（园林植物与观赏园艺专业论文）百合LfMADS基因表达载体构建及其功能分析.pdf

百合l f m a d s 基因表达载体构建及其功能分析 摘要 为了分析百合l f m a d s l 3 基因的功能，获得高效的植物表达载体，通过转化百合获得更多 百合花器官变异的表型奠定基础我们构建了p b i n l i m a d s l ，3 基因的正、反义植物表达载体， 并将构建的p b i n l f m a d s l ，3 植物表达载体通过根癌农杆菌介导转化烟草。p c r 检测结果表明， 大部分抗卡那霉素烟草植株中检测到与阳性对照大小一致片断，初步证明外源基因已经插入到烟 草基因组中。其中l f m a d s l ，3 正义、反义基因对烟草的转化率( p c r 阳性) 分别为9 8 、9 1 、 8 9 和9 5 。 转p b i n l f m a s d l 反义基因的阳性开花植株中发现其中l 朵花的雄蕊极短、花药缺失的异常 现象。转p b i n l t m a s d i 正义基因的阳性开花植株中发现1 个花萼变成花瓣的嵌合体，其他花器 官和营养器官没有发生变化。其中p b i n l j m a d s i 反义、正义基因转化烟草的变异率分别是2 和2 。 转p b i n l f m a s d 3 反义基因阳性植株中发现l 植株的苞叶发生部分花瓣化，花柄变短；转同 样基因的另外一个植株上发现1 朵花中的1 个雄蕊完全缺失。在转p b i n l f m a s d 3 正义基因的阳 性植株中没有发现花和植株的变异现象。其中p b i n l i m a d s 3 反义、正义基因转化烟草的变异率 分别是3 和o 。 通过与其他模式植物的花器官特性基因的比较，转百合基因的烟草植株的表型与相关转基因 植株表型既有相似之处，又有所不同；百合花器官特性基因的表达模式可能与模式植物花器官特 性基因的表达模式有所不同。根据现有实验结果，我们认为l y m a s d t 和l j m a s d 3 分别是百合花 器官发育的c 功能基因和s e p 基因。 关键词：百合，e 月l 纠d s 基因，载体构建，功能分析 c o n s t r u c t i o no fe x p r e s s i o nv e c t o ra n df u n c t i o na n a l y s i s o fl f m a d sg e n e sf r o ml i l i u m a b s t r a c t t oi d e n t i f yt h ef u n c t i o no fl i l yl f m a d s l 3g e n e s ，o b t a i nt h eh i g h l ye f f i c i e n tp l a n te x p r e s s i o n v e c t o r s ，l a y saf o u n d a t i o nf o rt r a n s f o r m i n gl i l ya n da t t a i n i n gas e r i e so f v a r i a n tf l o w e r s ，w ec o n s t r u c t l i l yl f m a d s l ，3s e n s ea n da n t i s e n s ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o i s l f m a d s l ，3g e n e sp r o m o t e db y3 5 s p r o m o t e rw a sc o n s t r u c t e d i n t ot h ep b i n 4 3 8p l a s m i dv e c t o lt h e nt r a n s f o r m e di n t ot o b a c c ob y a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n su b a 4 4 0 4 t h ep r e l i m i n a r yr e s u l t so fp c rf o rt r a n s g e n i cp l a n ts h o wt w o l f m a d s l ，3g e n e s w a si n t r o d u c e di n t ot h et o b a c c og e n o m e t h ep r o p o r t i o no ft r a n s f o r m e d 3 5 s ：l f m a d s l 3s e n s e a n da n t i s e n s e t r a n s g e n i cp l a n t w a s9 8 ，9 1 ，8 9 a n d9 5 s e p a r a t e l y e c t o p i ce x p r e s s i o no f 3 5 s ：l f m a d s la n t i s e n s e ；nt o b a c c oo n l yp r o d u c e do n eo f s t a