（基础兽医学专业论文）fsh诱导小鼠卵母细胞体外成熟机制的研究.pdf

摘要 捅要 哺乳动物卵母细胞生长、发育和成熟的惆节机制足当前生殖生物学及发育生物学的研究 热点之一。在卵母细胞成熟过程中促性腺激素( 尤其是f s h ) 起最要的作_ 日j 。关寸二促性腺激 素诱导卵母细胞恢复减数分裂的机制存在两个假说：挂促性腺激素诱导卵r 扩展使颗粒细 胞与卵埘细胞的缝隙连接中断，使抑制减数分裂的物质向卵母细胞的输入中断，导致减数分 裂队复；二是促性腺激素诱导卵丘细胞产生一些因子，克服抑制物质的作用而促使减数分裂 的恢复。但是迄今为止这些正因子的性质以及作明途径仍然有待研究。 近年来，哺乳动物卵母细胞体外成熟技术已取得长足的进步。即便如此，某些动物卵f 4 细胞体外成熟率仍然较低，仍存在许多问题没有解决。在人类及珍稀动物辅助生殖中卵埘绌 胞的获得是十分困难的，囚而最大限度的利用卵母细胞十分必要。有报道让明卵丘细胞产生 的某些冈子对卵母细胞的成熟有影响。因此我”j 以小鼠为实验动物模型，探索这些因子的作 j 目求提高裸卵和部分裸露的g v 期卵母细胞成熟和发育能力。 哺乳动物卵母细胞正常发育是一系列复杂发育调节过程，通过缝隙连接午 j 旁分泌协- j 作 _ l f j 卵母细胞最终完成发生。本研究席用缝隙连接解偶联剂结合兆培养技术通过i 刨接的手段探 【寸止二闪子进入途径及其对卵母细胞成熟的影响，从而为建立卵丘细胞共培养系统，提高卵母 细胞成熟率和发育能力提供参考数据。 本实验得到了如下的一些结果： i 、分离的卵丘细胞能够释放某些诱导d o 恢复减数分裂的园f ，这些因子可以通过旁分泌发 挥作用。 2 、分离的卵丘细胞可释放某些旁分泌因子，但是这些因子不能诱导完整的c o c s 中的卵母细 胞恢复减数分裂。 3 、f s h 刺激的卵丘细胞的产生某些因子，这些因子需要通过缝隙连接进入卵母细胞，并h 这种机制在c o c s 卵母细胞的减数分裂恢复中起主要作用。 4 、在f s h 作用下猪卵丘细胞可以产生提高小鼠p n o 和n o 的g v b d 比例的某些因子，但 是它们不能提高p n o 和n o 的受精率和囊胚率。 芙键词：缝隙连接；旁分泌；卵丘卵母细胞复合体；生发泡破裂 v m e c h a n i s mo fm o u s e o o c y t ei v m i n d u c e db yf s h a b s tr a c t r e g u l a t i o nm e c h a n i s mo fg r o w t b ，d e v e l o p m e n la n dm a t u r a t i o no fo o c y | ei nm a m m a lw a so n e o fl o c io fr e p r o d u c t i v eb i o l o g ya n dd e v e l o p m e n t a lb i o l o g yg o n a d o t r o p i n s ，e s p e c i a l l yf s h ，p l a y e d ai m p o r t a n tr o l ei nm a t u r a t i o no fo o c y t et h e r ew e r et w oh y p o t h e s e so nm e c h a n i s mo fm e i o t i c i e s u m p t i o np r e s e n t l y , o n ew a sc u m u l u so o p h o r u se x p a n d e dw h i c hi n d u c e db yg o n a d o t r o p h i n b r o o k e dg a pj u n c t i o n a lc o m m u n a t i o nb e t w e e no o c y t ea n dg r a n u l o s ac e l l s ，b l o c k e dt h ec o n d a c r i o a o fm e i o s i s i n h i b i t f o r ys i g n a l sf r o mt h eo u t e rc u m u l u sc e l l st ot h eo o c y t e ，t h e nm e i o t i cr e s u m p t i o n 7 h eo t h e rw a sm e i o t i cr e s u m p t i o nb ye l i e i t i n gam a t u r a t i o n i n d u c i n gs i g n a lf r o mt h eg r a n u l o s a c e l l sw h i c ho v e r r i d e dt h ei n h i b i t o r ym i l i e uo ft h ef o l l i c l e h o w e v e r , p r o p e r t ya n dr e g u l a t i o n m e c h a n i s mo f t h ep o s i t i v ef a c t o rw e r es t i l lu n k n o w n 。 