（动物遗传育种与繁殖专业论文）孕酮对体外培养牛子宫内膜基质细胞上孕酮受体表达的影响.pdf

论文独创性声明 9 5 9 0 9 6 。 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中小包 含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学 或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 贺津 沈年 关于论文使用授权的声明 6 月二占日 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在升i 同媒体 上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 导师签名 喵活、 0 撕貉6 月彩日 现年6 月诺日 1 _ ： 一 ；j 孕酮对体外培养牛子宫内膜蕞质细胞上孕酮受体表达的影响 摘要 孕酮受体( p r o g e s t e r o n er e c e p t o rp r ) 基因是核受体超家族成员之一，在介导与 调节卵巢排卵、胚胎植入、乳腺发育等生殖生理以及相关生殖健康中起着关键的作用。 在体条件下，孕酮可以引起孕酮受体表达降低，那么仅在子宫内膜上，这种调节是否 存在? 因此本实验目的就是探讨体外条件下孕酮对牛子宫内膜细胞p r 表达的影响。 实验方法为将子宫内膜细胞进行体外培养，然后在无血清培养条件下添加不同浓度的 孕酮，处理不同时间，将细胞的r n a 进行抽提，以g - a e t i n 基因为参照。采用半定量 p c r 方法研究p r 表达水平。其意义在于，对p r 进行深入全面的研究，不仅有利于 阐明胚胎植入过程中孕酮的作用机制和雌性不孕的分子发病机理，推动基础理论研究 的发展，而且在诊断、治疗等应用医学领域也将会具有实用价值。其具体试验方法和 结果如下： 1 选择组织块培养方法培养牛子宫内膜基质细胞，培养体系为；d m e m f 1 2 + f b s ( 原代2 0 ，传代l o ) + 1 0 0i u m l 青链霉素，在3 7 c ，5 c 0 2 和饱和湿度条件下 培养。 2 将来自8 头未孕黄牛个体传代培养获得的3 8 代子宫内膜细胞混合后，按l 中培养条件培养，直到细胞铺满培养瓶底6 0 后，换无血清培养液处理2 4 小时，再 用含有不同浓度孕酮( o 、5 0 、1 0 0 、2 0 0 和4 0 0 n e , l n l ) 的无血清培养液培养细胞，在 孕酮处理后( 1 、3 、6 、1 2 和2 4 1 1 ) 收集细胞进行总r n a 抽提。 3 对总r n a 进行定量后作r t - p c r 反应，把r n a 浓度调至l | i g g # l ，优化目的 基因p r 和参照基因i b - a c t i n 的p c r 条件，在一般反应环境不变的条件下，分别改变 循环次数、退火温度，选出目的基因p r 和参照基因p - a e t i n 均在直线增加阶段的条 件。 4 取p c r 产物5 m 经1 5 琼脂糖电泳，凝胶成象系统获取电泳图象。用b i o r a d q u a n t i t yo n e 4 5 软件对p r 与b - a c t i n 电泳条带进行分析，以b - a c t i n 为参照，对p r 的 表达量进行分析。 主要结果如下： 1 在组织块贴壁后第5 天发现有少量混合细胞( 上皮细胞和基质细胞) 呈放射状 生长于组织周围，形态上基质细胞呈梭形或椭圆形，还有的呈不规则长条形；上皮细 胞呈圆形，胞核较大而圆，到第1 0 1 4 天细胞可以基本长满培养瓶底，并且细胞基 孕酮对体外培养牛子宫内膜摹质细胞上孕酮受体表达的影响 本上是呈集块生长，成为单层细胞，偶有细胞间插生长。 2 目的基因p r 和参照基因b - a c t i np c r 优化条件为：模板量( o 8 i l 咖1 ) l m ，循环次 数3 5 次，退火温度5 6 ，反应体积5 0 m 。 3 半定量分析p r 基因表达结果显示；孕酮受体在未处理细胞中最高表达，其次 是5 0 、1 0 0 、2 0 0 、4 0 0 n g m l 浓度孕酮处理组；从作用时间看，孕酮受体表达量从高 到低依次是l 、3 、6 、1 2 、2 4 1 1 处理时间，但孕酮对孕酮受体的下调作用不与时日j 和 孕酮浓度呈直线关系。低浓度组( 5 0 r i g 、1 0 0 n g m 1 ) 在2 4 h 时p r 表达最低，而高浓 度组( 1 0 0 r i g 、2 0 0 n g m 1 ) 在6 h 后下降不明显，基本趋于稳定。说明孕酮能够抑制体 外培养的牛子宫内膜上孕酮受体的表达，而且抑制的强弱与孕酮浓度和作用时日j 有 关。说明孕酮对孕酮受体表达可以在细胞水平进行调控。 