（运动人体科学专业论文）不同负荷运动对大鼠心肌细胞凋亡和Bcl2蛋白表达的影响.pdf

摘要 目的：通过不同负荷游泳训练对大鼠心肌细胞凋亡及其相关基因b 细胞淋巴瘤 2 ( b c l 2 ) 表达变化和心肌组织超氧化物歧化酶( s o d ) 活性、丙二醛( m d a ) 含 量变化影响的实验研究，试图找出它们之间相互关系的一般规律，为训练制定合理的、 适宜的运动负荷提供理论依据。 方法：建立中等负荷和高负荷训练模型。随机选取雄性健康w i s t a r 大鼠3 6 只， 随机分成安静对照组( a 组) 、中等负荷运动组( b 组) 、高负荷运动组( c 组) ，每 组1 2 只。( 1 ) a 组不运动，正常饲养：( 2 ) b 组，每周训练6 天，第一天1 0 m i n ，每 日累加1 0 m i n ，至第2 周末1 2 0 m i n ，以后维持每天1 2 0 m i n 直至第8 周末；( 3 ) c 组， 前两周的训练安排同b 组的前两周一样，第3 周开始尾部负重( 开始时尾部负重为 体重的1 ，逐渐增加，第3 周末达到体重的5 ) ，第4 周开始每天上、下午各训练 一次，尾部负体重的5 ，每次1 2 0m i n ，维持此负荷直至第8 周末。各运动组大鼠 训练满8 周后，次日断头处死。心室取血，取心尖左心室肌固定或匀浆。h e 染色观 察心肌形态学变化，检测心肌组织s o d 活性、m d a 水平，用t u n e l 法检测心肌细 胞凋亡，用免疫组化法测定心肌细胞b d 2 蛋白表达。分析各指标不同负荷运动间的 差异性及相关性。 结果：b 组心肌纤维结构清晰，肌细胞和胞核大小匀称，排列整齐，着色均匀， 无异常变化。同时b 组心肌纤维增粗，胞质减少。c 组心肌纤维也有肥大，偶见毛细 血管轻度充血，未发现明显的变形坏死现象。b 组和c 组的心肌都有细胞凋亡现象。 a 组未检测出凋亡细胞，c 组细胞凋亡指数极显著性高于b 组( p 0 0 1 ) 。三组均有 b c l 2 表达，与a 组相比，b 组和c 组两组心肌b c l 2 表达均增加，b 组和a 组相比 具有极显著性差异( p 0 0 1 ) ，c 组和a 组相比有显著性差异( p 0 0 5 ) ，c 组表达显 著低于b 组( p o 0 5 ) 。c 组心肌组织中s o d 活性显著低于a 组( p o 0 5 ) ，m d a 含量显著高于a 组和b 组( p o 0 5 ) ，s o d m d a 比值显著低于b 组和a 组( p o 0 5 ) 。 结论：不同运动负荷导致大鼠心肌结构变化和心肌细胞凋亡不同。高负荷运动 相比中等负荷运动大鼠心肌细胞凋亡指数呈增加现象，提示心肌细胞凋亡可能是高负 荷运动心脏功能下降的病理生理机制。高负荷运动相比中等负荷运动，大鼠心肌细胞 b c 卜2 蛋白出现增高随之又显著降低的变化，这可能是运动时大鼠心肌细胞发生凋亡 的调控机制之一。中等负荷运动大鼠抗氧化能力增强，而高负荷运动组大鼠抗氧化能 力下降，导致自由基生成增多，这也可能是引起心肌细胞凋亡的另一机制。 关键词：心肌；细胞凋亡；b 细胞淋巴瘤2 ；氧自由基 a b s t r a c t d e s t i n a t i o n ：n r o u 曲r e s e a u r c h i n go nt h ea 骶c t i o na b o u tt h ep r o 伊锄m e dc e l ld e a t ha i l d t h ee x p r e s s i o n c h a n g e 0 ft h er e l a t e d g e n e b c l - 2a n dt h e a c t i v i t yc h a n g eo ft h e m y o c a r d i u m ss o da n dt h ec o n t e n tc h a n g eo ft h em y o c a r d i u m sm d aa f t e rd j f f e r e n t1 0 a d s t a m i n at r a i n i n gs w i 衄i n ge x e r c i s e ，i no r d e r t of o u n dt h eg e n e r a l r e g u l a t i o na b o u tt h e m t h e nw ec a ne s t a b l i s hr a t i o n a le x e r c i s el o a da n do 丘臼t h e o r yf o r t h et r a i n i i l g m e t h o d ：p r o d u c em i d d l el o a dt r a i n i n ga n dh i g hl o a de x e i d s et i a i n i n gm o d e l s 3 6m a l e w i s t a rr a t sw e r es e p a r a t e dr a n d o m l yi i l t os e d e n t a r yc o n t r 0 1 孕o u p ( g r o u pa ) ，m i