p e o p l em a d eag r e a tp r o g r e s si ni v mi nm a m m a lr e c e n t l y , e v e nt h o u g hm a t u r a l i o no fo o c y t e i ns o m es p e c i e sw e r es t i l lv e r yl o w m a n yp r o b l e m sa b o u ti v mw e r es t i l lr e m a i n e di na s s i s t e d r e p r o d u c t i o nt e c h n o l o g yp r o g r a mo fh u m a na n de n d a n g e r e ds p e c i e s ，o o c y t eo b t a i n i n gw a sv e r y d i f f i c u l ti ti sn e s s a r yt ou s eo o c y t em a x i m u m l y s e v e r a ls t u d i e sr e p o r t e dc uj u m u sc e l l sp r o d u c e d s o m ep o s i t i v ef a c t o r sw h i c hc o u l di n f l u e n c em a t u r a t i o n s ow eu s em o u s ea sam o d e l ，t o i n v e s t i g a t et h ef u n c t i o no ft h e s ef a c t o r s ，t oi m p r o v em a t u r a t i o na n dd e v e l o p m e n to fp n oa n dn o a t g vs t a g e d e v e l o p m e n to fm a m m a l i a no o c y t a sw a s as e r i e so fc o m p l e xa n dd e v e l o p m e n t a l l yr e g u l a t e d p r o c e s sg a pj u n c t i o n a lc o m m u n i c a t i o na n dp a r a c r i n es i g n a l i n gi n t e r p l a y i nt h o s e p r o c e s s e s w h i c hk i n do fc o m m u n i c a t i o nd o m i n a t e di nm e i o t i cr e s u m p t i o nw a su n k n o w t h i ss t u d yw a st o i n v e s t i g a t et h ep a t hw a ya n dt h ee f f e c to f t h ep o s i t i v ef a c t o r sb yu s i n gt h eg a pj u n c t i o n a li n h i b i t o r a n dc o c u l t u r et e c h n i q u et op r o v i d eb a s i cd a t af o rm a t u r a t i o na n dd e v e l o p m e n to fo o c y t ei n c u m u l u sc e l l 一c u l t u r es y s t e m t h er e s u l t so b t a i n e dw e r ea sf o l l o w s ： 1d i s s o c i a t e dc u m u l u sc e l l s p r o d u c e ds o m em e i o s i s i n d u c i n gf a c t o r sw h i c hc o u l d a c ta s a p a r a c r i n es i g n a l 2 d i s s o c i a t e dc u m u l u sc e l l sp r o d u c e ds o m ef a c t o r s ，b u tt h ef a c t o r sc o u l dn o ti n d u c em e i o t i c r e s u m p t i o no f o o c n ei nc o o s 3t h ea c t i o n o fp o s i t i v em e i o s i s - i n d u c i n gf a c t o r ss e c r e t e db yf s h s t i m u l a t e dc u m u l u sc e l l so n o o c y t ad e p e n d e do ng a pj u n c t i o n a lc o m m u n i c a t i o nw h i c hw a sd o m i n a n tm a n n e ri nm e i o s i s r e s u m p t i o n 4 。