m e nt r u n c a t e d w i t ha n t h e r t o b a c c op l a n tt r a n s f o r m e dw i t h3 5 s ：l f m a d s ls e n s eg e n e r a t e dt h em u t a t i o ni nw h i c ht h e p a r t i a ls e p a lw e r ec o n v e r t e di n t op e t a l o i do r g a n s ，n oo t h e rf l o r a lo r g a n sc o n v e r s i o nw a so b s e r v e d t h e p r o p o r t i o no fv a r i a t i o no ft h et r a n s g e n i c3 5 s ：l t m a d s l a n t i s e n s ea n ds e n s ep l a n tw a s2 a n d2 s e p a r a t e l y 3 5 s ：l f m a d s 3a n t i s e n s et r a n s g e n i cp l a n t ss h o wn o v e lp h e n o t y p e sb yc o n v e r t i n gp a r t i a lb r a c t s i n t op e t a l s b yc o n t r a s t ，t r a n s g e n i ct o b a c c o ，w h i c he c t o p i c a l l ye x p r e s s e s3 5 s ：l f m a d s 3s e n s e ，w e r e m o r p h o l o g i c a l l yi n d i s t i n g u i s h a b l ef r o mw i l d - t y p ep l a n t s n l ep r o p o r t i o no fv a r i a t i o no f t h et r a n s g e n i c 3 5 s ：l i m a d s 3a n t i s e n s ea n ds e n s ep l a n tw a s3 a n do r e s p e c t i v e l y i n c o m p a r i s o nt o t h ee x p r e s s i o no fo t h e rf l o w e ro r g a ni d e n t i t yg e n e si nm o d e lp l a n t s ，t h e e x p r e s s i o no ff l o w e ro r g a ni d e n t i t yg e n e s f r o ml i l i u mw a sd i f f e r e n t ，i nw h i c had i f f e r e n tg e n e e x p r e s s i o np a t l e mc o u l db ei n v o l v e d t h ep r e s e n tr e s u l t ss u g g e s t e dt h a tl f m a d s li st h ea g l i k eg e n e a n dl m a d s 3b e l o n g st os e p - l i k eg e n e k e yw o r d s ：c o n s t r u c t i o no f e x p r e s s i o nv e c t o r ；f u n c t i o na n a l y s i s ；l f m a d s ；l i l i u m 编号名称 表1 1 分离克降的百台基因 表l - 2 自台道传转化表 表2 - 1 合成的引物一览表 表2 - 2 p c r 反应参数 表3 - 1 脚n s ，3 基因对烟草的转化率 发其变异军 图t - i 模式植物拟南芥花发育模型 圈l - 2 百台花发育模型 1 翌2 - 1 正反义植物表达载体构建技术路 线 图2 2 双向植物表达载体构建技术路线 图表清单 页码编号名称页码 4 船i o 竺u m 椰反义删质粒构建示2 7 意图 l o 图2 - | j p a r t l f m a d s i 质粒构建示意图2 8 1 2 图2 - l2 农杆菌l f m a d s 菌落p c r 扩增 2 9 1 7 嗤3 i ：竺霉素对农杆菌侵染“后的叶片 3 4 筛选 。 3 7 3 3 1 4 l5 图2 - p g e m + t e a s yl f m a d se c o r l 甑 2 2 切 一 凹2 - 4 l f m a d s ! 。3l f 义基因的p c r 扩增2 3 i 兰j2 - 5 l f m a d s i 3 反义基因的p c r 扩增 2 3 图2 6 ：，珊基因克隆表达载体e c 。