（植物学专业论文）抗溴氰菊酯绿僵菌的诱变筛选及其杀虫效果.pdf

一 一、 1 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注和 致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的 启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名： 庄歪因0 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名： 至至区! l 指导教师签名： ，、j 签名日期：年月日 l 气 j iijl】ljjli -：i嬉j l， j，q矿 、 一 j i 辽宁师范大学硕士学位论文 摘 本实验以绿僵菌为材料，研究绿僵菌与溴氰菊酯、氟氯菊酯和阿维菌素这三种常用 杀虫剂的配伍能力。在此基础上，选取溴氰菊酯作为实验底物对绿僵菌进行紫外、n t g 和复合诱变筛选，获得一株对溴氰菊酯具有一定抗性的绿僵菌菌株，并采取s d s p a g e 凝胶电泳对突变绿僵茵进行分析，同时对突变菌株进行虫体实验来验证突变菌株的杀虫 效果。结果表明：三种杀虫剂对绿僵菌生长都有一定的抑制作用。其中在致死剂量下阿 维菌素的抑制效果最强、氟氯菊酯最弱、溴氰菊酯居中，同时三种杀虫剂对绿僵菌的抑 制作用随着浓度的增加而增强，随着浓度的降低而减弱。通过实验确定复合诱变的最佳 剂量，并在该条件下筛选出一株对敌杀死具有高抗性的绿僵菌菌株m a 3 。通过对该菌株 进行s d s p a g e 凝胶电泳在蛋白水平上对突变菌株进行分析，观察到突变菌m a 3 蛋白 谱带与对照蛋白谱带基本一致，但出现一条谱带变深，两条谱带变浅；表明m a 3 具有 一定得遗传变异性。对m a 3 和出发菌进行虫体检测显示，单独使用m a ，和出发菌的杀 虫效果差别不大，但是当与敌杀死配合使用的时候能显著提高致死率并且缩短l t 5 0 的 时间，说明突变菌m a 3 和敌杀死具有较好的配合效果。 关键词：绿僵菌；诱变育种；杀虫剂；s d s - p a g e ， li-l p，q ，j 呜噜， 、 l ， - j 鲁 囊 0 1 i 鲁 f 譬 抗溴氰菊酯绿僵菌的诱变筛选及其杀虫效果 t h ed e l t a m e t h r i nr e s i s t a n c em u t a t i o ns c r e e n i n go f m e t a r h i z i u m a n i s o p l i a ea n d 。t si n s e c t i c i d a e f f i ；c t a no p l i a ea nl t si n s e c t l c l d a le t t e c t 、 a b s t r a c t t i l i sr e s s e r c ht o o km e t e r h i z i u ma n i s o p i a ea so r i g i n a is t r a i n s e e i n gt h em e t a r h i z i u ma n i s o p l i a e g r o w t hs i t u a t i o ni nb i f e n t h r i n ，d e l t a m e t h r i na n da b a m e c t i n b a s e d0 1 1t h i ss t u d ys e l e c t e d d e l t a m e t h r i na st e s ts u b s t r a t e ，b ym e a n so fn t g 、u va n dc o m p o u n dm u t a t i o n ，g e ta m e t a r h i z i u ma n i s o p l i a ew i t hc e r t a i nr e s i s t a n c et od e l t a m e t h r i n a n dt a k et h es d s p a g eg e l e l e c t r o p h o r e s i sa n a l y s i so fm u t a t i o n si nm e t a r h i z i u ma n i s o p l i a e t h er e s u l t ss h o w st h a t ：1 1 1 i s t h r e ei n s e c t i c i d e sa l lh a v es o m ei n h i b i t i o no nt h eg r o w t ho fm e t a r h i z i u ma n i s o p l i a e i nw h i c h l e m a ld o s e so fa b a m e c t i ni nt h ei n h i b i t o r ye f f e c to ft h es t r o n g e s t ，t h ew e a k e s ti sb i f e n t h r i n d e l t a r n e t h r i ni sc e n t e r , a n dt h r e e i n s e c t i c i d e so nt h ei n h i b i t o r ye f f e c to fm e t a r h i z i u m a n i s o p l i a e w i t ht h ei n c r e a s eo fc o n c e n t r a t i o n ，w i t ht h ew e a k e n e d s i g n i f i c a n t l yl o w e r c o n c e n t r a t i o n s c o m p o u n dm u t a t i o ne x p e r i m e n t st od e t e r m i n et h eo p t i m a ld o s e 。