（动物遗传育种与繁殖专业论文）牛Sry基因核心启动子定位及其基因功能研究.pdf

摘要 摘要 s r y ( s e x d e t e r m i n i n gr e g i o no ft h eyc h r o m o s o m e ) 基因主导哺乳动物雄性性别决定和睾丸 的起始发育。转基因鼠证明s t y 可以诱导x x 型小鼠向雄性发育。s t y 蛋白含有一段可以结合 d n a 的区域，被称为h m g b o x 。h m g b o x 在哺乳动物不同物种间相对保守，人s r yh m g b o x 区域相应位置的点突变可以引起性别反转。对人s r y 的亚细胞定位研究结果表明其分布在 s e r t o l i 细胞细胞核内，推测其发挥转录因子作用。目前，s r y 的表达调控机制依然不清楚。 鼠s t y 在x y 型胚胎生殖嵴s e r t o l i 前体细胞中表达，并受到严格的时空限制，但在其他物种 并不十分严格，如人、羊在成年雄性的睾丸内依然可以检测到其表达。虽然己证明s r y 具有 诱导睾丸发育的功能，但其下游目的基因仍然无法确定。s o x 9 是s r y 可能的下游基因之一。 s t ( s t e r o i d o g e n i cf a t o r - 1 ) ，g 口幻4 ( g at ab i n d i n gp r o t e i n 们，w t lo z 班l m s t u m o rg e n e ) 、 s o x 9 ( s r y - r e l a t e dh m gb o x 一9 ) 、a m h ( a n t im u l l e r i a nh o r m o n e ) 和d a x l ( d o s a g es e n s i t i v es e x r e v e r s a ll o c u s 也被证明在性别决定过程中有重要作用。目前关于哺乳动物s r y 基因的大量 研究主要集中在人和鼠上，在其他动物上的研究较少。牛作为重要的经济动物，在畜牧业生 产中具有重要价值，奶牛繁殖时产生的半数雄性牛，经济价值很低，目前采用的性别控制技 术，主要是依据x 精子和y 精子d n a 含量上的微小差别，以流式细胞技术分离，存在价格 昂贵，分离效率低，及所分离的精子受精率低等问题。阐明牛性别控制相关基因的调控模式， 有希望在分子水平上千扰性别决定的调控网络，可以为奶牛性别控制提供新的思路；也可为 哺乳动物性别分化的比较生物学研究填补牛相关数据的空白。 本试验对牛s r y 基因进行了结构与功能的研究，主要内容包括：克隆了牛s o , 基因包含5 侧翼和编码区在内的1 8 3 8 b p 序列；原代分离培养牛生殖嵴细胞及卵巢颗粒细胞，并对生殖 嵴细胞进行性别鉴定及特征鉴定；利用生物信息学方法预测牛s t y5 侧翼1 0 6 6 b p 内潜在转录 起始位点t s s 及转录因子结合位点，比较1 0 个物种s r y s r y 蛋白同源性及趋异分化程度， 并进行物种进化分析，比较牛及人s r y 蛋白的三维结构；构建不同长度的缺失牛s t y 5 侧翼 序列调控的报告基因载体，利用荧光素酶双报告基因分析系统在生殖嵴细胞内研究牛s , y 核 心启动子区域位置；构建了p c d n a 3 1 - s r y 表达载体，在生殖嵴细胞和卵巢颗粒细胞中进行 了s t y 过表达，利用半定量r t - p c r 对性别控制相关基因在s r y 过表达前后的表达水平变化 进行检测，包括s t ，g a t a 4 ，w t l ，s o x 9 ，a m h 和d a x l ：构建p e g f p - n 1 s , y 亚细胞定位表 达载体，其可以表达融合蛋白( s r y g f p ) ，在牛生殖嵴细胞和卵巢颗粒细胞中进行了s r y 亚细 胞定位研究。主要结论如下： 1 克隆了牛跚基因包括5 侧翼及编码区( o r f ) 在内的1 8 3 8 b p 序列，通过测序及序列 比对，结果和g e n b a n k 中牛s o , 序列( n o a b 0 3 9 7 4 8 1 ) 完全一致。 2 原代分离培养牛生殖嵴细胞，对其进行鉴定表明，此细胞为处于性别分化时期的雄性生 殖嵴细胞，在体外生长状态良好，可以稳定传代，为后继研究奠定了基础。 3 原代分离培养牛卵巢颗粒细胞，经过在体外传代观察，细胞形态均一，在体外生长状态 良好，可以稳定传代，为后继研究奠定了基础。 v i i 东北农业大学农学博十学位论文 4 对牛咖端1 0 6 6 b p 序列的生物信息学分析发现，分别在- 9 3 、- 4 1 9 、- 7 2 2 ( a t g 中a 为0 点) 位置存在三个潜在的转录起始点( t s s ) ，而且这段区域含有非常丰富的转录因 子结合位点信息，这和s o , 基因表达的特异性、复杂性相一致。 5 1 0 个物种s r y s r y 蛋白序列比较结果表明，牛和山羊s d r 蛋白同源性最高，达到9 3 5 ； 牛和小鼠s t y 蛋白趋异分化程度最高，达6 0 4 。 