r l 2 4 酶训 图2 7 竺：n 鲫双向基囡克隆表达载体 2 4 酶切 一 图2 8删傩基嗣植物表达载体，s b a m h l 丰口s a l i 醇切 圈2 一p b i n - l f m a d s 正义基因质粒构建 2 6 示意图 一 图3 - 2 抗性烟草愈伤和小茧3 4 图3 - 3 转基圆植株叶片变皱3 4 图3 - 4 转正义l f m a d s i 基因烟草p c r 检测3 5 图3 - 5 转正义l f m a d s 3 基选j 炳草p c r 检测3 5 图3 - 6 转反义l f m a d s i 基冈烟草p c r 检测 3 6 图3 7 图3 - 8 图3 - 9 图3 ，l o 图3 1 l 图3 1 2 转反义l f m a d s 3 基冈烟草p c r 检测3 6 转l f m a d s i 正义基因烟草花萼瓣化 表型 3 8 转l f m a d s i 反义基因烟草花药缺失3 8 转l j m a d s 3 反义皋斟烟草花萼瓣化 表型 3 9 转删蹦，反义基因烟草雄钴部分 缺失表型 3 9 商业重瓣花百合表型 4 i 缩略词 缩略词英文全称 译名 a n l p a m p l c i l i n氯苄青霉素 b a b e n z y la m i n o p u r i n e 苄基腺嘌畸 c t a i b c e t y l t r i n l e t h y a m m o n i u mb r , r n i d e | 六烷基三甲基溴化铵 m s m u r a s h i g ea n ds k o o g m e d i u m 一种常用的基本培养基 d n t p d e o x y n u e l e o t i d et r i p h o s p h a t e3 - 磷酸脱氧核糖核睃 i b a i n d o l e b u w r i ca c i d吲哚j 酸 e be t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 n a a n a p h t h y l a c e t i ea c i d 禁乙酸 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 i 矗k i r i sh y d r o x y m e t h y ta m i n om e t h a n e 二羟甲摹氯基甲烷 e d t a e t h y l e n ed i a m i n e t e t m a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 i p t g l s o p r a p h y l ，b d - t h i o g a l a c t o s i d e 异丙基b d 硫代半乳藉苷 k a n k a n a m y c i n p 那霉熏 r i f r i f a m p i e i n利富平 c a rc a r b e n i c i l l i n 接苄青霉黍 r t - p c rr e v e r s et r a n s c r i p t a s e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 反转录p c r s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十= 烷基硫酸钠 x g a l 5 - h r o m o ，4 - c h l o r o 3 i n d o l y l g a l a - 1 3 - d - c t o s i d e 5 - 溴一4 氯3 - 吲哚半乳糖萤 m a d sb o x m c m l ，a g a m o u s d e f a - s r f b o xm a d s 盒 a s a e e t o s y r i n g o n e 乙酰丁香酮 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文巾特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业人学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的i 亩j 志列本研究所做的任何贞献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：杰多p 筢 时问： 口拜角，日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印什和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制f 段保存、亍 编学位论文。同意中国农业大学可阻用小同方式在- f i c 媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名 鑫印易 别纠 时l 司：叠以年5 日f s b i t j i n i 击5 年l 其撂b ，百台基因工程研究进展 第一章百合基因工程研究进展 百合是百合科( l i l i a c e a e ) 百合属植物的总称，为多年生球根花卉。