) 去磷酸化和激活，s p s 。p p 受 到p i ( 无机焦磷酸离子) 的抑制。菠菜叶片中s p s - p p 在光中明显激活，在p i 抑制时明显活性降 低。 1 3 1 2 蔗糖磷酸合成酶与番茄糖代谢 蔗糖的最初生物合成是在光合组织中，光合作用的直接产物磷酸丙糖有两个主要流向啪l ： 3 中国农业大学硕上论文第章前言 ( 1 ) 在叶绿体内转化为淀粉暂时储存起来；( 2 ) 进入细胞质中合成蔗糖，进行长距离运输。光 合组织中的蔗糖生物合成主要是靠细胞质中的蔗糖磷酸合成酶( s p s ) 来完成，因此s p s 可以通 过影响光合产物的分配进而影响整个植株的生长发育。目前为了在研究中能有效的发现这种酶的 作用，许多研究者利用转基因的手段来做实验。在转基因( 玉米s p s 基因) 番茄中的研究发现：叶 片中s p s 的活性增加与光合所需的光和c 0 2 的吸收率的升高相关，并且和蔗糖对淀粉的比值有 明显的正相关，可以提高光合固定的c 向蔗糖转化的比例【捌。在转基因番茄的研究中还发现，在 利用只能在叶片中表达的启动子( r u b i s c os m a l ls u b u n i tp r o m o t e r ) 的时候，s p s 的过量表达可以使 果实的发育提前，但并没有增加果实的干重。在利用能够在光合和非光合组织中都可以持续表达 的启动子( 3 5 s c a m vp r o m o t e r ) 进行转基因研究时发现，不仅可以使果实的发育提前，还可以增 加果实的生长量。在研究转基因番茄的时候还发现，s p s 的过量表达可以影响到碳水化台物的分 配，使分配进入根部的蔗糖减少，使得根冠比减小，这时的根冠比与叶片中的s p s 活性大小有显 著负相关关系m 】。因此高s p s 活性可以增加番茄在最适宜条件下的光合效率，同时光合产物向其 他组织进行长距离运输的蔗糖也能够增加，有增加产量的潜力。 番茄果实成熟过程中蔗糖的积累和s p s 活性的升高密切相关。据m t o n ”j 报道：成熟实用番 茄果实中蔗糖的含量不超过1 5 m m g f w , 其s p s 的活性在整个果实发育过程中都很低；而在蔗糖积 累型的番茄成熟果实中蔗糖含量约为1 1 8 m m g f w ，其s p s 的活性在果实发育末期约为前期的8 倍。但同时还要伴随着转化酶活性的消失。 1 3 2 蔗糖合成酶 1 3 ，21 蔗糖合成酶简介 蔗糖合成酶( s u c r o s es y n t h a s e , e c 2 。4 1 1 3 ) 是一种存在于细胞质中的可溶性酶，有些不 溶性的s s 附着在细胞膜上。植物生长发育中s s 既可以催化蔗糖合成反应又可以催化蔗糖分解反 应：栗糖+ u d p g 一蔗糖+ u d p ，催化蔗糖合成的最适p h 值为8 o 一9 5 ，催化蔗糖分解的最 适p h 值为5 5 6 5 。但通常研究者认为s s 主要起分解蔗糖的作用，为细胞壁提供合成底物和合 成淀粉，s s 的活性在合成淀粉或是细胞壁的组织中最高1 3 2 j 。 s s 是一个由分子量为8 3 - - 1 0 0 k d 的亚基构成的四聚体p 3 】。目前研究者已经从马铃薯i 、甜 菜、胡箩 、甘蔗等几十种植物中将s s 基因克隆出来。s s 基因( s u s ) 的大小约为5 9 k b ，e d n a 的长度约2 7 k b ，编码约8 2 0 个氨基酸，分子量约为9 4 k d 的蛋白质。由一对等位基因组成，但在 有些植物中是一对非等位基因组成。