f s h s t i m u l a t e dd i s s o c i a t e dc a n l u l u sc e l l sf r o ms w i n ep r o d u c e ds o m ef a c t o r sw h i c hc o u l d i n c r e a s et h ep e r c e n t a g eo fg v b do fp n oa n dn o ，b u tn o ti m p r o v ep e r c e n t a g eo ff e r t i l i z a l i o na n d b l a s t u j a ei nm o u s e v i l ：，。一，。玺些查：! 些堡耋丝，：；耋耋：l ；兰。，! ，。，。 k e yw o r d s ：g a p j u n c t i o n ；p a r a c i n e ；c u m u l u s - o o c y t ec o m p l e x ；g e r m i n a lv e s i c l eb r e a k d o w n v i i i p o s t g r a d u a t e ：y u es h u n l i m a j o r ：b a s i cv e t e r i n a r ys c i e n c e a d i s o r ：p r o f y a ny u n q i n 1 引言 哺乳动物卯母细胞聋 王= 发育和成熟的调节机制延当的生殖生物学及笈育生物学的研究热 之。目前卯母细胞体外成熟体外受精技术( i v m i v f ) 研究已经取得了很大进展，但休 外成熟卵母细胞的质量远不如体内成熟卵母细胞( s i r a r de ta l ，1 9 9 8 ) ，还存在很多问题没有 解次。i j qj _ k 有必要进一步研究卵母细胞成熟机制，提高卯毋细胞的体外成熟率和质茸。荚 j 卵母细胞成熟的机制，最使人们感兴趣的是磕数分裂阻浠状态的维持机制及减数分裂的陬 复机制。 1 1 卵母细胞的成熟 哺乳动物卵子发生过程中，卵母细胞减数分裂( 核成熟) 有两次停滞。第一次是在前艄 1 ，发生在j l 自j b 期卵原细胞迁移到卵巢皮质并被次级性索细胞包裹后，义称g v 期，并停盛在 这一阶段。性成熟后，在促性腺激素的刺激下卯泡开始发育。l h 峰诱发减数分裂的恢复， 发生生发泡破裂( g e r m i n a lv e s i c l eb r e a k d o w n ，g v b d ) ，在l h 峰后2 4 - 4 8 小时，初级9 目母细 胞从卵泡中排出，分裂成次级卵母细胞和第一极体，完成第一次减数分裂，停滞在中期1 1 ， 直至受精才启动第二次减数分裂。绝大部分哺乳动物如此( 狗和狐例外) 。第次停滞( 初级 卵母细胞) 到第二次停滞( 次级卵母细胞) 期间，伴随卵泡生长的启动，初级卵博细胞开始 迅速生长，细胞质内细胞器大量复制增殖，r n a 含量成倍增长，合成大量的蛋白质并积累能 量物质，为卵母细胞的受精及早期胚胎发育作好准备。卵母细胞的生长与卵泡的生k 并不平 行，小鼠卵母细胞的生眨在卵泡腔形成时就已完成而家畜卵母细胞生长一直持续到生发泡 破裂之前( g o s d e ne la l ，1 9 9 7 ) 。 1 2 促陛腺激素诱导卵母细胞恢复减数分裂的机制 e p p i g 等( 1 9 9 7 ) 对促性腺激素嚣导卵母细胞恢复减数分裂的机制曾提出两个假设：一 是促性腺激素诱导卵丘扩展使颗粒细胞与卵母细胞的缝隙连接中断，使抑制减数分裂的物质 ( 如c a m p ) 向卵母细胞的输入中断，导致减数分裂恢复：二是促性腺激素诱导卵丘细胞产 q ：些因子，克服抑制物质的作用而促使减数分裂的恢复。 1 2 1 抑制因子输入中断与减数分裂恢复 1 9 3 5 年p i n c u s 和e n z m a n n 发现将兔的有腔卵泡中的卵母细胞分离出来并在体外培养时 j 以i 。f 发成熟。将人卵母细胞从卵泡环境中分离出来它们会快速的恢复减数分裂( e d w a r d s 。 1 9 6 5 ) ，这种现象坡称为体外的自发成熟。