（分析化学专业论文）毛细管电泳—化学修饰电极安培检测联用技术及其应用研究.pdf

学位论文独创性声明 本人所里交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意 作者签名： 匦旦盐 日期：至喧：臼 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留，使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索有权将学位论文的标题和摘要汇编出版保密的学位论文在 解密后适用本规定 学位论文作者签名：氏龟酞 导师签名：电1 苛1 ， 论文摘要 毛细管电泳( c a # h r ye i c a 昀p h o 他s i s ，c e ) ，是以高压电场为驱动力，以毛细 管作为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的 一类液相分离技术。作为一种经典电泳技术与现代微柱分离有机结合的新兴分离 技术。c e 具有高效、快速、进样体积小和溶剂消耗少等优点，自上世纪8 0 年代 问世以来，得到了迅速的发展，其研究和应用涉及环境分析、药物分离、生化分 析等几乎所有的分析领域。 c e 技术的广泛应用与深入发展所面临的主要挑战是高灵敏度与多模式检测 器的发展。极细的毛细管内径带来了很高的分离效能，但同时也给样品组分的检 测带来困难，因此对检测技术相应提出了较高的要求，发展了许多类型的检测 器，有光学、电化学、质谱学检测器及化学发光等。而电化学检测中的安培检测 技术，具有比紫外检测更高的灵敏度，且仪器简单、价格成本低、线性范围宽、 操作简便，已经与毛细管电泳联用并得到了广泛的应用。 早期安培法检测多采用碳纤维电极、碳电极和金属电极等，随后化学修饰电 极( c m e ) 的使用更迸一步扩大了安培检测的范围和适用性。目前，c m e 在流 动注射分析( f 1 a ) 和h p l c 的安培检测器中，已得到广泛研究和应用，但在c e 中的应用还不是很多。因此，本文的研究目的是将c m e 用于c e a d 中，进一 步拓宽c e 的应用范围。主要内容分为三章： 第一章为绪论。简要地综述了毛细管电泳的特点、分离模式、进样技术、检 测技术，以及毛细管电泳的应用现状。 第二章聚酰胺修饰碳糊电极毛细管电泳安培检测技术测定四种氨基甲酸 酯类农药的应用研究。 随着生活水平和健康意识的提高，人们越来越重视农药残留问题，对农药残 留的检测是非常重要的一部分。氨基甲酸酯类农药是我国当前广泛使用的农药种 类之一，本文首次利用聚酰胺修饰碳糊电极一毛细管区带电泳安培检测法对四种 氨基甲酸酯类农药残留：仲丁威、异灭威、速灭威和西维因进行了测定。四种氨 基甲酸酯类农药遇碱快速水解，分别生成邻仲丁基酚、邻异丙基酚、间甲酚、a 一 萘酚，同时放出甲胺。用毛细管电泳一安培检测法测得酚类化合物的量，然后分 别换算为等当量的氨基甲酸酯类农药的量，从而建立了用毛细管电泳一安培检 测法检测所选四种农药残留的方法。再在最佳条件下，四种物质在2 3m i n 内可 达到基线分离。邻仲丁基酚、邻异丙基酚及问甲酚的线性范围为1 o x l 0 7 2 0 x l o - sm o l l - 1 ，检测限为3 o x l 矿m o i l l ，a 一萘酚的线性范围为2 o x l o r 7 2 o x l 0 - 5m o l l l ，检测限为6 o x l 0 - 8m o l u l 。本法用于农药残留的快速检测，结果 4 令人满意。 第三章纳米氧化亚镍修饰碳糊电极一毛细管电泳安培检测技术测定糖类物 质。 糖是自然界和生物体中广泛存在的物质，也一直是分析化学界公认的难分析 的类物质。本文首次利用纳米氧化亚镍修饰碳糊电极一毛细管区带电泳安培检 测法对三种糖类物质：葡萄糖、果糖和蔗糖进行了检测。在最佳条件下，三种物 质可在2 0 m i n 内达到完全分离，蔗糖的线性范围为2 0 x l o 击1 0 x l o dm o i l - 1 ， 检测限为6 0 x 1 0 7m o i l l ，葡萄糖和果糖的线性范围为1 0 x 1 0 6 1 0 x 1 0 - 3 m o i l l ，检测限为3 0 x l o 7m o i l - 1 。本法用于蜂蜜中糖类物质的快速检测，结果 令人满意。 关键词：毛细管电泳，安培检测，碳糊修饰电极，农药，糖 5 c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) i so n eo f t h em o s ti m p o r t a n ta n dr a p i d l yg r o w i n g s e p a r a t i o nt e c h n i q u e si nr e c e n tt w e n t yy e a r s i ta b s o r b e dt h ev i r t u e so fb o t ht h e c o n v e n t i o n a le l e c t r o p h o r e s i sa n dm o d e r