d d l el o a d e x e r c i s eg r o u p ( 伊o u pb ) ，h i g h1 0 a de x e r c i s e 伊o u p ( 孕o u pc ) ，a n de v e r yg r o u ph a d1 2 m t s ( 1 ) g r o u pa w a sb r e dn o 皿a lw i t h o u ta n ye x e r c i s e ；( 2 ) g r o u pbw 硒t r a i n e d6d a y s e v e r yw e e k t h e yw e r et r a i n e d1 0m i n u t e so nt h ef i r s td a ya n da d d e d1 0m i n u t e se v e r yd a y u n t i lt h et i m er e a c h e d1 2 0m i n u t e sa tt h es e c o n dw e e k e n d k e e p1 2 0m i n u t e se v e r yd a yt o t h ee i g l l t hw e e k e n d ( 3 ) g r o u pcw a st r a i n e di i lt h es a m ew a yo ft h ef 如n t 艄r 0w e e k s c o m p a r e dw i t hg r o u pb s f 如mt h et h i r dw e e k 伊o u pcb o r eah e a v yb u r d e n0 nt h et a i l ( m em tw a sb o m1 w e i g h to fi t sb o d yi nt h eb e 酉衄i n ga n dt h e1 0 a dr e a c h e dt o5 w e i g l l to fi t sb o d yo nt h et h i r dw e e k e n d 伊a d u a l l y ) f r o mt h ef o n hw e e k 掣o u pcw a s t r a i n e d2t i m e se v e r ) rd a y ，b o m1 w e i g l l to fi t sb o d y ，1 2 0m i n u t e se v e r yt i m e a f t e r8 w e e k s ，e x e r c i s et r a i l l i n gw a ss t o p p e da i l da ur a t sw e r el 【i l l e dt h en e x td a y t h ec h a n g e so f h e 、a p o p t o s i s 、b c l 一2e x p r e s s i o n 、s o da c t i v i t y 、m d ac o n t e n ti nl e f tv e n t r i c u l a rm u s c l e w e r eo b s e n ，e d t h e na n a l y z et h eo t h e m e s sa n dt h e r e l a t i v i t yo ft h ei n d e x e so ft h ed i f f e r e n t 1 0 a de x e i i s e s 1 ；k s u i t ：t h el e f tv e n t r i c u l a rm u s c l ef i b e r so f g r o u pch y p e r t “) p h y ；a n dh a dn o t h i n gd i s t i n c t n e c r o t i cc e l ld e a t h ( 拍u pba n dg r o u pca l lh a da p o p t o t i cc e l l s ，b u tw eh a dn o tf b u n d i ti n g r o u pa a p o p t o t i ci 1 1 d e xo f 伊o u pcw a sh i g h e rs i 印i f i c a n t l ym a i l 孕o u pb ( p 0 0 1 ) i 、v e r y 黟0 u ph a db c l - 2e x p r e s s i o n b c l - 2e x p r e s s i o no fg r o u pba i l dg r o u pcw e r eh i g h e r t h a i lg r o u pa g r o u pbw a sh i 曲e rs i 印i f i c a l l t l yt h a ng r o u pa ( p 0 0 1 ) g r o u pcw a s h i 曲e rt h 锄掣o u pa ( p o 0 5 ) a n dl o w e rt h a ng r o u pb ( p 0 0 5 ) s o da c t i v i t yo fg