（卫生毒理学专业论文）crⅥ诱导肝细胞凋亡与线粒体能量代谢障碍的关系研究.pdf

分类号u d c 硕士学位论文 密级 c r ( ) 诱导肝细胞凋亡与线粒体能量代谢 障碍的关系研究 r e l a t i o n s h i pb e t w e e nc r ( v i ) - i n d u c e da p o p t o s i sa n d e n e r g ym e t a b o l i s md y s f u n c t i o ni nh e p a t o c y t e 作者姓名：陈晶 学科专业：卫生毒理学 学院( 系、所) ：公共卫生学院 指导教师：钟才高教授 论文答辩日期丝1 2 ：兰三答辩委员会主 中南大学 二o o 年五月 课题来源：国家自然科学基金项目项目批号：3 0 6 7 1 7 7 6 6jjjj1洲58!竺l m7，iiiiiy 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名： 阻 日期： 迎l 竺年月丝日 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 中文摘要 c r ( ) 诱导肝细胞凋亡与线粒体能量代谢障碍的关系研究 摘要 目的： 在体外试验系统，初步探讨c r ( ) 诱导肝细胞凋亡与线粒体能量 代谢障碍的关系，为进一步阐明c r ( ) 诱导肝细胞凋亡的机制提供线 索。 方法： 以l 0 2 肝细胞为受试细胞，通过m t t 试验检测不同浓度单独 c r ( w i ) 及单独a t p 染毒对l 0 2 肝细胞存活率的影响，筛选确定低、中、 高c r ( v i ) 作用浓度及a t p 有效干预浓度即c r ( v i ) 处理浓度为 2 5 9 m o l l ，1 0 9 m o l l ，4 0 9 m o l l 及a t p 浓度为1 l a m o l l ，染毒时间为 2 4 h 。通过流式细胞仪检测细胞凋亡率及d n a l a d d e r 检测细胞凋亡， 反相高效液相色谱检测细胞内a t p 、a d p 、a m p 含量变化，氧电极检 测细胞线粒体呼吸功能( s t 3 、s t 4 、r c r 、p o ) ，荧光分光光度法检 测线粒体通透性转运孔( p t p ) 及跨膜电位( k v m ) 、细胞内活性氧 ( r o s ) ，酶标仪检测细胞i 为c a s p a s e 3 的活性。 结果： 1 c r ( v i ) 弓l 起l 0 2 肝细胞存活率降低：c r ( v 1 ) 在2 5 10 0 t m a o l l 处 理浓度范围内，能明显引起l 0 2 肝细胞存活率的降低( p 0 0 5 ) ，处 理浓度和细胞存活率之间存在负相关( r = 0 9 0 9 ，p = 0 0 0 ) 选取 2 5 g n o l l 、1 0 l m a o l l 和4 0 9 m o l lc r ( v i ) 浓度和细胞生存率最高的a t p 浓度1 卜t m o l l 。 2 c r ( v i ) 导致肝细胞凋亡：与对照组相比，c r ( v i ) 处理组细胞凋 亡率均明显上升，加入a t p 可明显减轻中剂量组细胞凋亡率，而在 高剂量组引起细胞凋亡率上升，坏死率下降( p o 0 5 ) 。 3 c r ( v i ) 弓i 起肝细胞d n a 损伤：中、高剂量c r ( w i ) 处理组诱导 细胞d n a 发生断裂，加入a t p 联合处理组，细胞d n a 断裂均明 显减轻。 4 c r ( v i ) 对肝细胞c a s p a s e 3 表达的影响：与对照组相比，其他 各组c a s p a s e 3 活性均明显升高( p 0 0 5 ) 。a t p 加入高剂量c r ( v i ) 处理组c a s p a s e 3 活性明显降低( p o 0 5 ) 。 5 c r ( v i ) 所致肝细胞氧化应激：与对照组相比，除了a t p 处理 组外，其他各组r o s 水平均有所升高( p o 0 5 ) 。 硕士学位论文 中文摘要 6 c r ( v i ) 所致细胞线粒体损伤：与对照组相比，各处理组线粒体 p t p 孑l 开放度和线粒体膜电位( a w m ) 下降均有所增加( p o 0 5 ) 。加入 a t p 联合处理，中剂量、高剂量组与相同浓度的c r ( v i ) 单独处理组相 比，p t p 孔开放度降低，膜电位下降率降低( p o 0 5 ) 。 7 c r ( v i ) 对细胞a t p 、a d p 、a m p 的影响：与对照组相比，低 剂量c r ( v 1 ) 组中a t p 、a d p 、t a n 略有上升，中、高剂量c r ( v i ) 处理 组则明显降低( p o 0 5 ) ，加入a t p 的各处理组，以上各指标均与相 应浓度的c r ( v i ) 单独处理组有差别( p o 0 5 ) 。