（果树学专业论文）发根农杆菌介导的山定子转化及植株再生体系的建立.pdf

捅要 为了提高山定子( m a l u s b a c c a t a ( l ) b o r k h ) 的生根能力，用发根农杆菌转化山定子，诱 导产生发根，并由发根再生植株。通过对不同发根农杆菌株系、培养基，共培养时间以及添加乙 酰丁香酮( a s ) 的研究，优化了发根农杆菌转化体系。当用添加a s ( 1 0 0 p m 0 1 l - 1 ) 的菌液侵染 植株切段3 0 分钟，共培养3 d ，在无激素的固体i 4 m s 培养基上诱导发根时，发根诱导率最高，达 到8 8 8 9 。 发根再生通过两个途径进行：1 诱导愈伤组织获得再生植株；2 发根通过器官发生途径直接 再生植株。途经1 筛选了三种不同激素组合的培养基，结果表明将发根愈伤组织在m s + b a 2 0n a g u 1 + i b a 0 1n a g l - i + g a 3 0 1n a g l - 1 的再生培养基上培养，再生率最高，达到3 。途经2 利用 l ，正交设计对影响发根再生的6 - b a 、i b a 、g a 3 、t d z 四种激素进行了筛选，结果表明将发根 在m s + 6 - b a 2 0 m g l i + i b a 0 5 n a g l - 1 + g a 3 0 3 m g l - l + t d z 0 5n a g l - i ( 琼脂 0 7 ，蔗糖3 ，p h 5 8 ) 的再生培养基上培养，以不没入培养基表面为宜，再生率最高，达到 7 3 3 。再生植株p c r 检测得到6 株阳性转基因植株，转化效率为1 0 为今后利用发根农杆菌转 化外源基因奠定基础。 再生植株在m s + 6 - b a 0 2n a g l i + m a 0 5n a g l _ l ( 琼脂0 7 ，蔗糖3 ，p h 5 8 ) 的培养基 上培养，邓肯氏新复极差测验( p - - - 0 0 5 ) 显示生根率( 8 6 以上) 显著高于对照( 6 1 ) ，根量 增加，根系发达，生根能力提高。再生植株移栽成活率高，达n 9 5 以上，对照仅为6 0 0 。 关键词；发根农杆菌，山定子，转化，再生 a b s t r a c t t o e n h a n c e t h e r o o f i n ga l 五l i t y o f m a i u sb a c c a t a ( l j b o a d l , h a i r y r o o t s w c t e i n d u e c d f r o m c u t t i n g s o f m a l u a b a c c a t a ( l ) b o r k h “p l t sc o - c u l t u r e d w i t h a g r o b a c t e r i u m r h i z o g e n e s ( 8 1 9 6 & r 1 6 0 1 ) s h o o t s 唧讹r e g e n e r a t e d f r o m h a u y r o o t s d i f f e r e n t g 仃a j n s o f a g r o b a c t e r i u m r h i z o g e n e s m e d i a , c o - c u l t i v a t i o nt i m ea n d u s a g eo f a c e t o s y r i n g e n e ( a s ) w e r cu s e dt oo p t i m i z et h et r a n s g e n i c e f f i c i e n c y i ti n d i c a t e dt h a tt h eh i g h e s tr o o f i n gr a t e ( 8 8 8 9 1w a so b t a i n e dw h e ne x p l a n t sw e i n f e c t e d b yl h e8 1 9 6b a c t e r i u ms u s p e n s i o nw i t ha s ( 1 0 0 p m o l l 1 ) ，c o - c u l t u r e df o r3d a ya n dc u l t u r e do n l 4 m sm e d i u m t w or e g e n e r a t i o ns y s t e r m sw e e s t a b l i s h e d - - s h o o t sw mt | i e g e n e r a t e df r o mc a l l ii n d u c e df r o mh a r i y r o o t s ；s h o o t s w e d i r e c t l y i n d u c e d f r o m h a i r y r o o t s d i f f c r e t p l a n t h o r m o