1关键词：牛子宫内膜孕酮受体半定l v c g 一， 慵 j 2 1 _ 7 ， 傅 ， 孕酮对体外培养牛子宫内膜基质细胞上孕酮受体表达的影响 e f f e c t so f p r o g e s t e r o n eo np r o g e s t e r o n er e c e p t o r e x p r e s s i o n i nc u l t u r e de n d o m e t r i u ms t r o m a l c e l l sf r o m b o v i n e g a n x i a o d i r e c t e db yp r o ，h o n g p e iz h e n g a b s t r a c t p r o g e s t e r o n er e c e p t o r 口r ) i sam e m b e ro fn u c l e o l u s r e c e p t o rs u p e r f a m i l y p re x e r t i m p o r t a n tr o l e sf o ro v u l a t i o n ，e m b r y oi m p l a n t a t i o n , m a m m a r yg l a n dd e v e l o p m e n ta n do t h e r r e p r o d u c t i v ep r o c e s s i n f e m a l ea n i m a l p h y s i o l o g i c a ll e v e l ，p r o g e s t e r o n e i n h i b i tp r e x p r e s s i o ni ne n d o m e t r i u m i nv i t r oe n d o m e t r i u m ，i si tp o s s i b l et oi n h i b i tp re x p r e s s i o n ? t h ea i mo ft h i ss t u d yi st od i s c u s st h ee f f e c t so fp r o g e s t e r o n eo np r o g e s t e r o n er e c e p t o r e x p r e s s i o n i n c u l t u r e de n d o m e t r i u ms t r o m a lc e l l s f r o m b o v i n e i n t h e e x p e r i m e n t ，f i r s t l y , e n d o m e t r i n m c e l l sw e r ec u l t u r e di nf b s f r e em e d i u ma n dt h e n e n d o m e t r i u mc e l l sw e r et r e a t e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f p r o g e s t e r o n e s e c o n d l y , a f t e rb e i n gt r e a t e dd i f f e r e n tt i m e ，e n d o m e t r i u mc e l l sw e r ec o l l e c t e da n de x t r a c t e d t o t a lr n a f i n a l l y , p ge x p r e s s i o nl e v e lw e r ea s s e s s e db ys e m i q u a n t i t a t i v ep c ru n d e r # - a c t i nr e f e r e n c e t h em o t b o d sa n dr e s u l t sw e r ea sf o l l o w ： 1 p r i m a r yc u l t u r eo fb o v i n ee n d o m e t r i u mc e l l sw a sc a r r i e do u tb yt i s s u e - c u l t u r e m e t h o d , t h ec u l t u r es y s t e mw a s ：d m e m f t 2 + f b s ( 2 0 f o rp r i m a r yc u l t u r e ，1 0 f o r s u b c u l t u r e ) + 1 0 0i u m lp e n i s i l l i na n ds t r e p t o m y e i n , a n di n c u b a t e da t3 7 ci na5 c 0 2 h u m i d i f i e da t m o s p h e r ec 0 2w a t e r j a c k e t e di n c u b a t o r 2 m i xt h ec e l l s d u r i n 9 3 8 9 e n e r a t i o n sf r o m8n o n e p r e g n a n tl u t e a l - t e r m s c a