6 进化分析表明牛与羊在亲缘关系上最为接近，归为一类，在比较的1 0 个物种中是处于进 化最远的亚类，表明偶蹄目动物s o , 基因在进化上受自然选择的影响有较大的变异。 7 比较牛和人s r y 蛋白结构，仅在保守区h m g b o x 处有较高的相似性，但是空间构象却 比较相似，都是通过结合d n a 螺旋小沟来识别7 个碱基的核心靶序列，作用方式也很相 似，说明虽然s r y s r y 蛋白在物种间序列差异较大，但蛋白的结构和作用方式却是很保 守的。 8 在生殖嵴细胞内，利用双荧光素酶报告基因检测系统，用1 3 个缺失表达载体，对牛s t y 5 侧翼1 0 5 6 b p 启动子区域进行了细致扫描，结果表明牛s o , 核心启动子位于翻译起始位点 a t g ( a 为o 点) 上游5 9 9 5 6 5 b p 一段3 5 b p 大小的区域内。 9 利用p c d n a 3 1 - s o 表达载体在牛生殖嵴细胞内过量表达s r y ，用r t p c r 检测性别发育 相关基因s t y 过表达前后表达水平变化，包括即、g a t a 4 、w t l ，s o x 9 、a m h 和d a x l ， 结果证明牛s o , 对s o x 9 表达有正调控作用，而其他基因不受s o , 过表达影响。 1 0 利用p e g f p - n 1 - s r y 融合蛋白表达载体( s t y g f p ) 在牛生殖嵴细胞和卵巢颗粒细胞中研 究s t y 的细胞内分布，结果证明牛s r y 蛋白定位于细胞核内，进一步证实其作为转录因 子发挥作用。 创新点： 1 首次利用生物信息学方法对牛s o , 基因作全面的生物信息学分析，如结论4 - 7 条，预测分 析对牛s t y 基因启动子潜在转录起始位点和转录因子结合位点；比较1 0 个物种s d ，蛋白 序列同源性和分化程度；利用1 0 个物种的s o , 序列，对牛蹄基因进行进化分析；对比 牛和人的s r y 蛋白空间结构。 2 首次细致分析了牛s t y 基因启动子区域，并将核心启动子定位于翻译起始位点a t g ( a 为0 点) 上游5 9 9 5 6 5 b p 一段3 5 b p 大小的区域内。 3 首次证明牛s o , 基因对s o x 9 基因有正调控作用，证明牛s t y 基因可能直接或间接调控s o x 9 表达。 4 首次利用实验证实牛s r y 蛋白定位于细胞核。 关键词牛；s o , ；核心启动子；s o x 9 ；亚细胞定位；分子进化；r t - p c r v i j i a b s t r a c t m m lm _ b o v i n eo c a l i z a t i o na nd j 11 n j _ - b e n e 。u n c t l o n a lc h a r a c t e r i z a t t o n a b s t r a c t i nm a m m a l s ，m a l es e xd e t e r m i n a t i o na n di n i t i a t i n gt e s t i sd e v e l o p m e n ta r eu n d e rt h ec o n t r o l o ft h es r y ( s e x d e t e r m i n i n gr e g i o no f t h eyc h r o m o s o m e ) i n19 91 ，k o o p m a nr e p o r t e dt h a ts t yg e n e c a nd i r e c tm a l ed e v e l o p m e n ti na l lx xt r a n s g e n i cm o u s e s r yp r o t e i nc o n t a i n sad n ab i n d i n g d o m a i nk n o w na st h eh m g b o x t h eh m gb o xi st h es i n g u l a rp a r to fs r yc o n s e r v e db e t w e e n s p e c i e s ，a n dp o i n tm u t a t i o n si nt h ec o r r e s p o n d i n gr e g i o no ft h es r yg e n ec a u s es e xr e v e r s a li n h u m a n s i nh u m a n ，s r yp r o t e i nw a sd e t e c t e di nt h en u c l e io fs e r t o l ic e l l s ，a n dw a ss p e c u l a t e dt h a t i tw o r k e d 丛at r a n s c r i p t i o n a lf a c t o r a l t h o u g ht h et e s t i s i n d u c i n gf u n c t i o no fs t yh a sb e e nc l e a r l y