r o u pc w a sl o w e r l h a ng r o u pa ( p 0 0 5 ) m d ac o n t e n to fg r o u pcw a s h i 曲e r t h 锄伊o u pa 锄d 印u pb ( p 0 0 5 ) s o d m d ao fg r o u pc w a sl o w e r t h a ng r o u pa 锄d 伊o u pb ( p o 0 5 ) c 仰c l u s i o n s ：d i 能r e n tl o a ds w i m m i n gt r a i n i n g sr e s u l t si nd i f f e r e n tc h a n g e so nb o t h s t m c t u r ea n da p o p t o s i s h i 曲l o a de x e r c i s ed o e sh a 衄t ot h em y o c a r d i a lc e l l c o m p a r e d w i t ht h em i d d l el o a de x e r c i s e 伊0 u p ，t h ea p o p t o t i ci i l d e xw a si i l c r e a s e da p p a r e n t ly t h e i 1 1 c r e a s eo fa p o p t o s i sc a r d i a cm y o c y t em i g l l tb et h ep a t h 0 1 0 百c a la n dp h y s i o l o 西c a l m e c h a n i s mf o rl o w e r i n gc a r d i o v a s c u l a rf u n c t i o na f t e r1 1 i g hl o a de x e r c i s e a f t e rh i 曲l o a d e x e r c i s et h ed e c r e a s eo fb c l 一2e x p r e s s i o no fc a r d i a cm y o c y t em a y b eo n eo ft h em e c h a n i s m o fg e n e t i cc o n t r o l so n 印o p t o s i si i lc a r d i a cm u s c l ec e l l m i d d l el o a de x e r d s ec o u l di n c r e a s e t h ec a p a c i t yo fa n t i o x i d a t i o n ，b u t1 1 i g hl o a de x e r c i s ec a u s et h ed e c r e a s eo ft h ec 印a c i t yo f a n t i o x i d a t i o na i l dt h ei n c r e a s eo fo x y g e n 丘e er a d i c a l s ，w h i c hm i g l l ta l s ob eo n eo ft h e m e c h a i l i s m sf o rr e g u l a t i n gt h ea p o p t o s i so fc a r d i a cm u s c l ec e l l k e y w o r d ：c a r d i a cm u s d e ；p r o 铲a m m e dc e ud e a t h ；b c l - 2 ；o x y g e nf r e er a d i c a l s 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除 了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发 表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 主丛肇砻日期：砌撵月哆日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解武汉体育学院有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以 供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 ：砌7 潭月乃日 不同负荷运动对大鼠心肌细胞凋亡的影响2 0 0 8 年武汉体育学院硕士学位论文 1 前言 运动心脏是百年来研究的热点，其研究涉及到运动训练中负荷与量的问题，还关 系到运动员的运动寿命以及优秀运动员的培养与塑造的问题。随着全民健身运动的广 泛开展，广大群众积极投身到体育运动中来，因此运动心脏不仅在职业运动员中存在， 也会在高水平运动员以外的群体中发生，积极开展不同负荷运动对心脏的影响等实验 研究意义重大，应受到科学界的广泛关注。 