nh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y l c ) a l t h o u g hc e h a san o tl o n gh i s t o r y , i th a sf l o u r i s h e di nw i d ea r e a sb e c a u s e o fi t si n h e r e n tf e a t u r e s ，s u c ha se x t r e m e l ys m a l ls a m p h n gv o l u m e ，c h e a p i n s t r u m e n t a t i o n , h i g hs e p a r a t i o ns p e e da n de f f i c i e n c y i nr e c e n ty e a r s ，c eh a sb e e n e x t e n s i v e l ys t u d i e da n da p p l i e da sah i g h l ye f f e c t i v ea n a l y t i c a l m e t h o d 缸m o d e r n a n a l y s i s a n de x c e f i e n tp r o s p e c t s o fc eh a v eb e e ns h o w ni nt h ef i e l d so f p h a r m a c e u t i c a la n a l y s i s ，b i o c h e m i c a la n a l y s i s ，f o o da n a l y s i s ，a n d e n v i r o n m e n t a l a n a l y s i s h o w e v e r , t h es m a l ls a m p l ei n j e c t i o nv o l u m ea n dv e r yt h i nc a p i l l a r yb r i n ga b o u t d i f f i c u l t i e st od e t e c t i o n s t h ec o m m o l lu s e dd e t e c t i o nm e t h o d sa r eu l t r a v i o l e t ( u v ) ， l a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e ( l i f ) ，l u m i n e s c e n c ed e t e c t i o na n dm a s ss p e c t r a ( m s ) b e c a u s ea m p e r o m e t d cd e t e c t o r0 气d ) i sm o s e n s i t i v et h a nu v - v i s i b l ed e t e c t o ra n d m u c hc h e a p e rt h a nl i fd e t e c t o r , i ti sp r e f e r r e dt oc o u p l ew i t hc ei nm a n ya n a l y s i s a r e a s c o m m o na m p e r o m e t f i cd e t e c t o r s ，b a s e do n 酉a s s yc a r b o no rc a r b o np a s t e e l e c t r o d e s e x h i b i tn or e s p o n s ef o rm a n ya n a l y t e sb c c a u s co fal l i g ho v e r p o t e n t i a l t h e b e n e f i t so fu s i n gc h e m i c a l l ym o d i f i e de l e c t r o d e s ( c m e s ) i nt h e s es y s t e m si n c l u d e a c c e l e r a t i o no fe l e c t r o nt r a n s f e rr e a c t i o n s ，p e r m s e l e c t i v et r a n s p o r t ，r e d u c t i o n i n f o u l i n g , a n dp r e f e r e n t i a la c c u m u l a t i o no fa n a l y t e d e s p i t eo ft h e s ea d v a n t a g e so f c m e s ，n oe n o u g hr e p o r t so ft h e i ra p p l i c a t i o ni nc eh a v ea p p e a r e d t h eg o a lo ft h i s d i s s e r t a t i o ni