n e sr e c o m b i n a t i o n w e i e s c r e e n e da n dt h eh i g h e z tr e g e n e r a t i o nr a t e0 w e r eg a m e df r o me a l l io nm e d i u mo f m s + b a2 0m g l - 1 + m a o 1 m g l 1 + g a 3 0 1 m g l - 1 p l a n t h o r m o n e sr e c o m b i n a t i o n w e r l gs e r e e d e d b y o o r t h o g o n a l l e s t t o i n d u c es h o o t s d i r e c t l y f r o m h 嘶r o o l 3 t h e h i g h e s t r e g e n e r a t i o n r a t e ( 7 3 3 ) w e o b b i n e d o n m e d i u m o f 2 0 m g l 1 b a , 0 5 m g l - 1 i b a , 0 3 m g l - t g a 3 a n d 0 5 m g l - 1 t d z w h e nh a r i yr o o t sd i dn o tc u tf r o mm o t h e rp l a n t s s i xt r a n s g e n j cs h o o t sw e t e s tb yp c i l t h et r a n s g e n i c 蕊c i e n c yw a s1 0 i tw a s ap r o m i s i n gm e t h o df o rg e n et r a n s f o r m a t i o n r e g e n e r a t i o ns h o o t s w e r ec u l t u r e d o n m e d i u m o f m s + i b a l 0 m g l - 1 f o r r o o t i n g r o o f i n gr a t e g i a o w e ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c ec o m p a r e dw i t hc o n t a o li nd u n c a n st e s t = o 0 5 ) r o o f i n ga b i l i t yo f r e g e n e r a t i o ns h o o t si n c a e a s e ds i g n i f i c a n t l y r o o t i n gr a t e ( m a r * t h a n8 6 1o fr e g e n e r a t i o ns h o o t sw e f e h i g h e rt h a nc o n t r o l ( 6 1 ) a f a r - w a u s p l a n m d o n , m o r et h a n9 5 o f r e g e n e r a t i o ns h o o t s 蛐“v c d ，w h i l e c o n t r o lw a so n l y6 0 0 k e yw o r d s ：a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ，m a l u sb a c c a t a ( l0 b o r k h , t r a n s f o r m a t i o n , r e g e n e r a t i o n 图表目录 表1 诱导发根的培养基组成 表2 g u s 基因p c r 反应体系 表3b ( 3 4 ) 正交试验因子水平表1 2 表4r o l b 基因p c r 反应体系。 表5 培养基对发根诱导率的影响1 6 表6 共培养时间对发根诱导率的影响。 表7 添加a s 对发根诱导率的影响1 7 表8 激素对发根再生植株的影响 表9l 3 4 正交设计发根再生率统计1 9 表l o 再生率直观分析表 表1 1k m 对抗性芽的筛选2 l 表1 2 再生植株生根率统计 表1 3 移栽成活率统计 图1 发根农杆菌8 1 9 6 和r 1 6 0 1 的p c r 检测。 图2 发根的诱导 图3 发根m s 培养基上生长 图4 发根g u s 组织化学检测 图5 山定子发根诱导的不同愈伤组织类型 图6 由愈伤再生的植株 1 6 1 8 图7 从山定子发根直接再生的植株2 l 图8 再生植株的异常形态 图9 再生植株生根 图l o 再生植株移栽 图1 1 再生植株的p c r 鉴定。 i v 2 1 缩略词表 v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名 试凌 时间： 缈7 年厂月加日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 词。