显菊塌地，卵泡环境对卵母细胞自发成熟起刭一种 抑制作州，而且这种现象已被几种动物的颗村细胞其培养( r s a f r i r ie l 越，1 9 7 5 ) 或添加卯、旭 液的实验i 止明( c h a n ge t a l ，1 9 5 5 ) 。这些是第种假说的自力的实验让明。 住9 _ 泡液中存在着一些减数分裂抑制冈子，以旁分泌的方式作用- f 卵母细胞抑制其成熟。 口甜人们认为这种冈r 在猪，人鼠及仓鼠卵泡液中是一种小分子多肚，( f h i b a u l tp ，讲，1 9 8 7 ) ， 止牛叩泡中为亚油酸( h o m a b r o w n ，1 9 9 2 ) 。此外，缝隙连接介导嘌呤( 次黄喋呤) 、c a m p 等抑制【捌子向卵母细胞的传递并抑制了成熟。f s h 、f o r s k o l i n 和霍乱毒素等药物处理颗粒细 肥，引起颗粒细胞中的c a m p 水平升高，结果卵母细胞内的c a m p 也相应的升高。l 噪呤类， 例如h x 和i b m xr 被认为通过调节细胞内c a m p 的代谢和调节卵母细胞膜上的腺什酸环化 酌的活性来维择减数分裂阻浠( s a l u s t r ie t a l ，1 9 8 8 ) 。实际上这些嘌吟在卵泡液- p 浓度很高 而且能蝣阻止小鼠、牛和猴的卵母细胞体外恢复减数分裂( e p p i g “口，1 9 8 5 ：d o w n s ，1 9 9 0 ) 。 1 2 2 促进因子与减数分裂恢复 但是抑制因子进八减少假说也存在着一些矛盾。l a w r e n c e 等( 1 9 8 0 ) 认为由于人鼠卵母 细胞上没有l h 的受体，因而其成熟必需依赖于体细胞提供的促进因子。b y s k o v 等( 1 9 9 7 ) 认为在促性腺激素的作用f 卵丘细胞可以产生某些减数分裂刺激因子。b a l t a r 等( 2 0 0 0 ) 住 牛的c o c s 卵丘细胞上发现了l h 受体。d o w n s ( 2 0 0 1 ) 也有类似的报道：使用f s h 或e g f 嚣刺激处丁减数分裂抑制状态的c o c s 发生g v b d 的百分比显著高于d o 。由此可见，c o c s 减数分裂恢复不是由于失去了抑制因子的输入，而是由丁卵丘细胞产生了某种芷因子作用于 卵母细胞引起减数分裂的恢复。这一假说得到了许多学者的认同。由于卵母细胞上没有促性 腺激索受体促性腺激素的作用必需以卵泡体细胞为中介。越来越多的研究发现，促性腺激 素呵能诱导卵丘细胞产生阳性刺激物，诱导卵母细胞的成熟。最近p a t s o u l a 等( 2 0 0 1 ) 在小 鼠的卵匠细胞和卵母细胞中都发现了l h 受体。其它动物是否也有此现象还有待丁i 进一步研 究。由此可见，卵母细胞的成熟与卵丘细胞产生的正因子之间关系密切。 1 2 2 1c a 2 + 与减数分裂恢复 大造的研究表明，c a 2 + 在无脊椎动物和两栖类卵母细胞减数分裂控制中起重要作用 ( k w o ne t a l ，1 9 9 1 ：k o h a ne ta l ，2 0 0 3 ) 。最近，人们的研究表明，c a “和钙调素( c a m ) 在哺 乳动物卵母细胞减数分裂恢复中起重要作用。在小鼠和仓鼠都己证实，卵母细胞内游离c 一+ 浓度的增加是减数分裂恢复所必需的( b o m s l a e g e re l a l ，1 9 8 4 ；e c k b e r g ，1 9 8 6 ) 。 c 2 4 在卵母细胞成熟中的作用机制仍没完全搞清，它的作用不是通过改变细胞内c a m p 浓度而实现的( b o r n s l a e g e re t a l ，1 9 8 4 ) 。由于c 一+ 可提高p k c 的活性( l a u r e n te l a l ，1 9 8 8 ) ， c a ”的作用可能是通过激活p k c ，从而催化蛋白质的磷酸化而促进减数分裂恢复。磷酸化可 能与鸟苷酸环化酶有关。因此c 一+ 对卵母细胞成熟分裂恢复的调节可能与c g m p 有关( v a n 2 c o p p e n o i l ee t a l ，1 9 9 7 ) 。外源c 一+ 在卵母细胞减数分裂恢复中的作用，不同作者的观点不尽 相同。有人报道小鼠、人鼠和牛卵母细胞一 ，内源性c n 2 + 的释放就足以使减数分裂恢复( h ee l t 2 ，】9 9 7 ；k u z m i n ae l a l ，1 9 9 9 ) ；而另有结果与之相矛盾，例如m a r u s k a ( 1 9 9 4 ) 报道，牛卵 毋细胞住缺乏c a ”的培养基中培养，g v b d 的发生受到抑制。 众所周知c a 2 + 是重要的第二信使，卵匠细胞接受l h 刺激后，卵匠细胞膜发生量设化， 皇珀胞内c 一+ 的浓度升高。由r 卵匠 - 5 卵母细胞通过缝隙连接建啦代谢偶联，升高的c a 。丌| 以 堪过缝隙连接进入卵母细胞( m a t l i o l ie ta l ，1 9 9 8 ；m a t t i o l i & b a r b o n i ，2 0 0 0 ；b u k a u s k a s8 ，“， 2 0 0 4 ) 。