百合花大色彩丰富， 花姿优美，既能作切花、盆花，又能在园林绿地中应削。百合的育种工作始于2 0 0 多年前的日本， 随着百台商业化程度的提高，人们对百合的观赏性状和栽培性状需求越来越高，使得1 9 世纪初 欧美等国家掀起了百合育种的高潮，目前主要围绕着花色、诧香、花形、花期、株型等观赏性状 的改良，以及抗病、抗寒、抗热、耐弱光、繁殖能力强、瓶插寿命、无花粉等栽培性状的改良进 行育种。传统百合育种以杂交为主，随着育种方法的不断改进，百合的育种工作取得了卓越的成 就，全世界以荷兰和美国为中心，培育出了数千个百合新品种，每年有人批百合新品种上市并销 往世界各地。这些品种具有引人注目的观赏效果及出色的商业价值，在世界花卉市场上取得了很 好的销售业绩，但杂交育种年限长、远缘杂交困难，引入某一或某些优良性状同时往往伴随一些 不良的性状。 近年来，随着分子生物学技术的广泛应用，观赏植物的分子育种工作也取得了迅速的发展， 所谓分子育种是指利用分子生物学技术，将目的基因或d n a 片断通过载体或直接导入到受体细 胞的基因组染色体上，使得遗传物质重新组合，经过细胞的复制增值，外源基因在受体细胞中表 达，使得遗传物质发生定向的改变，然后从转化的植株筛选出有价值的新类型植株，从而创造新 的品种。它具有引入外来基因扩大基因库的同时，定向修饰花卉某个或某些性状而保持其它性状 不变的独特优点。相对大田作物，观赏植物安全性方面的要求大大降低，容易被公众接受。因此， 分子育种技术在花卉品种改良和新品种选育方面的应用倍受关注。百合分子育种工作起步较晚， 但是在近几年中，科学家们围绕着百合花型、抗病毒的育种目标，从基因的克隆、载体构建、基 因转化、再生体系的建立、转基因的检测等方面都有相当的进展，但是真正利用转基闪技术定向 的创造新的百合品种还未见报道。 1 1 百合基因的分离鉴定和表达 1 11 百合花发育相关基因的分离鉴定及表达 百合基因分离的方法晟初主要通过筛选表达文库，后来则利用p c r 方法快速分离。基因的 鉴定除了进行序列分析比较外，主要依据表达特征分析，在模式植物中进行过量表达或抑制表达 等来推测。而从分子生物学角度研究百合花发育的有台湾中兴大学杨长贤实验室、德国t h e i s s e n 实验室、荷兰瓦格宁根大学的国际植物研究所，中国农业大学观赏园艺与园林系园林植物遗传育 种与生物技术试验室等。 杨长贤实验室利用r t - p c r 的方法从麝香百合的花芽中提取总r n a ，用r t - p c r 方法分离克 中国农业大学硕士学位论文 i m l li m li i i 降了花发育相关基因，对l m a d s i 和l m a d s 2 两个基因作了进一步功能鉴定后，推测二者分别 为百合中的b 功能基冈( t z e n g 等，2 0 0 1 ) 和d 功能基因( t z e n g 等，2 0 0 2 ) 。其中l m a d s i 全 长1 0 2 1 b p ，编码2 2 8 个氨基酸具有典型的m a d sb o x ，通过与a p 3 同源基因表达特征分析， l m a d s i 具有典型的a p 3 基因家族的特征。在3 5 s 启动子控制下，l m a d s i 的蛋白仅仅在花瓣和 雄蕊中表达，表明l m a d s i 可能在转入后调控。在3 5 s 启动子控制卜 ，l m a d s l 全序列在拟南芥 中异位表达，转l m a d s i 基因植物表现不正常的表型，植株变小、早花、花朵减少、花朵不能完 全开放、花瓣和雄蕊停止生长，由于雄蕊太短和不成熟的花药不能产生花粉导致植株雄性不育。 去除m a d sb o x 区域后，在3 5 s 启动子控制下的在拟南芥中异位表达，表达产生类似于印j 的表 型，仅仅产生2 轮花器官花萼和雌蕊。扫描电镜观测发现，短的花萼状结构的表皮细胞与野生型 花萼表皮细胞类似，短的雄蕊的状物表皮细胞与野生型雌蕊表皮细胞类似，他们认为这可能是 l m a d s l p i 的异源2 聚体不能充分有效的调节下游基因导致。l m a d s 2 与f 8 p 7 j j 和a g l i i 类 似，l m a d s 2 的m r n a 主要在胚珠中表达，在心皮有少量表达在其他花器官和营养器官中沉 默，在拟南芥中异位表达产生了3 5 s ：a g 植物的表型，植株变小、早花，丧失花决定性。有些产 生类似于a p 2 的表型，诱导花萼变成心状结构，可以看到柱头乳突和胚珠，花瓣变成雄蕊状结构， 推测为d 功能基因表达特征。t z e n g 等( 2 0 0 3 ) 用r t - p c r 和5 - r a c e 技术获得了铁炮百合 l m a d s 3 和l m a d s 4 两个基因。l m a d s 3 和拟南芥的s e p a “谢3 高度同源，长1 0 1 2 b p ，编码 2 4 2 个氨基酸。l m a d s 4 有1 0 8 8 b p ，编码2 4 6 个氨基酸。花分生组织、花芽生长各个阶段、花器 官中都可匕上检测到两者的m r n a 的存在，l m a d s 4 的m r n a 还可以在花序组织和叶片上检测到。 两者在拟南芥中异位表达对花型和花的转化作用效果不同。