d e m o n s t r a t e d ，i t sd i r e c tt a r g e tg e n eo rg e n e ss t i l la w a i ti d e n t i f i c a t i o n a so n el i k e l ys r yt a r g e t , t h e s r y - r e l a t e dg e n es o x 9h a se m e r g e d m o s to t h e rg e n e sw h i c ha r ei n v o l v e di nt h i sc o m p l e xp r o c e s s a n dp l a y i m p o r t a n tr o l e si nm a l es e xd i f f e r e n t i a t i o nh a v eb e e ni d e n t i f i e d ，i n c l u d i n g 驴 ( s t e r o i d o g e n i cf a t o r - 1 ) g a t a 4 ( g a t ab i n d i n gp r o t e i n4 ) w t l ( w i l m s lt u m o rg e e ) s o x 9 ( s t y - r e l a t e dh m gb o x - 9 ) ，a m h 阳n t im u l l e r i a nh o r m o n e ) ，a n dd a x l ( d o s a g es e n s i t i v es e x r e v e r s a ll o c u s - 1 ) a tp r e s e n t ，a l m o s ta l lt h er e s e a r c h e sa b o u tm a m m a l sa r ef o c u so nh u m a na n d m o u s e ，a n dt h e r ea r ef e w e rr e s e a r c h e so no t h e ra n i m a l s c a t t l ei st h o u g h tt ob e a ni m p o r t a n t e c o n o m i ca n i m a l ，i ti sg r e a tv a l u a b l ei na n i m a lh u s b a n d r y t h em a l ec a l v e sa r ev a l u e l e s s a t p r e s e n t , t h es e xc o n t r o lt e c h n o l o g i e sb e i n gu s e di nc o wp r o d u c t i o ni ss e p a r a t i o no fxa n dys p e r m s i t sd i s a d v a n t a g e sa r ee x p e n s i v e ，l o we f f i c i e n c y , r e d u c t i o no ff e r t i l i t yr a t e ，a n ds oo n r e s e a r c h e so n m o l e c u l a rr e g u l a t i o nm e c h a n i s ma b o u ts e xd e t e r m i n a t i o n , f i n d i n gt h em e t h o dt oi n t e r f e r et h e r e g u l a t i o nn e to fs e xd e t e r m i n a t i o nc a np r o v i d ean e wm e a n sf o rc o ws e xc o n t r 0 1 t h er e s e a r c h e s a m o n gd i f f e r e n ts p e c i e sc o u l da l s oh e l pu st of u r t h e ru n d e r s t a n dt h em e c h a n i s m so fs e x d e t e r m i n a t i o na n dt h ee v o l u t i o n a r yr u l e si nm a m m a l i a ns e xd e t e r m i n a t i o n i nt h i sr e s e a r c h ，w ec l o n e dt h e18 3 8 b ps t ys e q u e n c e s ，i n c l u d i n gt h e5 f l a n k i n ga n do r f b o v i n eg e n i t a l r i d g ec e l l sa n do v a r yg r a n u l o s ac e l l sw e r