c d 进入后，卵母缅胞也发生击极化计 f 起细胞c a 。浓度的短暂升高( m a t ( _ i o i i b a r b o n i ，2 0 0 0 ；毕春明等j2 0 0 0 ) ，在调节卵母细胞成熟中起重要作用。 1 2 2 2 多肽生长因子在卵母细胞成熟中的作用 生长因子都是分子量不人的可溶性多肽，因而义叫多肽生氏因子( p o l y p e p t i d eg r o w t h f a c t o r ) 。生长因子来自不同种类的细胞通过旁分泌、白分泌和山分泌等途径，对靶细胞的 增殖、运动、收缩、分化和组织的改造起调控作用。多肽生长因子在细胞的生长发育分化及 胚胎发育中起重要作用。 近儿年的研究表明某些皮肤生长因子可参与哺乳动物卵母细胞成熟的控制机制。表皮牛 氏因子( e g f ) 能刺激小鼠、兔的卵母细胞成熟( m e r r i m a ne t a t ，1 9 9 8 ：k e n n e d ye l a l ，2 0 0 3 ) 。 在小鼠，成熟培养基中含有嘌呤、c a m p 或磷酸一：酯酶抑制物的情况f ，e g f 能诱导g v b d 技生，这可能是通过e g f 刺激卵丘细胞产生一个正调控因子而实现的( c o t i c c h i oe t a l ，2 0 0 4 ) 。 山羊卵母细胞和卵丘细胞在成熟过程中e g f 受体的m r n a 的表达都升高，这表明e g f 参， l u 羊卵母细胞成熟的调控( n u r i n c ke ta l ，2 0 0 4 ) 。 有关转化生长因子( t g f ，t g f 1 3 ) 在卵母细胞成熟中的作用报道相互矛盾，即使在同一 种动物也有相互矛盾的报道( f e n ge t a l ，1 9 8 8 ；d r i a n c o u r te la l ，1 9 9 8 ) 。实际上，转化生长因 子与表皮生长因子有广泛的同源性，并与表皮生 圭冈子有相同的生物活性。转化生长困子参 j 凋节颗粒细胞孕酮的分泌。t g f b 作为卵巢内调节物参与了卵巢激素的分泌渊节，其促 避雌二醇合成的作用与其介导雌激素刺激颗粒细胞d n a 合成的作用相一致：而抑制孕酮分 泌对丁防止促黄体生成索( l h ) 峰前的孕酮水平过高，防l r 卵泡黄体化有积极意义( 吕时铭 摹2 0 0 1 ) 。 1 2 2 3m a s 在卵母细胞成熟中的作用 促减数分裂甾醇( m e i o s i sa c t i v a t i n gs t e r o l s ，m a s ) 是近年来新发现的能够促进哺乳动 物生殖细胞减数分裂恢复的物质。x i a 等( 1 9 9 4 ) 报道卵丘细胞分泌一种物质。该物质能通 过自由扩散作用于卵母细胞从而使卵母细胞克服抑制因素的控制而恢复减数分裂，经过分析 该物质可能是甾类物质。b y s k o v 等( 1 9 9 5 ) 进一步研究在哺乳动物上发现两种促减数分裂甾 醇( m a s ) ，能诱导体外培养的小鼠卵母细胞恢复减数分裂。其中，f f m a s ( 4 ，4 二甲基 ! ! ! ，一。一，：，：! 垂i ! 垒些查兰窒茎筌圭耋堡篁耋 ，! 。，。，。，。，。! ， 5 d 旧基8 ，1 4 ，2 4 三烯3 p 甾醇) 来自人的卵泡液，t m a s ( 4 ，4 ：甲基5 d 月日基8 ，2 4 烯3 p 甾醇) 来自牛单丸组织。这两种甾醇能诱导体外培养的小鼠卵母细胞减数分裂的恢复， 州能赴促性腺激素调控配子的成熟过程中起剑重要的生理作用( d o w n s ，2 0 0 1 ) 。此外，f f - - m a s 通过维持小鼠的微管组装干n 延迟皮质颗粒秆放( h e g e l e h a r l u n gp f 以1 9 9 9 ) 可提高卵 坷细胞的质量。 f f - - m a s 和t - - m a s 在多种哺乳动物( 包括人) 的排卵前卵泡中积聚( 夏国良等2 0 0 0 ) 。 j ：同哺乳动物的排卵前卵泡液中，都含有f f m a s 及t m a s 它们能肩动体外培养的次黄 噤呤抑制的小鼠卵母细胞的减数分裂。f f m a s 被汪明是在f s h 刺激下，由包嗣在卵母细 胞的卵匣细胞产生，可能为卵母细胞减数分裂恢复提供了一个新的通讯机制( b y s k o ve t “ 19 9 7 ) 1 2 3 促进因子作用途径 卵母细胞在体内成熟过程是在促一陛腺激素的作用f 在卵泡内完成的。在促性腺激素的作 剐f ，卵泡的体细胞成分合成正因子作用于卵母细胞，使之恢复减数分裂但迄今为止，正 千的性质，以及作用途径仍然有待研究。 1 2 3 1 旁分泌在卵母细胞成熟中的作用 陈勇( 2 0 0 0 ) 和夏国良( 2 0 0 0 ) 认为卵丘开始扩展先于卵母细胞成熟。s u z u k i 等( 2 0 0 0 ) 实验证明：由于卵丘扩展猪卵母细胞减数分裂i 和i i 期间卵丘细胞和卵母细胞之间是解偶联 的。冈而正因子可能是一种特化的旁分泌激素，以扩敞的形式作用于卵母细胞诱导减数分裂。 