转l m a d s 3 植株花朵变化大，h 开花 时间提早，失去花分生组织的终止性，提早开花的表型与上游的开花时间基因f 7 、c 0 1 、 l u m i n l d e p e n d e n s 以及花分生组织基因l e a f y 、a p e t a l a i 相关；相比之下，转l m a d s 4 基 因的拟南芥形态没有变化 日本a k i m k a n n o 博士在t h e i s s e n 实验室作博士后期间，曾克隆了多个岷江百合( l i l i u m m g 日k ) 花发育相关基冈，i ：从分子进化的角度对l r d e f 、l r g l o a ，l r g l o b 三个来源于百合的b 类基 因的功能作了分析( w i n l e r 等，2 0 0 2 ) ，这3 个基因与杨长贤实验室所克隆的l m a d s i 不同稍 后在g e n b a n k 上公布了序列。 荷兰瓦格宁根大学的国际植物研究所b e n e d i t o 等( 2 0 0 4 ) 以铁炮百合花芽为材料，构建 m a d s b o x 基因的文库，并克隆出与拟南芥s e p 3 转录因子具有高度相似性的l l s e p 3 基因。通 过d n a s t a r 软件进行序，4 分析，发现l l s e p 3 与兰科植物石斛兰( d e n d r o b i u mg r e x ) 的d o m a d s 和o m l 亲缘关系最近；n o r t h e r n 杂交分析发现，l l s e p 3 的m r n a 在整个百合花的发育以及成 熟花的花被、雄蕊和心皮中表达，在叶中不表达。l l s e p 3 在c a m v 3 5 s 启动子的作用下超表达 可以诱导拟南芥提早开花但并不诱导花器官的同源异型变化。l l s e p 3 与推断的百合e 功能基 因作用一致。b e n e d i t o 等( 2 0 0 4 ) 以铁炮百合雪后为材料，反转录合成l l a g lc d n a ，长1 1 7 1 b p ， 编码2 4 4 个氨基酸。在拟南芥中异位表达发现，强突变体表型类似a p 2 突变体植株变小、叶卷曲、 变矮、早花。有些花萼上部具有雌蕊柱头的乳突，有时候花瓣变雄蕊，弱突变生长正常，花型变 化很少，表明l l a g l 是一个a g a m o u s 同源基因。b e n e d i t o ( 2 0 0 4 ) 发现了一个新突变体，雄蕊 2 完全变成花瓣而雌蕊没有变化，这种表型在模式植物拟南芥中没有发现，命名为f e s t i v a 。 中国农业人学网林植物遗传育种与生物技术实验室张云( 2 0 0 4 ) 等利用r t - p c r 及5 - r a c e 技术，从百合雌蕊中分离克隆了l j m a d s l ，l j m a d s 2 、l f m a d s 3 个近全长的白合花发育相关 基冈，其中l a e e z 4 d s ：有8 4 6 b p ，编码1 9 2 个氨基酸和2 7 0 b p 的3 非编码区，通过序列比较发现 l j m a d s l 的o r f 的3 端与玉米、水稻等多种单子叶植物的a g 同源基闪有较高的同源性，与风 信于的h a g l 的同源性最高，对应区段的核苷酸的同源性达6 2 6 9 ，氨基酸的同源性为7 5 3 8 。 l j m a d s 2 片段长度为8 2 9 b p ，包括编码1 9 9 个氨基酸和2 2 9 b p 的3 1 f 编码区，与t z e n g 等报道的 l m a d s 2 对应的区段的o r f 的3 端氰基酸的同源性高达9 8 9 9 ，为d 功能基冈。l f m a d s 3 的 片段k7 9 7 b p ，含3 非编码区1 9 7 b p ，编码2 0 0 氨基酸，序列比较发现，与已知功能的s e p l 2 3 同源基阕所编码氨基酸的同源性分别是3 9 6 8 、4 9 3 1 、4 7 7 l ，上述l f m a d s l 、l f l h i a d s 3 两 个基阏序列已丁2 0 0 4 年1 1 月在g e n b a n k 上公布。到目前为【r ，除a 功能基因没有克隆到外， 百合b c d e 功能基因都已经得到，并在模式植物上得到表达，从自合花器官基田在模式植物上的 表达方式看，百合花器官基因表达模式与模式植物有所不同。图卜1 和1 2 分别显示模式稿物拟 南芥和卣台花发育的a b c d e 模型。 图1 1 模式植物拟南芥花发育模型图l - 2 百合花发育模型( 据c o h e n 等，2 0 0 4 修改) 1 1 2 花粉基因的分离鉴定表达 百合的花药大，花粉收集彝易，是花粉生物学研究的模式植物，目前从百合中克隆的基冈中 绝人多数与花粉发育或减数分裂过程相关。a n ( 1 9 9 3 ) 从东方百合分离出一个花药偏好性e d n a 克隆l m p l 3 1 a ，在开花期间，心皮、花瓣、根、叶、花芽中没有检测到m r n a ，仅在成熟的花 粉中表达。k i m 等( 1 9 9 4 ) 从麝香百台( i l i w nl o n g i f l o r u mn e l l i ew h i t e ) 成熟花粉cd n a 文库 中随机筛选2 5 个克隆，用于研究花约m r n a 表达的丰度和这些m r n a 编码的蛋白的功能。