s s 基因的表达调节在转录水平和转录后水平上，s s 基因启 动子有一个高的组织表达特异性。番茄果实中主要的s s 是t o m s s f 基因家族的表达产物，这种 酶至少在两个不同的位点上高度磷酸化，通过磷酸化来调节亚基的不同构像。 由于蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶都能够催化蔗糖的合成，因此他们二二者在蛋白结构上必然 有很多的相似之处。一般情况下s p s 的n 端大约有1 2 0 k i ) 的氨基酸残基是高度保守的，但在s p s 和s s 之间有两个高度相似的区域p 5 j 。一个结构相似的区域在从v 1 7 6 到$ 2 1 4 之间的3 9 个氨基 酸，他们有6 4 的相似性，此片断内有一个1 1 个氨基酸的区域( 在菠菜s p s 中为d 1 9 7 到e 2 0 6 ) 与富含g l y 的磷酸化结合位点相近。这中间的1 0 个氨基酸残基完全相同，只有在2 0 3 位上s p s 4 中国农业大学硕士论文第一章前言 是l y s 但在s s 上是v a l 。这个相似的区域很有可能在选择性接收f 6 p 或u d p g 而并非结合d - f 上有重要功能。另外一个相似的区域位于s s 的c 端( s p s 为d 5 8 7 - p 6 3 1 ) ，其中有2 5 氨基酸个残 基相同，8 个残基相似，总相似度为7 5 ，但是这一端的具体功能还没有搞清楚。 1 3 2 2 蔗糖合成酶与番茄糖代谢 光合“源”中生成的蔗糖要顺利的进行分配，还要取决于番茄果实这个“库”在营养竞争方 面的能力。蔗糖向果实进行卸载需要有一个蔗糖浓度梯度，这个梯度有人发现与番茄果肉中与细 胞壁结合的转化酶有很大关系。此酶可以水解由韧皮部卸出的大部分蔗糖，造成韧皮部与番茄果 肉中的蔗糖浓度有一个较大的顺差梯度，利于蔗糖向番茄果肉的运输p q 。但是输入番茄果实的蔗 糖的数量却与s s 的活性有很大关系，而与转化酶的活性关系不大p ”。在利用蔗糖合成酶反义基 因技术时，发现在s s 的活性受到抑制的情况下蔗糖卸载到番茄果实的量在花后的2 3 天之后没有 下降，但是在开花后的第一周内蔗糖的卸载量却明显低予正常番茄，并且转基因番茄的坐果率明 显低于对照1 3 8 1 。因此认为在番茄果实发育早期，s s 控制着向果实卸载蔗糖的能力。 1 3 3 转化酶 1 3 3 1 转化酶简介 转化酶( i n v e r t a s e ，e c 3 2 1 2 6 ) ，又称蔗糖酶或1 3 一呋喃果糖苷酶。在蔗糖代谢中催化如下反 应：蔗糖+ 啦o 一果糖+ 葡萄糖。转化酶包括酸性转化酶( a c i di n v e r t a s e , a i ) 和中性转化酶( n e u t r a l i n v e r t a s e ，n i ) ，也有报道碱性转化酶的存在【3 q ，但许多报道均将中性转化酶同碱性转化酶看作同 一种转化酶。舢催化反应的晟适宜p h 值在3 o 一5 o 可以分为可溶性的越和不溶性的a l ，前者 分布在液泡中或细胞自由空间内，后者存在于细胞间隙中并结合在细胞壁上【柚l 。n i 催化反应的 最适p h 值在7 0 左右，大多认为它是一种胞质酶。现在对转化酶的分子方面的研究主要集中在 a j 上，而对n i 的报道则比较少。 据人多数研究者的报道，转化酶的分子量大小从5 0 k d 到8 0 k d ，为单一或二聚体。