根据m a t t i o l i 等( 2 0 0 0 ) 近来的报道，l h 能真接作用于卵泡壁使壁细胞和或颗粒细胞 圩泌第一二信使( 例如m a s ) 进入卵泡液，以旁分泌的形式( a l b e r t i n ie t a l ，2 0 0 1 ；c e c c o n i ae t a l ，2 0 0 4 ) 作用于卵母细胞。 也柯报道f f - - m a s 能提高人类卵母细胞存活率( c a v i l l a e ta l ，2 0 0 1 ) 。f f m a s 可以显 箬提高性未成熟牛卵母细胞的核成熟( d o n n a y a e t a l , 2 0 0 4 ) 。近来研究表明在l h 刺激r 兔卵 巢的f f m a s 能迅速提高( g r o n d a h lf ，a 1 ，2 0 0 3 ) 。而且研究揭示厂在小鼠卵母细胞使用放 射性方法可以揭示m a s 的位点( f a e r g ee t a l ，2 0 0 1 ) 。f f m a s 的类似物也能够提高小鼠卵 母细胞的质量。这些结果看来m a s 可能在提高卵母细胞质量上有重要意义( m a t i nb i v e n se t c ! f 2 0 0 4 ) 。 k a w a m u r a 等( 2 0 0 4 ) 发现l h 刺激卵巢卵泡膜细胞和睾丸的间质细胞i n s l 3 的转录。 l g r 8 ，为一种g 蛋白偶联受体( 富含亮氨酸的g 蛋白偶联受体蛋白8 ) ，表达在生殖细胞并 、潋活抑制g 蛋白，从而引起c a m p 的产生下降。i n s l 3 处理可启动体内和体外的排卵前卵母 细胞减数分裂进程。这证明i n s l 3 - - l g r 8 旁分泌系统在介导促性腺激素诱导的卵母细胞成 熟过程中起重要作用。 4 1 2 3 2 缝隙连接在卵母细胞成熟中的作用 卵泡是雌性生殖结构和功能单位，其中颗牲细胞是卵泡内主要的体细胞成分，并赴卵母 细胞成熟的过程中起重要作用。颗粒细胞之间以及颗粒细胞和卵母细胞之间通过j “泛的缝隙 旺接形成一个功能上的整体。( g i l c h r i s te t a l ，2 0 0 4 ) 。 缝隙连接发生在邻近细胞之间；它们是排列在细胞膜之间的跨膜通道，允r i ：无机离子、 第一信使和小的代谒 物( 小于l k d 的) 住细胞间传递( h a r r i s ，2 0 0 1 ) 。这些分子是调节卵母细 胞生k 和发育所必需的( k i d d e r e l a l ，2 0 0 2 ) 。缝隙连接的基本单位是连接子( c o n n e x o n ) 一 种圆十 型的细胞器构成的半通道。来自两个细胞的连接了的末端对末端就构成r 一个完整 晌蛋白通道。每个连接子是个六聚体，它由六个蛋白弧单位构成叫连接蛋h ( c o n n e x i n c x ) ，属于连接蛋白家族。有一些连接蛋白在卵巢卵泡中表达，尤其是c x 3 7 和 c x 4 3 ，被证明在卵泡发生中起重要作用( v e i t he t a l ，2 0 0 4 ) 。c x 3 7 位于原始卵泡的卯母细胞 和周嗣瓤粒细胞之间( s i m o ne la l ，1 9 9 7 ) 。在c 5 7 b l 6 基囡敲除小鼠缺乏c x 3 7 ，卵巢卵泡发 一ei e 常但是只能持续到出脖前。 c o n n e 鲥nc o n n 秣o nl 兀f 日c e l l u l a r t h a n n e l 图1 缝隙连接分子结构示意图 f i g1c e l l u l a rm o l e c u l eo f g a p j u n c t i o n s ( 引臼k i d d e re ta l2 0 0 2 ，1 2 3 g a pj u n c t i o n sa n do v f l r i a nf o l l i c u l o g e n e s i sr e p r o d u c t i o n 6 1 3 6 2 0 ) 卵巢中卵泡发生过程中如果缺少连接蛋白4 3 ( c x 4 3 ，一种由颗粒细胞大照表达的缝隙连 ，。，! ，。，一：! 垂i l 垒些叁薹垒丝兰堡鎏耋。，一。：，。! ，。，。 接篮自) 卵泡发育会受到严重影响( g i t t e n s e ta f ，2 0 0 5 ) u g i r t e n s 等( 2 0 0 5 ) 还发现在缺乏c x 4 3 的小鼠卵泡发生失败是由于颗粒细胞对卵母细胞 分泌的g d f 9 ( g d f 9 ，种卵母细胞特有的生睦分化因子9 ，g d f 9 可以刺激颗粒细胞扩增 币分化) 的反应能力r 降造成的，这表明两种不同类犁细胞间缝隙连接通讯的存在与卯母细 咆发牛和成熟密切相关。 印母细胞成熟过程中卵匠与卵母细胞之间代谢偶联也发生变化。土要是卵丘细胞之问缝 隙迕接的丢失( 1 s o b ee t a l ，1 9 9 8 ) ，在成熟后期，卵母细胞与卵斤细胞之间的协作变得仪局限 t 放射越，与外部卵丘细胞是解偶联的( m a t t o l i b a r b o n i ，2 0 0 0 ) 。