d n a 序列分析表明，l m p l 3 1 编码一条多肽与芥茄的花粉偏好基冈l a t 5 9 高度的同源，编码果胶裂解 酶蛋白。l m p l 3 4 编码l 条与硫氧还蛋白具有相似性的多肽。l m p l 3 2 编码1 个1 8 2 个残基蛋白， l 已知序列没有同源性。m o u s a v i 等( 1 9 9 9 ) 从百合中分离一个花药特异基囡l i m l 4 ，在花药发 中国农业大学硕士学位论文 育和花粉形成过程中具有淀粉的积累和淀粉质分化的功能。w a n g ( 2 0 0 0 ) 从麝香百合的成熟花粉 中分离出 个编码诱导脱水蛋白的花粉特异性工l 4 刀基因，作为转录因子在成熟的花粉中积累。 o g a t a ( 1 9 9 9 ) 从麝香百合分离了l i m 5 和l i m l 3 两个新的减数分裂相关的基因，研究发现他们是 细胞外结构元件，并且具有核定位信号功能。d i n g ( 2 0 0 4 ) 从百合花中通过r t - p c r 扩增获得 a q u a p o r i n 1 i k eg e n ea q p l l 基因，分折表明它是一个p i p i 亚家族成员。n o r t h e r n 杂交结果显示， a q p l l 在整个植株上表达，但是特别在幼嫩花瓣中强烈表达。在烟草中的超表达促进叶中的细胞 液渗透能力。 1 1 3 百台病毒基因的分离鉴定表达 刘文洪等( 2 0 0 4 ) 从2 个地区的东方百合( l 肼u me vo r i e n t a lh y b r i d s ) 上分别扩增得到2 条 长约1 0 0 0 n t 片断，将分离物与其他黄瓜花叶病毒( c m v ) 分离物进行了同源比较，c m v - l s 和 c m v - h z 两个分离物都属于c m v 亚组成员。刘文洪( 2 0 0 4 ) 用r t - p c r 从浙江丽水的亚洲百合 扩增2 个p o t y v i r u s 病毒分离物g 和x 的37 端e d n a 片段，序列分析表明均为百合斑驳病毒( l i l y m o t t l ev i r u s ，l m o v ) 。m a s u t a 等( 2 0 0 2 ) 分析了2 个百合株系矗“l e i c h t l i n i i 和l i l i u ml o n g i l o r u m 的黄瓜花叶病毒h l - c m a 和l y 2 - c m v ，尽管它们来自不同的国家和不同的种，但是它们的r n a 3 序列有9 7 的同源性。分子进化树和序列特性表明，2 个百台烟草黄瓜花叶病毒源于同一个祖先。 r y u 等( 2 0 0 2 ) 用r t - p c r 扩增获得1 个百合( l i l i u mt s i n g t a u e n s e ) 黄瓜花叶病毒r n a 3 的全长 序列，用限制性图谱分析发现“一c m v 属于c m v 的亚家族i 中的一新的株系，全长2 2 3 2 b d ， 包含的2 个开放性阅读框分别有8 4 3 b p 和6 5 7 b p ，分别编码3 a 运动蛋白和外壳蛋白。百合的基因 研究主要包括了花器官发育基因和花粉基因，对此我们进行归纳，见表1 1 。 表1 - 1 分离克隆的百合基因 4 百合基因工程研究进展 1 2 百合的遗传转化 1 2 1 不同启动子对遗传转化效率的研究 v a nd e rl e e d e p l e g t 等( 1 9 9 2 ) 采用不同的启动子c a m v 3 5 s 、t r 2 、a c t l 、l a i 5 2 、c h i ap a 2 驱动g u s 报告基因转化百合花粉，仅t r 2 在百合花粉中显示活性。n i s h i h a r a 等( 1 9 9 3 ) 用花药 特异性启动子l a t 5 2 将g u s 基因导入到百合花粉中获得表达。表明l a t 5 2 启动子也是有效的。 w i l m i n k ( 1 9 9 5 ) 等以百合、郁金香为受体研究了c a m v 3 5 s 、水稻的a c t l 、玉米的a d h l 及玉 米的u b i q l 四种启动子的活性。结果发现来自单子叶的启动予能启动g u s 基因在水稻组织上很 好的表达，但在百台等其他单予n l 植物上启动的效果很差甚至沉默，在启动子和报告基闻的中阀 插入一个内含子能降低启动子的活性。t s u c h i y a 等( 1 9 9 6 ) 用c a m v 3 5 s 、a c t l 、a d h l 三个不同 的启动子分别驱动的g u s 基因，转化l i l i u m f o r m o l o n g i 、d a u r i c u m 和l j a p o n i c u m3 种卣合的 鳞片和末成熟的胚胎，结果显示a c l l 启动子和修饰的c a m v 3 5 s 启动子得到了晟大的g u s 基因 的瞬时表达，被认为是有效的百合遗传转化的启动子，尽管g u s 基因5 上游序列的瞬时表达还 受胚龄、培养时间和培养条件的影响。