与对照组相比，细胞 能荷( e c ) 在中剂量c r ( v i ) 单独处理组上升，高剂量c r ( v i ) 单独处 理组下降( p o 0 5 ) 。 8 c r ( v i ) 和a t p 对肝细胞细胞呼吸功能影响：与对照组相比，各 c r ( v i ) 处理组r c r 明显降低，4 0 1 t m o l l c r ( v i ) + a t p 与相同浓度的c r ( v 1 ) 处理组相比明显升高( p o 0 5 ) 。与对照组相比，c r ( v i ) 处理组p o 均 明显降低( p o 0 5 ) 。 结论： 体外试验系统中，c r ( v 1 ) 可诱导肝细胞发生凋亡和线粒体能量代 谢障碍，二者呈明显的相关性。a t p 能减轻c r ( v i ) 所致的线粒体损 伤，使线粒体呼吸功能恢复，降低c a s p a s e 3 的活性，减轻d n a 损伤。 在c r ( v i ) 为2 5 1 u n o l l 1 0 1 x r n o l l 浓度范围，a t p 能明显减轻c r ( v 1 ) 诱导的细胞凋亡，当c r ( v i ) 浓度为4 0 n o l l 时，a t p 能使c r ( v i ) 诱 导的细胞坏死率下降，细胞凋亡率增加。 关键词：六价铬；肝细胞；线粒体；能量代谢；a t p ；凋亡 i i 硕士学位论文英文摘要 r e l a t i o n s h i pb e t w e e nc r ( v i ) 一i n d u c e da p o p t o s i sa n d e n e r g ym e t a b o l i s md y s f u n c t i o ni nh e p a t o c y t e a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t o e x p l o r e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e nt h e e n e r g y m e t a b o l i s md y s f u n c t i o na n dt a p o p t o s i si n d u c e db yc r ( v i ) h el 一0 2 h e p a t o c y t e s a n d p r o v i d e c l u e sf o rt h ef u r t h e rr e s e a r c hi nt h e m e c h a n i s mo fc r ( w i ) 一i n d u c e dh e p a t o c y t ea p o p t o s i s m e t h o d s ：t h ee f f e c t so f c r ( v i ) s i n g l et r e a t e do ra t ps i n g l et r e a t e d o nc e l ls u r v i v a lr a t ew e r ea s s e s s e db yt h er e d u c t i o n so ft e t r a z o l i u md y e ( m t t ) i nc u l t u r e dl 一0 2h e p a t o c y t e s l 0 2h e p a t o c y t e si na l lt e s t sw e r e r e s p e c t i v e l y i n c u b a t e dw i t h 2 5 1 a n o l l ，l o p m o l l ，4 0 p m o l l c o n c e n t r a t i o n so fc r ( v i ) o r a n d1w n o l la t pf o r2 4 ha c c o r d i n gt oc e l l s u r v i v a lr a t e t h ec e l l u l a ra p o p t o s i sa n dn e c r o s i sr a t i o s a m e x i n v - f i t c p id o u b l es t a i n e da n a l y s e db yf c m ；d n ad a m a g ew a so b s e r v e db y u s i n gt h ed n a - l a d d e nt h em i t o c h o n d r i a lp e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r e ( p t p ) a n dt h em i t o c h o n d r i a lt r a n s m e m b r a n ep o t e n t i a l ( v m ) w e r e