目前多数学者认为运动员心脏属于生理反应，是调节性、可恢复性心脏增大，与 病理性心脏有着本质区别。出生后的心肌细胞属于终末分化细胞，其生长异常主要表 现为增生，是一种不具备增殖能力的成熟细胞。心肌细胞凋亡在维持心脏正常形态结 构方面具有十分重要的意义。过去还认为，细胞凋亡在不具备再生能力的细胞如成熟 的心肌细胞、神经细胞中不再发生。但近些年的研究发现，细胞凋亡同样存在于心肌 细胞中，并且在心脏生理、病理发展过程中起重要作用，被认为是心脏由代谢性变化 向病理性变化发展的细胞生物学基础。科学家不懈的努力，发现运动心脏的某些初级 基因( c f o s ，c m y c ) 、调节肽( 胰岛素样生长因子，i g f ) 以及次级基因( m h c ，m l c 2 ， 一a c t i n ) 有表达，心肌收缩蛋白( m h c ，m l c ，a c t i n ) 与调节蛋白( t m ，t n s ) 表型 有改变，运动心脏发生过程中初级( r a s ，j u n ) 与次级基因( 姗c ，m l c ，a n f ) 表达的 调控，还包括心血管调节肽( 内皮素、降钙素基因相关肽、血管紧张素、儿茶酚胺、 神经肽酪氨酸抗心律失常肽) 功能和作用机理的变化。近年来随着细胞凋亡技术的不 断开拓发展，有学者已经关注到了心肌细胞凋亡与运动性心脏重塑的关系。目前已经 证实在淋巴细胞、骨骼肌和心肌细胞中存在由运动诱发的细胞凋亡，尽管尚不明了凋 亡发生的确切机制，但普遍认为与细胞类型和运动刺激的性质有关。有实验证明，线 粒体在脊椎动物细胞凋亡中起着重要的作用。急性运动时线粒体将产生大量的氧化产 物损伤d n a ，影响凋亡启动蛋白和抑制蛋白的表达，细胞发生凋亡。此外氧化产物的升 高和谷胱苷肽水平的降低都可能促使线粒体释放细胞色素c ，凋亡启动因子( a i f ) 和 c a s p a s e 活化蛋白。细胞色素c 从线粒体内释放入细胞质中是细胞凋亡的早期反应。胞 液中的细胞色素c 和凋亡蛋白水解酶活化因子( a p a f 一1 ) 以及a t p 一起形成复合物，活 化c a s p a s e 9 ，启动蛋白水解酶，诱发细胞凋亡u 1 。以往对运动中心肌细胞凋亡的研究 很少，未得到肯定的实验结果。近年袁箭锋等1 采用流式细胞仪，发现一次性立竭运 动可造成心肌细胞凋亡数量显著增加，大体观察无训练大鼠心脏更不耐受运动刺激， 但其心肌凋亡率却低于有训练组，但机制尚不明了。金其贯口1 采用d n a 原位末端标记 法( t u n e l ) 对无负重大鼠进行过度游泳训练，发现过度训练大鼠有心肌细胞凋亡， 一小时训练组也发现一例有心肌细胞凋亡。这些结果提示心肌细胞凋亡参与了运动心 脏重塑，也可能参与了心脏实质细胞的丢失。但其中尚有许多问题需要实验进一步证 实。心肌细胞凋亡造成心肌数目逐渐减少，使心脏收缩成分减少，进而使心脏向心功 能低下和新功能不全方向发展。但运动对生理和病理条件下( 疲劳或过度疲劳) 的心 肌细胞凋亡影响有何差异? 两者是否有关系? 相关性有多大? 心肌细胞凋亡不同指 标的检测是否对结果有不同的影响? 不同的训练方式( 游泳或跑台) 和训练时间对心 肌细胞凋亡的影响差异性有多大? 运动对不同的动物或人的心肌细胞凋亡的影响是 否有差异? 这些问题目前还不清楚。对这些问题的不断探索，将对科学的训练、运动 心脏的保护、加强运动员的医务监督、防止大负荷训练对心脏造成损伤、降低高负荷 运动训练后的运动员远期心脏病的发病率、促进人类的身体健康均有十分重要的意 1 不同负荷运动对大鼠心肌细胞凋亡的影响2 0 0 8 年武汉体育学院硕士学位论文 义。 本实验设计采用“游泳训练法建立大鼠中等负荷和高负荷运动训练模型，通过 h e 染色、t u n e l 、免疫组化和血液生化分析等方法对心肌细胞凋亡进行研究，试图 找出长期的不同负荷运动后关于心肌细胞的部分指标变化趋势以及它们之间相互关 系的一般规律。 2 不同负荷运动对大鼠心肌细胞凋亡的影响2 0 0 8 年武汉体育学院硕士学位论文 2 文献综述 2 1 细胞凋亡研究现状 细胞凋亡( a p o p t o s i s ，a p ) 是细胞死亡的一种重要形式，即程序性细胞死亡 ( p r o g r a 咖e dc e l ld e a t h ，p c d ) 。一般认为，p c d 是受一系列基因控制的生理性细 胞死亡方式。它是生命活动中重要的细胞学事件，不同于因受各种伤害而导致的细胞 坏死，它是一种遵循自身程序结束其生命的主动细胞学过程，以保证机体能及时清除 过多的、衰老的或受损的细胞，维持正常的新陈代谢。在某些生理或病理因素的条件 下，细胞对内、外信号刺激做出应答性反应，触发程序性死亡机制，于是细胞就主动 参与特定程序的缓慢死亡过程，是与有丝分裂功能相反的调节细胞群体的方式h ，。 1 9 7 2 年k e r r 等首次以形态学概念提出“细胞凋亡”这一术语瞄1 ，由于检测技术的限 制，长期以来有关细胞凋亡的发生机制及其生物学意义一直未受重视。8 0 年代末， 随着分子生物学、细胞生物学等学科理论和技术的发展，细胞凋亡的检测技术有了很 大的发展，特别是1 9 9 3 年w i j s m a n 提出了凋亡细胞d n a 片段末端原位标记技术后1 ， 使细胞凋亡的原位检测成为可能，也成为医学生物学领域里又一新的研究热点，由此 促进了对细胞凋亡本质的深入揭示。