l p e r c u l t u r e dt h ec e l l st i l lc o v e r e d6 0 o f t h ec u l t u r eb o t t l eb o t t o m c h a n g e dt h ec u l t u r e m e d i u l nt of b s f r e ed m e m f 1 2 ，a f t e l 2 4 h ，t r e a t e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f p r o g e s t e r o n e ( 5 0 、1 0 0 、2 0 0 、4 0 0 r i g l ) f o rd i f f e r e n tt i m e t h e nc o l l e c t e dt h ec e l l sf o rr n a e x t r a c t i n g 3 s e m i q u a n t i t a t i v er t - p c rw a su s e di nt h i ss t u d y f i r s t l y , a d j u s tt h et e m p l a t e 3 t，o 0 r r ， ， - - 孕酮对体外培养乍子宫内膜摹质细胞上孕酮受体表达的影响 c o n c e n t r a t i o nl e s st h a nl ，耀咖l ，t h e no p t i m i z et h er t - p c rc o n d i t i o no f p ra n d # - a e t i n ， 4 f e t c h5 # 1p c ro u t c o m e sf o rg e l o s eg de l e e t r o p h o r e s i s ，t h ee l e e t r o p h o r e s i si m a g e w e r eo b t a i n e db yb i o - r a dq u a n t i t yo n e 4 5 a n a l y s et h ep re x p r e s s i o nb y s e m i - q u a n t i t a t i v ep c ru n d e r # - a e t i nr e f e r e n c e t h em a i n r e s u l t sw e r ea sf o l l o w ： 1 t h ee n d o m e t r i u mc e l l sb e g a nt og r o wf r o mt h et i s s u ea f t e ri th a ds t i c k e dt ot h e c u l t u r eb o t t l eb o t t o mf o ra b o o u t5d a y s ，a n dt h ec e i l sg r e wa r o u n dt h et i s s u e s a sa a e t m o m o r p h i cf a s h i o n ，t h ec e l l s m o r p h ai st y p i c a lf i b r o b l a s t ，t h ec e l l sc o u l dc o v e rt h e b o t t l e b o t t o m a f t e r c u l t e r e d f o r a b o u t l 0 1 4 d a y s 2 t h eo p t i m a lp c rc o n d i t i o no fp r o g e s t e r o n er e c e p t o ra n db - a c t i nw a s ：t e m p l a t e ( o 8 x g , 1 ) i d ，3 5c i r c l e s ，a n n e a lt e m p e r a t u r e5 6 * ( 2 ，t o t a lr e a c t i o nv o l u m e5 叩1 3 s e m i q u a n t i t a t i v ep c ra n a l y s i ss h e w ：t h ee x p r e s s i o no fp r i np r o g e s t e r o n et r e a t e d c e l l sw a sh i g h e rt h a nn o n e t r e a t e dc e l l s ，a n dt h ep re x p r e s s i o nd e g r e s s e db yt h ei n c r e a s eo f p r o g e s t e r o n e c o n c e n t r a t i o na n dt r e a t m e n tt i m e i tr e v e a l s t h a t p r o g e s t e r o n e c a n d o w n - r e g