d e t e r m i n e db yt h e f l u o r o s p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o d ；t h ea c t i v i t yo f c a s p a s e - 3w a st e s t e db yt h em i c r o p l a t er e a d e nt h el e v e l so fc e l l u l a r a t p , a d p , a m pc o n t e n ta sw e l la st h ec h a n g e so fa t p a d pr a t i oa n d t h ee n e r g yc h a r g e ( e c ) w e r ed e t e c t e db yh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ，t h er e s p i r a t o r yf u n c t i o no fm i t o c h o n d r i aw a s d e t e c t e db yo x y g e ne l e c t r o d e r e s u l t s ： 1 t h ec o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n td e c r e a s ei nc e l ls u r v i v a lr a t eo f c r ( v i ) - t r e a t e d l 一0 2c e l l sw a so b s e r v e d t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n c o n c e n t r a t i o na n ds u r v i v a lr a t ew a ss i g n i f i c a n t l yn e g a t i v ec o r r e l a t i o n ( f 一0 9 0 9 ，p o 0 5 ) t h e 2 5 卜t m o l l ，10 i _ t m o l l ，4 0 p m o l l c r ( v i ) c o n c e n t r a t i o na n dlv _ m o l la t pw e r ec h o s e n 2 c o m p a r e dt ot h ec o n t r o lg r o u p ，t h ea p o p t o s i sr a t i oo fa l lt h e c r ( v i ) - t r e a t e dg r o u p si n c r e a s e dm a r k e d l y ( p 0 0 5 ) c o m p a r e dt ot h e s a m ec o n c e n t r a t i o no fc r ( v i ) ，t h ea p o p t o s i sr a t i o i nt h e10 9 m o l l i i i 堡圭堂垡鲨奎英文摘要 c r ( v i ) + a t pg r o u pd e c r e a s e d ，w h i l et h ea p o p t o s i sr a t i oi nt h e4 0 卜t m o l l c r ( ) + a t pg r o u pi n c r e a s e db u tt h en e c r o s i sr a t i od e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 5 ) 3 d n a d a m a g e w a so b s e r v e di nt h ei n t e r m e d i a t ed o s e g r o u p 10 i - t m o l lc r ( v i ) 】a n dm a x i m u mg r o u p 4 0 1 a m o l lc r ( v i ) ，b u ti n t h ei n t e r m e d i a t ec o m b i n e d g r o u p 10 l 上m o l lc r ( v i ) + a t p 】a n dt h e m a x i m u mc o m b i n e dg r o u p 4 0 t r n o l lc r ( v i ) + a t p t 1 1 ed n a b r e a k a g e r e d u c e dc o m p a r e dt ot h es a m ec o n c e n t r a t i o no fc r ( v i ) s i n g l eg r o u p ( p 0 0 5 ) 4 c o m p a r e d t ot h ec o n t r o lg r o u p ，t h ec a s p a s e - 3a c t i v i t yi n c r e a s e d r e m a r k a b l yi no t h e rg r o u p s ( p 0 0 5 ) ，a n da f t e rt r e a t e dw i t ha t pt o g e t h e r , t h ec a s p a s e _ 3 a c t i v i t yo ft h em a x i m u mg r o u pd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ( p 0 0 5 ) 5 1 1 1 er o si na l l g r o u p se x c e p ta t pt r e a t e dg r o u pr o s e s i g n i f i c a n t l yc o m p a r e dt ot h ec o n t r o lg r o u p ( p o 0 5 ) 6 t h em i t o c h o n d r i a l o p e n n e s so fp e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r e ( p t p ) a n dt h e r a t eo fm i t o c h o n d r i a lm e m b r a n e p o t e n t i a l ( v m ) 一 - 。 d e c l l m n gs l g m t i c a n t l yi n c r e a s e di na l lg r o u p sc o m p a r e dt ot h ec o n t r o l g r o u p ( p 0 0 5 ) a t pm a r k e d l yi m p r o v e dt h e mi nt h ei n t e r m e d i a t e c o m b i n e dg r o u pa n dm a x i m u mc o m b i n e dg r o u pc o m p a r e dt ot h es a m e c o n c e n t r a t i o no fc r ( v i ) g r o u p s ( p 0 0 5 ) 7 t h ec o n t e n t so fa t p , a d pa n dt o t a la d e n i n en u c l e o t i d e ( t a n ) s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di nt h em i n i m u mg r o u pb u td e c l i n e di nt h e i n t e r m e d i a t ed o s e g r o u pa n dt h em a x i m u mg r o u pc o m p a r e dt ot h e c o n t r o l g r o u p ( p 0 0 5 ) w h i l et h ee n e r g yc h a r g e ( e c ) s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e di nt h ei n t e r m e d i a t ed o s eg r o u pb u td e c r e a s e di nt h em a x i m u m c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ( p o 0 5 ) 8 i na l lt h ec r ( v i ) s i n g l et r e a t e dg r o u p s ，r c rh a ds i g n i f i c a n t l y d e c l i n e dc o m p a r e dt ot h ec o n t r o l g r o u p ( p 大脑 腓肠肌。在肝脏中，年龄增长和热量限制对肝 脏a t p 含量及a t p 产生的速率都没有明显影响【2 3 1 ，因此，肝细胞是进行能量代 谢研究的较好受试细胞。细胞内a t p 水平下降是许多细胞凋亡的特征之一，但 是六价铬染毒后a t p 水平下降是否跟肝细胞凋亡相关，仍没有系统研究，但直 接给予a t p ，使细胞内a t p 水平恢复能否抑制c r ( v i ) 诱导的细胞凋亡，国内外 罕见研究。 铬及其化合物是人类环境中最常见的化学性污染物之一，它们对人类健康的 影响已日益受到人们的广泛关注。