近年众多学者研究认为，心肌细胞中存在凋亡现 象，心肌细胞凋亡在维持心脏正常形态结构方面具有十分重要的意义，并且在心脏生 理、病理发展过程中起重要作用h 一1 ，被认为是心脏由代谢性变化向病理性变化发展 的细胞生物学基础。心肌细胞凋亡的研究起步较晚，分析其原因有三：细胞凋亡过 程短暂不易发现( 持续约卜一3 h ) ；方法学限制；忽略细胞凋亡在心脏病理生理 中的作用旧1 。直至1 9 9 4 年g o t t l i e b u 训和k a w a n u 研究组采用电镜结合d n a 凝胶电泳 方法才采取了心肌细胞凋亡的直接证据。t a n a k a n 列从培养的乳鼠心肌细胞入手证实了 体外心肌细胞凋亡的存在。随着科学技术的进步，心肌细胞凋亡的检测方法也日趋完 善。h e 染色是较简单的方法，它具有成本低且形态学保存完整的特点。但对凋亡的 检出特异性较低，不能快速检验出凋亡细胞，且需排除淋巴细胞和炎症细胞的碎片和 细胞有丝分裂所造成的假象。t u n e l 法是末端脱氧核苷酸转移酶( t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s e ，t d t ) 介导的三磷酸去氧乌苷( d g t p ) 缺口末端标 记技术。这种方法较敏感且反应速度快，还可以量化分析凋亡过程中d n a 链的断裂， 但t u n e l 法成本较高，且荧光会在较短的时间内衰减而使得形态学标本难以保存。透 射电镜观察凋亡细胞是最简单又特异的经典方法，但在凋亡率不是很高时，用其来定 量凋亡细胞核费时、效率低且重复性较差。流式细胞仪技术是通过检测细胞d n a 含量 而对凋亡细胞进行定量分析的方法，它具有灵敏、快速、准确、结果客观且重复性好 的特点，是进行定量分析凋亡细胞的首选，但价格昂贵。因此，在进行细胞凋亡检测 时，需结合既特异灵敏，又能定量的多种检测手段。 2 2 细胞凋亡与坏死 虽然细胞凋亡和细胞坏死之间存在着某种联系，既可由同一原因引起，又可同时 存在，但这两种细胞死亡之间还是存在着本质的区别n 射。 2 2 1 细胞凋亡与细胞坏死形态学差别 细胞凋亡的形态学特征是细胞首先收缩变圆，微绒毛消失，核染色质密度增高( 固 缩，c o n d e n s a t i o n ) ，聚集在核膜周边( 边集，m a r g i n a t i o n ) ，核膜皱折( f 0 1 d ) ，表 3 不同负荷运动对大鼠心肌细胞凋亡的影响2 0 0 8 年武汉体育学院硕士学位论文 面起泡或出芽( b 1 e d ) ，胞浆浓缩( c o m p a c t n e s s ) ，细胞器集中( s q u e e z e ) ，并出现 凋亡小体( a p o p t o t i cb o d y ) ，最后被巨噬细胞或邻近细胞吞噬。超微结构下不存在 细胞内容物外溢的现象，因此整个过程不伴有组织炎症发生n 制。而坏死细胞表现为胞 体肿胀，同时细胞器肿胀、破坏、辨认不清，细胞核早期无变化，晚期破碎，染色质 断裂成许多不规则的小凝块，呈簇状，细胞膜破裂，形成小泡，胞内容物释放而诱发 炎症反应。 2 2 2 细胞凋亡与细胞坏死生物化学差别 细胞凋亡在生化方面的变化是以染色质d n a 被激活的核酸内切酶有控降解为突 出的特征。染色质d n a 被核酸内切酶降解，产生若干大小不一的多聚核苷酸片断。在 琼脂凝胶电泳上呈现阶梯状d n a 区带图谱( d n al a d d e r ) ，这些区带由5 0 一3 0 0 k b 或 1 8 0 2 0 0 b p 整数倍的多聚核苷酸片断组成n 朝。对d n a 降解发生机制进一步研究发现。 细胞发生凋对d n a 降解发生机制进一步研究发现，细胞发生凋亡的早期，即存在c a 2 + 内流引起胞浆内c a 2 + 浓度升高，激活c a 2 + 依赖性核苷酸内切酶，这些酶在降解d n a 的同 时，c a 2 + 也常常激活钙蛋白酶( c a l p a i n ) 、谷氨酰胺转化酶( t r a n s g l u t 锄i a s e ) 和蛋 白酶c 引起胞浆内蛋白质交联或破坏细胞骨架口引。不过也有报道，细胞凋亡时未见d n a 的降解m 1 ，表明d n a 的降解并不是细胞凋亡过程中必不可少的变化。这可能是因为某 些细胞内限制性核酸内切酶活性较低，而且琼脂糖凝胶电泳的特异性高但灵敏性较 低，不能检测出轻微的d n a 降解。通过流式细胞仪观察细胞凋亡也发现胞浆膜完整， 线粒体仍有跨膜电位、保留了a t p 依赖的溶酶体质子泵等n 引。由此可见，细胞凋亡的 发生过程中，细胞的氧化代谢是很活跃的，细胞能正常地保钠排钾，a t p 保持在正常 水平。因此，细胞凋亡是一个需要能量的过程。另外，凋亡过程需要一些特定蛋白质 的合成，特别是一些与凋亡过程相关的基因表达，生成特殊的酶，所以能量供应也是 必需的；坏死过程中，蛋白质合成停止，能量供应消失。 2 2 3 心肌细胞凋亡的生物学特征 心肌细胞凋亡在持续缺血2 小时后发生，高峰时间为4 5 小时，6 小时后减少， 而且凋亡的心肌细胞在体内存在的时间短暂，一般只有2 _ 3 小时，故不易被发现。 