u l a t et h ep re x p r e s s i o ni nv i t r oc u l t u r e db o v i n ee n d o m e t r i u mc e l l s ，a n dh a v e s o m e t h i n gt od ow i t hp r o g e s t e r o n ec o n c e n t r i f i o na n d t r e a t m e n tt i m e k e yw o r d s ：b o v i n e ；u t e r u se n d o m e t r i u m ；p r o g e s t e r o n er e c e p t o r , s e m i - q u a n t i t a t i v ep c r 4 孕酮对体外培养牛子宫内膜摹质细胞上孕酮受体表达的影响 1 文献综述 1 1 子宫内膜细胞体外培养的研究进展及应用 1 1 1 子宫内膜细胞的研究现状 子宫( u t e r u s ) 是胚胎附植及孕育胎儿的地方。子宫内膜是卵巢激素作用的靶组织， 在生殖生理的研究中占有重要地位。在不同的生理周期中，子宫经历不同的变化。孕 酮和雌激素的联合作用使子宫内膜细胞在妊娠期发生形态及生物化学的变化，这种变 化不仅表现在上皮细胞和间质细胞形态学上的变化，同时还表现在其增殖及分泌活性 的改变，此时期的子宫内膜细胞将转化为蜕膜细胞，子宫内膜变为分泌性内膜。对子 宫内膜细胞进行体外培养，有利于研究细胞的生长、分化和代谢以及卵巢激素的作用 机制。现在一般认为体外培养技术是从h a r r i s o n l l l 和c a r r e l l 2 1 两人真正开始的。自细胞 培养技术问世以来，人们对子宫内膜细胞培养进行了大量的研究，1 9 8 8 年b o n g s oa t 3 1 进行了人子宫内膜细胞体外培养和形态学观察，为人子宫内膜细胞培养应用于其它方 面的研究创造了条件。g l a s s e r 等【4 】提出一种新的培养方法使上皮细胞保持其极性，他 们将所获得的内膜腔上皮细胞放于涂有e h s 基质的半透性滤纸上培养，结果显示上皮 细胞呈极性生长，该实验提供了一种更接近在体内状态的上皮细胞培养模型。k e v i n 等1 5 1 蒋洲梅等6 】张芳婷等7 】均成功的分离出子宫内膜上皮细胞及基质细胞。v i g a n o 等t 8 1 报道分离子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的方法不同，可将其分为离心分离法【9 1 和筛 网分离法【1 0 一】。这些成果为进一步研究细胞因子对体外培养子宫内膜上皮细胞及基质 细胞增殖的影响打下了基础。近年来，关于牛、兔、鼠等的子宫内膜细胞体外成功培 养均有报道。子宫内膜细胞的培养已成为一项重要的试验技术，培养方法也有了显著 提高，而且可以分离纯化出多种子宫内膜细胞。 研究者的目的不仅仅局限于成功培养子宫内膜细胞，而在于其实际价值。关于人 类子宫内膜的研究，主要在于子宫内膜异位症现象，异位内膜间质细胞与上皮细胞相 互作用，不同于在位内膜，故于体外进行异位及在位内膜细胞的分离培养，有助于进 一步研究两类细胞的功能和相互作用，找到异位与在位内膜细胞之间的差异，观察并 监测异位细胞的生长特征、表面受体表达、生物活性及药物动力学影响，目的在于揭 示子宫内膜异位症的发病机制，为子宫内膜异位症的临床治疗提供理论依据0 1 , 1 z l 。在 动物上，国外已有不少关于建立动物胚胎与各种体细胞共培养系统的报道。如：小鼠 t 孕酮对体外培养牛子宫内膜摹质细胞上孕酮受体表达的影响 胚胎与小鼠子宫细胞及输卵管上皮细胞共培养1 1 3 1 4 , 1 5 】，兔胚胎与兔输卵管上皮细胞共 培养【1 6 1 ，猪胚胎与猪子宫单层内膜细胞共培养切，牛胚胎与牛胎儿子宫单层成纤维 细胞共培养1 8 1 和人胚胎与牛胎儿子宫成纤维细胞或人子宫单层上皮细胞共培养i 垮2 0 1 等。这些胚胎体外着床模型为研究人和哺乳动物胚泡着床机理提供了有力手段；另外 对子宫内膜细胞的体外培养可以进一步研究甾体激素对胚胎体外发育和附植的影响， 以及子宫内膜细胞在子宫局部免疫中的作用【2 1 0 2 1 。 1 1 2 子宫内膜的周期性变化 子宫内膜的组织结构随着动物所处的发情周期阶段不同而不同。发情前期在雌激 素作用下，子宫开始发育，内膜胚性结缔组织迅速增生变厚；子宫腺生长，分泌能力 逐渐加强，血管在内膜分布增多：内膜水肿充血，甚至出血。发情期，雌激素水平达 高峰，子宫内膜继续增生并充血，水肿，红细胞渗出；子宫腺分泌旺盛。发情后期， 卵巢形成黄体，开始分泌孕酮；固有膜毛细血管少量出血，但会被吞噬吸收。发情间 期，黄体大量分泌孕酮，子宫腺大量分泌子宫乳，可维持妊娠。休情期，在非妊娠状 态下，黄体完全退化，子宫腺体恢复原状，分泌停止。随着下一批卵泡生长又进入一 个新的发情周期。 1 1 3 子宫内膜的功能 子宫内膜不仅是一个保护性内膜，而且是具有多种分泌功能的内膜。它除了提供 子宫营养外，还通过自身分泌以及甾体激素的相互作用影响胚胎附植，妊娠维持以及 其它生殖过程。 