这种变化有效地阻rj ，卵 丘细胞内减数分裂抑制信号进入卵母细胞从而有利1 卵母细胞减数分裂的恢复。据报道：卵 庀细胞与卵母细胞问的缝隙连接的减少和丢失与卵母细胞发生g v b d 的百分比是一致的 ( ) o w n s ，2 0 0 1 ) 。 还有人认为缝隙连接既能在卵丘细胞和卵母细胞之间运输抑制信号又能运输刺激信号。 性生腺激素刺激后阻滞住g v 期小鼠和鱼的卵丘包绕的卵母细胞g v b d 的发生比例耍高r 那 些去除卵丘细胞的卵母细胞的比例( c e r d a f ，a 1 ，1 9 9 3 ；d o w n s , 1 9 9 5 ) 。可见卵丘卵母细胞复合 溶中的卵母细胞成熟过程似乎与缝隙连接有关。 从爪蟾的实验证明促性腺激素可以诱导卵泡细胞包围卵母细胞成熟，缝隙连接擒制荆i j 以抑制这种诱导( p a t i n o p u r k i s s ，1 9 9 3 ) 。这暗示出存在某种促进凶f 并且是通过缝隙连接 的方式作用于卵母细胞的。 可以说，缝隙连接的存在，实际上是卵丘细胞和卵母细胞的一种性质和特殊的代谢能力， 已往调仃卵母细胞成熟中起重要作用( t a n g h ee l a l ，2 0 0 2 ) 。 图2 缝隙连接和旁分泌通讯示意图 f i g2a c t i o no f g a p j u n c t i o na n dp a r a c r i n e 6 加m i i 棒0 e 1 胁，守o 纠甜h 。嚣鬻喇 f g f 4 硎5 铂p 彝矾甜i o n 村 0 期p p u “n 晰舯i d 轴e $ 拍e i b o 哦e s j 蚋、l n o 洲t o 帅b o u m i u 油 o 咐i 增0 偿州f a c 鸬 o _ 口8 0 f - 9 6 t d f g b 旧轴p _ 嘲 e p 一6 0 - i i n 种 ( 引白g i l c h r i s te ta l 2 0 0 4 8 2 8 3 o o c y t es o m a t i cc e l li n t e r a c t i o n sd u r i n gf o l l i c l ed e v e l o p m e n n1 1 1 a m m a l sa n i t ar e p r o ds c j4 3 1 4 4 6 ) 1 3 卵母细胞的体外成熟 卯母细胞的体外成熟技术( i nv i t r om a t u r a t i o n ，i v m ) 是近年米研究的热点问题之一，它 是仡自然周期或使用少量促性腺激素的周期，将水成熟的卵母细胞( g v 期或g v 前期的卵 母细胞) 在体外培养成熟，达剖次级卵耐细胞( m 1 1 ) ，能够难常受精、发育和着床包拓完 整的卵泡培养和单纯的卵丘复台体培养( n e w t o ne la l ，2 0 0 1 ) 。 生发泡期的卵母细胞体外成熟进入m i i 期在技术上对于人多数哺乳动物是可行的 ( t - l e i k i n h e i m o & g i b b o n ，1 9 9 8 ) 。在家畜例如猪手u 牛，从屠宰场采集的卵g v 期卵母细胞的 l v m 常用于商业生产胚胎和生产新的家畜( c h a n s o ne ta l ，2 0 0 1 ；k i k u c h ie ta i ，1 9 9 9 ) 。在实验 动物例如大鼠和小鼠，也获得了较好的产生胚胎平| l 新动物的方法( z h a n ge t a l ，1 9 9 1 ；a n d e r i e s z & t r o u n s o n ，1 9 9 5 ) 。但是人的临床辅助生殖g v 卵母细胞的i v m 成功率相对来说还较低 ( f r o u n s o ne t a l ，1 9 9 8 ；a n d e r i e s z e t 口f ，2 0 0 0 ) 。而且人类及珍稀动物辅助生殖中卵母细胞的获 得是十分困难的，在生产实践中，裸卵和部分裸露的g v 卵母细胞占所获得的卵母细胞比例 不小，弃之可惜，因而应最大限度的加以利用。有报道证明卵丘细胞产生的某些止网予能 够提高卵母细胞的成熟能力( m a r i nb i v e n se la l ，2 0 0 4 ) ，因此探索正因子提高这类卵母细胞 的成熟率和发育能力是十分必要的。 实验研究的主要内容和方法： 哺乳动物卵母细胞正常发育是一系列复杂发育调节过程，通过缝隙连接和旁分泌协同作 用卵母细胞最终完成发生过程。因此我们在实验中应用缝隙连接解偶联剂结合艇培养技术试 图通过间接的手段探讨正因子进入途径以及其对卵母细胞成熟的影响，还可为建立卵阡细胞 培养系统，提高成熟率和发育能力提供参考数据。 2 材料和方法 21 卯母细胞的获取 2 1 1 实验动物 性未成熟雌性昆明白小鼠，购自哈尔滨医科大学第附属医院。控制光照( 光照1 4 小 对；黑暗1 0 小时) ，室内温度2 5 ，饲养1 - - 2 周斤用于试验。此时为2 4 2 8 日龄，体重l5 18 克。 