（微生物学专业论文）曲霉l22木聚糖酶系主要组分的分离纯化及性质研究.pdf

。，。，。，釜皇查耋呈茎星耋呈茎垡星鱼圣。，。，。：，。，。：， 摘要 a s p e r g i l l u sl 2 2 是本实验室筛选得到的一株既产纤维素酶又产木聚糖酶的真 菌菌株。对a s p e r g i l l u sl 2 2 的粗酶液进行n a t i v e - p a g e 分析显示粗酶液中含有多 个木聚糖酶成分，在酸性条件下酶活较高，最适作用温度在5 5 ，具有较好的 温度和p h 稳定性。 经超滤浓缩、分子筛色谱、阴离子和阳离子交换层析，由棘孢曲霉发酵液最 终分离得到四个电泳纯的木聚糖酶组分。通过s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以测 得这些组分的分子量依次是9 2 1 3k d a ，3 2 4k d a ，3 0 1 3k d a ，1 9 3 9k d a 。实验 证明这些酶组分均属于酸性木聚糖酶，x y - 1 及x y 2 的最适反应p h 在3 5 0 之间，x y 一3 的最适反应p h 在4 6 6 6 之间，x y - 4 则在p h 2 6 6 6 范围内均表现 很高的酶活性。各酶组分在酸性条件下较稳定，碱性条件下酶活丧失较快。) ( v 1 及x y 2 的最适反应温度在7 5 c ，在5 0 。c 以下比较稳定；x y - 3 及x y - 4 最适反应 温度为5 5 。c ，在4 0 1 2 以下比较稳定。c l l 2 + 、a g + 对各组分都有一定的抑制作用， 浓度增大的情况下甚至会强烈抑制酶活性。金属离子m 9 2 + 、b a 2 + 、c a 2 + 可以较大 幅度地促进x y 3 的木聚糖酶活，c a 2 + 也可大幅度促进x y - 4 的木聚糖酶活性。通 过对各酶组分米氏常数的测定可知，x y 一1 及x y - 2 对底物桦木木聚糖的k 。值分 别为o 3 6 和0 2 6 ，说明这两种酶对底物的亲和力较大，x y - 3 及x y - 4 对底物 亲和力较小，k 。值为2 4 6 和1 3 9 。四种组分的v r 。分别为4 0 1i t m o l m i n m g 、 8 8 lum o l m i n m g 、8 1 9 71 t m o l m i n m g 、4 7 1pm o l m i n m g 。 关键词：a s p e r g i l l u s 工刀，木聚糖酶，分离纯化 a b s t r a c t a s p e r g i l l u sl 2 2 ，b e i n ga s p e r g i l l u s a c u l e a t u s ，h a se x h i b i t e dh i g ha c t i v i t i e s o f c e l l u l a g ea n dx y l a n a s e t h ec r u d ex y l a n a s es y s t e mh a ss e v e r a le l e m e n t sa n d h a dg o o d s t a b i l i t i e so f t e m p e r a t u r ea n dp h t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo f t h ec r u d ex y l a n a s e w a ga b o u t5 5 c a n di ts h o w e dh i g h e ra c t i v i t yi na c i d i co rn e u t r a lc o n d i t i o nt h a ni n a l k a l i n ec o n d i t i o n f o u rk i n d so fx y l a n a s e sw e r e s e p a r a t e d a n d p u r i f i e db yu s i n g e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h ya n di o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n do t h e rp u r i f i c a t i o n m e t h o d s f r o mt h ec r u d ec o n t r a c t t h em o l e c u l a rw e i g h t s o fe a c h c o m p o n e n t s w e r e c h a r a c t e r i z e d b y s d s - p a g e ，a n d w e r e 9 2 1 3k d a ，3 2 4 k d a ，3 0 1 3k d a ，1 9 3 9 k d a , r e s p e c t i v e l y a l lt h e s ea c t i v i t i e sw e f cs h o w e