1 1 3 1 为胚胎附植作准备 胚泡与子宫内膜黏附并植入子宫内膜基质的过程就是胚胎附植，在类固醇激素、 细胞因子和活性分子的精确调控下，胚泡与子宫内膜识别、黏附、并侵入子宫内膜下 的基质层形成胎盘，完成胚泡植入的过程，从而建立母胎联系，以支持胚胎完成妊娠 期的生长发育过程。子宫内膜在胚胎附植前必须做好接受胚胎的准备，与胚泡植入时， 滋养层首先与子宫内膜表皮接触，表皮细胞的顶部质膜首先参与粘着，表皮下组织及 植入的胚泡也发生变化，以适应胚泡与子宫内膜之间的相互作用，所以子宫内膜的特 征性变化是胚胎附植的关键。 1 1 3 2 子宫内膜细胞在子宫局部免疫调节中的作用 6 孕酮对体外培养牛子宫内膜基质细胞上孕酮受体表达的影响 子宫所发挥的作用及其功能的复杂性，使子宫成为动物体内一个特殊的免疫学部 位。妊娠期，它既保证具有同种异体移植物性质的胎儿不被排斥和营养需要，又保证 母体不受胎儿抗原的损害和子宫局部不受病原的感染，这给生殖生物学家或是免疫学 家提出了极富挑战意义的难题，自从5 0 年前p e t e r m e d a w a r 首次提出作为同种异体移植 的胎儿不被母体免疫排斥这一独特的免疫现象后，生殖生物学家或是免疫学家对其机 制进行了大量的研究，尤其是神经一免疫一内分泌系统间调节网络学说的提出，极大 地丰富了人们对子宫局部免疫和母胎问涉及免疫排斥的妊娠识别信号等的认识，诸多 研究成果正在加深人们对子宫局部免疫与妊娠间相互作用本质的理解。目前的研究已 经扩展到包括固有免疫和特性免疫等生殖道防御机制、妊娠系统和局部免疫的调节、 免疫失调与妊娠结果，以及内分泌与免疫的关系等各方面。这些研究不仅对提高胚胎 移植尤其是异种动物移植的成功率，对于提高家畜繁殖率具有重要的意义，而且对于 揭示器官移植、肿瘤免疫以及全面认识机体的自身调节均有重要意义。子宫内膜中存 在多种免疫细胞，a g r 细胞、r # t 细胞、单核吞噬细胞系统等，它不仅对胎儿造成伤害， 更具有免疫保护和免疫营养作用，但由于受激素、孕体等多种因素的影响及其相互作 用，子宫内膜免疫细胞的存在，可向有利于胚胎生长、发育等方面变化，使妊娠得以 正常进行。巨噬细胞分布于子宫整个内膜基质和基层结缔组织，妊娠期间其密度增加， 但受精卵植入后，在植入部位迅速减少，随着妊娠的进展，不断从蜕膜部消失、巨噬 细胞多数表达m h c i i 类抗原，具有m h c i i 类抗原所具有的免疫作用。另一类免疫 细胞是淋巴细胞，主要是t 细胞，n k 样细胞。妊娠期，在胚胎附植部聚集大量的n k 样细胞，揭示它们与胎盘的形成有关，其分泌的细胞因子可能有利于胎盘成熟【2 3 1 。一 般认为，n k 样细胞的活性对妊娠的结局有重要影响，妊娠早期血中尤其是蜕膜中n k 样细胞明显上升，毒性增强，被认为是发生流产的预测标示。子宫内膜在动物生殖的 整个过程中始终发挥着重要作用，但其是否和如何参与子宫局部的内分泌一免疫平衡 调节中的作用，对于全面认识子宫局部的免疫调节具有重要作用。 1 1 3 3 子宫内膜细胞的接受性 受精卵能否被成功植入决定于侵入性胚泡和接受性子宫内膜的密切合作。研究表 明，胚胎植入时发生一系列细胞或生物学事件。胚胎植入“窗口”是指胚胎植入前在 子宫内膜所发生的暂时的特殊“生理接受”状态它的建立主要由黄体分泌的孕酮和 雌激素以及子宫表达的细胞因子、生长因子、蛋白水解酶类调控【2 4 1 。从输卵管来的受 精卵只有在这种接受状态下才能与子宫内膜进行信号交换，相互识别，发生植入过程， 7 孕酮对体外培养牛子宫内膜摹质细胞上孕酮受体表达的影响 胚胎植入只有在有限的时间内发生。子宫内膜的接受性主要表现为特定的细胞和分子 事件的顺序发生，这些事件的诱导表达与胚泡到达子宫腔同时出现。其中，细胞黏附 分子，糖蛋白类、细胞因子等构成网络系统，以自分泌、旁分泌或并分泌等形式，参 与“母胎对话”机制，在胚胎附植进程的精确调节中发挥重要作用。 1 1 3 4 子宫内膜细胞体外培养的应用 体外培养细胞具有很多优越性，主要表现在：研究对象是活细胞，研究条件可以 人为控制；研究样本可以达到比较均一；研究内容便于观察、检测和记录；研究的范 围比较广泛，费用相对经济。利用这一技术，可对细胞进行多方面的研究。第一，细 胞与细胞之间的相互作用，如胚胎诱导作用、细胞粘附作用、接触抑制、密度抑制等； 第二，细胞的生态学，如营养需求、细胞内产物的分泌，激素的影响、感染、病毒或 化学物质诱导的转化反应、药物反应等；第三，细胞内活动，如d n a 的复制和转录、 蛋白质合成、能量代谢；第四，细胞内物质的流动，如r n a 自胞核向胞质的转移、细 胞因子受体复合物的移动。子宫内膜细胞体外的成功培养，不仅可以深入地研究子宫 的生理，还可以为阐明许多生殖性疾病的机制提供良好的手段，所以得以广泛的应用。 1 - 1 3 4 1 研究人类子宫内膜异位症的病理生理机制 1 8 6 0 年r o k i t a n s k y 【扭硐首次报道了人类妇产科常见病子宫内膜异位( e m ， e n d o m e t r o s i s ) 来，对它的研究越来越多，子宫内膜异位症是指具有生长功能的子宫 内膜出现于子宫体腔内壁以外部位引起的疾患( 或一系列病变和症状) 。