欢 新戤；彳叫 时间：鲫7 年砌，。日 时间：为巾7 年月乃日 第一章综述 1 i 植物转基因研究概况 植物转基因是指利用重组d n a 技术和植物细胞组织培养技术，将外源基因导入植物受体细胞 进行无性繁殖，使外源基因在受体细胞中表达，使之稳定遗传并赋予植物新的性状，如抗虫、抗 病、抗逆、高产、优质等，从而产生人类所需的转基因植株。自从1 9 8 3 年由美国科学家首次获得 转基因植物后，到2 0 0 2 年止，全球转基因作物已遍布1 6 个国家和地区，各国试种的转基因植物 超过4 5 0 0 种，批准商业化生产的已有1 2 0 多个品种( 系) ( 毕喜红等，2 0 0 5 ) 科学家们己在3 5 个属2 0 0 多种植物中实现了基因转移，包括粮食作物、经济作物、蔬菜、瓜果、花卉及泡桐、杨 树等造林树种，实现了改良植物农艺性状，缩短育种年限，加速育种进程等目的。1 9 9 6 年至2 0 0 3 年的8 年间，转基因植物的全球种植面积增长了4 0 倍。我国是世界上转基因作物第一个商品化种 植的国家，1 9 9 4 年首次种植抗黄瓜花叶病毒( c m v ) 和抗烟草花叶病毒( t m v ) 双价的转基因烟 草( 程燕，2 0 0 5 ) 目前我国有6 种转基因植物被批准进入商品化生产，包括我国自己培育的耐 储存番茄( 1 9 9 7 ) 、抗虫棉( 1 9 9 7 ) 、观赏植物矮牵牛( 1 9 9 7 ) ，抗病毒甜椒( 1 9 9 8 ) 、抗病毒 番茄( 1 9 9 8 ) ，以及美国孟三都公司培育的抗虫棉( 1 9 9 7 ) 此外，转基因烟草、南瓜、豌豆、 花生、云杉、杨树等已经大面积种植( 赵安芳等，2 0 0 6 ) 1 1 1 植物细胞外源基因导入的方法 植物细胞外源基因导入的方法和技术很多，总的来说可分为直接导入法和间接导入法直接导 入法可分为：化学物质导入法、电穿孔法，脂质体法、微注射法、基因枪法( 微弹轰击法) 和花粉 管通道法等。间接导入法主要为土壤农杆菌转化系统和植物病毒载体系统( 陈祯，2 0 0 2 ) 电激穿孔法电激穿孔法是2 0 世纪8 0 年代初发展起来的一种遗传转化技术。植物细胞膜在外界 高压电脉冲下会造成非对称穿孔，d n a 分子有可能通过小孔进人细胞内并整合到受体细胞的基因 组上，但细胞本身的生理活动受到的影响不大( 刘茵等，2 0 0 4 ) h y u n g 等( 1 9 9 5 ) 通过电激法 已成功地将g u s 基因导a 苹果主栽品种富士( m f u j i ) ，经检测g u s 基因在转基因植株体内得到 稳定表达。 基因枪法 将外源d n a 包被在微小的金粒或钨粒表面，高压作用下微粒被高速射入受体细胞或 组织，使微粒上的外源d n a 整合到植物基因组d n a 中并得到表达，从而实现基因的转化目前， 通过基因枪技术，很多植物都可以得到转化，如小麦、水稻、玉米，大豆，棉花等( 刘茵等，2 0 0 4 ) 。 花粉管通道法在授粉后向子房注射含目的基因的d n a 溶液，利用植物在开花、受精过程中形 成的花粉管通道，将外源d n a 导人受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着 受精卵的发育而成为带转基因的新个体( 刘茵等，2 0 0 4 ) 刘德林等用此法获得转基因大豆植株 ( 李文霞，2 0 0 5 ) 化学物质诱导法 现在用得最多的物质是聚乙二醇( p o l y c t l c y l c n e g l y c o l ，p e g ) ，利用p e g 引起 膜表面电荷的紊乱，干扰细胞识别，而有利于细胞膜间的融合和外源d n a 进入原生质体顾红雅 等( 1 9 9 5 ) 用p e g 法把c a t 、g u s 基因导入水稻、玉米、烟草、胡萝h 和香石竹原生质体中 微注射法是使用毛细管( 一般针尖的直径为0 5 r i m ) ，在显微镜下将外源d n a 注射入植物细 胞或原生质体的一种直接而完善的方法( 陈祯，2 0 0 2 ) 这种方法转化率高，但操作复杂，仪器 要求高，植物遗传转化中应用较少 农杆菌介导的转化法农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件 下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠痪瘤或发状根根癌农杆菌和发根 农杆菌中细胞中分别含有t i 质粒和i h 质粒，其上有- - 瑟t - d n a 。农杆菌通过侵染植物伤口进人细 胞后，可将t - i ) n a 插人到植物基因组中因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系( 付顺华， 2 0 0 3 ) 张荃等( 2 0 0 1 ) 用农杆菌介导法将屈心瑾因导人番茄，获得耐盐转基因番茄植株。张宪 银等( 2 0 0 1 ) 用该法将大豆球蛋白基因导入水稻，并获得转大豆球蛋白基因水稻植株。