st oa p p l yc m e si n t oc e a dt e c h n i q u et oe x t e n di t sa p p l i c a t i o na r e aa n d t oi m p r o v et h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t y t h ec o n t e n t so ft h ed i s s e r t a t i o ni n c l u d et h r e e c h a p t e r s ： ht h ef i r s tc h a p t e r , t h ec h a r a c t e r i s t i c so fc e , t h es e p a r a t i o nm o d e l s ，t h ei n j e c t i o n t e c h n o l o g i e so fc e , t h ed e t e c t o r s ，t h es t u d i e sa n da p p l i c a t i o n so fc es i m p l ya r e i n t r o d u c e d c h a p t e r2i st h ed e t e r m i n a t i o no ff o u rk i n d so fc a r b a m a t ep e s t i c i d e sb yc a p i l l a r y z o u ee l e c t r o p h o r e s i sw i t ha m p e r o m e t d cd e t e c t i o na tap o l y a m i d e m o d i f i e dc a r b o n p a s t e e l e c t r o d e i nt h i s p a p e r , ap o l y a m i d e m o d i f i e d c a r b o np a s t ee l e c t r o d ei n c z e - - a dw a sf i r s t l ya p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no f f o u rc a r b a m a t ep e s t i c i d e s ： 6 f e n o b u c a r b ，i s o p r o c a r b ，m e t o l c a r ba n d c a r b a r y l t h ef o u rc a r b a m a t e sw e r eh y d r o l y z e d i na l k a l e s c e n ta q u e o u ss o l u t i o n s ，r e s u l t i n gi nt h ef o r m a t i o no f2 - s e e - b u t y l p h e n o l , 2 - i s o p r o p y l p h e n o l ，m - c r e s o l a n d d - n a p h t h o l ，w h i c hc o u l db cd e t e r m i n e db y a n a p e r o m e 仃ya f t e rc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e d cs e p a r a t i o n u n d e rt h es e l e c t e do p t i m u m c o n d i t i o n s ，t h ef o u ra n a l y t e sc o u l db ep e r f e c t l ys e p a r a t e dw i t h i n2 3m i n t h el i n e a r r a n g e so f2 - s e e - b u t y l p h e n o l ，2 - i s o p r o p y l p h e n o la n dm - c r e s o w e r ef r o m1 o x l o 7 t o 2 0 x 1 0 5t o o lr la n dt h a to fa n a p h t h 0 1w a sf r o m2 0 x 1 0 7t o2 0 x l f f 5m o ll - 1a n d t h e i rd e t e c t i o nl i m i t sw e r e3 0 x 1 0 8 ，3 0 x 1 0 8 ，3 0 x 1 0 8a n d6 0 x 1 0 8t o o ll 1 r e s p e c t i v e l y ( s 皿咭3 ) a b o v er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h i sm e t h o dw a so fh i g h s e n s i t