l i p s k y 等( 2 0 0 2 ) 用基因枪法将分别在3 5 s 启动子、a c t 启动子控制下的含有p a t 标记基因和c m v 复制酶缺陷基因转化到铁炮百合雪后愈伤组织中， p c r 检测转基因百合中含有p a t 标记基因，并且没有黄瓜花叶病毒的复制酶基冈。t a b a t a ( 1 9 9 3 ) 等人用直接转化法将含有不同启动予的载体转化到小孢子母细胞、花药、愈伤组织的原生质中， 发现用c a m v 3 5 s 启动子时g u s 报告基因仅仅在来源愈伤的原生质中表达；而用 m c i 2 p r o ( d e l t a l 2 ) 和m e i 2 p r o ( d e l t a l 2 - - s ) 的启动子驱动报告基因时，仅仅在来源丁小孢子母细 胞的原生质体中表达。当启动子基因发生突变时，发现g u s 基因的活性降低，表明g u s 基因在 小孢子母细胞中的活性依赖m e i 2 启动子。 1 2 , 2 农杆菌介导的百合遗传转化 目前用于百合基因转化的方法包括农杆菌介导法、电激法、基因枪法等。由于农杆菌可引起 植物发生可遗传变异、拷贝数少、插入位点固定、后代遗传简单等优点，农杆菌介导的百合遗传 转化常常为大家所推崇。c o e h n ( 1 9 9 2 ) 用鳞片切段与致癌农杆菌菌株c5 8 共培养，得到瘤状突 中国农业大学硕士学位论文 起，并在愈伤组织中检测到冠瘿碱基因的表达。l a n g e v e l d ( 1 9 9 5 ) 将农杆菌株接种到百合植株上， 在百合的茎间产生了肿瘤组织，表明某些农杆菌的株系可以侵染百合组织，这为利用农杆菌进行 百合遗传转化奠定了基础。 农杆菌介导的基冈转化体系中，农杆菌的生k 状况、纯度、浓度对转化具有重要作用。百合 可以通过愈伤组织再生或者直接再生的方式接受外源基因。外源基因对导入的外植体的状态要求 很高依据农杆菌的菌株不同和外植体的不同，侵染的时间是不一样的，抗生素的筛选也非常重 要。 李宝平等( 1 9 9 9 ) 以百合鳞片为材料，通过根癌农杆菌l b a 4 4 0 4 将兔防御素n p 1 基因转化 到百台中，为了提高转化效率，在y e p 液体培养基中加入不同的物质以活化v i r 区基因，研究发 现在收集菌体前3 小时加入1 0 0 u m o l l a s ( 乙酰j 香酮) 为好。唐东芹等( 2 0 0 3 ) 诱导东方百合 西伯利亚鳞片直接分化小植株，结果表明外部鳞片和中部鳞片的分化能力大丁内部鳞片。同 一个鳞片不同段中上段鳞片最差，中段较好，下段分化能力最强。诱导培养基以m s + 1 0 m g l b a + 0 5 m g l n a a + ( 0 1 1 0 ) m 虮2 , 4 d 为宜分化培养基m s + i 0 mg l 1 a a + 0 5 mg l b a 最佳。k a ( 卡那霉紊) 筛选浓度，鳞片为7 5 m g l ，小鳞片叶为1 2 0 m g l ，小叶柄为7 5m g m ，小 叶片为5 0 m g l ；头孢霉素或c a r ( 羧苄青霉索) 选择压可用2 5 0 m g l 。刘菊华等( 2 0 0 3 ) 研究 了龙牙百合( l i l i u ms p p ) 的植株再生和遗传转化，鳞片在m s 十2 ，4 d2 m g ，l + 6 b ao 2 m g l 培养 基上暗培养1 5 天后长出浅黄色的愈伤组织，用含有c h i 和g l u 基因的根癌农杆菌l b a 4 4 0 4 侵染 愈伤组织，根癌农杆菌液o d 值以0 4 为最佳，侵染时间为3 0 分钟；共培养基为m s + 2 ，4 d 2 m g l + a s2 5 0 u m o l l ，选择诱导培养基为m s + 2 ，4 一d2 m g l + l5 0 m g lk a + 3 0 0m g lc a r ，分化培养 基为m s + i 0m g l 6 一b a + 0 0 5 m g l n a a + 1 0 0 m g l k a + 3 0 0 m g lc a r ，生根培养基为m s + 2 m g l n a a + 1 0 0 m g l k a + 3 0 0 m g l + 3 0 0 m g l c e f ( 噻孢霉素) ，用p c r 和s o u t h e r n 杂交检测，得到阳性 植株为】6 7 。余桂红等( 2 0 0 4 ) 也以东方百合西伯利亚为研究对象，用根癌农杆菌l b a 4 4 0 4 侵染百合叶片和鳞片，发现鳞片诱导直接分化培养基以m s + 0 5 m g l b a + 0 5 m g l 2 ，4 d 为最佳， 小叶块和小鳞茎的不定芽分化m s + i 0 m g lb a + 0 0 5m g li a a 最好；k a 筛选浓度为1 0 0 m g ，l 小鳞茎以1 2 5 m 以为最佳；c a r 以3 0 0 - 4 0 0m g l 最好。唐东芹等( 2 0 0 4 ) 以百合花丝诱导的胚性 愈伤组织为基因转化的受体材料，利用根癌农杆菌株系e h a l 0 5 将p b i x p t a 基因导入百合。g u s 检测转化后共培养3 d 的组织块，g u s 瞬时表达率可达6 0 ，选择培养2 0 d ，组织中约有1 检测 到g u s 基因的稳定表达。