ei s o l a t e da n dc u l t u r e di nv i t r o w e i d e n t i f i e dt h es e xa n dc h a r a c t e r i s t i co ft h eg e n i t a lr i d g ec e l l s t h ei n f o r m a t i o no fs t y5 f l a n k i n ga n d o r fw e r ea n a l y z e db yb i o i n f o r m a t i c sm e t h o d t h ep o t e n t i a l t r a n s c r i p t i o n a ls t a r t s i t ea n d t r a n s c r i p t i o n a lf a c t o rb i n d i n gs i t e si ns t y5 f l a n k i n g1 0 6 6 b pw e r ep r e d i c t e d t oa n a l y z i n gt h e e v o l u t i o no fb o v i n es t y , w ec o m p a r e ds r yp r o t e i ns e q u e n c e sa m o n g10s p e c i e s w ea l s op r e d i c t e d a n dc o m p a r e dt h et h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r es r y s r yb e t w e e nh u m a na n db o v i n e t of i n dt h e c o r ep r o m o t e ro fb o v i n es r y ，w ec o n s t r u c t e d13d e l e t i o nr e c o m b i n a n t sw i t hd i f f e r e n tl e n g t ho fs t y l x 东北农业火学农学博上学位论文 5 。f l a n k i n g ，p r o m o t e ra c t i v i t ya n a l y s i s w a sp e r f o r m e di nb o v i n e g e n i t a lr i d g ec e l l sb yt h e d u a l - l u c i f e r a s er e p r o t e ra s s a ys y s t e m s o , g e n ew a so v e r e x p r e s s e db yp c d n a 3 1 一s r yi ng e n i t a l r i d g ec e l l sa n dg r a n u l o s ac e l l s ，a f t e rt h a ts i xg e n e sw h i c hw e r ei d e n t i f i e da si m p o r t a n tg e n e si ns e x d e t e r m i n a t i o ni nm a m m a l s ，i n c l u d i n g 即，g a t a 4 , w t l ，s o x 9 , a m ha n dd a x lw e r ee x a m i n e db y s e m i q u a n t i t a t i v er t p c rt oo b s e r v et h e i re x p r e s s i o nc h a n g ei n f l u e n c e db ys t y s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o nw a sa l s op e r f o r m e dt oa n a l y z et h ed i s p o s i t i o no fs r yp r o t e i ni ng e n i t a lr i d g ec e l l sa n d g r a n u i o s ac e l l s w eg o tt h ec o n c l u s i o nb e l o w ： 1 t h e18 3 8 b ps o , s e q u e n c e s ，i n c l u d i n gt h e5 f l a n k i n ga n do r f ，w e r ec l o n e da n ds e c q u e n c e d b l a s ta n s l y s i si n d i c a t e dt h a tt h es e q u e n c e sw e r ec o n s i s t e n tw i t hb o v i n es r ys e q u e n c e si n g e