i v i t y , g o o dr e p e a t a b i l i t ya n dc o u l db eu s e di nt h er a p i dd e t e r m i n a t i o no ft h e p e s t i c i d er e s i d u e s d e t e r m i n a t i o no f c a r b o h y d r a t e sb yc a p i l l a r y z o n e e l e e t r o p h o r e s i sw i t h a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o na tal l a n o n i c k e lo x i d em o d i f i e dc a r b o np a s t ee l e c t r o d ew a s r e p o r t e di nc h a p t e r3 i nt h i sp a p e r , an a u o n i om o d i f i e dc a r b o np a s t ee l e c t r o d ei n c a p i l l a r yz o u ee l e e t r o p h o r e s i sw i t ha m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n ( c z e - a a ) ) w a sf i r s t l y a p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fc a r b o h y d r a t e s e f f e c t so fs e v e r a li m p o r t a n tf a c t o r s s u c ha sd e t e c t i o np o t e n t i a l ，t h ec o n c e n t r a t i o no f r u n n i n gb u f f e r , s e p a r a t i o nv o l t a g ea n d i n j e c t i o nt i m ew e r ei n v e s t i g a t e dt oa c q u i r et h eo p t i m u mc o n d i t i o n s u n d e rt h e s e l e c t e do p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h r e ec a r b o h y d r a t e s ：# u c o s e ，s u c r o s ea n df r u c t o s ec o u l d b ep e r f e c t l ys e p a r a t e dw i t h i n2 0m i n t h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e np e a kc u r r e n ta n d c o n c e n t r a t i o no ft h r e ec a r b o h y d r a t e sw e r el i n e a ro v e ra b o u t3o r d e r so fm a g n i t u d e w i t hd e t e c t i o nl i m i t s ( s m = 3 ) r a n g i n gf r o m3 0 x 1 0 。7t o6 0 x 1 0 7m o l l l t h e e l e c t r o d ew a ss t a b l e , a n dc a nb eu s e df o ra tl e a s to n ew e e k t h ep r o p o s e dm e t h o dh a s b e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e dt om o n i t o rc a r b o h y d r a t e si nt h er e a l s a m p l e sw i t h s a t i s f a c t o r ya s s a yr e s u l t s k e yw o r d ：c a p i l l a r ye l e e t r o p h o r e s i s ，a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n , m o d i f i e d c a r b o np a s t ee l e c t r o d e ，p e s t i c i d e s ，c a r b o h y d r a t e s 7 第一章绪论 第一节毛细管电泳概述 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 。