dt ob ea c i dx y l a n a s e t h eb e s tr e a c t i o n p h o fx y 1a n dx y - 2w a sb e t w e e n3 6 - - 5 0 ，a n dt h a to f x y 一3w a sb e t w e e n4 6 - - 6 6 x y - 4e x h i b i t e dh i 曲a c t i v i t yb e t w e e n2 0 6 6 t h ee n z y m i ca c t i v i t i e s w e r em o r e s t a b l ei na c i d i co rn e u t r a le o n d i t i o na n dw e r ei n h i b i t e di nb a s i cc o n d i t i o n t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r e sf o rx y - 1a n dx y - 2w e r et h es a m et ob e7 5 c ，a n d t h e ys h o w e dg o o ds t a b i l i t ya t5 0 c t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r e sf o rx y 3a n dx y 一4 w e r e5 5 c ，a n dt h e ys h o w e ds t a b l eo n l yb e l o w4 0 c t h ea c t w i t yo f e a c h c o m p o n e n t c a nb es t r o n g l yi n h i b i t e db yc u 2 + a n da g + t h ea c t i v i t yo f x y - 3c a nb ei n c r e a s e d d r a m a t i c a l l yb ym 矿+ ，b a 2 + ，c a 2 + t h ea c t i v i t yo f x y - 4 c a na l s ob ei n c r e a s e d b yc a 2 + t h ek m v a l u e s ( x y l a nf r o mb e a c h w o o d a ss u b s t r a t e ) o f x y - 1a n dx y - 2w o r e 0 3 6 a n do 2 6 ，r e s p e c t i v e l y ，s h o w i n gh i 出a f f m i t yt ot h e i rs u s b s t r a t e t h ek m v a l u e so f x y - 3a n dx y 一4w e r e2 4 6 a n d1 3 9 s h o w i n gl o w 锄l z y m e s u b s t r a t e a f f i n i t y t h ev v a l u e so ft h e s ea c t i v i t i e s w e r e4 0 1um o l m i n m g 。8 8 1p m o l m i n m g ，8 1 9 7pm o l m i n m g ，4 7 11 1m o y m i n m g ，r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：a s p e r g i l l u sl 2 2 ，x y l a n a s e p u r i f i c a t i o n i i i 源剖性声晴 本人郑重声明：所呈交懿学位论文，是本人在导师髂指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含锰俘其他个人戏集体汪经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法镶责侄奎本人承担。 论文作卷签名：墨塑爨期：翌! ：里! 关于学位论文使用授权的声明 本入完全了解由东大学有关保留、使用学位论文的瓶定，同意学 校保甑或向豳家有关部门或机构送交论文的复印件和电子舨，允许论 文被豢阕和僚阕；本入授权由东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据摩进行检索，可以采用影印、缭印或其饱复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此勰定) 论文作者签名：二舡导师签名：雠尽 期：罂堕：! ：塑 。；。：。，。，。童垒奎耋耋羹耋茎耋耋基圣。，。，。，。一 第一章绪论 l 。堇纤维素、半纤维素的结构 植物细胞壤主要由纤维素、半纤维索和本质素等物质组成。这些物质是自然 赛中最主要匏可荐生资滚，被广泛穗应瘸于造纸、食晶、医药等行监。程当今 建 界能源固益短缺的情况下，这贱资源正越来越受到重视。 纤维素是不溶于水的均一多糖。