n b a n k ( n o a b 0 3 9 7 4 8 1 ) 2 b o v i n eg e n i t a lr i d g ec e l l sw e r ei s o l a t e da n dc u l t u r e di nv i t r o ，a n di tw e r ei d e n t i f i e dt h a ti tc a m e f r o mam a l eg e n i t a lo fs e xd i f f e r e n t i a t i o np e r i o d ；t h e yc o u l dg r o wn o r m a l l yi nv i t r o ，a n db e p a s s a g e ds t a b l e l y 3 b o v i n eo v a r yg r a n u l o s ac e l l s w e r ei s o l a t e dc u l t u r e di nv i t r o ，t h e yc o u l dg r o wn o r m a l l yi nv i t r o ， a n db ep a s s a g e ds t a b l e l y 4 t h eb o v i n es r y5 f l a n k i n gs e q u e n c e so f10 6 6 b pw e r ea n a l y z e db yb i o i n f o r m a t i c sm e t h o d i t w e r ei n d i c a t e dt h a tt h e r ew e r e3p o t e n t i a lt r a n s c r i p t i o n a ls t a r ts i t e sa t 一9 3 、- 419 、- 7 2 2 ( a t g ，a w a s0p o i n t ) ，a n dt h et r a n s c r i p t i o n a lf a c t o rb i n d i n gs i t e s ( t f b s ) p r e d i c t i o ni n d i c a t e dt h a tt h e r e w e r ec o p i o u s p o t e n t i a lt f b si n t h e f r a g m e n t , w h i c hw a sc o n s i s t e n t w i t ht h es p e c i a l c o m p l i c a t e dr e g u l a t i o nm e c h a n i s mo fs r y 5 c o m p a r i s o no f10s p e c i e ss r y s r ys e q u e n c e ss h o w e dt h a tb o st a u r u sw a sm o r eh o m o l o g o u s t oc a p r ah i r c u s ( 9 3 5 ) ；b o st a u r u sw a sm o r ed i v e r g e n tf r o mm i l sm u s c u l u s ( 6 0 4 ) 6 e v o l u t i o na n a l y s i so fs r y s r ys e q u e n c e so f10s p e c i e ss h o w e db o st a u r u sa n dc a p r ah i c u s w e r em o r er e l a t i v e ，a n db e l o n g e dt oag r o u p ，t h e ya r er e a c ht ot h ed i s t a le n do ft h ec l a d o g r a m ， i n d i c a t e dt h a ta r t i o d a c t y l o u sa n i m a l sh a sg r e a t e rv a r i a t i o nt h a no t h e r sb ym e a n so fn a t u r a l s e l e c t i o n 7 c o m p a r i s o no fs r y s r yp r i m a r ys t r u c t u r eo fh u m a na n db o v i n e ，t h eh m g - b o xw a st h e s i n g u l a rc o n s e r v e dp a r t , b u tt h e yw e r es i m i l a ri nt h et h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r e t h e yb o t hc a l l r e c o g n i z et h e7 b pc o n s e r v e