c e ) ，亦称高效毛细管电泳( h i g h p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，硼c e ) ，是以高压电场为驱动力，以毛细管 作为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离的一类 液相分离技术。 c e 仪器基本结构大致包括毛细管柱、迸样系统、高压系统、检测系统和数据 采集系统等r 1 。毛细管柱是c e 的核心部件，石英毛细管是当今的首选材料。 最常用的毛细管内径为2 0 7 轨m ，有效长度为5 0 7 5c m 。进样系统采用自动迸 样方式，主要有流体力学和电动方式。高压系统要能提供3 0k v 的直流电压。检 测器目前最常用的是紫外一可见光检测器和荧光检测器等 2 - 1 。 e e 作为一种经典电泳技术与现代微柱分离有机结合的新兴分离技术，自上 世纪8 0 年代闯世以来，得到了迅速的发展，其研究和应用涉及环境分析、药物 分离、生化分析等几乎所有的分析领域，引起学术届，尤其是色谱界的广泛关注。 这与它独特的优点是密不可分的：( 1 ) 分离时间短。由于毛细管具有良好的散热 功能，分离毛细管的纵向电场强度可达到4 0 0 v a m 以上，因而分离操作可以在 很短的时间内( 最快可在几秒钟) 完成。( 2 ) 具有很高的分离效率。理论塔板数 达到4 0 0 ，0 0 0 m 以上，最高达w m 数量级。( 3 ) 仪器结构简单，操作简便， 运行成本低，且易实现自动化。( 4 ) 样品用量极少( 仅为纳升级) ，绝对检测限 较低。( 5 ) 溶剂消耗少，环境污染小。( 6 ) 样品对象广，从无机离子到整个细胞， “无所不能”，尤其多用于分离生物多聚体，如肽类、蛋白质、核苷酸，金属离 子、无机离子及药物等。 3 】 溶液中荷电粒子在电场作用下的泳动现象早在1 9 世纪中叶就有人进行研究。 在长期的电泳分离实践中，曾提出了许多电泳模式，随着科学技术的进步，也发 展了形式多样的电泳技术。对c e 最有启发性的工作首推h j e r t e n 4 于1 9 6 7 年发表的一篇论文，他最早提出用窄孔径管在高电场下进行自由溶液电泳，并用 内壁有甲基纤维素涂层的石英玻璃管( i d 3 r a m ) 在慢速旋转下分离。可用于无 机和有机离子、多肽，蛋白质、核酸、病毒和细菌的分离，但操作麻烦。1 9 7 4 年，芬兰的v i r t e n a n 5 提出用2 0 0 5 0 0 t m 内径玻璃管进行分离，但效率不高。 1 9 8 1 年j o r g e r t s o n 和l u k a c s 6 ，7 发表的研究论文对c e 的发展作出了决定性 的贡献，他们用内径7 缸m 的毛细管对荧光标识氨基酸化合物进行c e 分离测定， 9 获得理论塔板数高达4 0 万的高分离性能，并且深入地阐明了c e 的一些基本性 能和分离的理论依据。1 9 8 4 年，日本的t e r a b c 等 8 引入了毛细管电泳的一个重 要分支，即以组分特别是中性粒子在毛细管内的胶束和缓冲液之间的分配为基础 的胶束电动毛细管电泳( m e k c ) ；1 9 8 7 年，h i e r t e n 9 又把传统的等电聚焦过程移 到了毛细管内，提出了毛细管等电聚焦( c i f ) ；同年，c o h e n 和k a r g e r 等 1 0 提出 了毛细管凝胶电泳( c g e ) ，这是现代效率最高的分离方法。 到8 0 年代后期，c e 的研究成为分析化学领域的热门课题，至今已有各种英 文专著1 0 多部，从8 0 年代末开始每年都有多次国际性c e 学术会议，通过s t i n ( t h es c i e n t i f i c t e c h n i c a li n f o r m a t i o nn e t w o r k ) 对美国化学文摘的检索结果表 明，9 0 年代以来，c e 的论文数几乎成直线上升，应用范围迅速扩大，说明毛细 管电泳技术正成为分析科学和生命科学中最受瞩目，发展最快的一种分析分离技 术。 第二节毛细管电泳分离模式 毛细管电泳按分离介质和分离原理不同，存在多种操作模式。如今的毛细管 电泳不再仅仅局限于分离带电荷的大分子粒子，也适合分离阳离子、阴离子以及 中性分子。常见的毛细管电泳的分离模式包括毛细管区带电泳( c z e ) 、胶束电动 毛细管色谱( m e k c ) 、毛细管凝胶电泳( c g e ) 、毛细管等电聚焦( c l e f ) 、毛细管 等速电泳( c r r p ) 和亲和毛细管电泳( a c e ) 等。 2 1 毛细管区带电泳( c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o p h o r e s i s ，c z e ) 毛细管区带电泳( c z e ) 是c e 中最基本，也是最常用的一种分离模式。它 是基于各被测物质的净电荷与质量比间的差异，在直流高压驱动下，以不同的速 度在电解质溶液中移动而导致分离。它要求缓冲液具有均性，毛细管内各处具 有恒定的电场强度 1 1 。毛细管中除电解液外，无需填充任何物质，操作容易， 自动化程度高。