唐云明 1 8 1 等报道在甘薯的叶片中纯化了转化酶，全酶的分子量为7 9 4 k d ，由2 个相同的弧基组成。在胡 萝h 4 1 1 中发现了a i 的两个同工酶，分子量分别为6 1 0 k d 和4 9 0 k d 的2 条多肽。在成熟番茄果 实中e n d o 4 2 | 等检测到一条分子量为7 4 0 k d 的蛋白，是a | 的前体。番茄l y c o p e r s i c o ne s c u l e n m m 成熟果实中的a i 的主要形式是一段分子量为5 2 o k d 的糖蛋白，对应的m r n a 在番茄栽培种果 实中表现丰度高而在番茄野生种( 蔗糖积累型) l c h m i e l e w s k i i 果实中未检测到，相应的e d n a ( t i v i ) 已经被克隆。目前转化酶的基因已从番茄、胡萝h 、玉米、马铃薯、甘蔗、葡萄等作物 中被克隆到。 1 3 3 2 转化酶与番茄糖代谢 在番茄果实内蔗糖代谢的关键酶中酸性转化酶的活性福对较高，高活性的酸性转化酶主要为 5 中国农业人学硕士论文第一章前言 快速生长的组织提供己糖碳源1 4 3 l 。大约9 0 的酸性转化酶为可溶性，绝大多数存在于液泡中， 只有1 0 存在于细胞壁中。在液泡中存在的主要为六碳糖，由细胞间隙输入的蔗糖可能受到细胞 胞壁结台酸性转化酶的调节( y d l ee ta 1 ，1 9 8 8 ) 。蔗糖向果实进行卸载需要有一个蔗糖浓度梯度， 这个梯度有人发现与番茄果肉中与细胞壁结合的转化酶有很大关系。此酶可以水解由韧皮部卸出 的大部分蔗糖，造成韧皮部与番茄果肉中的蔗糖浓度有一个较大的顺差梯度，利于蔗糖向番茄果 肉的运输。在果实快速生长过程中，酸性转化酶活性的快速升高可能在某种程度上影响着整体输 入的蔗糖( d e m l l i t z - k i n ge ta 1 ，1 9 9 7 ) 。液泡中的存在的主要糖为六碳糖，液泡中的转化酶可以调 节蔗糖和己糖的储存。o h y a m a 等m 1 报道反以转化酶基因的表达抑制了转化酶的活性，从而引起 了番茄果实内蔗糖的积累。k l a n n 等m j 等研究发现，在番茄果实发育期间，酸性转化酶反以基因 转化的果实中蔗糖含量约为对照的5 倍而果糖和葡萄糖的含量约为对照的5 0 ，这表明可溶性 酸性转化酶的活性控制着番茄果实中糖分的组成。 1 3 4 蔗糖进入番茄果实途径 糖经筛管从叶片长途运输到果实后，从筛管，伴胞( s e ，c c ) 复合体卸载到果实内。韧皮部卸 载有两条细胞学途径：一条为质外体卸载，即蔗糖和戚山梨酵糖从筛管伴胞复台体卸载到质外空 间，然后通过库细胞质膜上的载体或质子泵( h + - - a t p a s e ) 进入库细胞；或是在细胞壁转化酶的 作用下分解为果糖和葡萄糖，再通过库细胞质膜上的己糖载体进入库细胞；进入库细胞后来经细 胞壁转化酶分解的可能以蔗糖的形式直接进入液泡，进入液泡后或是被液泡酸性转化酶分解为果 糖和葡萄糖或仍以蔗糖形式储存：经细胞壁转化酶分解所产生的果糖和葡萄糖可能再合成或不合 成蔗糖直接跨液泡膜在液泡中积累。另一条为共质体途径卸载，即糖通过筛管伴胞复台体与周围 韧皮部薄璧细胞间的脆间连丝运输到库细胞，达库细胞届蔗糖迅速合成为淀粉或被分解用于功 能和组织构建，以保持浓度梯度。 