天然纤维索是由3 , 0 0 0 - 1 0 ，0 0 0 个d 葡萄 糖分予以一l ，4 - 糖萤键结合成盼线形长链分子。大约有4 0 的馥浆糖链摊歹l j 极为 有序，赢的无分枝的葡凝糖链相排列形成片层，同时也相互重叠，葡聚糖的链间 嚣链凑存在大蘩熬氢键，软瑟镁纾维素爨骞褰骚度纛撬纯学酶群瓣戆力噱壤攥 x 射线研究发现，纤维索是由结晶区与光定形区交错连接而成的二相体系。一个 纾维素分子霹雾遘尼个结鑫区翻无定形嚣，结菇医窝无定形嚣麴沌餐，维鑫靛完 善程度，则因纤维素的种类而辩【2 i 。 半纤维素最低分予慧的多糖。它与纾维素最翠的区涮是因其时碱的溶解性不 嗣丽分的。最初的定义为：植物细胞中与纤维索相连的阿溶于碱的成分1 3 。1 9 6 2 年，a s p i n a l l l 4 1 以化学结构的观点揭示了半纤维豢的本质；半纾维素是来源于植 物的聚糖类，它舍有一穆或凡秘耱基，翅d 本糖酶，d 彗器蕤基，d 睾乳羲基 等构成旗础链，而其它糖基作为支链连接于此旗础链上。根据来源的不同，半纤 维素戆成分存农缀丈豹差舞。本本疆凌瓣糖残蕊遴常蔻珏本穰，d 一曹搭糖，d - 半乳糖，d 一阿j 鼗伯糖，葡萄糖醚酸等( 5 1 。草类和谷类中的半纤维索糖残纂种类通 常少婆，其中簸常觅懿为d 一本糖，l _ 麓拉伯糖，蕊半巍糖和珧葡萄糖瀚。根据 其主要成分的不同，可分为聚本糖，聚半乳糖- 葡萄糖甘嚣糖，聚葡萄糖。甘露糖， 浆阿拉伯糖一半孥l 糖等，其中蕈本植物和阔叶术中的半纤维素分予的主要成分为 聚本糖类，它楚8 - d 一嗽睫型本糖由8 1 4 - 耱营键连接嚣残基本嚣桨，每疆一定 的木糖单位木糖中的羟基被侧链糖基所取代，取代的频率和结构依其来源和分离 瓣方式不楚瑟不溺翻。 纤维素和半纤维素怒两种究全不相同的物质。半纤维素不悬纤维索的前身。 这疆释物瘦弱终梅菇纳翻下表 粕。 。：，。，。，。：皇垂耋呈耋垄螫鏊耋垒窒鎏釜，。：，。，。，。 表1纤维素和半纤维豢的结构 l纤维素半纾缭索 链型囊链 主链和支链 糖类葡萄糖主链木耩、甘露糖、半巍糖 支链阿拉瞧糖、半乳糖、甲基馥辑醛酸 连结键b - 1 , 4主链b 1 , 4 支链n l ，2 ；瑟1 ，3 ；s 1 , 4 ；，1 , 6 聚合度 1 0 ，0 0 0 - 1 5 ，0 0 0 1 5 0 _ 2 0 0 木聚糖( x y l a n ) 是禽有1 3 1 , 4 - 糖苷键的一种复杂的半纤维素【引，在植物细胞 鏊中的含量仅次予纤维豢，约占细胞干熬的3 5 口啦，燕自然界中继纤雅索之后 含量第二丰富的褥生生物质资源 1 ”。它存在于陆生植物的缨胞壁中，几乎檀株的 所有部位都含有它。它的主链由母1 , 4 糖苷键相连的b ，d 吡喃型木糖残基聚合 褥残“。窘然雾中的本聚羲多为巽聚多糖，主毯秘掇链糖基上鸯多秘取代基弱， 主要是乙酰基、葡萄糖酸酰基和阿拉伯糖酰基( 可进一步与香豆酸、阿魏酸等酚 黢相连) f 搀】等。这些铡镳基函与攘耪囊稳中豹其宅冗释绥稳洼多壤 黧寒覆素、 纤维素、果胶、葡聚糖等) 以共价或非共价键相连，组成植物细胞的重要结构一 绸藏壁。术聚糖移在于穰物细臆的次生壁中，处予术质素和其它多聚糖之闻，怒 慧连接作用。也正由于这些侧链的不同，使得木聚糖的结构变化范围很大，从仅 由8 1 , 4 一糖营键涟接的雾聚木糖线性分予到高度分枝的弹质多耱4 】。同型术聚多 耱分布缀少，仅见予茅擎、烟擎帮菜些撼物秘予的外壳书。 一般将木聚糖分为硬术( 针叶) 木聚糖和软术( 阔叶) 木聚糖两种。 硬本( 赞时) 本聚藏套o - 乙装一4 一o * 等基蘩麓糖醛酸本耱聚含嚣藏，含7 0 个以上的吡喃型木糖残基，以b 1 , 4 葡萄糖瞥键相遗，聚台度( d e g r e eo f p o l y m e r i z a t i o n ，狰p 。多聚耪孛蕊含苹体数) 麓1 5 0 , - , 2 0 0 。每隔l o 个木耱残基藏 肖1 个4 - 0 - 甲基葡萄糖醛酸基团位于其c 。2 位。硬木木聚糖高度己酰化，繇2m o l 术耱残基就含im o i 的乙溉基，己酰基团的存在与木聚糖的部分溶解性膏关。通 常情况下t 乙酰化主要发生在本瓣残基的c 3 搜上，两在c 2 位取代的情况擐少， 也有两个位置均被乙酰化的，三者之间的比例为4 ：2 ：1 、2 ：2 ：1 或3 ：3 ：i 。在提取木 2 。，。，。堂型耋茎鹜肇量堇螫塞。：。，。e s 一 聚糖的过程中，乙酰基团能够在c - 2 位和c - 3 位之间转移，而在碱性抽撮的条件 下穰容荔豫去。 软术( 阏叶) 木聚糖由阿拉伯- 4 0 甲基葡萄糖醛酰术聚糖残基聚合而成， 聚合度为7 0 - - - 1 3 0 ，平均长度短予硬木木聚耱，分枝也少于硬本本聚糖。4 - 良荦 基葡萄耱醛酸的含量比农硬木本聚糖中的高，也位于木糖残基的c 一2 位。软木术 聚糖是非乙酰化的，约1 3 的术糖残基淹n l ，姨喃型阿拉伯糖残基取代，通过 d 1 , 3 一糖营键与本糖残慕豹c 3 位楣逢。叠- d 敬嗪型本耱、垂 争基饕萄耱醛 酸和l ，啖喃型阿拉伯糖三者之间的比例为1 0 0 ：2 0 ：1 3 。 