铬的环境污染是目前重大公共卫生问题之一。 c r ( v d 对人类健康的危害一直被广泛关注。本研究在体外试验系统，以l 0 2 细 胞为受试细胞，使用a t p 联合处理，以减轻c r ( v i ) 染毒后细胞内a t p 水平下降， 进而研究a t p 耗竭在c r o c i ) 诱导肝细胞凋亡中的作用，探讨能量代谢在c r ( v 1 1 诱导肝细胞凋亡中的作用，为进一步探讨c r ( v i ) 肝损害机制以及提出职业性铬中 毒防治措施奠定实验基础。 硕士学位论文 第二章材料与方法 第二章材料与方法 2 1 材料 2 1 1 受试细胞 人胚肝细胞系l 0 2 ( l 0 2 肝细胞) 购自上海中科院细胞培养中心。 2 1 2 主要试剂 重铬酸钾( k 2 c r 2 0 7 ，分子量2 9 4 1 9 ，s i g m a 公司，基准级，含量9 9 9 9 以上) ； a t p ( 鹏程生物，含量9 8 ) ；胰蛋白酶( s o l a r b i o ，美国) ；r p m i 1 6 4 0 培养基( s o l a r b i o 。 美国) ；新生牛血清( 杭州四季青生物工程材料有限公司) ；噻唑蓝( m t t ，m r l l r e s e o 公司，美国) ；二甲基亚砜( d m s o ，s i g m a 公司，美国) 。 细胞凋亡率检测试剂：( a n n e x i n v f i t c 细胞凋亡检测试剂盒，凯基生物) ， 牛血清白蛋白成分v ( s i g m a ，美国) 。 肝细胞内a 1 1 p 、a d p 、a m p 含量检n - a t p ( 鹏程生物) ；a d p 、a m p 标准 品( s o l a r b i o ，美国) ；四丁基溴化铵( 科密欧) ；磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，磷酸 均为市售分析纯。 细胞d n a 损伤检测试剂：正常熔点琼脂糖( g i b c o 公司，美国) ，其它试剂 均为市售分析纯。 线粒体功能检测试剂：罗丹明1 2 3 ( r h l 2 3 ，s i g m a 公司，美国) ；h e p e s ( a m e r s h a m 公司，美国) ；曲拉通x 1 0 0 ( t r i t o n x 1 0 0 ，s i g m a 公司，美国) ； 蔗糖、琥珀酸钠、磷酸二氢钾、异丙醇等均为市售分析纯。 蛋白定量检测试剂：考马斯亮兰蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程研究 所；d n a 提取试剂盒( t i a n g e n ) 。 其它试剂均为市售分析纯。 2 1 3 试验溶液配制 k 2 c r 2 0 7 溶液：取0 2 9 4 9k 2 c r 2 0 7 溶于2 0 0 m l _ 三蒸水中，即浓度为5 m m o l l 原 液。临用时，将5 m m o l lk 2 c r 2 0 7 原液用三蒸水稀释为所需浓度，过滤除菌，4 c 保存。 r p m i 1 6 4 0 培养基：一瓶r p m i 1 6 4 0 培养基分别加入青霉素和链霉素至终浓 度1 0 0 u m l ，用时a n d , 牛血清( 1 0 ) 。 m t t 溶液：取m t t 2 5 0 0 m g 溶于5 0 m lp b s 溶液( p h = 7 4 ) ，浓度为5 m g m l ， 充分搅拌溶解，过滤除菌，置棕色瓶，4 。c 保存。 甲躜裂解液：取15 9 s d s 溶于5 0 m l _ 三蒸水和5 0 m l 的n ，n 二甲基甲酰胺混合液 中，稀盐酸和冰醋酸混合液调p h 值n 4 7 ，室温保存。 p b s 溶液：取8 0 0 9 n a c l ，0 2 0 9 k c l ，3 5 8 9 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ，0 2 4 9 k h 2 p 0 4 ， 4 硕士学位论文 第二章材料与方法 溶于1 0 0 0 m l 双蒸水中，用1 mn a o h 调p h 7 2 ，过滤备用。 p 缓冲液：将4 2 7 8 7 9 蔗糖，0 0 0 3 4 9k h 2 p 0 4 ，0 0 2 6 0 9h e p e s ，0 0 5 6 7 9 琥珀 酸钠溶于双蒸馏水中，定容至5 0 m l ，过滤除菌4 保存。 含2 5 0 m m o l l 蔗糖的细胞裂解液：将8 5 5 3 7 9 蔗糖溶于8 9 m l 细胞裂解液，临用 时加入l m lt r i o nx 1 0 0 及1 0 0 m ld m s o 。 罗丹明1 2 3 ( r h l 2 3 ) ：将5 m g r h l 2 3 溶于5 m l 甲醇中，充分溶解，配制成浓度 为l m g m l 的储备液，2 0 保存，备用。 碘1 8 正常熔点琼脂糖( n m a ) ：取1 8gn m a 溶于1 0 0 m l p b s 溶液( 微波 炉加热溶解) 。 