db i n d i n gs i t es e q u e n c e s i ti n d i c a t e dt h a ta l t h o u g ht h es t yp r i m a r y s t r u c t u r eh a sg r e a t e rv a r i a t i o na m o n gd i f f e r e n ts p e c i e s ，t h et h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r ea n d m o d eo f a c t i o nw e r es i m i l a r 8 w ec o n s t r u c t e d13d e l e t i o nr e c o m b i n a n t sw i t hl u c i f e r a s er e p o r e t e r ，t h ep r o m o t e ra c a t i v i t yo f b o v i n es r y5 f l a n k i n gl0 5 6 b pw a sa n a l y z e db yd u a l - l u c i f e r a s er e p r o t e ra s s a ys y s t e mi ng e n i t a l r i d g ec e l l s ，t h ec o r ep r o m o t e ro fb o v i n es t yw a sl o c a t e da tt h e 一5 9 9 - - 5 6 5 b pu p s t r e a mo fs o , t r a n s l a t i o ns t a r ts i t ea t g ( ai s0s i t e ) ，af r a g m e n to f3 5 b p 9 s r yw a so v e r e x p r e s s e di ng e n i t a lr i d g ec e l l sb yp c d n a 3 1 s r y ，a f t e rt h a ts i xg e n e sw h i c hw e r e i d e n t i f i e da si m p o r t a n tg e n e si ns e xd e t e r m i n a t i o ni nm a m m a l s ，i n c l u d i n gs f l ，g a t a 4 , w t l ， x a b s t r a c t s o x g , a m ha n dd a x lw e r ee x a m i n e db ys e m i - q u a n t i t a t i v er t p c rt oo b s e r v et h e i re x p r e s s i o n c h a n g ei n f l u e n c e db ys o , t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ts , yc a nu p r e g u l a t et h es o x 9e x p r e s s i o n 10 s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o nw a sp e r f o r m e dt oa n a l y z et h ed i s p o s i t i o no fs r yp r o t e i ni ng e n i t a l d d g ec e l l sa n dg r a n u i o s ac e l l s b o v i n es r yp r o t e i ni o c a l i z a t e di nt h ec e l ln u c l e i ，i tc o n f i r m e d t h a tb o v i n es r yw o r k i n g2 l st r a n s c r i p t i o nf a c t o r k e yw o r d s ：b o v i n e ；蹄；c o r ep r o m o t e r ；s o x 9 ；s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n ；m o l e c u l a re v o l u t i o n ； r ，r - p c r c a n d i d a t e ：h a nf e n g t o n g s p e c i a l t y ：a n i m a lg e n e t i c sb r e e d i n ga n dr e p r o d u c t i o n s u p e r v i s o r ：p r o f l i ud i ，p r o f l i nx i u k u n x i 独创声明 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 逵； 垫遗查基丝益墓挂型直塑的：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文作者签名：写易风稠 日期：p 哲年月砌日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：彰触芥圉 日期：沙口扩年月z 夕日 导师 签名：1 v 日期：加沪月日 引言 1 引言 高等动物性别发育是个非常复杂的生命过程。