不鞘疆凌溪食本聚耱瓣多多瞧有嚣麓鬟，一般疆材中繇含夔本聚糖魄较李孝中 的多，硬材中能占干重的1 5 3 0 ，软材中一般占干重的7 - 1 0 。而在一些一年 生植物，魏小麦、甘蔗、稀花静子壳中，术聚耱含量菲常嵩，一般都能商速3 0 以上【1 6 1 。 众所周知，植物纤缭性材料主要由纤维素( 3 0 5 0 ) ，半纤维素( 1 5 ，3 0 ) 和 本质紊( 1 2 2 0 ) 缀或【1 7 】。撞物缨腿壁中会麓大量姻缍维索组成熬微纾丝，埋在本 质素和半纤维索构成的逡续相中，形成了极其复杂的天然纤维素和初生壁，次生 蹙等绥爨缝擒。本聚糖蠢稷辫裂纤维素上戆趋势，这霹簸楚盎予鬣键蠢辍萎 乍爱 的结果，共价键与非共价键的共同作用有助于维持木质纤维结构的完整性f 1 8 】。 1 2 产纤维素酶和木聚糖酶的微生物 很多微生物都能产生木聚糖酶口9 1 。程植物残留物上象长的微生物能够合成 降解纤缕素和半纤维素麴水解酶炎，这可是由予植物细胞中纤维素积半纤维素 紧密相逢的原因，但同时也存在仪产纤维素或半纤维素水解酶的菌种。嘏年来， 已经取缀多真嫠 2 0 2 2 】霹缨菠瞄茹l 孛提取凼了本聚耱骜。 已知的可以产半纤维素酶类的微生物已有几十个属，一百多种，其中包括细 菠，藏线藿，冬黉龚蘩等。瑟醑袋较深入戆主要涉及蠡霉| 2 4 2 5 、啻簿【2 窀戳及瑞氏 木霉2 7 - 2 9 。但这然真菌所产的酶类通常为酸性或中性酶，在碱性范围内无活性或 活性撮低，近年来人们陆续筛选副一些嚼碱性和酣碱性翱藩，如b a c i l l u s 中的某 毖种弛3 2 1 ，它们由于能产嫩在碱性条件下商较高本聚糖酶活性豹碱性或耐碱性本 黎糖酶，丽引起了人们的关注。 1 3 木聚糖酶系的组成 木聚糖本身结构的复杂性决定了它不可能为任何一种单一的酶类所彻底降 解，具有部分相同但又有不同特性的木聚糖酶是为了彻底降解底物。酶的糖基化 作用、蛋白质分泌后的d n s - 剪切作用、自凝作用及与其它多聚糖酶的聚合作用， 可用来解释为什么同一菌株可产生多种木聚糖酶。例如，a s p e r g i l l u sn i g h 酊可产 生1 5 种木聚糖酶，t r i c h o d e r m av i r i d e 可产生1 3 种【3 3 】，t a l a r o m y c e se m e r s o ”i l 产 生l l 1 3 种f 3 4 】。图l 所显示的是含有多种取代基的木聚糖结构及水解酶的作用 位置。 b 魂芦舛 p 一束撇 图1 含有多取代基的木聚糖结构及水解酶作用位置 按降解木聚糖酶的催化特性可将其分为： ( 1 ) b 一1 , 4 一内切木聚糖酶( b 一1 , 4 一e n d o x y - l a n a s e ) 其作用是切开木聚糖主 链内的糖苷键，降低基质的聚合度。在内切木聚糖酶作用的前期，所形成的主要 产物是聚合度较大的低聚木糖，随着水解的深入主要生成木三糖、木二糖，但一 般不会生成木糖。内切木聚糖酶根据其水解产物可分为有脱枝活性与无脱枝活性 两大类，前者水解产物中只存在阿拉伯低聚木糖，无游离阿拉伯糖；后者水解过 程中可以释放出阿拉伯糖。 多数真菌和细菌的b 一1 , 4 一内切木聚糖酶是单亚基蛋白，m r 为8 ，5 0 0 8 5 0 0 0 p i 值为3 6 - 1 0 3 。根据对几十种9 - l ，4 - 内切木聚糖酶的分子量和等电点进行统计 后发现：7 0 的酸性1 3 1 , 4 一内切木聚糖酶m r 在3 0 ，0 0 0 以上，而碱性0 1 , 4 一内切 4 木聚糖酶m r 则多在3 0 ，0 0 0 以下p “。 绝大多数b 一1 , 4 一内切木聚糖酶的最适p h 值小于7 0 ，最适反应温度在4 5 到7 56 c 之间。多数内切木聚糖酶能够水解d p 值大于2 的寡聚木聚糖，其亲和力 随着d p 值的降低而降低。 木聚糖主链上的取代基团对酶解过程存在阻碍作用，这是否由空间障碍导致 还不能肯定，如果事先用某些手段除去这些取代基团可使酶与底物的表观结合程 度加强。而有些木聚糖酶对于木聚糖主链上的取代基团则有严格的要求，似乎这 些取代基团有助于酶的催化基团取向并定位于特定的酶切位点【3 6 1 。如黑曲霉 口s p e r g i l l u sn i g e r ) 的两个木聚糖酶( p i8 0 和p i9 6 ) 所催化的反应的产物中并没 有阿拉伯糖，而且对去除了阿拉伯糖残基的木寡聚糖作用很小或不起作用，由此 看出其作用位点要求近旁有阿拉伯糖残基存在州。 ( 2 ) b 木糖苷酶( b x y l o s i d a s e ) 该酶有单聚体、二聚体或四聚体等组成 形式，m r 为2 6 ，0 0 0 3 6 0 ，0 0 0 ，p i 值3 3 7 3 。在细菌和酵母中，b 一木糖苷酶主要 存在于细胞内。 b 一木糖苷酶主要作用于寡聚木糖，属于外切酶的一类，主要水解短链的低 聚木糖或木二糖，并从非还原性末端释放出木糖。它对底物的亲和力随着底物的 d p 值降低而增加，因此对多聚木聚糖几乎体现不出活力。在各种寡聚木糖中， 木二糖是木糖苷酶的最佳底物。 0 一木糖苷酶是一个多功能酶。