根据解剖学结构观察和共质体、质外体染色的研究发现，糖向果实中转运的途径主要有两条 【删：( 1 ) 从授粉受精之e t 到3 0 3 5 天这个果实快速生时期内，由于此时果实快速生长，蔗糖进 入果肉细胞时是不分解的直接经过共质体进行运输，此期内蔗糖卸载的能力与s s 的活性相关； ( 2 ) 从授粉受精后3 5 天左右到果实成熟这段时间，此期果实膨大速率减慢，干物质积累减少， 这段时间内蔗糖向果肉卸载是经过质外体进行的，经过一段较短的稳定期之后，就被酸性转化酶 进行了快速分解。 番茄在发育早期主要积累淀粉，筛管和伴胞之间以及伴胞和周围韧皮薄璧细胞之问存在大量 的胞间连丝，蔗糖的卸载以共质体途径为主导；但到发育后期番茄果实内大量积累高渗透性的己 糖( 果糖和葡萄糖) ，韧皮薄璧细胞之间的胞间连丝数量下降，胞间隙扩大，质膜的表面积增加。 为了防止重新转载到筛管中，保持卸载端与库细胞间的浓度梯度，卸载途径改为质外体途径 4 7 1 。 1 3 5 糖在番茄果实内部的循环代谢 在很多情况下，s p s 的活性和转化酶活性阻及s s 的分解活性同时测到，所以有相当一部分 学者对植物体内是否存在一个蔗糖代谢的“无效循环”并不清楚。q u o c 和f o y e r 4 s 1 提出的模型 6 中国农业大学硕士论文 第一章前言 认为，番茄果实中存在4 个主要的“无效循环”( 图1 - 2 ) 。 第一个循环：s s 分解胞质中蔗糖，而s p s 重新合成蔗糖。 第二个循环：蔗糖在液泡中被转化酶分解，而在胞质中被s p s 和s s 重新合成。 第三个循环：蔗糖在质外体中被转化酶分解，随后被s p s 和s s 重新合成。 第四个循环：造粉体中淀粉持续的合成和分解以及与胞质中六磷酸葡萄糖的联系。 图卜2 番茄果实蔗糖代谢中4 个主要“无效循环”模型 f i g 1 - 2 m o d e lo f t h ef o u rp r i n c i # f u t i l ec y c l e i n v o l v e di ns t t c f o s em e t a b o l i s mi nt o m a t o 自口i b g ：葡萄糖f ：果糖a d p g ：腺苷二磷酸葡萄糖g l p ：1 一磷酸葡萄糖p 争p ：六磷酸麓萄糖u d f g ：尿苷二磷 酸葡萄糖s s ：蔗糖合成酶s p s ：蔗糖磷酸合成酶f 一6 _ p ：六磷酸果糖f i ，6 b p ：1 ，6 t 二磷酸果糖 1 4 糖及酶活性的遗传研究 国外在研究蔗糖代谢遗传规律方面，都集中在酶分子水平和基因水平，国内也有些相关的报 道。有报道指出，发育的番茄果实中蔗糖积累特性由单个隐性基因控制并且同低水平的 j 蛋白 相关【4 9 】。s s 基因由一对等位基因组成，但有些植物中则是由一对非等位基因组成。h a r a d a l 5 0 1 等 发现s s 基因本身不与蔗糖积累相联系。 中国农业大学硕士论文 第一章前言 但蔗糖代谢遗传在育种方面的应用性研究很少。s e r g e 等p l j 在研究蔗糖积累特性的遗传规律 时，用l y c o p e r s i c o ne s u l e n t u m ( 己糖积累型1 和l y c o p e r s i c o nc h m i e l e w s k i i ( 蔗糖积累型) 杂交， 发现 f 1 代杂交种均表现为己糖积累型，表明由隐性基因控制着蔗糖的积累。在f 2 代杂交种中，蔗糖 积累型与己糖积累型植株的分离比例位1 4 ：1 。取f 2 代中的蔗糖积累型植株，自交、与两亲本回 交分别产生f 3 、b c l p l 和b c i p 2 。在f 3 代中，所有植株的蔗糖含量均高于己糖，总糖量与蔗糖 积累型的亲本相似。