PCR常见问题及解决方案.ppt

PCR常见问题、原因分析及其对策,主讲人：,PCR技术简介,PCR常见问题、原因分析及其解决方案,提高PCR反应特异性的策略,主讲内容,PCR技术简介,PCR标准反应体系,DNA模板引物反应缓冲液dNTPddH2O耐热聚合酶,反应体系对PCR扩增的影响,DNA模板,纯度蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应完整性模板降解会导致PCR扩增无产物浓度加量过多导致非特异性扩增增加特异性长度适当、避免二级结构和二聚体完整性避免反复冻融浓度应适当,过高导致非特异性增加,过低则,引物,扩增产物太少,反应体系对PCR扩增的影响,反应Buffer,pH值,盐离子浓度稳定剂,增强剂,Mg2浓度,过高非特异性严重过低无扩增产物,dNTPMixture,浓度适当避免反复冻融,ddH2O,pH值适当避免污染,PCR标准反应体系,DNA模板引物反应缓冲液Mg2dNTPddH2O耐热聚合酶,如何选择最合适的DNA聚合酶,DNA聚合酶的特性,PCR实验的不同需求,如何选择最合适的DNA聚合酶DNA聚合酶的特性,纯度,稳定性,酶活性,如何选择最合适的DNA聚合酶PCR实验的不同需求,长片段扩增,PCR试剂盒,扩增效率,保真性,特异性,基因组扩增、RT-PCR,基因筛选、测序、基因克隆,复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）,构建基因图谱、测序、分子遗传学,复杂模板扩增、大规模基因检测,特异性,热启动Taq酶,原理,蜡封抗体抑制化学修饰,特点,避免非特异性扩增提高PCR反应的,特异性,用途,基因组扩增RT-PCR,热启动Taq酶,特异性,保真性,高保真酶,原理,用途,35核酸,表达基因的克隆基因的定点突变细胞内基因点突变分析（SNP）,外切酶活性降低碱基错配率,保真性,高保真酶,高保真高扩增效率,原理,混合酶高扩增效率35核酸外切,用途,超长片段扩增,测序,构建基因图谱,复杂模板扩增,GC含量高,二级结构,高保真高扩增效率,PCRMasterMix,原理,预配好的PCR反应液DNA聚合酶反应缓冲液dNTPPCR增强剂,PCRMasterMix,特点,快速简便减少加样误差和污染灵敏度高可扩增低至2个拷贝的目的模板特异性强降低PCR反应的要求，增强特异性稳定性好长期放置活性无改变,适用范围,大规模基因检测目的基因拷贝数极低的样本GC含量高,有二级结构的模板复杂基因组样本可直接检测菌落，基因点突变检测,或者阳性克隆的筛选。,PCR技术简介,PCR常见问题、原因分析及其解决方案,提高PCR反应特异性的策略,PCR常见问题、原因分析及其解决方案,PCR常见问题,无扩增产物,非特异性扩增,拖尾,假阳性,PCR常见问题之一,无扩增产物,模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短,原因,对策,纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间,现象：正对照有条带，而样品则无；,PCR常见问题之二,非特异性扩增,现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,PCR常见问题之二,引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多,原因,对策,重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数,非特异性扩增,PCR常见问题之三,拖尾,现象：产物在凝胶上呈Smear状态。,M12,PCR常见问题之三,模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多,原因,对策,纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数,拖尾,PCR常见问题之四,假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况),原因：靶序列或扩增产物的交叉污染,现象：空白对照出现目的扩增产物,对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,PCR技术简介,PCR常见问题、原因分析及其解决方案,提高PCR反应特异性的策略,提高PCR反应特异性的策略,巢式PCR（Nest-PCR）,四种策略,递减PCR（TouchDownPCR）,热启动PCR（HotStartPCR）,使用PCR增强剂,策略之一,巢式PCR（Nest-PCR）,巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。,巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5RACE）的特异性。,策略之二,递减PCR（TouchDownPCR）,递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2,直到退火温度低于Tm5。,特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。,递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。,策略之三,热启动PCR（HotStartPCR）,热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度；,现在有很多公司都有HotStartTaq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用；,热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。,策略之四,使用PCR增强剂,甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。,其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合