它是一种性激 素依赖性疾病，尽管子宫内膜异位症为良性疾病，但子宫内膜可以全身组织、器官种 植生长，具有类似恶性肿瘤的行为田】经证实1 0 1 5 的女性发病，9 0 生育年龄女 性有经血逆流现象，提示子宫内膜异位侵袭机制才是子宫内膜异位症发病的关键1 2 8 1 通过体外分离培养子宫内膜间质细胞和上皮细胞，观察其形态学特点，比较不同细胞 的侵袭行为，初步探讨它们在e m 发病中的可能作用机制。近年来的研究还表明e m 的 发病机理与机体细胞因子平衡也有密切关系【2 9 0 0 1 1 1 3 4 2 研究胚胎附植的调节机理 从广义上讲，“胚胎植入”( e m b r y oi m p l a n t a t i o n ) 是指从卵子受精到胚泡附植于子 宫内膜中的一系列细胞或分子生物学事件( t a b i b i a d e h 和b a b a k n i a ，1 9 9 5 ) 。狭义讲，“胚 胎植入”指胚泡到达子宫进行定向定位后，与子宫内膜上皮接触、粘附，并侵入子宫 基质中，建立胚胎发育所必需条件的过程。通过对胚胎附植生物学基础的了解以及对 子宫内膜细胞生理学的探讨，从而在胚胎侵入性和子宫内膜接受性两方面研究胚胎植 3 孕酮对体外培养牛子宫内膜基质细胞上孕酮受体表达的影响 入的调节因素，进而对人类育与不育的研究，以及对动物的胚胎移植、生产实践相联 系技术的研究。 1 1 1 3 4 3 研究子宫免疫调控机制 母一胎问的免疫关系是在长期物种进化过程中逐步形成并建立的一种相互适应 过程。从孕体的抗原性分析，它对母体而言是一种同种异体移植物，成功的妊娠有赖 于子宫局部免疫平衡，通过母一胎间相互作用，使平衡随孕体的生长和发育不断地调 整变化，孕体能始终逃避母体的免疫攻击。这种平衡的建立与调节涉及多种免疫调节 机制，胚胎如不能与该平衡调节同步，就会被排斥。在这种平衡状态下，孕体本身在 局部免疫平衡中也发挥着必需的和重要的作用，母体的免疫反应不但不会引起免疫排 斥，而且对孕体产生免疫营养作用。因此，对母一胎间免疫关系的研究，不但是对机 体免疫的全面认识，而且对于防制人类与家畜的自发性流产，提高家畜繁殖率，濒危 动物的保护，人类生育的有效控制，提高移植器官成活率以及探明某些肿瘤的发病机 理等均有理论指导和实际应用价值。 1 1 3 4 4 在体外受精一胚胎移植技术( i v f e t ) 上的研究应用 体外受精一胚胎移植技术6 r e e t ) 的研究及应用至今己有多年，胚胎移植成功率 仍然很低【3 1 翔l 。造成这一结果的主要原因之一是过去常规使用的胚胎体外培养条件不 能完全满足胚胎发育的需求，使胚胎难以正常发育【3 3 1 ，后来人们将配子、早期胚胎进 行输卵管移植，发现胚胎发育率及妊娠率都提耐州。体外模仿输卵管内环境的最好方 法是将胚胎与输卵管上皮或子宫内膜细胞共培养，模拟体内发育，多种动物乃至人的 有关研究都证明，共培养的胚胎发育率、发育速度及胚胎质量都不同程度的得到提高 【3 5 州。共培养可使胚胎发育与子宫内膜发育同步，自然状态下，胚胎在输卵管内发育 到囊胚期后才进入宫腔附植，而普通i v f e t 将胚胎发育到2 8 细胞期就移植到宫腔 内，这样胚胎在体外延长培养2 3 d ，即在取卵后3 4 d 再移植，使子宫内膜为胚胎着 床做好准备，提高了胚胎移植成功率。 9 孕酮对体外培养牛子宫内膜摹质细胞卜孕酮受体表达的影响 1 2 孕酮及孕酮受体的研究进展 1 2 1 前言 孕酮主要是由卵巢分泌的甾体类固醇激素，作用于子宫内膜、子宫肌组织和乳腺 组织，是孕卵着床和维持妊娠所必需的激素。孕酮具有促进子宫内膜出现分泌期变化， 促进乳腺腺泡发育，使处于黄体期女( 雌) 性的基础体温升高的作用。孕酮发挥这些 生理作用是通过其受体介导的。 孕酮受体( p r o g e s t e r o n er e c e p t o r ，p r ) 属于类固醇核受体超大家族的成员，多分布 于子宫内膜和肌层中，在表面上皮、腺上皮细胞、内膜基质细胞和平滑肌细胞的细胞 核内。而应用免疫细胞化学染色，光学显微镜观察，发现胞质内不含受体阳性物质”1 。 p r 是核受体家族中的重要转录因子，分为a 、b 亚型，它们分别是由1 条单基因通过2 个不同的起始密码子转录而成，在乳腺的发生发展以及乳腺癌的增生过程中发挥了重 要作用f 4 钔。相对于孕酮受体a ( p r a ) 而言，孕酮受体b ( p r b ) 有更强的转录活性【4 卦， 可以调控p 2 i 、e - m y e 、s o x 4 等许多重要的靶基因m l 。 1 2 2 孕酮受休 孕酮的生理作用是通过细胞内特异蛋白孕酮受体( p r ) 的介导。孕酮受体是转录因 子，也是核受体超家族之一。p r 有p r a 和p r b 两种异构体，在啮齿类和人由一个单基 因而来，基因上有两个不同的a u g 密码子，转录时选择其中一个启动，表达 4 7 , 4 8 1 。用 体外系统观测得知，p r 的两种异构体有不同的结构和功能特性，推测其生理功能不 同。 1 2 2 1 孕酮受体结构和功能特性 孕酮和孕酮受体结合后引起受体构型发生显著变化，导致：1 ) 受体形成同源二聚 体，2 ) 受体磷酸化的增加，3 ) 受体二聚体与靶基因启动区的特异激素反应元件结合， 4 ) 受体二聚体在靶基因启动子区与特异的共激活蛋白及普通的转录子作用，形成转录 初始复合体。