这表明蔗糖的积累特性可以稳定的转育到栽培番茄中。同时测定b c l p 2 中 两种类型植株在果实发育过程中转化酶和蔗糖合成酶的活性，发现己糖积累型植株中转化酶和蔗 糖合成酶的活性多相当高，而蔗糖积累型具有高的蔗糖合成酶和低的转化酶活性。 8 中国农业大学硕士论文 第二章材料与方法 2 1 实验材料与取样 第二章材料与方法 实验采用六个番茄品系，是中国农业大学农学与生物技术学院蔬菜系自行选育的高代自交 系，均为无限生长的大果型鲜食番茄。实验材料的初步筛选是在2 0 0 3 年秋季进行，在2 8 个品系 中用果糖和蔗糖的含量进行初步筛选，选择出果糖的含量高( 1 6 号、1 8 号品系) 、中( 1 7 号、1 9 号品系) 、低( 2 0 号和2 1 号品系) 共6 个品系。2 0 0 4 年早春试验材料种植于河北省固安育种基 地的日光温室中，2 0 0 3 年1 1 月1 5 日播种，2 0 0 4 年1 月2 5 日定植。单干整枝，栽培管理方法按 常规进行。随机区组设计，三次重复，每个小区为3 4 株。定植后第二花穗开花时标记花下的第 一片叶( 叶长5 1 0 ) ，分别在标记后的7 天、1 4 天、2 1 天、3 5 天、4 9 天、6 3 天进行取样，测 定叶片生长过程中糖含量；在标记后的7 天、2 1 天、3 5 天、4 9 天、6 3 天进行取样，测定酶活性 变化。在2 0 0 4 年2 月2 9 日选择当天开放的生长状态一致的第二穗花的花朵进行标记，分别于标 记后的1 4 天( 幼果期) 、2 5 天( 快速膨大期) 、3 9 天( 绿熟期) 、5 0 天( 转色期) 、5 9 天( 完熟 期) 进行取样和测定。取样时果实每重复取4 6 个，四分法取果实组织；叶片每重复取1 0 片叶， 采用四分法进行取样。酶提取和测定采用鲜样：糖提取和测定采用干样( 四分法混合取的组织在 7 5 c 进行烘干，两天后称重提取，研磨后的粉末为提取和测定的样品) 。 2 2 实验方法 2 2 1 糖的提取与含量测定 2 2 1 1 糖的提取 糖的提取参考植物生理学实验”，并加以改进。研磨烘干的果实、叶片组织，称取干样l o o m g 左右，置下5 a l 的8 0 的乙醇溶液中进行8 0 c 水浴提取3 0 分钟，收集滤液。重复提取3 次，合 并滤液，脱色过虑后进行糖测定。收集提取糖过滤后的残渣，沸水提取可溶性淀粉，高氯酸分解 为可溶性糖1 ，通过葸酮比色法测定生成的糖来测定可溶性淀粉含量。 2 2 1 2 糖含量的测定 蔗糖含量的测定：取一定量的糖提取液( o 5 毫升左右) ，加入2 n 的氢氧化钠溶液沸水浴加 热2 0 分钟消除原有的还原糖，冷却至室温，加入盐酸问苯二酚于8 0 水浴中2 0 分钟，通过测定 吸光度来计算蔗糖含量，用蔗糖作标准曲线。 9 中国农业大学硕士论文 第二章材料与方法 果糖含量的测定：取一定量的糖溶液( 0 5 r a l 左右) ，用盐酸闻苯二酚比色法测定果糖的含最， 用果糖作标准曲线。 总糖和淀粉含量的的测定：取一定量的糖溶液( o 2 m l 左右) ，用葸酮乙酸乙酯比色法测定总 糖的含量，用葡萄糖作标准曲线。 2 2 2 酶的提取与活性测定 2 2 2 1 酶的提取 酶的提取参考t o mh n i e l s e np 4 l 的方法加以改进。酶的提取采用鲜样，叶片和果实采f 后置 丁4 0 c 条件下，进行提取和测定。混合后的组织2 9 左右，用4 倍体积的提取缓冲液在冰浴卜的研 钵中进行研磨。