由于农 杆菌主要的特异性感染对象是所有的双子叶植物，故此法主要限于对双子叶植物的基因操作 农杆菌对植物感染有以下几种方法：活体接种法是指把新鲜培养土壤农杆菌接种到植株的 伤口部位，从而诱发肿瘤形成共培养法根据受体水平可分为原生质体共培养、悬浮细胞 共培养和愈伤组织共培养；叶盘转化法将实验植物材料的叶片( 或下胚轴，子叶、根等) 进行表面消毒用无菌打孔器从叶片上取下圆形小片，然后接种上含有转移载体的土壤农杆菌 这种经处理的叶盘，进行再生与筛选( 陈祯，2 0 0 2 ) 植物病毒介导的转化法病毒在植物体内可自主复制及系统性扩散，经过遗传工程改造的病 毒可以携带外源基因并在植物体内表达，可见发展一种高效的病毒载体将会有巨大潜力。文献上 已有许多病毒载体的开发，但是距理想的载体尚有很大的改进发展空间( 韩亚杰等，2 0 0 6 ) 1 2 发根农杆菌研究概况 2 0 世纪8 0 年代以来，在植物细胞培养技术领域中发展了一种新的培养系统，即鼬质粒载体法， 它是由发根农杆菌感染双子叶植物后，其i t i 质粒的t - d n a 片段整合到植物细胞核基因组中，从 而诱导出发根，由发根再生出转基因植株，转入的d n a 可以传递给子代( 张毅等，1 9 8 9 ) 与t i 质粒相比，础质粒转化有以下优点：( 1 ) 由发根农杆菌转化植物产生的发根来源于同一个植物 细胞( 张荫麟等，1 9 9 2 ) ，是一个单细胞克隆，因此，发根的每一个细胞都是转化的，可以避免 嵌合体，并且发根的每一个细胞都是通过转化而来的，有利于遗传操作；( 2 ) 用硒质粒作为基 因载体时，不需要“解除武装”( d i s a r m e d ) ，从其转化的细胞上很容易再生植株，即用野生型发 根农杆菌感染植物可直接再生出完整植株；( 3 ) 可以直接作为中间载体；( 4 ) r i 质粒和t i 质粒 可以配合使用，建立双元载体，扩展了两类质粒在植物基因工程中的应用范围；( 5 ) r i 质粒不 含c 基因，对植株再生无影响，且再生植株的染色体很少发生畸变；( 6 ) 发根的无性系可以通 过激素的自主性进行选择；( 7 ) 由发根农杆菌m 质粒转化所产生的发根分化为正常植株的分化 率高，倍性稳定，遗传稳定，并且容易建成一系列能够在不同植物细胞核染色体上插入一个t - d n a 拷贝的株系( p e t i te t 以1 9 8 3 ) 2 中国农业大学硕士学位论文第一章综述 发根农杆菌( a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ) 属根瘤菌科的一种土壤细菌，它可以使植物宿主细 胞组织产生发根。发根是整株植物或植株某一器官、组织( 包括愈伤组织) 单个细胞甚至原生质 体受发根农杆菌的侵染所产生的一种病理现象( d a v i d e t 4 l1 9 8 8 ) 发根农杆菌所含r j 质粒的 t - d n a 通过整合植物基因组，稳定表达引起宿主植物发根的生长( c h i l t o ne t 以1 9 8 2 ) 发根具 有生长迅速、遗传稳定、起源于单个细胞等特点( m a k n i g h te t 以1 9 8 7 ) 因此用含改造型鼬质粒 的发根农杆菌侵染植物细胞可将目的基因导入植物组织并再生转基因植物，为通过遗传工程改良 植物抗性和品质提供有效途径( x u e t a l , 1 9 9 7 ) 许多研究表明，r j 质粒转化植物可以诱导发根 产生，促进根的生长发育，改变根的特性，且易从发根获得再生植株至今已成功地利用m 质粒 对包括2 7 个科5 5 个属的许多草本植物及一些林木与果树如毛白杨，杂交杨、刺槐、欧洲落叶松、 苹果、墨西哥酸橙等进行了转化( 周达锋等，1 9 9 3 ；c h r i s t e y , 2 0 0 1 ) ，这些转化植物离体培养的 生根能力获得了极大的改善，一些木本植物转化的再生植株移栽田间后生根能力明显增强，表现 出根系更为发达，抗旱性提高。 早期一些研究发现，发根农杆菌的致根性与其所携带的一个诱根质粒( r o o ti n d u c i n gp l a s m i d ， r i ) 有关，其上的t - d n a 片段可以整合进入被发根农杆菌侵染的双子叶植物的核基因组中并能稳 定表达，从而导致发根( h a i r r o o t ) 的发生( w h i t ee t a l , 1 9 8 0 ) ，现已证实控制发根形成的主要 因子是m 质粒t - d n a 上的基因( w h i me t a , 1 9 8 5 ) 1 2 1r i 质粒的基因结构 发根农杆菌( a g r o b a c t e k r mr h i z o g e n e s ) 属于根瘤菌科，为革兰氏阴性菌。发根农杆菌中与诱 导发根有关的结构包括染色体毒性基因( c h r o m o s o m a lv i r u l e n c e 。西v 】和砌质粒两部分。c 谨因 的活化和表达关系着发根农杆菌与植物细胞壁的附着，是致病早期阶段的必要步骤。