来源于木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i 和t r i c h o d e r m e t h a n o l i c u s ) 的木糖苷酶具有阿拉伯糖苷酶活性。黑曲霉的b 一木糖苷酶1 5 既能酶 切木糖苷键又能酶切n 一阿拉伯糖苷键、b 一葡萄糖苷键和b 一半乳糖苷键。许多b 一木糖苷酶具有1 , 4 一和1 ，3 木糖苷转移酶的活性，在底物浓度很高的情况下更是如 此，从而使低聚木聚糖转变为木聚多糖【3 8 1 。 作为木聚糖降解的主要作用酶，b 一1 , 4 内切木聚糖酶与b 一木糖苷酶共同作 用可以使木聚糖降解为木聚寡糖或者木糖。 ( 3 ) o l - 呋喃型阿拉伯糖苷酶( a l - a r a b i n o f i t r a n o s i d a s e ) 由于缺少合适 的天然底物等原因，使得该酶的研究遇到了很多困难，因而在过去的2 0 多年里 分离该酶的报道很少。现在已知阿拉伯糖苷酶多以单体形式存在，也有二聚体、 四聚体、六聚体和八聚体等形式，m r5 3 ，0 0 0 4 9 5 ，0 0 0 ，p i 值2 5 9 3 ，最适d h 值在2 5 6 9 之间。 n l 一呋喃型阿拉伯糖苷酶一般分为两种类型，一种为外切型，占多数，可 以作用于d 硝基酚呋喃型阿拉伯糖苷和分枝阿拉伯聚糖；另一种为内切型，占 少数，仅能作用于线性阿拉伯聚糖。 ( 4 ) d 一葡萄糖醛酸苷酶( q - g l u c u r o n i d a s e )葡萄糖醛酸苷酶水解葡 萄糖醛酸和木耱残基之间的a 1 , 2 一糖苷键。该酶的m r 一般在1 0 0 ，0 0 0 以上，如 伞蕈( a g a r i c u sb i s p o r u s ) 中为3 6 0 。0 0 0 ( 二聚体) ，橙色热子囊菌( t h e r m o a s c u s a u r a n t i a c u s ) 中为11 8 ，0 0 0 。它们的p i 值都小于4 0 ，最适p h 值在3 3 到6 0 之 间。 n 一葡萄糖醛酸苷酶的底物特异性随酶的来源不同而不同。来源于黑曲霉的 n 葡萄糖醛酸苷酶可以作用于4 o 甲基葡萄糖醛酰木聚多糖，经内切木聚糖酶 作用后产生的寡聚木聚糖更适于被该酶作用。来源于a 6 曲口o 7 2 $ 的葡萄糖醛酸苷 酶既不能水解4 一o 甲基葡萄糖醛酰木糖苷，又不能作用于4 o 甲基葡萄糖醛酰 木聚多糖，而只能水解d p 值在2 - 6 之间的4 0 + 甲基葡萄糖醛酰寡聚木糖，活力 随着d p 值的增加而降低。 ( 5 ) 乙酰木聚糖酯酶( a c e t y l x y l a ne s t e r a s e s ) 乙酰木聚糖酯酶作用于木糖残 基c 一2 和c 一3 位上的乙酰取代基团。木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) 产生两种乙酰木 聚糖酯酶，m r 均为3 4 ，0 0 0 ，p i 值分别为6 8 和7 0 ，均为糖蛋白。 从嗜热厌氧杆菌( t h e r m o a n a e r ob a c t e r i u ms p j w s l y s 4 8 5 ) 中分离到乙酰木 聚糖酯酶i 和i i 。酶i 在细胞外作用于木聚糖上的乙酰取代基团，酶i i 在细胞内 作用于寡聚木聚糖上的乙酰取代基团。乙酰木聚糖酯酶可以消除乙酰基团对内切 木聚糖酶作用的空间阻碍作用，增强内切木聚糖酶对木聚糖的亲和能力【3 9 】。 ( 6 ) 酚酸酯酶( p h e n o l a c i de s t e r a s e s ) 酚酸酯酶主要包括香豆酸酯酶和阿 魏酸酯酶。前者切除香豆酸和阿拉伯糖残基之间的酯键，后者切除阿魏酸与阿拉 伯糖残基之间的酯键。新美丽丝菌( n e o c a l l i m a s t i xm c 一2 ) 产生两种阿魏酸酯酶 ( f a e i ，f a e i i ) ，均为单亚基蛋白，m r 分别为6 8 ，0 0 0 和2 4 ，0 0 0 ，p i 值分别 为4 2 和5 7 ，最适p h 值分别为6 2 和7 0 。 该真菌还产生一种香豆酸酯酶( c a e ) ，是二聚体，m rl1 , 0 0 0 ，d i 值4 7 ， 最适p h7 2 。该酶活力受到多种离子的影响，如lm m o l l 的h 9 2 + 和f e 2 + 分别抑 6 制该酶的活力达5 8 和1 9 ：当离子浓度达到5m m o l l 时，则分别抑制该酶活 力达7 2 耧3 0 碳。 1 4 本聚糖酶瓣特性 1 4 。1 本粱糖酶鳇理化特性1 4 1 1 不同来源木聚糖的组成和性质不尽相同，假它们在理化性质方面仍存在较 大的稳骰性。 1 4 1 。1 分子量 细菌产生的术聚糖酶蛋白质驻基比较单一，分予量范围在8 , 0 0 0 一1 4 5 。0 0 0 之 阈。而真菌产生的本聚瓣酶蛋白质亚基则较复杂，分子爨大小变化也较大。 1 4 1 2 耐热性 缨蘩、寞萤产本聚耱逡切酶戆最透瀑崖范围楚4 0 c 6 0 c ，囊萤本聚糖酶豹 耐热性通常比细菌木聚糖酶差一些。嗜濑性细菌t h e r m o t o g as p 生产的木聚糖酶 戆在1 0 5 4 c 1 1 0 c 、p 壬壬穰5 3 静条彳孛下爨骞最德鹣潘辫l 。 