2 1 2 操作液和成熟培养液 操作液为添加4 m m 次黄嘌呤( h x ) 的m 2 液。成熟培养液为添加o 2 3 m m 丙酮酸钠、 4 m m h x ( s i g m a ) 、3 m g m l 牛血清白蛋自( b s a ) ( s i g m a ) 的n - m e m ( g i b c o ) 配制成h x m e m 液。激素处理组的f s h ( s i g m a ) 度为7 5 i u m l 。在使用甘草酸( 1 8o g l y c y r r h e t i n i ca c i d ，g a ) ( s i g m a ) 的实验中，培养液同上但是使用3 m g m l 的p v a ( s i g m a ) 替代b s a 以利f 这种物 质的作用( d o w n s ，1 9 9 5 ) 。所有的培养液和操作液都加入5 0 1 u m l 的青霉素和链霉素。 2 1 3 卵母细胞分离和培养条件 小鼠腹腔注射1 0 1 u p m s g ( 天津生物制品公司) 只，处理4 8 小时后，领椎脱臼法处死 小鼠，摘取双侧卵巢置丁3 7 的操作液中。于实体镜f 用4 号半灭菌针头穿刺有脏卵泡，释 放出卵匠一卵母细胞复合体( c o c s ) 。选择卵丘细胞完整的c o c s 然后使用操作液洗涤3 次， 再随机分配到相应实验组中。 采用微滴培养体系进行培养，在3 0 r a m 的培养皿中培养滴体积为4 0 9 l ，表面覆盖薄层矿 物油( s i g m a ) ，预平衡3 小时后用于培养，每滴培养2 0 枚卵母细胞。将洗涤3 次的小鼠卵 母细胞移入已平衡好的培养液滴中，于3 7 。c ，5 c 0 2 ，9 5 空气，1 0 0 湿度的埠l 化碳培 养箱( f o r m a3 1 1 1 ) 内进行成熟培养。 9 ! ：。，垂i l 查些奎鋈茎塑! ；茎堡篓耋，：，! ： 22 共培养实验 2 2 1 卵丘细胞的采集和其培养 小鼠的卵f 芒绌胞获墩是在微滴中用细管去= ：f 卵斤_ 丌在原有微滴中与卵母细胞培养。人既 卵l i 细胞采集白4 6 周的注射促性腺激素的雌性人鼠，通过刺破卵泡释放卵庀卵母细胞复合 体在做滴q ，使川口吸管剥离卵匠细胞然后捡出大鼠的卵母细胞，换成实验用卵母细胞。猪 卯l 细胞采集自当地的孱宰场获得的未经激素刺激的性成熟猪的卵巢的有】捧卵泡的卵r 卵斗 j = 钠胞复含体，分离和培养方法同人鼠。 j 蔓熟培养是在直径3 0 r a m 平皿中进行，每个微滴4 0 l 的培养液斤盖有矿物油。在所有处 潭组中，操作后保持容量在4 0 y l 使用v i 吸管脱掉c o c s 的卵丘。住口吸管操作中要小心控制 t j 啦侍中的液体，不改变微滴中液体量。培养条件同e 。 2 3 缝隙连接检测 礼显微操作仪下，向卵丘卵母细胞复合体注射含有l o ( w v ) 荧光黄( l u c i f e r y e l l o w c h ) ( s i g m a ) 羊u1 0 m mh e p e s 的溶液。使j = f j 拉针仪( n a f i s h i g e ，c ol t d ，t o k y o ，j a p a n ) 分别 * 作l 州定管和注射管然后使用微煅仪和磨针仪进行加l ，加j i 后用定管和注射管的外径和内 分 0 为1 2 0 和3 0 1 - u n ：3 利1 l l 】n 。为了利于穿入注射，将注射管弯3 5 角。向卵母细胞注 射荧光黄溶液，然后在激发光波长为4 8 8 纳米荧光显微镜检测染料相+ 卵r 的扩散稃度。为j ， 保谢实验的准确性我们在注射后1 0 分钟之内进行荧光观察。 2 4 卵母细胞体外成熟检测 n ：j g 养2 0 后小心的分开不同类型的卵母细胞使州相芹显微镜检测卵母细胞成熟率。本 霉：验以生发泡破裂( g e r m i n a lv e s i c l e b r e a k d o w n ，g v b d ) 作为细胞核成熟 勺标，占，只f r 咧 最存在第一极体的卵母细胞被认为是m i i 期卵母细胞。 橹卵母细胞移入含有活体荧光染料h o e c h s t3 3 3 4 2 ( s i g m a ) 染色，h o e c h s t 3 3 3 4 2 使削m 2 配制其j ：作浓度为1 0 1 a g j m l 。将卵母细胞置于载玻片上，覆盖盖玻片后在荧光显微镜r 观察。 25 成熟卵母细胞的体外受精和胚胎培养 使h 雄鼠附犟尾获得的精子与成熟j i 彳的m 1 1 艄卵母细胞进行体外受精。使用4 号、m i 头 从附阜昆中分离山糖子，加入到含有1 5 r a g 牛血清白蛋白的m 1 6 液中。精子最终浓度为5 o 1 0 6 个m 1 。在甲皿中制作体积为5 0 9 l 的精r 悬液滴并覆盖矿物油( s i g m a ) 。然后在5 c 0 2 ，9 5 的空气，3 t c 培养箱中培养9 0 分钟使精子获能。在成熟2 0 小时后，有明最第一极体的 m i i 卵母细胞从培养液中移出并使用m 1 6 - p 1 5 m g m l 的b s