线粒体匀浆缓冲液：8 5 6g 蔗糖，6 3 8g 糖醇，o 1 6 9 t f i s - h c l ，0 0 2 9 e d t a k + 溶于1 0 0 m l 去离子水中，保存于4 。 线粒体呼吸测定介质：7 7 0 9 蔗糖，0 1l g k c l ，0 2 0 9 k h 2 p 0 4 ，0 7 9 9 t f i s - h c l ， 0 0 4 9 e d t a ，三蒸水定容到1 0 0 m l ，用盐酸p h 调到7 5 。 高效液相色谱流动相：1 0 4 5 9 磷酸氢二钾，5 4 4 9 磷酸二氢钾，1 6 1 9 l 四丁基 溴化铵，三蒸水定容到1 l ，磷酸将p h 调到6 4 3 。 2 1 4 主要仪器： h h c p t 型c 0 2 培养箱( 上海一恒科技有限公司) ；1 0 1 1 a b 型电热鼓风干燥 箱( 天津市泰斯特仪器有限公司) ；h h 6 0 型恒温水浴箱( 常州国华电器有限公 司) ；p h s 3 c 型酸度计( 常山市鑫龙医疗器械有限公司) ；t d z 5 - 4 0 多管架自动 平衡离心机( 长沙天创仪器制造有限公司) ；t g l 2 0 m 高速冷冻离心机( 长沙平 凡仪表有限公司) ；d y y - i i i 7 型电泳仪( 北京六一仪器厂) ；9 6 孔培养板( e a g l e s 公司，美国) ；x d 1 0 1 型倒置生物显微镜( j o n e c 公司，美国) ；t h e r m of o r m a 超低温冰箱( - 8 0 4 c ，美国) ：m k 3 型酶标仪( t h e r m o 公司，美国) ；反相高效液 相色谱仪( 日本岛津) ，o x y g r a p h 氧电极( h a n s a t e c h ，英国) 等。 2 2 方法 2 2 1 试验技术路线 5 硕士学位论文 第二章材料与方法 2 2 2 肝细胞培养 按常规细胞培养法培养l 一0 2 肝细胞，所用培养基为1 0 新生牛血清 6 硕士学位论文第二章材料与方法 r p m i 1 6 4 0 培养基，置于5 - - - - 氧化碳培养箱中培养，每2 3 天用含0 2 e d t a 的 0 2 5 胰酶进行消化，并传代一次。 2 2 3 肝细胞生存率测定 方法： 取生长良好的l 0 2 肝细胞，用0 2 5 胰蛋白酶消化，离心去上清后，加入 2 m l 含1 0 新生牛血清的r p m i 1 6 4 0 培养基，充分吹打成单细胞悬液，采用细胞 计数板，显微镜下观察计数，调整细胞浓度为1 l c m l 。 每孔10 0 l 1 体积的细胞悬液接种于9 6 孔培养板中，培养2 4 h 后，用受试物 处理：a t p 单独作用组染毒2 4 h ，浓度为：0 、o 1 2 5 、0 2 5 、0 5 、1 0 、1 5 、2 、4 p m o l l ； c r ( v i ) 染毒2 4 h ，浓度为：o 、2 5 、5 、1 0 、2 0 、4 0 、5 0 、8 0 、1 0 0 i t m o l l ，每孔加 受试物11 1 t l ，对照组力i i p b siir t l 。 继续在3 7 * c5 c 0 2 及饱和湿度条件下培养2 4 h ，加入1 0 p lm t t ，继续孵 育4 h ，每孔再加入1 0 0 山甲臌裂解液，继续在3 7 、5 c 0 2 及饱和湿度条件下培 养6 h ，取出9 6 孔板，置微量振荡器持续振摇1 0 m i n ，待甲躜充分溶解。酶标仪上 4 9 2 n m 处，测吸光度值( a ) ，计算其平均值，结果表达为公式： 细胞活力( ) = 磊襄浩器t o o 。公式2 ， 2 2 3 细胞凋亡检测 2 2 3 1 细胞凋亡率检测 方法： 取生长良好的l 0 2 肝细胞，以1 x 1 0 4 m l 传代于8 个5 0 r a l 培养瓶内培养，待 细胞贴壁生长密度至大于底板的8 0 进行步骤。 染毒处理：根据m t t 结果，设2 5um 、1 0um 、4 0 um c r ( v 1 ) 单独作用浓 度组及与1pma t p 联合作用组，染毒2 4 h 。设空白对照组。 染毒2 4 h 后，先收集上清液，再与胰酶消化后的细胞混合，以1 0 0 0 r m i n 离 , l , l o m i n ，弃上清，2 0 m l 含2 b s a 的p b s 洗两次，1 0 0 0 r m i n 离一t , l o m i n ，弃上清。 每组取5 x 1 0 5 个细胞，悬浮于5 0 0 l x lb i n d i n gb u f f e r ，悬浮细胞。 每组加入5 山加m e x i l l v f i t c 染液混匀后，加入5 p lp r o p i d i u mi o d i d e 混匀。 室温、避光、反应5 1 5 m i n ，于1 h 内用流式细胞仪进行检测( 激发波长 e x = 4 8 8 n m ，发射波长e m = 5 3 0 n m ) 。 