础质粒是发 根农杆菌中位于染色体d n a 之外的独立基因组，为双链共价闭合环状：d n a ，其大小在1 8 0 2 5 0 k b 之问。在结构上，与t i 质粒相似，它主要具有所区、t - d n a 叹 及其内在的冠瘿碱( o p i n e ) 合成 3 中国农业大学硕士学位论文第一章综述 功能区等( 周达锋等，1 9 9 3 ) v i r 区即致瘤区，约2 0 k b ，它的基因活化作用于t d n a 的加工及 转移。t - d n a 区为转移d n a 区，都含有1 l d n a ，是农杆菌能否产生发根的关键，t - d n a 进入植 物细胞后整合到核d n a 匕，通过基因的表达引起性状的改变复制起始位点，启动质利_ t d n a 的复 制( w h i t ee t a l , 1 9 8 0 ) 这个区域缺失或突变，该菌株无浸染能力。被感染的植物不出现病症和 发根。t - d n a 区左右边界各有2 5 b p 的重复序列，是t - d n a 从i d 质粒上切出的酶的识别位点。t - d n a 上的基因进入植物细胞后能被植物r n a 聚合酶i i 催化转录( p e t i te t a l , 1 9 8 3 ) 在通常情况下，v i r 区的7 个操纵子v i r a g ，除v i r a 属于组成型表达外，其余均处于抑制状态。当发根农杆菌侵染时， 植物伤口产生的低分子酚类化合物( 乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮) 能够刺激农杆菌，使阳r 区处 于抑制状态的基因被激活( 张艳馥等，1 9 9 4 ) ，产生一系列限制性核酸内切酶。在酶的作用下产 生t - d n a 链，并引导t - d n a 链与细菌细胞膜上的特定部位结合，然后向植物细胞转移，进入植物 细胞核内，t - d n a 随后整合进植物细胞的基因组。 1 2 2 基因的位点与特征 目前已知的r j 质粒有农杆碱( a g r o p i n e ) 型，甘露碱( m a n n o p i n e ) 型、黄瓜碱( c u c u m o p i n e ) 型和米奇矛品( m i k i m o p i n e ) 型。农杆碱型的硒质粒含有两个t - d n a 区域。即t l - d n a 和t r - d n a 区域，两个区域之间为一个非插入的d n a 区，其余3 种类型m 质粒的t - d n a 为连续的w h i t e 等 ( 1 9 8 5 ) 采用插入与缺失诱变实验对农杆碱型发根农杆菌a 4 的t - d n a 进行了功能性分析，结果发 现t l - d n a 上至少含有4 个与发根诱导有关的基因位点，分别命名为( r o o tl o c i ) a 、b 、c 和d 随后s l i g h t o m 等人( 1 9 8 6 ) 对t l - d n a 核苷酸序列进行分析，揭示该区域上含有1 8 个开放阅读框 ( o r f s ) ，其中的o r f l 0 、o r f l1 、o r f l 2 和o r f l 5 分别与a 、b 、c 和d 相对应。1 9 9 4 年h a n s e n 等研究证实了在t l - d n a & 还存在一个新的基因位点o r f l 3 a 。在已证实与发根诱导有关的这些基 因中，其大小、编码蛋白功能及在植物体内表达部位等均有所差异究证实了在t l - d i q a _ t ：还存在 一个新的基因位点o r f l 3 a 。在已证实与发根诱导有关的这些基因中，其大小、编码蛋白功能及 在植物体内表达部位等均有所差异。a 基因、b 基因和c 基因在农杆碱型、甘露碱型和米奇矛品型 础质粒中均存在( k i y a k a w ae ta l , 1 9 9 4 ) 且有关基因能诱导发根，利用它这特性增强植株的 生根力( 周达贤等，2 0 0 0 ) 1 2 3r i 质粒对植物的转化机制 v i r 区基因群( v i r a - g ) 中除a 外的6 个基因通常处于抑制状态发根农杆菌浸染宿主时，被 损伤的植物细胞合成并释放出特殊的小分子酚类化合物( 如乙酸丁香酮等) ，该物质与砌a 基因 产物( 一种结合在膜上的受体蛋白) 结合，再激活v i r g 基因的表达，从而诱导其它联合基因的表 达。其中v i r d 基因可以编码两个分子量分别为1 6 2 k d 和4 7 4 k d 的多肽，这两个多肽共同作用表 现为限制性核酸内切酶活性，专一识别t - d n a 的两个2 5 边界序列，并分别在这两个部位剪切形成 游离的t - d n a 。游离的t - d n a 在其它髓基因产物的协同作用下以某种方式转移并整合到植物细 胞基因组中( 俞俏等，1 9 9 5 ) t r - d n a 的口“基因表达导致生长素局部浓度提高，生长素浓度的 提高作为信号，激瓤- d n a ，尤其是其中的r o l b 基因的表达，从而诱导出发根 4 1 2 4 影响发根农杆菌转化的因素 大多数发根农杆菌能侵染多种植物，其侵染性与植物的基因型差异性及细胞的生理状态有 关。