在电镜下观察，其具有的形态特征是：多见于坏死与正常交界区，呈单个散在分布， 核染色质密度增高，聚集在核周边，而细胞膜完整，细胞器大多正常。凋亡中期可见 胞膜失去原有的特定形态，表面出现突起或小泡，胞浆浓缩。凋亡晚期可见核膜消失， 细胞器结构破坏，并出现凋亡小体，整个过程不伴有中性粒细胞浸润n 吼删。而心肌细 胞坏死表现为：急性心肌缺血4 1 2 小时起出现凝固性坏死，核固缩与核溶解，胞浆 萎缩，边缘坏死形成收缩带，继之胞核和胞浆条纹消失，且细胞间质有明显的中性粒 细胞浸润2 1 ，2 引。 由于凋亡细胞核酸内切酶的活性增加，在核小体连接处，将d n a 链切断，形成不 同倍数的1 8 0 2 0 0 b p 的核碎片；琼脂糖凝胶电泳上呈“阶梯状”图谱，这是心肌细胞 凋亡的特征性标志n 。而坏死细胞核染色质分解，d n a 变化较迟，被溶酶体酶类降解 为随机片断，在电泳上表现为不规则的大片“污斑 。 2 3 细胞凋亡与心血管疾病 在真核多细胞生物体中，细胞数目通过细胞分裂、增殖与细胞死亡来维持基本恒 定。此种增殖与死亡的平衡对生物体的发展及保持正常结构、功能有重要意义。细胞 4 不同负荷运动对大鼠心肌细胞凋亡的影响2 0 0 8 年武汉体育学院硕士学位论文 死亡分被动性或意外死亡即坏死，主动程序性死亡即凋亡。目前己有大量资料表明凋 亡是细胞生命的基本特征。凋亡过程调节机体的发育、进化，维持内环境的相对稳定。 近年来，细胞凋亡的研究日益深入，并不断向各学科渗透，心血管领域也不例外。业 已证实，人类血管内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞普遍存在凋亡现象。细胞凋亡对 于心血管系统主要具有3 方面意义：维持心脏和血管正常的胚胎发育和正常成熟的 组织结构。在增生与退化、肥厚与萎缩之间获得稳态平衡，起到对心脏和血管的形 态转型和重构作用。在一定条件下对心血管组织损伤的修复有促进作用。然而，当 细胞凋亡发生异常时又带来严重危害，引起许多心血管疾病。这里有必要先认识细胞 凋亡与心血管疾病的关系。近几年，心肌细胞凋亡在医学界的研究较多，主要是心肌 细胞凋亡与衰老、心肌缺血、心肌肥厚和扩张、心力衰竭、心肌梗塞、心脏的缺血一一 再灌注等各种疾病。 2 3 1 细胞凋亡与心脏的缺血一一再灌注损伤 动物实验研究己发现心肌细胞凋亡与心肌缺血一一再灌注等心血管疾患有着密 切关系。最初见于1 9 9 4 年g o t t l i e b 比3 1 等的报道，他们在家兔离体心脏灌注模型上发 现，缺血3 0 分钟后再灌注4 小时组出现心肌细胞凋亡，心肌细胞呈现d n a 梯状现象 及核染色质浓缩。提示心肌细胞凋亡是再灌注心肌损伤的特征之一。f 1 i s s 乜钔等采用 原位末端标记及琼脂糖凝胶电泳技术也确定在缺血和缺血一一再灌注大鼠心肌细胞 中有典型的凋亡形态改变与d n a 梯形格局，认为缺血与缺血一再灌注大鼠心肌细胞均 可发生细胞凋亡：心肌细胞凋亡与缺血和缺血一一再灌注持续时间的长短有关；心肌 缺血一一再灌注过程可诱导心肌细胞凋亡。s a r a s t e 等心副研究8 例死于急性心肌梗塞 的人体的心肌标本，通过i s e l 方法检测到典型的细胞凋亡生化特征，d n a 断裂广泛 形成，心肌细胞凋亡特别是在梗死心肌的周围区域，而其他远端无梗死的心肌很少有 细胞凋亡，认为除了坏死，在缺血一一再灌注损伤中还有细胞凋亡参与病变形成。近 年来，对细胞凋亡在缺血一一再灌注损伤中的研究己为探索其本质以及寻求生物学防 治方法提供了新思路。研究资料表明，心肌缺血一一再灌注中存在凋亡机制，且与细 胞内钙超载、氧由基生成等因素有关：至于其因果关系以及如何通过减轻心肌细胞凋 亡而起到防治再灌注损伤中的作用，尚需进一步研究。 2 3 2 细胞凋亡与心肌炎和心肌病 病毒性心肌炎时心肌细胞既有坏死亦可发生凋亡。病毒感染可激发细胞因子和 f a s 表达，i n o s 合成增加，从而诱导凋亡过程。较多的证据表明，部分心肌病可能由 病毒性心肌炎演化而来。在某些扩张型心肌病中可检出病毒染色体组r n a 。病毒感染 细胞后发生细胞程序性死亡，通过牺牲个别的细胞以清除外来物，抑制病毒大量复制， 从而有助于维持整体稳定，属于一种宿主防疫机制乜6 1 。k a w a n o 等晗7 1 通过对6 名急性、 慢性心肌炎病人的心肌组织活检研究发现，急性心肌炎病人的心肌未见凋亡细胞，而 慢性心肌炎病人心肌有多处凋亡。据此推测细胞凋亡可能是病毒性心肌炎引起心肌损 伤并变为心肌病的发病机制之一。心肌病，特别是扩张型心肌病( d c m ) ，心肌组织并 无明显的炎症反应，但有较多的细胞丢失。n a r u l a 等啪1 发现特发性扩张型心肌病病 人心肌细胞凋亡数量从5 到3 5 不等。凋亡细胞呈灶性分布，并认为心肌细胞凋亡是 扩张型心肌病时心肌细胞进行性丢失的主要原因。我国钟学宽等人检测3 0 例克山病 尸体标本，其中急性、亚急性、慢性各占1 0 例，发现急性、亚急性、慢性克山病心 肌组织中凋亡细胞阳性率分别为2 l o 、8 1 0 、7 1 0 ，而死于交通事故的正常人作对 5 不同负荷运动对大鼠心肌细胞凋亡的影响2 0 0 8 年武汉体育学院硕士学位论文 照心肌未检出凋亡细胞，提示凋亡在克山病这一特殊的d c m 中亦扮演重要角色。 