2 2 3 2d n a - l a d d e r 定性检测细胞凋亡 2 2 3 2 id n a 提取 细胞处理同2 2 4 1 。 7 硕士学位论文第二章材料与方法 收集细胞，用预冷的p b s 重悬，离心并漂洗两次，倒尽上清，j j l l a 2 0 0 p l 缓冲液g a ，振荡至彻底悬浮。 加入2 0 p l 蛋白酶k ，混匀。 ! j i l x , 2 0 0 1 d 缓冲液g b ，充分混匀，7 0 c 放置1 0 r a i n ，溶液变清亮，离心去 除管盖内的水珠。 加入2 0 0 p l 无水乙醇，充分振荡混匀1 5 s ，有沉淀出现，离心去除管盖内的 水珠。 将溶液和沉淀转移到一个吸附柱中，1 2 0 0 0 r p m ，离一t = , 3 0 s ，倒掉废液，将 吸附柱放入回收管内。 向吸附柱中加入5 0 0 “i g d ，步骤同。 向吸附柱中加入7 0 0 p l p w ，步骤同，重复2 次。 将吸附柱放回收集管中，1 2 0 0 0 r p m ，离一t l , 2 m i n ，倒掉废液，室温放置数 分钟。 将吸附柱转移到干净的离心管中，加入2 0 0 1 a l t e 洗脱2 5 m i n ，1 2 0 0 0 r p m 离 , 心2 m i n ，收集洗脱液。 2 2 3 2 2 琼脂糖凝胶电泳 1 8 9 琼脂糖+ 1 0 0 m l t b e ，微波加热，至全溶。 制胶：调节胶膜厚度至3 5 m m ，将冷却至8 0 c 的凝胶液倒入模板，插入梳 子，室温冷却，大约1 0 m i n 后小心拔出梳子。 连接电极，将胶板置入电泳槽中，倒入t b e 。 加样：样品与上样缓冲液按5 ：l 混合均匀后取5 1 t i ：j l ：l 入l a n e ；m a r k e r 直接加 入6 p l 。 设置电压- - 9 6 v ( 1 2 v c m 8 c m 胶板) ，开始电泳。 待蓝色指示剂移动至胶膜底部时，结束电泳。 取出胶板，置a g o o d v i e w 终浓度为0 5 p # m l 的电泳液中显色4 0 m i n 后，观 察、拍照。 2 2 3 3c a s p s e3 活性检测： 原理：c a s p a s c 3 可以催化底物a c - d e v d p n a 产生黄色物质，从而可以通过 测定吸光度值来检测c a s p s c 3 的活性。 制定p n a 标准曲线。 细胞处理同2 2 4 1 步骤，胰酶消化后，6 0 0 94 c 离- t 二, 5 m i n 收集细胞，尽 力吸除上清，p b s 洗涤一次。每2 0 0 万个细胞加k 1 0 0 p l 裂解液，重悬沉淀，冰浴 裂解1 5 m i n 。 4 1 6 0 0 0 2 0 0 0 0 9 离，t , l o 1 5 m i n 。 8 硕士学位论文第二章材料与方法 上清转移到预冷离心管中，蛋白测定调整到1 - 3 m g m l ，加入 a c d e v d p n a ，测定0 5 ，查询标准曲线，确定活性。 2 2 4 细胞氧化应激检测 2 2 4 1 细胞内活性氧( r o s ) 含量检测 原理：d c f h d a 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可 以被细胞内酯酶水解成d c f h 。而d c f h 不能通透细胞膜，从而使d c f h 探针很容 易被装载到细胞内，细胞内的活性氧可以氧化无荧光的d c f h 生成有荧光的d c f , 检测d c f 的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。 细胞处理同2 2 4 1 。 收集细胞后装载探针：l ：1 0 0 0 用无血清培养基稀释d c f h d a ，终浓度 为1 0 j _ t m o l l ，收集细胞后悬浮于稀释好的d c f h d a 中，细胞浓度为2 1 0 7 r n l ， 3 7 孵育3 0 m i n ，每5 m i n 混匀一次。 激发波长4 8 8 n m ，发射波长5 2 5 n m ，荧光检测吸光度值。 2 2 5 线粒体损伤检测 2 2 5 1 线粒体膜通透性转运孔( p t p ) 检测( 荧光分光光度法) 细胞预处理：将大培养瓶中的细胞用0 2 5 的胰酶消化并吹打成单细胞悬 液，调整细胞数为1 x 1 0 6 m l 。将充分吹打均匀的细胞悬液接种于1 5 0 m l 培养瓶中， 于二氧化碳培养箱中培养。 染毒处理：培养4 8 h 后，弃原培养液，更换1 6 4 0 培养基。随机分8 个处理组 同2 2 4 1 分组。染毒2 4 h 后，先收集上清液，再与胰酶消化后的细胞混合，以 1 0 0 0 r m i n 离, t ：, l o m i n ，弃上清。 线粒体的制备及处理：细胞消化吹打成单细胞悬液后用2 m l p b s 洗一次， 离心去上清。