一般采用磷酸盐或硼酸盐缓冲液，实验条件包括缓冲液浓度、p h 值、电压、改性剂( 乙腈、甲醇) 等，适用于蛋白质、氨基酸、多肽、对映体、离 子等带电物质的分离分析，对于中性物质无法实现分离。 2 2 胶束电动毛细管色谱( m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r p h y ， m e k c ) 1 9 8 4 年，t e r a b e 等 8 在c e 电解质溶液中加入离子表面活性剂，在溶液 中形成离子胶柬作准固定相，实现了中性分子的分离，这个模式称为胶束电动毛 1 0 细管色谱( m e k c ) 。当把离子型表面活性剂加入缓冲液中，使其浓度超过临界 胶束浓度( c r i t i c a lm i c c l l ec o n c e n t r a t i o n ，c m c ) 时，这种表面活性剂的单体便 会聚集形成一具疏水内核，外部带负电的亲水胶束。目前以阴离子表面活性剂， 十二烷基磺酸钠( s d s ) 胶束使用最为普遍。溶质分子在流动的水相和起到固定相 作用的胶束相( 准固定相) 之间分配，中性粒子因其本身疏水性不同，在两相中 分配存在差异而得以分离。m e k c 弥补了c z e 分离模式的不足，它不仅可以测 定荷电离子，而且可以测定中性粒子，适用于氨基酸、肽类、小分子物质、手性 物质、药物样品及体液样品的分析。近年来，各种各样的表面活性剂得到了研究， 如环糊精、聚乙烯毗啶等，并在许多样品测试中得到了应用 1 2 1 6 。 2 3 毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r yg e le l e c t r o p h o r e s i s ，c g e ) 毛细管凝胶电泳( c g e ) 由k a r g e r 等 1 0 于1 9 8 7 年提出，是将板上的凝 胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。凝胶具多孔性，与分子筛相似，溶质能按分 子大小逐一分离。由于凝胶具有粘度大、抗对流的特点，能减少溶质的扩散，所 得峰型尖锐，柱效极高，是毛细管电泳的理想介质，但制备困难，寿命偏短，重 现性不好，使用时易产生空泡。现已有人研究用粘度较小的线性聚合物，如甲基 纤维素、羟丙基甲基纤维素代替普通的聚丙烯酰胺( p a g e ) ，则可获得无凝胶、但 仍有筛分作用的“无胶筛分”( d _ o n g c ls i e v i n g ) ，分离能力虽稍逊，但柱价低，寿 命长，重现性好，方便实用 1 7 。c g e 和无胶筛分广泛用于生物大分子的分析， 如蛋白质、寡聚核苷酸、r n a 、d n a ，还可用于聚合酶链式反应( p c r ) 产物 分析。 2 4 毛细管等电聚焦( c a p i l l a r yi s o e l e c t r i cf o c u s i n g ，c i e f ) 毛细管等电聚焦( c i e f ) 是将普通等电聚焦电泳转移到毛细管中进行。它具 有较高的分辨率，通常可以分离等电点差异小于o o l p h 单位的相邻蛋白。通过管 壁涂层可使电渗流( e o f ) 降至最小，从而防止蛋白吸附于管壁及破坏稳定的聚 焦区带。聚焦时，于阳极放稀酸，阴极放稀碱，加高电压( 6 8 k v ) 。几秒钟后，毛 细管内部建立起p h 梯度，使两性蛋白顺梯度迁移至各自的等电点处，停下聚焦， 产生一窄的聚焦带。最后再改变阴极的p h 值，即加入含除o f f 之外的阴离子的 物质，如n a c i ，使聚焦后的蛋白依次通过检测器向阴极运动时，得以检测。但在等 电点时，蛋白易沉淀而堵塞柱子，可通过调整聚焦时间、电压、蛋白浓度以及添加 剂等加以解决 1 7 。主要应用于两性化合物如蛋白质等的分析。 2 5 毛细管等速电泳( c a p i l l a r yi s o t a c h o p h o r e s i s ，c 1 t p ) 毛细管等速电泳( c t p ) 是在毛细管内进行的等速电泳。它和其它的电泳技 术一样，也是根据样品的电泳淌度不同而进行分离。c i t e 采用两种不同的缓冲体 系，种是前导电解质，充满整个毛细管柱：另一种称为尾随电解质，置于一端 的电泳槽中，前者的淌度高于任何样品组分，后者则低于任何样品组分。当毛细 管两端加上电压后，样品带在给定p h 值下，按其淌度和电离度大小依次连续迁 移，得到了互相连接而又不重叠的台阶或梯形区带。该方法常用于分离离子型物 质，已有人成功地分析了酮替酚 i s ，胆酸盐 1 9 和b 一内酰胺类抗生素 2 0 ，并 因适用较大内径的毛细管而可用于微制备。 2 6 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye i e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ，c e c ) 毛细管电色谱( a ) 可以看成是c z e 中的空管被色谱固定相填充的结果， 以样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以电渗流为流动相驱动力的色谱过 程，可同时分离离子和中性分子。