1 4 1 3 耐酸碱性 不丽生物体生产静d 一木聚耱酶逶常在较广静p h 值帮3 1 0 范围内稔定，而 娥适p h 值范围趄4 7 。缎真菌如k a w a c h i i 曲霉菌和h e r q u e 青霉菌所产的木聚糖 酶的最邋p h 值范围则在2 - 6 的酸性区域。 1 4 。1 4 等邀点 各来源不同的木聚糖的内切酶的等电点一般在3 1 0 之间。 1 , 4 1 。5 氨萋酸缎成 不同来源的术聚糖酶的氨基酸组成相差不大，主要为丙氨酸、谷氨酸、甘氨 羧、丝氨羧蠢苏缀酸。 1 4 1 。6 糖类成分 真禳生物木聚糖酶通常为糖罄化酶，原核生物如粪球梭菌种、链霉菌种、耐 热嗜温杼菌种等所产木聚糖酶则为塘蛋岛。这些糖类基因一般与蛋自矮共馀连接 或与木聚糖酶形成可解离复合物。糖基化避多糖酶对非常环境保持稳定的种手 段f 4 3 】。 1 4 2 木粱糖酶的多样性 7 木聚糖酶水解木聚糖主链骨架的0 ，1 , 4 糖苷键，其水解产物主要为募聚木糖 年鞋本二耩，少量静术糖移掰拉镶糖。壶予本聚糖结掏懿复杂眭及本聚耱酶来源豹 广泛性，本聚糖酶具有多样性的特点。从对底物的特异性划分有非特异憔术聚糖 酶和特辩往木聚糖酶。非特异性术聚糖酶能作用于多种底钫，弼纤维素、羧甲基 绥维素、野维寡糖、纡缳二糖及海带多糖等i 删。其它底物和本凝糖竞争酶的活 性位点。它们一般有较大的分子蹩和偏酸的等电点。特异性木聚糖酶则以木聚糖 燕廷嚣藏凌发生 挈媛。礤突结果裳暖微蔓曼携孛有涎类本聚糖酶；低分子量本聚糖 酶含1 8 2 - - 2 3 4 个氨基酸残基；高分子量的术聚糖黼含2 6 9 8 0 9 个甄基酸残基。木 凝耱酶豹凌裁瞧翻分是稷据某魏本聚耱瓣靛够穗鬻控镶跨基双辩有嚣掇整糖侧 旗的木聚糖上释放出来，如从a n i g e r 获得的两种酶，一种能降解阿拉伯糖侧基， 茄一穗负责术三耱静承解，这两耱酶瓷阏作焉，穗离了本聚糖的降解效率+ 丽勇 外一些本聚糖酶龆没有这种协同作用。依据对木聚糖主链上降解位点的特异性， 可将木聚糖酶分为木聚糖内切酶、木聚糖外切酶潋及可问时从内辩和多鞯链一侧 发生作用豹本聚糖酶。对不同来源的本浆糖酶嬲研究已涯实了本聚糖酶的多样 性。 1 4 3 本聚耱懿的催纯特毪 不周来源的本聚糖酶催化特性也有熬异，有不同的最适p h 和最适作用温度， 金属离子对不同来源的术聚糖酶活性的影响各不相同。术聚糖酶按其序列问源健 秘疏水麟分帮亍属于糖萤水解酶的两个家族，即f 家族( 1 0 家族) 和g 家族( 1 1 家族) 】，属予同一家族的木聚糖酶催化区域舆有同源性，可以根据融知家族 豹酶来攘爨未戋瑟戆整纯特性。f 家族戆术聚糖酶分子量舞，复杂，逶豢产生毙较 小的低聚糖，该茹e 族的术聚糖酶w 以作用于对硝基苯( p n p ) 和对硝基苯纤维二 耱，与疯耪结舍嚣较少数量瓣毽簌；g 家簇鲍拳浆糖酶樊 j 黠木聚蕤毒禳离豹特异 性 4 6 , 4 7 1 。在木聚糖酶的满性中心禽有多个能与底物结合的亚位点，这些位点的结 构、大小、数鼙戳及它稍与催仡基霞的空间关系决定该酶对不丽底物的亲帮力、 专一性、作用方式及酶反应的动力学参数【鹌i 。水聚三糖是能被本聚糖酶作用的 最小底物。t h a r z i a n u m 及t t i g n o r u m 本聚糖酶可以转糖濑化的方式降解术四糖。 t p s e u d o k o n i n g i i 豹一静本聚糖黪可扶玉米技时缨腿壁酶解2 0 瓣本糖残基，两 只从大豆枝叶细胞壁降解l o 术糖线基，表明某些t r i c h o d e r m a 术聚糖酶对底物 8 邕。篁! 曼舞皇詈曼懋燃皇詈! 当童薹垒耋耋羹塞耋尘窒螫塞皇墨曼群麓鼍! 舅攀燃毫暑曼鼍燃世：詈，置燃篡 具有高度的选择性。木聚糖酶的底物特舜性包括f 蓖物组成的特异性，对键的特异 筏稷对带有取代纂赢秘鹣特异馁。壤据本蒙耱酶对藏魏缀残戆特癸经不瓣可壤其 分为特异性和交叉特异性酶。前者只分解木聚糖的b 一1 , 4 一糖苷键，后者除分解木 聚耱翡1 3 。1 , 4 一糖蟹键井还分解纾维素静- 1 , 4 一耩营键。对k c a t k m 篷的测定， 足以确定非特异性的酶怒以木聚糖酶为主还是以纤维素酶为主。如热纤梭菌产生 的酶组分中的一种酶e g e 其术凝糖酶和纤维素酶活性比率为t ：1 0 4 翘，丽另一缀 分e g h 5 0 3 的比攀为1 ：t 1 0 。卣予些被毙隆表达的酶其底携特异性仍不严格，这 样就排除了试验用酶混村其它酶的可能性【5 1 l 。两类酶的底物特辩性与篡活性位 点不曩蠢关。特毋蛙不严揍豹酶蔼与纾绦豢底掳稳终月，嚣特异峻严掺豹薅无戴 能力。臌物特异性反应了酶与底物结合的基团而不是催化基团的不同。除作用于 鍪1 , 4 术糖萤镶瓣1 3 d ，l ，| 隼痰韬本聚糖酶终，还露只作臻予一d + 1 ，3 本耱营键豹 b - d 一1 ，3 。内切术聚糖酶，后者由海洋环境中的藻类和真菌产生，当然它们也能产 生一d ，l ，垂木聚糖酶f 5 2 l 。 根据本聚糖酶是否可释放出阿拉伯糖，将其分为脱枝链酶和j # 脱枝链酶，这 取决于酶除了裂解主链遴结键外，是否w 除去阿拉伯糖侧链取代基。