孕酮受体的结构特征已经确定，其氨基端保守性弱，含有调节靶基因启 动子活性水平和特异性的转录活性功能区a f 1 和a f 3 。居中的d n a 结合区高度保守， 含有在形成受体二聚体起作用的序列、并具d n a 结合特异性。在d n a 结合区的下游， 是一段高度变异的区域，含有核定位信号，同时也是另外一个活性转录区a f 2 。这段 序列下游是培基结合区( l b d ) ，是功能复合体。除了其与孕酮结合功能，孕酮受体还 i o 孕酮对体外培养乍子宫内膜草质细胞上孕酮受体表达的影响 有其它重要的序列，有在非活性状态下和细胞内热休克蛋白作用的序列，受体形成二 聚体，反式激活( t r a n s a c t i v a t i o n ) ，分子内和分子闻沉默( s i l e i l c i n g ) 需要的序列1 4 9 】 孕酮受体也能以不依赖配基的方式被激活，通过提高细胞内激酶活性的细胞通透 介质1 5 0 - 5 3 1 ，或通过细胞外刺激与细胞膜受体作用来激发细胞内磷酸化通路，这包括生 长因子，儿茶酚胺神经递质( c a t e c h o l a m i n e r g i en e u r o t r a n s m i t t c r ) ，多巴胺 ( d o p a m i n e ) i 弘5 7 1 。当与一些拮抗剂如广泛应用的它莫西芬( t a m o x i f v n ) 及r u 4 8 6 结合时， 孕酮受体由非活性态转变成高度活化的受体，这时细胞内的磷酸化通路被激活。 1 2 2 2 孕酮受体的两种异构体：p r - a 和p r - b p r - a 和p r b 在很多脊椎动物表达，包括人类和啮齿类。两个不同的启动子是非 依赖性被调节而产生p r - a 和p r - b 1 4 7 j 钔。生殖组织中孕酮受体绝对量及p r - a 和p r - b 的化学计量比的变化，是由发育和激素的状态引起的。不同物种中两种异构体的保守 性，产生的基因组机理的复杂性，以及在生殖组织里不同激素的调节，提示它们的差 异表达也许是细胞对孕酮的不同反应。 p r - a 和p r - b 的不同仅仅是在受体的氨基端p r - b 含了额外的一段氨基酸，在小鼠 这段序列有1 6 5 个氨基酸，其它种类由1 2 8 到1 6 5 不等，这段序列赋予了p r - b 特异的反 式激活功甜5 8 捌，使其起到重要的作用：特异靶基因能被p r - b 而不被p r - a 激活。 p 凡a 和p r _ b 都能和孕酮结合、形成二聚体、与孕酮反应元件作用，转录来调节 基因表达。当细胞里p r - a 和p r - b 表达量相当时，可以有三种方式形成二聚体与d n a 结合：a a 或b b 同二聚体，或a - b 异二聚体。这三种二聚体特异介导孕酮的调节作 用，将依赖p r b 特异区域赋予这些复合体不同的反式激活特性。很明显，这些差异 将扩展对孕酮的生理应答的范围。在特定的生理条件下，靶细胞内p r a 和p r - b 的比 率将会改变二聚体复合体的相关补体、显著影响细胞对孕酮的反应。 近年来越来越多的证据显示p r a 和p r - b 的功能不同。首先，在培养的组织细胞 中分别表达，根据细胞类型和所用的靶基因启动子的特异性，p r a 和p r - b 显示出不 同的反式激活特性。在许多细胞类型和p r 依赖型的启动子，p r - b 尤其显示了很强的 转录激活作用，而p r - a 却是非活化态这些发现暗示，p r - a 和p r - b 调节不同的靶基 因对孕酮产生应答，在不同的靶组织两种异构体表现不同的反式激活能力。第二，当 p r - a 和p r - b 在培养细胞中都表达时，结合了激动剂的p r - a 处于非活性态，却能明显 的抑制p r - b 的活性1 6 0 , 6 1 1 。这些结果表明，在特定的组织p r o a 能全面减弱特定靶基因 对孕酮的应答有抑制子能力是p r a 一项选择性特质，不仅对p r - b ，也对其它甾类 孕酮对体外培养牛子宫内膜摹质细胞上孕酮受体表达的影响 受体有抑制。因此，p r - a 可能通过与共同作用子的竞争，抑制雌激素、糖皮质激素、 盐皮质质激素受体依赖型基因的活性。第三，p r - a 和p r - b 对孕激素拮抗剂有不同的 反应。结合拮抗剂的p r - a 是非活性态，含有p r - b 的细胞通过调节磷酸化通路，使结 合拮抗剂的p r - b 转变为活性很强的转录因子。第四，p r - a 和p r - b 在结合拮抗剂后， 都能反式抑审f j ( t r a n s r e p r e s s i o n ) 雌激素受体( e r ) 的活性。然而对p r - b 来说这一特征有很 大程度的细胞特异性【6 1 缶3 】。 1 2 3 孕酮的作用范围 孕酮在子宫内膜从增殖期转变为分泌期、子宫内膜基质细胞分化为蜕膜细胞及胚 泡着床和早孕维持中都有重要作用【删。过去认为：孕酮直接作用于靶细胞而发挥功能。 近年来，随着甾体激素受体的提纯，抗孕激素抗体的获得和免疫细胞化学敏感性的提 高，很多研究证明孕酮是通过与靶细胞上的受体结合而起作用的【6 5 1 。