加含2 5 0 m m o l l 蔗糖的细胞裂解液3 m l ，吹打均匀后于4 。c 4 0 0 0 r m i n 离一t 二, 1 0 m i n ，取上清再于40 c1 0 0 0 0 r m i n 离一t , 1 5 m i n ，所得沉淀即为线粒体，用3 m l 测定介质p ( 2 5 0 m m o l l 蔗糖、2 m m o l l h e p e s 、0 5 m m o l l k n 2 p 0 4 、4 2 m m o l l 琥珀酸钠) ，将其溶解并吹打均匀即成线粒体悬液。然后定量测定线粒体蛋白含 量，使各组含量基本一致。 将上述线粒体悬液移入石英杯中，发射及激发波长均为5 2 0 n m ，温度2 5 c ， 在9 6 0 m c 型荧光分光光度计上测定吸光度值( a 5 2 0 ) 。 公式： p 卵孔开放度c ，= 型竖堕堕塑笔筹墓嘉嘉鬈耋掣。 ( 公式2 2 ) 9 硕士学位论文 第二章材料与方法 2 2 5 2 线粒体跨膜电位( ay m ) 测定( 荧光分光光度法) 细胞预处理、染毒及线粒体制备同p t p 检测。 将3 m l 线粒体悬液移入石英杯中，加入浓度为2 0 m m o l lr h l 2 3 溶液5 p l ， 保温3 0 m i n 后检测r h l 2 3 荧光强度的变化。激发波长5 0 5 n m ，发射波长5 3 4 n m 。温 度为2 5 ，测定吸光度值( a 。5 3 4 ) 计算膜电位降低率( ) 。 膜电位降低率c ，= 壁堕望望号等鬈黑主喜笋。 ( 公式2 3 ) 2 2 6 高效液相色谱测定方法测定肝细胞内a t p 。a d p ，a m p 含量 2 2 6 1 细胞处理 取处于对数生长期l 0 2 肝细胞，用0 2 5 胰酶消化，以1 0 4 1 0 5 个m l 细胞数 接种于1 0 0 m l 培养瓶。 培养2 4 d 时后换液，随机分为8 个处理浓度组进行染毒，继续培养2 4 d 时； 取出培养瓶，收集培养基于离心管，0 2 5 的胰酶消化后离心，用p b s 冲 洗2 次后调整细胞数目约为1 0 6 m l ，用e p 管收集细胞； 每个e p 管中加入少量p b s 混匀成细胞悬液，破膜。加入5 0 h l5 0 h c l 0 4 ， 于超声波混匀器混匀。用8 0 p l 的k 2 c 0 3 调整p h 值至6 5 ，1 2 0 0 0 r m i n 离一1 , 1 0 分钟 后，取上清液检测。 2 2 - 6 2 测定方法 试验前准备 称取a t p 标准品6 0 5 m g ，a d p 标准品4 9 9 m g ，a m p 标准品5 0 7 m g 置于2 5 m l 容量瓶中，三蒸水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液，应用前再按 a r p ：a d p ：a m p = 1 ：l ：1 稀释。 色谱条件 色谱柱为d i a m o n s i lc 1 8 柱( 2 0 0 m m x 4 6m m x 5 p m ) ；流动相为甲醇1 0 0 m m o l l 磷酸氢二钾磷酸二氢钾( 含四丁基溴化铵5 m m o l l ，用磷酸调p h 至6 4 3 ) = 1 5 ：8 5 ，用前经0 4 5 i t m 的过滤膜，超声脱气，流速为1 0m l m i n ，柱温为3 5 c ， a u f s1 4 0 m v , 进样量为2 0 “l ，紫外检测波长为2 5 4 n m 。 测量指标的计算 计算总腺苷酸含量( t a n ) ( 结果以p 1 0 6c e l l s 表示) ，a t p a d p 比值以及负 荷能量( e n e r g yc h a r g e ，e c ) 。 l o 硕士学位论文 第二章材料与方法 公式： t a n = a t p + a d p + a m p 髓= 丝婴! ! 三丝丝 a t p + a d p + a m p 2 2 7 细胞呼吸功能检测 2 2 7 1 线粒体的提取 ( 公式2 4 ) ( 公式2 5 ) 细胞预处理：将大培养瓶中的细胞用0 2 5 的胰酶消化并吹打成单细胞悬 液，调整细胞数为1 x 1 0 6 m l 。将充分吹打均匀的细胞悬液接种于1 5 0 m l 培养瓶中， 于二氧化碳培养箱中培养。 染毒处理：培养4 8 h 后，弃原培养液，更换1 6 4 0 培养基。随机分8 个处理组 同2 2 4 1 分组。染毒2 4 h 后，先收集上清液，再与胰酶消化后的细胞混合，以 1 0 0 0 r m i n 离, 1 , 1 0 m i n ，弃上清。 线粒体的制备：加入线粒体提取介质( 0 2 5 m 蔗糖、0 3 5 m 糖醇、 1 0 m m t r i s h c l 、0 5 m me d t a k + ) 液氮反复快速冻融3 次，细胞匀浆器匀浆5 m i n ， 4 4 0 0 0 r r a i n 离, l 二, 1