可释放出阿 拉谊糖瓣本聚糖薅戆铡予也缀多，如黑黪霉秘链霉藿产缎豹术聚糖酶 5 3 - 5 5 1 。有意 思的是，有时一株细菌产生的几种木聚糖酶中，某些可释放阿拉伯糖，而另外一 些裂无垂乏作翅。闷一缨薅产生不瓣特舅牲懿酶毒利于最大程度囊鏊辫鼹本浆糖。 还肖另外一些木聚糖酶，只作用于姆含有某取代基邻近的主链的键。如黑曲 霉的一栋萤产生酶两秤米聚耱簿辩线黧术寡褡稗除去鬻拉倍糖淑筏基辩木聚耱 无作用或几乎露作用口6 1 。另一种酶可切汗与甲熬葡萄糖醛酸取代基邻：j 眨的主链 键，该取代基燕酶作用绝对需鬻的田l 。这些例子中，酶的作用并没有释放出游 离的取代基，因蕊推测慰取代基的需要是为了使薅活性郝位能够正确她定位在底 物上。 1 4 。4 不阕泰解藩之阏的罄隧增效作惩 木浆糖的生物降解满要多种酶的参与，在具有不同催化功能的酶之间。协同 增效俸厢是十分明显的。从t a l a r o m y c e se m e r s o i l 5 8 1 纯仡出来的内仞木聚糖酶不熊 水解麦秸本聚糖( 阿拉伯木聚糖) 。但如果此麦穗本聚糖先经由鼹菌株产生的 。_ l 一阿拉伯呋嘶轲糖昔酶处理，则前述的内切木聚糖酶立即表现出催化活性。从 9 ，。坐查奎兰堡耋兰丝鎏耋。，。，。，。e 詹册i c d l al a n u g i hd 阳纯化的一个内切木浆糖酶部分水解蔗渣木激糖时，产物是低 蒙本耱与嚣控 蠡低聚本糖。爨续农矮，慰其串款低聚末耱罄本上被瘩瑟藏本二糖， 但是，即使经过2 4 小时的长时间水解，这种阿拉伯低聚术糖仍未能进一步水解， 产物中瞧没有游离静随缱信蕹密凌。这波甥，鬻控绉禧取代墓对魏蠹韬本聚藉酶 有阻碍作用。不过，若周n l 啖喃糖瞥酶除去阿拉伯糖取代基之后，水解仍然 楚很容荔的。 同榉，乙酰本聚糖醮酶作用予乙酰他的本聚糖后释放出醋酸，跨去了乙酰基 的屏蔽作用，使术聚糖主链更易于接近肉切木聚糖酶活憾中心，提高了倦化效率。 嚣蠹切本聚糖懿农释烹链产生熬己酝化低聚本糠，剐又憝嚣酶受好豹基蔟，绶鼗 相互促谶，加速了总反陂的进行。 疼访本聚糖酶与本耱营酶之瓣恣瓣榉存农协嚣佟羯。魏入参本蒲蔷酶露 能加速内切木聚糖酶对底物水解。其作用机理看来主要熙降低了终产物木二 耱对蠢切本聚蒲酶酶季乖籍作焉。德如，燕麦本聚耱盾b a c i l l u ss t e a r o t h e m p h i t l u s 的内切术聚糖酶与f 3 水糖苷酶一起处理，可以使这种基成几乎完全转化成本糖， 没有术糖曹酶，内切术聚糖酶的催他效率要低得多。 内甥本聚糖辩与g ，麓萄糖赣酸酶、融酸穗酶之趣的协曩效旋选有不步擐道， 它们联合使用爵表现出催化活性的增强。 不鞠戆表韵本聚赣瓣之阕毪窍癸弱壤效终鼹。恻魏，曩s u c c i n o g e n e s 分泌魂 类不同的内切术浆糖酶i 及i i 。i 具有脱枝活性，可以在主链水解低聚木糖之前 涂去窿挝稿糖残纂，这样酶珏藏更易予将木聚糖主链承解。 1 4 。5 木聚糖酶与纤维素酶的协同作用 木聚糖酶与纤维索酶及其宦多糖水解酶的倦化作用也存在密切的关系，在 b u t y n v i b r i o f i b r i s o l v e n 嚣z 您蘩椿爨多 分瓷窭一穗髂茭本骧体( x y l a n s o m e ) 靛多 距单位鬣白聚集体，分予量大于6 6 9k d a ，这种胞外复合体由1 4 条蛋白链组成， 葵孛l l 条表袋骞来聚耱酶活往，3 条表现裔葡聚耱酶活往f 蹶。c l o s t r i d i u m p a p y r o s o h , e nc 7 蔼株也肖这样一种多重复台的纤维素酶一本聚糖酶系统，同时对 纤维素与术聚糖液现承解活性。献h u m i c o l a l a n u g i o s a 中纯化出一种b 一葡萄糖苷 酶，对纾维二糖活性极强，但同时可以缓慢外切承鳃低聚本糖。较长蹲阅永解羞， 几乎可以将全部低聚木糖转化为术糖单糖。 i o 。，。：，。，：量墼兰耋l 冀鍪呈耋錾耋墼童呈，。，。，。孽，。：m e 1 5 常用的术聚糖酶的纯化方法及酶活测定方法 1 5 1 术聚糖酶的纯化方法 本聚糖酶的纯化一般采用以下几个步骤：样品的预处理，盐析，离子交换色 谱窝凝黢色谱。其中寓予交换色谱多数以疆囊予交换色谱采进行，少数也采臻了 阳离子变换色谱。极个别的木聚糖酶的纯化采用了亲和色谱。 l 。5 。2 术聚籍蘸活溺定方法 木聚糖酶的测定方法通常肖d n s 法，s o m o g y i - n e l s o n 滋和r b b x y l a n ( r e m a z o lb r i l l i a n tb l u er - d - x y l a n ) 法 6 0 1 。前两种方法是基于测定酶反应后所 器救出晌还原糖璧，第三秘方法是基于从r b b - x y l a n 巾释藏爨熬染色醛片寒测 定。这三种方法中d n s 法应用广泛，s o m o g y i - n e l s o n 法测定值较d n s 法测定结 桊要羝，嚣显试裁毒一定褥毒憋：r b b - x y t a n 法霉骧攘狳其它稳荚酶豹予援，嚣 定结果准确性高。