人类在了解性别决定机制和性别控制的道 路上，经历了漫长的时期。研究哺乳动物性别发育规律，实现对哺乳动物性别发育控制，不 仅对畜牧业生产具有重要意义，而且对预防和治疗人类一些伴性遗传疾病也具有指导意义。 家畜性别对畜牧业生产业生产影响巨大，奶牛、奶山羊需要母畜，肉用家畜需要公畜( 肉 质及生长速度好于母畜) ；采用配套体系生产猪肉和鸡蛋，种畜禽母系只需要雌性动物，父系 只需雄性；在育种过程中实现性别控制能够增加选种强度，加快育种进程；在体外授精过程 实现精子性别控制，将能更有效利用优良卵母细胞。另外，濒危动物需要增加雌性动物数量， 才会有利于迅速扩大繁殖；所以家畜性别控制一直是当今生物学领域的重大研究课题之一。 目前虽然对雄性性别发育主控基因s r y 的研究取得了丰富的成果，但距离详细了解复杂的性 别发育网络还要经历漫长的过程。本文将对s 一基因及其在哺乳动物性别发育过程中的作用 详细综述。 1 1 跚基因与性别决定 1 1 1 胀y 基因的发现 早在1 9 5 7 年，就已经发现y 染色体决定哺乳动物雄性性别发育。人和鼠的细胞遗传学分 析表明，y 染色体上存在一个诱导x y 个体雄性性别发育的显性遗传基因座( f o r de ta 1 ，1 9 5 9 ； j a c o b se ta 1 ，1 9 5 9 ；w e l s h o n se ta 1 ，1 9 5 9 ) 。这一基因座在人的缩写为t d f ( t e s t i s - d e t e r m i n i n g f a c t o r ) ，在鼠的缩写为r d y ( t e s t i s - d e t e r m i n i n g g e n eo nt h e 矽，这一基因座就是蹄基因( 在人称 为s r 堪因1 。 在s t y 基因的寻找过程中使用了很多分子生物学方法，最终利用定位克隆技术成功分离出 s t y 基因，而且这一过程被认为是定位克隆的一个经典案例。大多数定位克隆方案都是先通过 染色体易位分析确定候选基因，然后删除此基因，通过观察异常表型的出现确定目标基因。 在寻找跚基因的过程中，正是通过这一方法分析人性别反转病人。大多数人) ( ) ( 男性病人都 带有y 染色体序列，这是由于在减数分裂时期发生了x - y 染色体间的交叉互换( f e r g u s o n - s m i t h , 1 9 6 6 ；f e r g u s o n s m i t he ta 1 ，1 9 8 8 ) 。当分析四位x x 男性病人的d n a 时，发现他们都带有一段 3 5 k b 大小的y 染色体特异序列( s 幻c l a i re ta 1 ，1 9 9 0 ) 。扫描这段3 5 k b y 染色体保守序列时，发现 了一个开放阅读框( o r f ) ，这个开放阅读框就是编码s r y ( s e x ，d e t e r m i n i n gr e g i o ny g e n e ) 基因的 序列。同时在鼠y 染色体上也找到了一个与其同源的基因( g u b b a ye t a l ，1 9 9 0 ) 。 这个基因带有t d f 的所有特征。更重要的是，在x y 女性性别反转病人体内发现豫y 基因 存在突变，表明睾丸的正常发育需要s r 堪因发挥功能( b e r t ae ta 1 ，1 9 9 0 ；j a g e r e ta 1 ，1 9 9 0 ) 。 s t y 基因的睾丸诱导发育功能在转基因鼠试验中也得到证实，在这个试验里x x 鼠如果带有s , y 东北农业大学农学博十学位论文 基因就可以向雄性发育( k o o p m a ne t a l ，1 9 9 1 ) 。这些试验表明y 染色体上的勋瑾因对诱导雄性 性别决定是必须的而且充分的，它是睾丸决定因子的编码基因( i s h i ie ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 1 1 2 艘】，基因的结构和功能 人艘y 基因开放阅读框( o r e ) 存在于一个单独的内含子内，编码2 0 4 个氨基酸的蛋白。蛋 白可以分为三个区域( f i g 1 1 ) ，中央7 9 个氨基酸编码h m g b o x 区域，其可以与d n a 结合并使 之弯曲，h m g b o x 两端包含两个细胞核定位信号。人s r y 蛋白c 末端除了后7 个氨基酸外，没 有其他明显的保守结构，这7 个氨基酸在体外可以和p d z 结构蛋白相互作用( p o u l a t e t a l ， 1 9 9 7 ) 。