而且植物的基因型差异、细胞的生理状态与转化密切相关目前，在感染硒质粒而得到转化 的1 6 0 多种植物中，大多数为双子叶植物，而裸子植物和单子叶植物较少发现草本植物对砌质 粒的敏感性大于木本植物，即使同一种植物，不同器官的敏感性也不同农杆碱型鼬质粒的发根 农杆菌比含甘露碱型和黄瓜碱型的发根农杆菌有更广泛的宿主范围( 张乐民等，1 9 9 2 ) 受体细 胞是否处于被感染态也是转化成功的关健因素之一王冲之等( 1 9 9 9 ) 在融质粒转化西洋参的研 究中，发现西洋参的叶很难诱导出发根，叶柄则较为容易，尤其是带部分叶片的叶柄更易获得发 根等，这可能与受休的生理反应、细胞内源激素水平、细胞壁的结构及受体在植株中的部位等有 关( 张毅等，1 9 8 9 ) 菌种的活化、受体的培养、感染方法，培养基的成分及培养条件等是影响转化成功的重要因 素。一般说来，感染的菌液预先活化，不经活化或培养时间过长的菌液会降低转化频率。菌种活 化培养基成分、p h 值、培养温度都直接影响感染转化效果。 共培养后的受体除菌，一般采用添加抗生素的培养基培养除菌，由于抗生素对发根的生长有 抑制作用，有时还会导致愈伤组织化，所以有人采用温度除菌法( 张荫麟等，1 9 9 0 ) 有研究表 明，不含酵母提取物、含高浓度肌醇的菌液感染受体，可促进髓基因的表达。王冲之等( 1 9 9 9 ) 在m 质粒转化西洋参的研究中，发现用胡萝p 提取液处理发根农杆菌后，能缩短对西洋参转化所 需时间，诱导率也明显提高。 1 2 5 发根农杆菌的应用 础质粒转化过程中有基因转移并且能够遗传( c h i l t o ne t 以1 9 8 2 ) ，因而由发根再生出的植 株及其后代中存在着许多有用的变异性状同时，可以用础质粒作为载体将有用性状基因导入特 定植物中 在农林业上，许多重要造林树种和优质果树栽培品系扦插繁殖时生根率很低，严重制约了用 无性繁殖方法对它们进行大面积推广近年来，许多研究表明，对木本植物导入基因或直接采用 发根农杆菌处理木本植物的插条等繁殖材料，能够改善生根能力，明显地提高生根率，这可为解 决生产上林木繁殖难生根的问题提供一条新的途径s t r o b e l ( 1 9 8 5 ，1 9 8 8 ) 率先用发根农杆菌分 别对扁桃插条和油橄榄苗木进行了接种处理后发现，发根农杆菌不仅能提高插条的生根率，促进 根系的生长，有利于对干旱的抵抗，而且还导致叶片数量、径粗、苗高及植株生物量明显提高， 在经处理后的油橄榄上还观察到其开花量、结实率、单果重以及含油率等均高于对照。 应用发根农杆菌鼬质粒转化植物时，既可以将t d n a 上所携带的基因直接转入植物基因组 中，又可以先对r j 质粒进行遗传操作，通过中间载体或二元载体将外源基因导入础质粒中，再进 行遗传转化。转化时，可以通过将活化的菌液注射或涂抹在幼小的植株伤口上来进行侵染，也可 以取茎、叶、叶柄，胚、子叶、下胚轴等部位的外植体与活化的菌液共培养，还可以将原生质体 与活化的菌液共培养经目的菌株侵染后的外植体，经过一定的诱导培养和连续的抑菌培养，即 可得到脱菌的发根。 由于r j 质粒载体系统的优越性，近年来这方面研究报道剧增。值得一提的是，近年来植物次 5 中国农业大学硕士学位论文第一章综述 生代谢关键酶基因的分子克隆及基因工程已成为生命科学的一个新的生长点。由于发根在合成次 生代谢物质方面的优势，人们更多地选用础质粒作载体，将次生代谢关键酶基因导入植物细胞来 调节次生代谢过程。h a s h i m o t o 等( 1 9 9 3 ) 用发根农杆菌作载体，将天仙子羟化酶基因导入富含 莨菪碱的颠茄中，获得了带有天仙子羟化酶基因的发根，这种发根中的东莨菪碱含量比野生型( 不 含天仙子羟化酶基因) 发根高5 倍。这一研究结果表明，通过次生代谢生物合成途径中关键酶基 因导入调节次生代谢过程是可能的。 1 3 果树转基因研究概况 果树多为多年生作物，童期长，遗传背景复杂( 高度杂合体) ，常规育种周期长、工作量大、 效率较低，不能满足生产发展的需要自2 0 世纪8 0 年代末起，人们已开始探索新的转移基因的途 径。即通过现代细胞工程和基因工程手段，将理想的基因转移到优良的栽培品种中去，以达到定 向改良品种或砧木的目的。这一技术为果树育种提供了新途径。1 9 8 8 年果树的转基因研究首先在 核桃上取得突破，m c g r a n a h a n 等获得了转基因核桃植株，随后苹果、柑橘，梨、草莓、欧洲李、 桃、杏、葡萄、蔓越桔，猕猴桃、番木瓜、芒果和香蕉等也相继成功实现了遗传转化( l e ee l a t , 1 9 9 8 ； y a m a m o t o e l 口2 0 0 0 ；s c o r z a e l a l , 1 9 9 1 ；l a i m e r e l 以1 9 9 2 ；f i t c h e l 4 1 9 9 3 ) ，获得了转基因植株 目前苹果转基因研究取得了显著成就，已有m 2 6 ( j a m e se l 口，1 9 8 9 ) ，新乔纳金( n e w j o n a g o l d ) 、 