提取缓冲液中包含5 0 m m 的h e p e s n a o h ( p h 为7 5 ) ，1 0 m m 的m 9 0 2 ，l m m 的 e d t a 0 1 ( w v ) b s a ，0 5 ( w v 1p v p ，o 0 5 ( v v ) t r i t o n x - 1 0 0 ，2 5 m m o l ld t t 。提取液在高 速冷冻离心机中1 2 0 0 0 9 离心2 0 分钟，上清液即为酶的粗提取液。 2 2 2 2 酶活性的测定 蔗糖磷酸合成酶( s p s ) 活性的测定：参考n a j e hb a l i ”“的方法加以改进。粗酶提取液5 0 u l 加入到il o u l ( p l t 为7 5 ，含有l o o r m o l l 胍p e s n a 0 h 、4 0 m o l lm g c l z ) 的反应缓冲液中，同时 加入2 0 u l2 0 0 m m o l l 的u d p g 溶液和2 0 u ll o o i o l l 的f 一6 一p 溶液中。反应3 0 分钟后加入2 n 的氢氧化钠溶液沸水终止反应，用盐酸问苯二酚比色法测定生成的蔗糖，空白用加入反应液后直 接终止反应的吸光值来表示，用蔗糖作标准曲线。酶的活性用u m o ls u c g f 删o u r 来表示。 蔗糖合成酶( s s ) 活性的测定：测定的方法基本同s p s 。只有将卜6 一p 换为果糖，盐酸问苯 二酚比色法测定生成的蔗糖。 酸性转化酶( a i ) 活性的测定：参考d a p h n em i r o 1 的方法加以改进。用0 1 m l 的提取液加 入到0 9 m l 的反应缓冲液中反应3 0 分钟。反应缓冲液中包含0 1 m o l l 的乙酸一乙酸纳( p h 值为 4 8 ) ，0 1 m o l l 的蔗糖溶液。反应完成后加入3 ，5 - 二硝基水杨酸溶液，沸水中终止反应并显色， 通过测定吸光度来检测还原糖浓度，用葡萄糖作标准曲线。 中性转化酶( n i ) 活性的测定：测定基本a i ，只是反应缓冲液不同，反应缓冲液中包含0 1 m o l l 的柠檬酸一柠檬酸三钠溶液( p h 值为6 6 ) ，0 1 m o l l 的蔗糖。 2 2 3 番茄产量和果实相对生长率的测定 单果重测定：称景、记录果实生长发育过程中每次取样的单果重量。 产量测定：于果实红熟期分别采收、记录，以小区为单位计算产量。 番茄果实的相对生长率计算方法p 6 j ：r g r = ( f w t 2 - f w t l ) f w t l ( t 2 一t 1 ) ，其中f w t 2 为第 二次取样时的果实重量( 克) ，f w t l 为第一次取样时的果实重量( 克) ，t 2 一t l 为两次取样的时间 差值( 天) 。 1 0 中国农业大学硕士论文 第二章材料与方法 2 3 双列杂交遗传分析 2 3 1 遗传分析设计 遗传分析所用的材料为上述用于糖代谢研究的6 个耱含量不同的品系经过正交组合设计得到 的杂种一代。1 5 个杂交组合按照随机区组设计，3 次重复，每小区3 4 株，于2 0 0 4 年2 月4 日播 种育苗，3 月2 6 日定植于塑料大棚内。单干整枝，管理同常规生产方法。在第二穗果实迅速膨大 期取第二穗果实的下位叶片，每小区随机抽样3 株，单株测定叶片中糖含量和酶活性。在2 0 0 4 年5 月2 8 日第2 穗果实达到转色期时取样，每小区随机抽样3 株，按单株测定番茄糖含