2 3 3 细胞凋亡与心力衰竭 心力衰竭是多种心血管疾病的终末期表现，但演进至心力衰竭的机制并不完全清 楚。如缺血性心脏病、心肌炎、心肌病、心肌梗塞所致的心功能不全，细胞凋亡可能 起重要作用。另一类心力衰竭即慢性超负荷所致者更为常见，亦是近年研究凋亡的热 点。在压力负荷增大的情况下，机体初始的代偿机制是心肌肥厚，以维持足够的收缩 功能并保持血流动力学的相对稳定。心肌肥厚及某些细胞( 或纤维细胞) ，非细胞成 分( 胶原纤维) 的异常增加即形成所谓“重构 。必须注意到“重构 并不能始终维 持相对正常的心功能。心肌收缩功能在维持一段时间的平衡后进行性下降，血流动力 学紊乱加剧，最终进入终末期心力衰竭瞳引。在这一过程中发现有心肌细胞数目的进行 性减少和纤维化加重。对于负荷过重所致心功不全，一般认为无炎症反应，故细胞丢 失可能主要不是通过坏死，而是通过凋亡。在动物实验中，等长牵拉乳头肌或缩窄主 动脉可使0 6 4 的心肌细胞呈现t u n e l 阳性，表现容量负荷或收缩期末左室压力增大 可能诱发凋亡啪1 。在数个研究中发现心力衰竭时心肌细胞凋亡率明显增加。 2 3 4 细胞凋亡与心律失常 窦房结、房室结及传导组织细胞的胚胎发育及出生后数周的发育过程中均有细胞 凋亡发生。细胞凋亡过度、不足或延迟均可导致心律失常。j 硼e s m l 用电镜观察反复 发作室性心律失常伴晕厥的长q _ t 综合征患者切除的窦房结，发现有典型细胞凋亡。 认为其心律失常反复发作可能与细胞凋亡反复发生有关，在窦房结内有局限性、非炎 症性退变，电镜证实存在凋亡现象。房室结的胚胎样组织的不完全凋亡可引起心肌细 胞额外激动而形成室性心律失常，其周边的联络环凋亡不足可导致折返旁路的形成， 进而造成折返性心动过速或w p w 综合征发生。窦房结或窦房交界区细胞凋亡过度则会 导致病窦综合征；希氏束发育过程中过度凋亡以及细胞外基质和成纤维细胞的增生可 发生传导阻滞。因此，细胞凋亡失衡可能是某些心律失常的发病基础。最近发现细胞 凋亡与致心律失常右室发育不良( a r r h y t h m o g e n i cr i 曲tv e n t r i c u l a r d y s p l a s i a ，a r v d ) 关系甚为密切。a r v d 是新近确认的一种遗传疾病，通常在青少年 发病，多为男性，大多数为常染色体遗传，经常发生劳力诱发的室性心律失常，猝死 率较高，病理学特征为心肌细胞非炎性丢失，并进行性地被脂肪和纤维组织所代替。 1 9 9 6 年m a l l a t 和n a r a l a 口纠同时报道，在a r v d 的心肌中发现广泛的心肌细胞凋亡。 m a l l a t 用t u n e l 法，结合光镜观察细胞形态，证实的确存在细胞凋亡，而非坏死。 心肌中炎性反应缺如亦不支持坏死的存在。为进一步证实凋亡的存在，还检测了哺乳 动物发生凋亡的关键酶一一核内d n a 裂解酶c p p 3 2 的水平，结果发现c p p 3 2 过度表达， 其水平与t u n e l 的阳性率一致。在a r v d ，凋亡主要发生在右心室，受鬓的细胞主要 为心肌细胞，但凋亡仅见于相对正常的区域，在病变区域罕见或未见凋亡，表明凋亡 的发生是在非炎性心肌细胞丢失并为脂肪、纤维组织取代之前的事件。a r v d 时心肌 细胞发生凋亡的机制不明。虽有确凿的证据表明a r v d 的右心发育不良，是心肌细胞 进行性凋亡所致细胞持续丢失的后果，但与室性心律失常之间尚未找到直接的联系， 凋亡及脂肪、纤维化是否累及起搏一一传导系统需进一步明确。其他类型的心律失常， 特别是快速室性心律失常，均可引起心肌缺血，推测亦能诱发凋亡。如快速起博心室 的犬模型，可发生扩张型心肌病，同时心肌f a s 表达增加，心肌细胞凋亡明显。另有 人观察到心律失常患者内膜下心肌亦有凋亡现象。 6 不同负荷运动对大鼠心肌细胞凋亡的影响2 0 0 8 年武汉体育学院硕士学位论文 2 4 运动心脏与心肌细胞凋亡 2 4 1 细胞凋亡与心脏重塑 从低等动物到高等动物的发育，都存在着程序性细胞死亡的现象。现在已经认识 到，在哺乳动物的胚胎发生、发育和成熟过程中，细胞凋亡是保证个体发育成熟，构 成组织细胞生死交替所必需的。新生动物的心脏与成年动物的心脏不同，其左、右心 室在重量、细胞数、室腔大小方面均无明显差异，因而出生后其形态有一个转变和成 熟过程。观察出生1 2 1 天的大鼠心脏组织口引，细胞凋亡在出生后第1 天即大量出 现，随着时间的推移凋亡细胞数量逐渐减少，至第2 1 天基本消失。非心肌细胞发生 凋亡的比例高于心肌细胞，这可能是心肌血管成分迅速增加引起的细胞增生旺盛所 致。更重要的发现是，心肌细胞凋亡的发生率在不同部位也有差异，右心室明显高于 室间隔和左心室，调节细胞凋亡可以影响左右心室的厚度，这种现象符合心脏形态发 展的趋势。出生后肺的扩张、周围循环阻力的增加造成左、右心室负荷突然改变和差 异，可能是诱发细胞凋亡并造成其不同发展趋势的原因。与此相应，在高血压性心脏 肥大幻和扩张型心肌病的心肌中也发现了细胞凋亡现象。以前人们用肌小节的伸长或 心肌细胞变长来解释这种心脏肥大和心腔扩大。但近来发现，用牵拉刺激直接作用于 乳头肌时高拉力负荷反而使肌小节长度缩短，乳头横径上细胞数减少，同时观察到心 肌细胞凋亡。