莳液浓度o d 6 值为0 8 左右时侵染效果较好，同时附加1 0 0 u m o l l a s 可提高转化效率，p c r 分子检测转基因植株部分呈现阳性，初步证明外源基因已整合到百合基因 维中。在农杆菌介导的遗传转化中，适宜的菌液浓度是转化成败的关键之一，菌液浓度过低会 使菌细胞数目不足导致转化效率降低；浓度过高，农杆菌生长过度会导致转化受体死亡，且死菌 数目随之增多而造成菌活力不足，也会导致转化效率降低。一般认为菌液浓度在o d 6 0 0 = 0 5 1 0 时较易侵染。导入外源d n a 不同植物最适浓度不同。对于百合，菌液浓度在o d 。= o 8 左右时 侵染效果较好。此外，为避免l b 培养基对植物材料的伤害，在转化前用m s 培养液重悬菌体可 提高转化效率。 6 自合基因工程研究进展 h o s h i ( 2 0 0 4 ) 用东方百合( l i l i u m a e a p u l e o ) 的花丝诱导产生的愈伤组织，分割成直径1 c m 小块放在不含n h 4 n 0 3 ，含2 0 m g l a s 、2 m g l p i c 、7 0 0 m g l 天冬酰胺酸水台物、7 0 0 m 叽谷 胺酸盐、3 0 m g ，1 糖的m s 培养液中，放有砂纸的5 0 m l 的离心管中2 9 0 0 r p m 离心1 0 s ，用培养好的 根癌农杆菌e h a l 0 1 为转化菌株，通过侵染的愈伤组织发现，5 分钟为适合的侵染时间，侵染过 的愈伤组织在暗处共培养7 天，之后转入到增殖培养基和再生培养基中暗培养每隔3 周换一次 培养基，3 4 个月后再生的植株可以长出来，之后放到生根培养基中。抗生素的浓度筛选根据百 合的品种以及农杆菌的菌株不同而不同，对于用e h a l o l 侵染东方百合杂交品种而言，增殖培养 基、再生培养基以及生根培养基中噻孢霉素的浓度为3 0 0 m g l ，潮霉素为5 0 m g 。g u s 基因染色 检测和r t p c r 检测均为阳性，并获得了转基因植株。 1 - 23 基因枪介导的百合遗传转化 基| 夭】枪转化法义称微弹轰击法。是将外源d n a 包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压 的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源d n a 进入细胞后，整合到植物染色体 上得以表达，从而实现基因转化。刘菊华等( 2 0 0 3 ) 用基因枪法轰击龙牙百合的鳞片叶长出的愈 伤组织，参数为真空度7 6 0 m m h g ，射程6 c m ，靶受体直径3 c m ，方法与一般基因枪转化方法类 似。轰击后的外植体立刻放到相应的培养基中培养以免材料脱水加重细胞的受伤害程度。不同 的品种、外植体的转化效率有显著差异。另外，不同金属微粒、d n a 沉淀辅助剂、d n a 纯度、 d n a 浓度、微弹速度等都会影响转化效率。在目前所尝试的转化方法中，较为成功的是基因枪 介导法。 花粉、鳞片、愈伤组织均可作为基因枪法的转化受体。v a nd e rl e e d g e - p l e g t 等( 1 9 9 2 ) 用基 冈枪转化法将含有g u s 基因的质粒载体导入到百合花粉中获得表达。n i s h i h a r a 等( 1 9 9 3 ) 用基 因枪法轰击白台的花粉，获得g u s 的瞬时表达。v a nd e rl e e d g e p l e g t 等人( 1 9 9 7 ) 曾用基因枪 法将选择标记基因n p t i i 转入一个百合品种的花粉中，再将含胛7 ”基因的花粉授粉于另一百合 品种，得到了3 株抗卡那霉素转基因植株，与未转基因的百合进行杂交，杂交后代卡那霉素的抗 性发生了分离。这一方法又称之为花粉介导法。t s u c h i y a 等( 1 9 9 6 ) 用基因枪法将含有g u s 基 因载体转化l i l i u m f o r m o l o n g i 、l d a u r i c u m 、l j a p o n i c u m3 种百合的鳞片和未成熟的胚胎，其中 含有a c t l 启动子和修饰的c a m v 3 5 s 启动予得到了最大的g u s 基因的瞬时表达。 荷兰l e i d e n 大学v a nt u y l 曾将编码l s v 、t b v 、l v x 外壳蛋白基因的d n a 片段用基因枪 法打入鳞片，以获得抗病毒的百合。w a t a d 等人( 1 9 9 7 ) 利用基因枪法将g u s 报告基因或p a t 选择标记基因打入经过4 8 小时预培养的铁炮百合愈伤组织，参数为11 0 0 p s i ，距离6 c m 。经过培 养获得5 5 株小苗，p c r 检测1 9 株含有p a t 基因，经s o u t h e r nb l o t 检测得到了3 个阳性植株。 l i p s k y 等( 2 0 0 2 ) 用基因枪法将分别将含有p a t 标记基因、3 5 s 启动子的p3 5 s a c 载体和含有抗 黄瓜花叶病毒的复制酶基因、a c t 启动子的p s a n l 0 1 载体打到铁炮百合雪后愈伤组织中，p c r