r b b x y l a n 法还可应用于产木聚糖酶微生物的筛选中，该方法 篱擎、灵敏度离、不伤害微生秘，可敬邋过壹按鼹察筛选平援上徽生物髑鳝是否 出现透明圈来判断，但是r b b x y l a n 的价格昂贵。 1 6 木聚糖酶的应用及发展前景 木聚糖酶在食品、饲料、遗纸等工渡领域上有很多的应用f 6 n 。 1 6 1 在食品工业的斑用1 6 2 , 6 3 l 本聚耱酶在食鑫行鼗鹃应弼主要体臻在它靛及捧壳、曹蔗渣、玉米皮蕊等天 然食物半纤维中分解得到低聚木糖矧。低聚木糖怒由2 7 个木糖以8 1 , 4 - 糖替键 连接而成的低聚糖。该糖盼特点号功靛怒：具难清化性，低卡两不会导致肥胖； 商很高的双歧菌增殖活性，是肠内双歧魏的活化增殖因予；是难发酵性糖，因此 不易造成龋齿。另外，用低聚术糖可制成不同甜度的食晶，可代替葡萄糖作为糖 嚣疯人筑疗效食燕。生产低聚本糖最有效、副终蠲最少熬方法是零j 焉本聚耱酶。 新鲜蔬菜水果等加工成鼹儿食品、膏状物、干燥蔬菜粉末和速溶食品的过程中， 方瑟羧纾维素、半纾缳豢、票黢篷裹静淀粉蛋幽痿、灌籍、色素、精漓、香料、 维生素不能充分提取，如果采用燕煮、酸碱等法，使组织棠化来充分提取，会使 1 1 维生素簿遭到破坏，色褥味发生变化，彼不台璁；男一方面可溶性的木聚褚、粜 胶都是旗性物矮，会造成提取波糙度过大绘后来的浓缡予燥等带来困难。如果采 用含有纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶的曲制剂处理，则可在极溢和条件一f 使组织 豢诧，捷绥慈玻整，将鸯效兹麓宠分提取窭来，羯露大大遗终低提取滚瓣稔度， 而粘度的降低，可使生产中的浓缩或干燥效率成倍提高，也相威降低生产成本， 在采汴燕产过稔孛，蒋羽是爝怒滤静方法来生产浓缩苹染汁，擎独佼翔祭胶酶怒 不够的，往往在这种曲中添加一定比例的木聚糖酶，来分解其中的阿拉伯木聚糖， 这样可楗高超滤浓缩速度，减少膜的清洗次数，明显追提高生产效率和产品质羹 【6 5 】。 木聚糖酶另一用途为烘烤工业。该酶通过与面粉中的可溶性及不可溶性戊聚 糖发生爱应瑟携舞嚣麓嬲终豹辩蛙，扶嚣改善瑟弱熬燕_ i 及稳定性爱，改善瑟叙 瓤的组织结构，增大面包体积。在各种磷包加工中，该酶可以取代乳化剂或与之 琵台傻瓣。壶予该酶不含a 一淀粉酶，梵获褥最佳效采，该酶窿与寞蓠淀粉酶酝 合使用。 1 6 2 在饲料工业的应用 木聚糖酶一个很重簧的用途为饲料工业。半纤维索的主要成分木聚糖，是一 种 # 淀粉多糖( n s p ) ，不能被攀霉动物潢他，具有可滚性，霹学致单嚣动狻戆 小肠粘度提高，最终使消化受阻。木聚糖酶能破坏植物的细胞壁，将木聚糖分解 艘零羲，戈蘑穆零l 震，势洚低蕊凌熬穗发，褥蘸馋辩裂瓣率。毽魏，在掰子镯辩 的酶制剂中，该酶扮演踅要角俄。通常，该酶与n 淀粉酶、b 葡聚糖酶、果胶 酶、蛋蠢酶等酶制裁割成复台酶，特勇遥甭添掬于采餍，l 、麦葙大麦、麸受为基磷 的家禽嗣粮a 小麦和大波含有很高的非淀粉多糖，玉米划含非淀粉多糖根少。嗣 前，世界各屋约8 0 的肉鸡小菠基础豳粮均添加该复合酶制剂，其效莱与被认 为是随鸡积其他家禽最健饲料鲍玉米一耍糖日粮摆同。努据芬兰饲料国黪有限公 司报道，在饲料中阿拉伯木聚糖的增加，会加剧牲畜肠炎的发病率，因此，添加 零聚糖薅分解本攘糖还蠢耱壹动物绩酝炎戆终趱。 1 6 3 在制浆造纸工业的应用 1 2 1 6 3 1 木聚糖酶助漂 当前，造纸工业仍以亚硫酸盐法制浆为主。在该工艺过程中，漂自跫通过化 学药瑟黪撂用滁去浆中莱些成分，朝通过溶解纸浆中约术质素使其结构上的发魏 基团和其它有识物质受到彻底的破坏与溶出，目的是增加纸浆的白度及囱度稳定 性，改薄纸浆的锈莲纯学挂霞。嚣瑟该工序霞瓣大量懿鬣往牲豹含氯纯学试裁， 如氯气、二氧化氯等，柱纸浆漂白过程中，含氯化学物璇经反戚后生成大量氯化 有梳复合兹，这些物质大多是致变帮或潜在的致变裁，对环境惫害极大。制浆过 程中采用木聚糖酶用作纸浆漂融助剂处理纸浆，可增加纤维的分离度，烂著减少 漂白剂用量 6 6 1 ，减少裔害废液排放，并有利予降低生产能耗。术聚糖酶作为纸 浆漂自驹裁来处理纸浆豹枫理被认力是【6 7 4 0 】：木聚耱酶霹以去除沉积在终维表藤 上的木聚糖从1 i 锰使化学漂剂更翁和残余的木质素发生作用：经木聚糖酶处理后纤 维戆渗透控增强，有剃予漂裁戆渗透及内部本囊囊戆终勰；逶过本聚耱酶豹露薅， 可以破坏浆中继续存在的l c c ( 木质索与碳水化合物的复合体) 键，增大了纾 维阉豫，鹱雨裔稳予溶解本震素静攘涂。在实验室麓模上，及s t r e p t o m y c e s r o s e i s c l e r o t i c u s 7 1 】、s 。a c t i n o m y c e t e s1 7 2 、th a r z i a n u m1 7 3 及h u m i d l as p 1 7 4 纯 亿密的术聚糖酶已经散过酶法勘漂实骏。将蔗浚纸浆焉捉纯自b a c i l l u ss p 的本黎 糖酶进行生物处理，再经过氧化氢漂白，结果卡伯值( 发应的主要是浆中本质素 含量) 降低了l o 个单位，白度提高了2 5 【7 卯。有报邋表明，b a c i l l u sc p 阳蚶1 7 6 及曼c o l i 【7 7 】中党隆表达约末聚耱酶氇掰班提裹攮色牛瘦纸浆懿去本