人s r y 蛋白n 末端除了含有可以增强于d n a 结合能力的磷酸化位点外，也没有明显的 保守结构( d e s c l o z e a u xe ta 1 1 9 9 8 a ) 。哺乳动物不同物种i 甘- j s r y 蛋白只有h m g b o x 区域相对保 守，在其他区域变异较大。小鼠的s r y 蛋白和其他物种或和其他亚种比略有不同，其内部存在 一段谷氨酸富集区域，但其他物种没有。 1 1 2 1h m g b o x 的作用：与d n a 结合并使之弯曲 s r y 蛋白的h m g b o x 区域是个保守的d n a d x 沟识别序列，属于高迁移率的非组蛋白结 构，使其具有可以和d n a 结合的能力( j a n t z e ne ta 1 ，1 9 9 0 ；w a t e r se ta 1 ，2 0 0 7 ) 。因此将s r j ，基因 归属于一类具有特异d n a 序列结合能力的转录因子，如t c f l 和l e f l ( o o s t e r w e g e l e ta 1 ，1 9 9 1 ； t r a v i se ta 1 ，1 9 9 1 ；v a nd ew e t e f i n ge ta 1 ，1 9 9 1 ) 。人s r y 蛋白h m g 结构和d n a 结合复合物的核 磁共振结构表明( f i g 1 2 ) ，其结构是三个洳螺旋结构组成的l 型立体结构。螺旋l 和2 反向平行 形成一个短臂。稍长些的螺旋3 与氨基酸链末端反向平行形成长臂，并与短臂形成9 0 。角。三 个螺旋内保守的芳香族氨基酸聚集在一起形成蛋白的疏水核心，稳定蛋白结构。s r y 蛋白和 d n a 小沟结合并使之发生约8 0 0 弯曲。 在一位x y 性腺发育畸形病人，其h m g b o x 区域1 1 e 6 8 突变为t h r ，导致s r y 蛋白与d n a 的 结合能力下了5 0 。现在还不清楚这种蛋白和d n a 结合的精确功能，但可以推测它可以构成 一种特殊的染色体d n a 结构。染色质研究也证实s r y 蛋白可以转移f m - 2 启动子上的核小体( n g e ta 1 ，1 9 9 7 a ) 。人s r y 蛋白可以同a a c a a a g 和a a c a a t 序列特异结合，分别与咒 和l e f l 的结合位点一致( h a r l e ye ta 1 ，1 9 9 2 ；h a r l e ye ta i ，1 9 9 4 ；v a i ld ew e t e r i n ge ta 1 ，1 9 9 2 ；w a t e r m a n e ta 1 ，1 9 9 1 ) 。研究发现人s r yh m g b o x 如果发生突变，破坏了s r y 蛋白与d n a 结合能力，会 出现x y 性别反转( h a r l e ye ta 1 ，1 9 9 2 ；s h a h i de ta 1 ，2 0 0 8 ) ，表明s r y 指导雄性发育的生物学功 能是靠s r y 蛋白与d n a 的结合发挥作用( e i ye ta 1 ，2 0 0 7 ) 。这些结果表明s r y 是处于睾丸发育 级联反应顶端的细胞自主调控因子。 深入研究表明人和鼠的s t y 蛋白可以使d n a 发生6 0 8 5 0 角的弯曲，这个弯曲角度在不同物 种也有所不同( f e r r a r ie ta 1 ，1 9 9 2 ；g i e s ee ta 1 ，1 9 9 2 ；g i e s ee ta 1 ，1 9 9 4 ) 。l e f i 也有相同特性的研 究报道( g i e s ee ta 1 1 9 9 2 ) ，因此暗示这些蛋白有可能做为结构转录因子，它们被认为靠影响 目标基因调节区域的染色体结构而发挥作用，以此来促使调控复合物组装( g r o s s c h e d le ta 1 ， 1 9 9 4 ；w o l f f e ，1 9 9 4 ) 。体外研究表明，l e f i 主要是靠调节其和两个辅助因子( e t s 1 和p e b p 2 a ) 在增强子内的结合位点相对位置来调控t c r a 增强子的活性( g i e s ee ta 1 ，1 9 9 5 ) 。在转染分析 2 引言 中，s 秽可以部分替代l e f l 的功能，发挥激活增强子的作用。人x y 女性性别反转病人突变的 s r y 蛋白可以正常暑l 1 d n a 结合，但使d n a 发生弯曲的能力存在缺陷( p o n t i g g i ae t a l ，1 9 9 4 ) ， 这个结果支持s r y 作为结构转录调控因子的模型。s r y 基f g l t h m g b o x l 夏域的序列在不同物种 间保守性非常弱( f i g 1 1 ) 。这可以用s t y 基因位于y 染色体上作部分解释，因为y 染色体上的基 因相对于常染色体和x 连锁染色体上的基因更容易发生序列飘移。即使这样解释，s , - y 基因的 非保守变异依然比预期更大，在进化过程，这种变异已经达到了正向选择程度( k i n ge t a l ， 2 0 0 7 ；p a m i l oe ta 1 ，1 9 9