c e c 是c e 与h p l c 的有机结合，既有c e 的 高柱效，又有h p l c 的高选择性，利用涂层还可有效减少生物大分子如蛋白分子 在毛细管壁的吸附，改善峰形，提高选择性，是一种很有发展前景的模式 2 1 2 3 。 2 7 亲和毛细管电泳( a m n i t yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，a c e ) 亲和毛细管电泳( a c e ) 是指在电泳过程中具有生物专一性亲和力的分子受 体( r e c e p t o r ) 和其配体( 1 i g a n d ) 问，发生了特异性的相互作用，形成了受体一 配体复合物，通过研究受体或配体在发生亲和作用前后的电泳谱图变化，可获得 有关受体一配体亲和力大小，结构变化，作用产物等方面的信息 2 4 ，2 5 。a c e 研究受体与配体相互作用，与传统方法相比，有很多优点。需要样品量很少；对 受体纯度要求不高；可同时研究多种配体对一种受体结合行为；在溶液中进行， 可保持蛋白与配体作用所需要的生理条件，更接近体内结合行为；不需对受体或 配体进行标记，简化操作步骤；有多种模式可供选择；适用各种亲和体系；测定 速度快；准确性好 2 6 2 。a c e 技术广泛应用于分子生物学和生物化学等研究领 域 2 7 ，如核酸片段的特异性识别，蛋白相互作用，竞争性免疫分析，药物一 受体和药物一蛋白作用研究 1 等。此外，a c e 也可用于提高毛细管电泳分析灵 敏度，选择性和分辨率。 2 8 非水毛细管电泳( n o n a q u e o u sc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，n a c e ) 非水毛细管电泳( n a c e ) 以有机溶剂完全代替水作为电泳介质，利用各种 有机溶剂的不同物理、化学特性来控制电渗流和对应体的迁移。常用溶剂有甲醇、 乙腈、甲酰胺等，乙酸及其铵盐也是普遍使用的电解质。n a c e 主要用于分析不 易溶于水而易溶于有机溶剂的物质，或者分离在水溶液中淌度十分相似的物质。 w a l b r o h e l 等 2 s 于1 9 8 4 年首次以乙腈为非水溶剂分离了几何异构体喹啉和异喹 啉，取得了不错的效果。这种分离模式具有灵敏度高、改善分离、减少毛细管内 壁吸附等很多优点，但仍存在很多限制性因素，而且要选择合适的有机溶剂也有 一定的难度。 2 9 毛细管矩阵电泳( c a p i l l a r y a r r a ye l e e t r e p h o r e s i s ，c a e ) 毛细管矩阵电泳( c a e ) 是将几十根甚至几百根等长的毛细管平行并列在一 起，同时分离检测大量的样品。它是在常规c e 原理和技术的基础上，结合微型 制造技术设计出来的一种检测技术，具有物料通量大，可以实现几十或几百个样 品同时分析，单个样品分析成本低的特点。同时，由于毛细管很多，起到了分流 作用，可以施加更高的电压，在保证分离效率的同时减少了分离时间e 2 9 。c a e 对于d n a 快速测序具有其他方法所无可比拟的优越性。 2 1 0 集成毛细管电泳芯片( i n t e g r a t e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sc h i p ，i c e c ) 集成毛细管电泳芯片( i c e c ) 技术是以晶体硅、玻璃、塑料、陶瓷和硅橡胶 为基体材料，利用微细加工技术，将高效毛细管电泳移植到平方厘米级大小的 芯片上，通过在芯片上加工出沟道和其他的功能单元，实现样品的进样、反应、 分离、检测等过程的集成。这是一种多功能、快速、高效、低耗的缩微实验技术 3 0 。1 9 9 2 年，m a n z 3 1 1 等首次采用光刻化学腐蚀方法，在玻璃片上刻蚀微通 道，用熟键合方法 3 2 把另一块玻璃片粘贴到带有微通道的玻璃片上，制成十 字交叉型玻璃电泳芯片。同年在瑞士巴塞尔举行的高效液相色谱会议上以及在美 国洛杉矶举行的i e e e 传感器会议上，以玻璃作为基片材料的毛细管电泳芯片 的实验结果相继问世，i c e c 从此诞生 3 3 该项技术与分析仪器的微型化和集 成化紧密相连，使得其能符合现代化学、制药工业的低成本和高产出的需求，广 泛用于生物医药和i 临床实验中。 第三节毛细管电泳检测技术 c e 发展初期，j o r g e n s o ne 3 4 曾指出，c e 技术的广泛应用与深入发展所面 临的主要挑战是高灵敏度与多模式检测器的发展。二十多年来，为了适应c e 微 体积和在柱检测的需要，在检测方法和检测器方面进行了大量的和卓有成效的研 究，发展了许多类型的检测器，有光学、电化学及质谱学检测器等。 3 1 紫外一可见吸收检测法 紫外一可见吸收检测法( u v 一s ) 是c e 分离中应用最广泛的一种检测方 法。石英毛细管可透过2 0 r i m 波长以下的紫外光，因此允许从紫外到可见光这一 波长范围内对样品组分进行检测。而且由于透光窗口直接开在毛细管上( “在柱” 检测) ，所以检测器本身不存在死体积及因此而造成的组分混合所产生的样品区 带展宽现象。