绿袖( g r e e n s l e e v e s ) 、皇家嘎拉( r o y a lg a l a ) 、元帅( d e l i c i o u s ) ，王林( o r i n ) 、e l s t a r 、等 品种和砧木获得转基因植株( 张志宏等，1 9 9 7 ；j a m e s e l a , 1 9 8 9 ；d a n d e k a r e l 口f 1 9 9 0 ；c l a u d e e l 以 1 9 9 2 ；n o r e l l ie t a , 1 9 9 3 ；a n n a e l 以1 9 9 8 ) 目前，随着重要农艺性状相关基因的分离和鉴定、重组d n a 技术的发展和离体培养再生技术 的进步，使通过生物工程方法培育具有优良性状的果树新品种成为现实。与传统的育种途径相比， 其优势主要表现在3 个方面：第一，可以定向改良果树遗传性状。即有目的地引入一个或几个外源 基因( 如抗虫抗病基因，延缓果实衰老基因等) ，并不改变品种的其它性状，就可实现对品种的 某一特定性状( 如抗性、果实耐贮性等) 的定向改良。第二，扩展了育种范围。分子水平的基因 重组打破了物种之间杂交的障碍，有可能将丰富的外源基因结合到所需改良的果树品种上。第三， 大大缩短了育种年限。 目前在果树上应用较多的是根癌农杆菌和发根农杆菌介导的遗传转化法( 陈祯，2 0 0 2 ) ，用 农杆菌感染植物细胞，在一定条件下让农杆菌携带的质轻2 d n a 片断插入寄主细胞的核基因组，转 基因细胞再生，分化，最后获得转基因植株( 唐志鹏等，2 0 0 5 ) 在苹果基因转化中主要应用电 穿孔法、基因枪法和农杆菌介导法( 刘淑娥，2 0 0 5 ) 。农杆菌介导法包括根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s ) 和发根农杆菌( a g r o b a e l e r i w nr h i z o g i n e s ) 介导法，是通过农杆菌种的t i 或r j 质粒作 为基因转化的载体，将外源基因导入植物细胞，切割整合到植物染色体上而完成转化。利用农杆 菌介导法进行遗传转化成的转基因植株的苹果基因型有：绿袖( j a m e se l a , 1 9 8 9 ) 、元帅 ( m a x i m o w a s e l 以1 9 9 8 ) 、嘎拉( b o n t e l a , 1 9 9 6 ) 、皇家嘎拉( l i u e l 口f 1 9 9 8 ) 、金冠( m a x i m o w a s e l 口1 9 9 8 ) 、新乔纳金( 张志宏等，1 9 9 7 ) 、北斗( b o n t e l 以1 9 9 4 ) 、澳洲青苹( t r i f n o v a e l 以 1 9 9 4 ) 以及苹果砧木m 7 ( n o r e l l i 甜a , 1 9 9 4 ) 、m 2 6 ( l a m b me l4 1 9 9 1 ) 等。 6 1 4 研究目的与意义 山定子( m a l u sb a e c a t a ( l ) b o d d d 山定子属于蔷薇科苹果属植物，落叶小乔木，产于我国 内蒙古、黑龙江，辽宁、吉林、河北、山西、陕西、甘肃等省( 区) 分布于亚洲东北部、前苏 联的西伯利亚、蒙古、朝鲜以至日本山定子生长势强，结实早，抗腐烂病，耐寒力强( 可抗5 2 c 低温) 根系深，须根发达，抗寒抗涝，嫁接苗生长旺盛，结果早且丰产，是东北、华北等地广 泛使用的优良砧木( 曲泽州等，1 9 9 0 ) 但其抗旱性较弱( 叶乃好等，2 0 0 4 ) ，对盐碱地的适应 性较差( 曲泽州等，1 9 9 0 ) ，易发生缺铁黄化，使得这种优良砧木在国内的推广受到局限。 c h i l t o n 等( 1 9 8 2 ) 首次报道了发根农杆菌( a g r o b a c t e r i u m r h i z o g e n e s ) 可以诱导植物产生发 根( h a i r yr o o t ) ，发现其具有生长速度快、分化程度高等特点。w e l a n d e r 等( 2 0 0 2 ) 用发根农杆 菌8 1 9 6 转化苹果砧木j o r k 9 并获得了转基因植株这些转化植物生根能力获得了极大的改善，一些 木本植物转化的再生植株移栽田间后生根能力明显增强，表现出根系更为发达，抗旱性提高( 梁 机等，2 0 0 2 ) 但是发根农杆菌对果树砧木转化的研究还很少，尤其是对中国特有主栽砧木的转 化仍是一个空白。 应用转基因技术对山定子进行遗传改良有理论和现实的重要意义。建立一种高效、稳定的遗 传转化体系，是转基因技术在苹果砧木育种上应用的基础，也可为发根农杆菌转化其它木本植物 的研究提供借鉴发根农杆菌m 质粒介导的基因转移系统是植物基因工程中有效的基因转移方 法，而有关发根农杆菌介导山定子遗传转化的研究还没有报道。 本试验以山定子为对象，系统研究了影响发根农杆菌转化山定子诱导发根的诸多因素，找出 适合条件，建立一个稳定、高效的山定子发根转化系统。