在快速左室起搏诱导的扩张型心肌模型中1 ，心肌受到机械负荷刺激， 产生代尝性心腔扩大时，亦观察到心肌细胞的凋亡。对高血压病的研究中发现，心脏 肥大的早期发生心肌细胞凋亡，随后凋亡现象消失，出现心脏肥大啪1 。故认为机械性 刺激( 如牵拉、张等) 引起的心肌肥大，可能与心肌细胞早期发生凋亡，随后进入细 胞增殖有关。 2 4 2 细胞凋亡与运动心脏重塑 2 4 2 1 运动心脏重塑的宏观特征 1 8 9 9 年瑞典医生h e n s c h e n 通过叩诊发现越野滑雪运动员心脏肥大，即称之为运 动员心脏( a t h l e t e sh e a r t ) ，并认为“最大的心脏将赢得比赛的胜利 。此后，众多 学者对运动员心脏进行研究表明，运动员的心脏特征主要表现在形态与机能两个方 面。其中，心脏肥大是其主要形态学改变，可发生在左、右心室和心房，但以左心室 肥大为主。心脏肥大程度与运动负荷和运动持续时间呈正相关，但通常运动员心脏肥 大呈中等程度肥大，运动员心脏重量一般不超过5 0 0 9 。不同项目运动员心脏肥大类 型各异，一般耐力项目运动员心脏为离心性肥大( e c c e n t r i ch y p e r t r o p h y ) ，以心脏 扩大为主，也伴有心壁增厚；力量项目运动员心脏为向心性肥大( c o n c e n t r i c h y p e r t r o p h y ) 。运动员心脏机能改变主要表现为：安静时，运动员心率( h r ) 减慢， 呈现窦性心动过缓，优秀耐力运动员h r 甚至可接近3 0 次分，心脏每搏量( s v ) 增 大，心输出量( c o ) 变化不大。运动时心力贮备大，h r 增快，c 0 可达3 5 升。 2 4 2 2 运动心脏重塑的微观特征 运动心脏心肌细胞体积增大，心肌纤维直径增粗，心肌纤维之间毛细血管密度增 加。心肌细胞内肌原纤维体积密度增加，肌节增长。粗面内质网增多，线粒体体积密 度与数密度增大，线粒体到毛细血管的最大氧气弥散距离缩小，横小管扩张增大，润 盘连接出现不同程度的改变。已有报道不同负荷运动对心肌细胞肥大的影响是不同 的，中等负荷训练时心脏的超微组织结构向心脏机能提高的方向发展，而反复的大负 7 不同负荷运动对大鼠心肌细胞凋亡的影响2 0 0 8 年武汉体育学院硕士学位论文 荷运动在心脏结构和功能发生适应性重塑的同时也造成了某些微损伤，尤其是右心 室，内膜下心肌和乳头肌组织出项早期缺氧性损伤，实验同时证实运动后2 4 h 上述改 变可恢复正常，因此若短期内得到充分的休息和营养，微损伤状况是可以得到改善并 有望恢复正常m 驯。 2 4 2 3 运动心脏的发生、发展与转归的调节机制 有关运动心脏的发生机制是现代运动心脏研究的热门话题。今年随着分子生物学 理论和技术的发展及应用，大量研究表明：运动心脏的发生已不仅仅是由于血液动力 学超负荷所致的细胞体积增大及相应亚细胞结构改变的简单过程，而是在神经体液因 素调节下，尤其在心脏自身的内分泌、旁分泌及胞内分泌调节机制下的一类结构、功 能及代谢等方面的心脏重塑过程。目前研究发现，在运动心脏重塑过程中，心钠素、 内皮素、血管紧张素i i 、甲状腺素、降钙素基因相关肽、胰岛素样生长因子、儿茶酚 胺及其相应受体起重要调节作用。上述调节因素经过一系列信息传递过程( c a 2 + ，i p 。) ， 引起初始应答基因( 癌基因f o s ，m y c 等) 和次级应答基因( 心肌收缩蛋白基因 姗c ，m l c 一2 ，a c t i n ，a n f 等) 在转录水平的表达，最终产生运动心脏结构与功能的重塑。 在运动心脏重塑过程中，次级应答基因受到次级后应答反应较慢，其表达产物为心肌 结构蛋白。有关运动心脏各类初始应答基因和次级应答基因表达的研究方兴未艾，而 且有关基因表达的调控机制目前还不十分清楚，因此很多问题有待进一步的研究探 讨。 2 4 2 4 运动性心脏重塑与病理性心脏重塑的区别 病理心脏的形态结构重塑与其功能代谢不匹配，往往是进行性心脏肥大，毛细血 管的增多落后于心肌纤维的增多，心肌细胞和亚微结构的重塑落后于其氧化代谢的需 求，心肌收缩蛋白表型的重塑落后于心肌兴奋和收缩过程的需求，心肌内钙和心肌收 缩结构钙可获得量的重塑与其兴奋一一收缩过程不适合。因此，病理性心脏的发展与 转归是进行性的，不可逆的。而运动员心脏的结构与功能的适应性重塑使其具备良好 的功能储备，且运动员一旦停止运动训练，运动员心脏肥大及其功能结构的改变可以 消退与恢复，进一步证明运动员心脏和病理心脏有本质区别。 2 4 2 5 运动与心肌细胞凋亡 细胞凋亡是保证个体正常发育所必须的，一旦细胞凋亡规律失常，个体发育也将 异常甚至死亡h 0 4 。但关于运动与心肌细胞凋亡关系的研究目前报道较少。但是在体 育训练中，为追求超量恢复导致超负荷训练成为一种常见的运动性病症，表现为运动 员的多器官功能紊乱，特别是心肌损伤。 近年来研究证实，急性心肌梗塞( a c u t em y o c a r d i a li n f r a c t ，a m i ) 的梗塞区 及其周边区有细胞凋亡发生。b a r d a l e s 等h 幻用原位细胞凋亡分析技术检测8 0 例心脏 组织切片，发现常规苏木素和伊红染色的病理组织学切片检