事实上样品组分的分离在检测窗口处仍在进行，为了获得高效，检测 区的宽度应小于样品组分的区带宽度，也就是说透光窗口应足够的小。毛细管电 泳峰宽一般在2 5 m m 之间，所以透光窗的尺寸应控制在上述峰宽的1 3 以内。 紫外可见光吸收检测法的优点是对组分区带不会引起额外展宽，而且其通用性 较强、仪器技术成熟和价格适中，因此已成为商品c e 仪器最常用的检测器。缺 点是受狭窄孔径的限制，灵敏度较低( 检测限一般为1 0 5l o - 6 m o l l - ：) 3 5 。因 此，为了进一步降低吸收检测限，提出了不少有关扩展吸收光程和提高吸收检测 灵敏度的新方法、新技术。i i a f t w i c h 3 6 1 等采用一个纳升级多反射单元，光路长 度扩展了4 4 倍，检测限提高了4 0 倍，达到了6 5 x 1 0 - s m o l l 。此外采用轴向光吸 收模式 3 7 灵敏度也得到进一步提高。 3 2 荧光检测法 荧光检测法( i f ) 的原理是用激光作为光源，通过诱导被测样品的荧光基团 发出荧光信号来测定分析物。因对组分区带不会引起额外展宽，检测灵敏度很高， 和紫外检测器相比，检测限可降低3 4 个数量级，尤其是激光诱导荧光检测 ( u f ) ，其灵敏度可高达1 0 1 2 1 0 - 1 6 m o l l 是目前毛细管电泳中最灵敏的一种检 测方法 3 8 。 间接荧光检测法常用于待测物本身不发生荧光而又缺乏合适的衍生化试剂， 该方法是基于将荧光离子作为电泳缓冲液的主要组分，待测离子与荧光离子之 间由于电荷的替代或生成离子以达到检测的目的 3 9 。k u h r 等 4 0 首先应用 间接荧光检测法分离和检测氨基酸。 3 3 质谱检测法 质谱( m s ) 检测是基于分子荷质比的不同，它不仅可以区分不同分子质量 的分析物，不同质量分裂模式的分析物，还能提供分子结构信息，是c e 非常理 想的一种检测器。1 9 8 7 年o l i v a r e s 4 1 首次报道了c e - - m s 联用技术，并得 到了很大的发展。质谱检测的灵敏度高，结构分析能力强，但是关键是接口技术。 1 4 常用的有同轴连续流快原子轰击接口 4 2 和电喷雾电离接口 4 3 。 3 - 4 化学发光检测法 化学发光检测( c l ) 的原理是在检测窗口引入发光试剂，使它与分析物复合 发光，通过检测此光信号达到检测分析物的目的。该法不用外加光源，因而背景 低，可获得很高的灵敏度，而且线性范围宽，仪器设备简单。近年来已经开始同 毛细管电泳联用，直接用于复杂样品中微量组分的分离和测定，颇引人瞩目。 g i l m 纽等 4 4 基于l m n i n 0 1 h 2 0 2 反应将电致发光检测引入毛细管电泳，l u m i n o l 和h 2 0 2 在电极表面氧化后形成超氧化自由基，进而产生激发态的产物，化学发 光的波长在4 2 5n m 。碳纤维电极响应稳定，但灵敏度不及铂丝电极，对鲁米诺的 检测限分别为9 2a m o l 和2 6 0a m o l 。用该法分离a b e i 衍生的正辛胺、正丙胺， 检测限分别为2 0 f i n o l 和0 9 6 f m o lh 2 0 2 浓度，电极材料和微电极上的电压对结 果有影响。 3 5 电化学检测法 电化学检测( e c ) 包括电位法、电导法和安培法。同其它检测方法相比，电 化学检测灵敏度高，线性范围宽，选择性好，而且设备简单，价格低廉，便于推 广和使用。安培法测量化合物在电极表面发生氧化或还原反应，失去或得到电子 时，产生与分析物浓度成正比的电流。电导法和电位法是测量两电极间由于离子 化合物的电荷迁移，引起的电导率或电位的变化。其中，安培法是三种模式中最 容易实现，最普遍应用的一种电化学检测法，同时也是本论文的主要研究课题。 第四节毛细管电泳电化学检测技术进展 c e e c 有三个基本模式：安培法，电导法和电位法。与其他检测方法相比， 电化学检测法有其独特的优点：灵敏度高，检测体积小，因此可用于窄孔径 ( 2 5 z mi d ) 毛细管检测，为微体积环境( 如单细胞) 研究提供了高灵敏度方 法。目前，c e - e d 的理论和技术的研究处于发展和完善的阶段，应用领域在不 断的拓宽，展现了其广泛的应用前景。 4 1 安培检测技术 安培检测( a d ) 是c e e c 中应用最多的一种检测方式，1 9 8 7 年由 w a l l i n g f o r d 4 5 等首次将其应用于c e 分离分析中，迄1 0 多年来得到很大发展。 安培检测具有灵敏度高、选择性好、响应速度快等特点。 4 1 1 检测方式 安培检测技术发展至今主要有离柱安培检测( o f f - c o l u n m ) 和柱端安培检测 ( e n d - c o l u m n ) 两种方式。 安培检测从一开始被引入毛细管电泳中，多为离柱检测r 4 6 ，即用一接头 将分离与检测毛细管连接，使c e 分离电压和电流与e c 检测系统相隔离，减小 对e c 检测信号的干扰，因此，接头是该检测方式的关键。根据目前文献报道，接 头材料一般使用多孔玻璃和石墨、n a t i o n 、t e f l o n 、钯管、醋酸纤维素膜