在此基础上，通过正交设计筛选出发根 再生的最适培养基，建立了发根再生的良好体系，为今后转入外源目的基因奠定基础。 7 2 1 实验材料和试剂 2 1 i 植物材料 第二章材料与方法 诱导发根 苹果砧木山定子( m a l u s b a c z a t a ( l ) b o d d h ) 试管苗来自中国农业大学果树系组培室。将 生长一个月的的试管苗在m s + 6 - b a 0 5m g l 4 + i b a 0 5m g l 1 ( 琼脂0 7 ，蔗糖3 ，p h 5 8 ) 培 养基上进行培养，培养条件为：光照1 2 h d ，光沈0 0 0 t x ，( 2 5 士1 ) 发根再生植株 选择g u s 检测呈蓝色反映的发根生根。培养条件为：光照1 2h d ，光强2 0 0 0i x ，( 2 5 士i ) 再生植株生根移栽 选择粗壮的、生根较好的植株进行移栽。移栽所使用的营养土、蛭石、保鲜膜购白花卉市场 2 i 2 菌株和质粒 野生型发根农杆菌8 1 9 6 和r 1 6 0 1 ，分别获赠于法国植物分子生物学研究所l o f t e n 教授和北京 大学林忠平教授。p b i l 2 1 质粒含抗卡那霉素( k a n a m y c i n ，k i n ) 的新霉素磷酸转移霉( n o ti i ) 基因及报告基因g u s 2 1 3 试剂 6 - b a 、g a 3 、m a 及t d z 等激素购自鼎国生物试剂公司：抗生素k m 和c e 鹏s i g m a 公司； p c r 检测所需的d n r p 溶液，t a q d n a 聚合酶、扩增缓冲液等生化试剂购f | s i g m a 公司。g u s 组织 化学检测的x - g l u c 购自索来宝公司。 2 2 培养基和溶液配制 2 2 i 培养基 发根诱导培养基( 表1 ) 表i 诱导发根的培养基组成 8 山定子生长培养基( 1 l ) m s 全量，0 5 m g l - l i b a ，0 2 m g u 1 6 - b a 山定子增殖培养基( 1 l ) m s 全量，0 2 m g l - 1 i b a 0 5m g l - 1 6 - b a 。 y e b 培养基( 1 l ) 5 9 l - 1 牛肉浸膏，1g l 1 酵母提取物，5 9 l - 1 蛋白陈。5g l 1 蔗糖，0 3 9 【1 m g s 0 4 7 8 2 0 ，p h = 7 2 ( 固体培养基加琼脂1 5 9 l 1 ) 2 2 2 试剂配制 质粒提取试剂： 酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ；异丙醇；7 0 0 , 6 7 , 醇； 溶液l ：5 0m m 0 1 l - l 葡糖糖，1 0m m 0 1 l 1e d t a ，2 5m m 0 1 l 1t r i s h c l ( p h 8 o ) ； 溶液i i ：i s d s ，0 2t 0 0 1 l - 1 n a o h ； 溶液h i ：5t 0 0 1 l - 1 乙酸钠6 0m l ，冰乙酸11 5m l ，定容9 1 0 0m l 植物基因组0 n a 提取液配方： o i m 0 1 l 1 t r i s - h c i ，p h8 0 ；0 , 2 m o t l - 1 e d t a ，p h 8 o ；1 5 t o o l l - 1 n a c h2 p v p 4 0 ( w v ) ；2 c t a b ( w v ) ； t e 溶液：1 0 m m 0 1 l 1 i r i s h c l ，1 m m o i l - i e d t a ，d d h 2 0 定容，p h8 0 e b ( 1 0 m g m 1 1 ) ：l g e b 溶于1 0 0 m l 水，4 c 避光保存。 1 0 x t a e 缓冲液：t r i s4 8 4g ，冰醋酸11 4 2m l ，0 5m 0 1 r 1e d t a ( p h 8 o ) 2 0m l ，加水定 容至1 l 6 x d n al o a d i n gb u f f e r ：0 2 5 溴酚蓝，4 0 甘油水溶液，4 c 保存。 2 3 实验方法 2 3 1 提取发根农杆菌质粒 收集细菌 ( 1 ) 将2 m l 含1 0 0 m g l - l k m 的液体b 加入到容量为1 5 m l 的试管中，然后接入一单 菌落，封好盖子，于2 8 1 2 、1 5 0r p m 振荡培养至o d s 旷0 6 ( 2 ) 将1 0 m l 培养物倒入1 5 n d 离心管中，于4 1 2 ，1 2 0 0 0r p m 离心3 0 s ( 3 ) 吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。 碱裂解法提取质粒 ( 1 ) 将细菌沉淀重悬于1 0 0m 用冰预冷的溶液i 中，剧烈振荡，使细菌沉淀在溶液i 中完全 分散 ( 2 ) 加2 0 0 m 新配制的溶液，缓慢颠倒离心管5 - 1 0 次，以混合内容物。将离心管放置于 9