因此，孕酮受体 含量的变化将反映出孕酮功能的变化。 1 2 3 1 促蜕膜化作用 孕酮具有促蜕膜化作用，但对其机制尚无定论，有学者认为孕酮的促脱膜化反应 是通过调节蜕膜局部产生的生长因子与细胞外基质等再作用到基质细胞膜上的受体， 激活第二信使系统而起作用的【删。近来人们对子宫内膜微环境变化对孕酮启动与维持 蜕膜化反应的影响很重视。 1 2 3 2 免疫调节作用 岳根华在研究妊娠湖羊细胞免疫水平与孕酮水平后发现，孕酮是一种免疫抑制剂 1 6 7 。孕激素可激活巨噬细胞、t 淋巴细胞等免疫职能细胞以及具有免疫潜能的内膜上 皮细胞和间质细胞产生多种细胞因子、生长因子和粘附分子。激素与局部免疫，激素 与各种细胞因子、生长因子，激素与粘附分子相互问的作用，有协同也有拮抗，其正 常表达有利于胚胎正常发育和着床。孕早期细胞滋养层可产生大量t g f 3 1 ，许多研究 资料表明，t g f l 3 1 是一种具有多种免疫调节功能的细胞因子【6 s - 6 9 , 7 0 7 1 1 ，它可由活化 的t ，b 淋巴细胞产生，并能抑制它们的生长和分化【7 2 l ，母胎接触面的许多t 、b 细胞 受胎儿同种异体抗原刺激后可产生t g f ，i ，调节其它细胞因子的作用，抑制活化的t 淋巴细胞对某些抗原引起的增殖与分化m 1 ，此外t g f1 3 家族参与胎盘多种功能的调 节，主要是起抑制作用。如抑制淋巴细胞增殖、分化；抑制单核细胞产生t g f o t 与i f n - 7 ： 拮抗或修饰其它生物因子或细胞因子的作用。这些对抑制母体免疫反应。维持妊娠至 1 2 孕酮对体外培养牛子宫内膜摹质细胞上孕酮受体表达的影响 关重要。t g f f l l 与类固醇的关系往往是体现在免疫调节作用上。胎儿是母体的同种异 体移植物，小鼠胚泡着床过程中，滋养层细胞逃脱了母体的免疫排斥，整个胚胎也逃 脱了母体的免疫排斥，其机制还未搞清。但文献报道，这与t g f f l l 有很大的关系。蜕 膜细胞分泌的细胞因子是蜕膜细胞间相互联系的语言信号，在蜕膜免疫微环境中起着 中心的调节作用，甚至决定妊娠的成败【明。目前认为类固醇激素是子宫的一种特异性 细胞增殖和分化的初步调节剂，其行为活动影响着生长因子的表达1 7 4 】，反过来又可影 响激素水平，有研究表明妊娠早期t g f 口l 等好几种生长因子及其受体在子宫和胚泡 中表达，这至少可以说明类固醇激素对着床过程的影响是通过生长因子以自分泌或旁 分泌形式进行调节而产生的1 7 5 , 7 6 1 。在子富内膜蜕膜化的过程中，t g f b i 被表达，并与 雌、孕激素一起调节细胞增殖与分化，它在蜕膜免疫微环境中起着中心的调节作用。 一般来说，子宫内以分泌雌激素为主的环境不适于胚胎附着；而孕酮对雌激素起拮抗 作用，为胚胎附着做准备，这些细胞因子及其受体在调节细胞增殖过程中起着很重要 的作用。且大多数生长因子的功能很多，对细胞的增殖和分化都有刺激作用，并还可 作为抗凋亡因子而阻止功能细胞的死亡。 1 2 3 3 在胚泡作床中的作用 雌、孕激素对子宫植入窗的调节具有种属特异性，z h u 等【7 7 l 研究证实，啮齿类 动物大鼠，内源性雌激素的高峰是植入窗开放所必须的。胚泡植入前后多种相关因子 的表达密切相关。 1 2 3 3 ip 与胚胎“植入窗” 胚胎“植入窗”是指哺乳动物的子宫内膜能允许胚胎着床的一个极短的关键时 期。在“植入窗”内，子宫内膜的形态、显微结构及生化等方面要发生一系列的变化 以适应胚胎着床【7 8 l 。近年来的研究己充分证明胚胎“植入窗”存在于人及其他哺乳动 物，如何确定“植入窗”的开始及持续时间对于辅助生育技术及节育措施的发展意义 重大，但目| ； 尚缺乏简便易行的生化指标进行监测。p 对胚泡着床至关重要，无p 时， 囊胚虽能生存几天，但不能植入。人类约有1 0 4 0 的不孕症和反复流产是由黄体 功能不足所致【7 9 1 。谭宗建等研究证明孕鼠血清p 在孕5 8 天迅速上升并达峰值，几乎 为动情期的两倍，p 峰出现的时间与大鼠的胚胎“植入窗”相当。提示大鼠的“植入 窗”需大剂量的p 维持。m i l l i g a n 等t s o l f l i 发现，切除早孕期小鼠的卵巢，不同孕期小鼠 维持妊娠所需的p 的量是不同的：在胚胎尚未着床的孕早期( 孕l 4 天) ，只需极低量 的p ( i e 常生理水平的2 5 ) 即可允许胚胎着床；但在随后的着床阶段( 孕5 9 天) ，着床 孕酮对体外培养牛子宫内膜摹质细胞上孕酮受体表达的影响 点的发展和子宫内膜的迅速蜕膜化，则需要大剂量的p 才能维持妊娠。在妇女排卵后 的第4 9 天( 即黄体中期) ，也可观察到类似的p 峰【8 1 1 ，进一步说明胚胎着床前后的p 峰 对于调节子宫内膜的容受性和允许胚胎着床至关重要。 p 要通l i ：p r 才能发挥其生物效应。谭宗建等发现，p r 在大鼠子宫内膜中的表达与 其血清p 水平的变化基本一致，但与张沅等 8 3 1 报道的p r 的m r n a 在孕早期大鼠子宫内 膜中表达的变化趋势不同，可能是p r 的m r n a 与蛋白表达水平不一致所致。在孕5 7 天，p r ；i