a n di nt h e c o n d i t i o n ss e l e c t e do n ep a i ro fd e c i sh i ：曲r e s i s t a n c et om e t a r h i z i u ma n i s o p l i a es t r a i n sm a 3 t h es t r a i n sb ys d s p a g eg e le l e c t r o p h o r e s i si nt h ep r o t e i nl e v e lo fm u t a n ts t r a i n sw e r e a n a l y z e d ，o b s e r v e dm u t a n tm a 3p r o t e i nb a n d sc o n s i s t e n tw i t ht h ee o n t r o lp r o t e i nb a n d s ，b u t t h ee m e r g e n c eo fab a n db e c o m e sd e e p e r , t h et w ob a n d sc h a n g e ss h a l l o w ；t h a tm ah a ss o m e o ft h eg e n e t i cv a r i a t i o n ：m a 3a n dt h eo r i g i n a ls t r a i no ft h ep a r a s i t e sd e t e c t e dw e r es h o w nt h a t u s e dm a 3a n do r i g i n a lk i l l i n ge f f e c tw a sn o tv e r yd i f f e r e n t , b u tw h e nu s e di nc o n j u n c t i o n 、析ld e c i st h em o r t a l i t yw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da n dt h el t 5 0t i m ew a ss h o r t e n r e s u l t ss h o w st h a tm a 3h a v eg o o de f f e c t 、析ld e c i s k e yw o r d s ：m e t a r h i z i u ma n i s o p l i a e ；m u t a t i o nb r e e d i n g ；p e s t i c i d e s ；s d s p a g e ； 一i i 一 ，t h e 、 j - 一 tl，、 ，j k j 鲁 辽宁师范大学硕士学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t i i l 综i 苤1 1 1 绿僵菌的研究概况1 1 1 1 绿僵菌分类方面的研究1 1 1 2 绿僵菌的侵染机理及治病机制1 1 1 2 1 绿僵菌的侵染过程1 1 1 2 2 绿僵菌侵染过程中的一些主要的结构和物质。1 1 2 绿僵菌诱变育种3 1 2 1 微生物诱变育种概述3 1 2 2 物理诱变剂的种类和作用机理3 1 2 3 化学诱变剂的种类和诱变机理4 1 3 利用绿僵菌防治常见害虫的研究5 1 3 1 绿僵菌菌剂剂型的确定5 1 3 2 室内的毒力测定6 1 3 3 绿僵菌生物防治在国外的应用情况6 1 3 4 绿僵菌油剂在我国国内的研究现状。7 1 4 目前存在的问题和展望7 1 5 本实验的目的及意义8 2 几种常用微生物培养基对绿僵菌生长的影响9 2 1 材料和方法9 2 1 1 实验材料。9 2 1 2 实验方法9 2 2 结果分析9 2 3 小结1 l 3 绿僵菌与三种常用农药的相容性实验1 2 3 1 材料和方法l2 3 1 1 实验材料1 2 3 1 2 实验方法1 2 3 2 结果与分析1 3 3 3 ，j 、1 2 ；1 4 l，ff t；、1一 h；：；j ，、。；一 、； 抗溴氰菊酯绿僵菌的诱变筛选及其杀虫效果 4 抗溴氰菊酯绿僵菌的诱变筛选。1 5 4 1 材料和方法1 5 4 1 1 实验材料_ 1 5 4 1 2 实验方法15 4 2 实验结果1 7 4 2 1 化学诱变浓度、时间的确定及突变株的初筛1 7 4 2 2 紫外诱变时间的确定及突变株的初筛1 7 4 2 3 复合诱变条件的确定l8 4 2 4 抗溴氰菊酯菌株的筛选1 9 4 3 小结1 9 4 3 1 复合诱变具有高效性1 9 4 3 2 微生物筛选技术的改进。2 0 5 菌体蛋白的s d s p a g e 凝胶电泳检测菌株的突变性和遗传稳定性2 l 5 1 材料和方法一2 l 5 1 1 材料21 5 1 2 方法。2 2 5 2 结果分析。2 3 5 2 1 菌体蛋白s d s p a g e 凝胶电泳对突变菌株的鉴定2 3 5 2 2 菌体蛋白s d s p a g e 凝胶电泳对突变菌株遗传稳定性的鉴定2 4 5 3 硝、l 右2 4 5 3 1 蛋白谱带分析。2 4 5 3 2 稳定性2 4 6 绿僵菌与杀虫剂的联合毒力测定2 5 6 1 材料与方法2 5 6 1 1 供试菌种及杀虫剂2 5 6 1 2 不同浓度杀虫剂的配制2 5 6 1 3 绿僵菌孢子悬浮液的配制和孢子粉的制备2 5 6 1 4 供试黄粉虫的采集2 6 6 1 5 黄粉虫对敌杀死敏感性的观察 2 6 6 1 6 实验的设置2 6 6 1 7 数据的统计分析2 7 6 2 实验结果2 7 论文 一v 一 ：z 7 作用效果。2 7 ：i ( ) ：ll 3 4 ：；5 1 j 辽宁师范人学硕士学位论文 1 综述 1 1 绿僵菌的研究概况 1 1 1 绿僵菌分类方面的研究 绿僵菌属是在1 8 8 3 年由$ o r o k i n 率先建立的。在至今的一百多年中世界各国的 学者相继对绿僵菌属的数目、形态学和生物学特性及应用进行了大量的研究。但是在分 类学方面始终没有形成统一的标准，造成了分类学的混乱。目前常用的方法是酶学及分 子生物学方法揭示目前已有绿僵菌品种的生物进化发育关系。l e a l 等【2 】用r a p d 鉴定 了2 0 株金龟子绿僵菌有些菌株表现出明显的地理性，但是有的菌株的地理性就不是那 么明显。p i p e 等【3 】用8 种限制性内切酶和s c p 7r d n a 探针研究了一些绿僵菌的分类， 结果表明通过r d n a 的r f l p 分析可以将绿僵菌分为不同的地理型，但无法确定其与 寄主的相关性。到目前为止已经发现的绿僵菌属总共不到2 0 种，主要有金龟子绿僵菌 m a n i s o p l i a e 、金龟子绿僵菌小孢亚种ma n i s o p l i a ea n i s o p l i a e 、金龟子绿僵菌大孢亚种 m a n i s o p l i a em a j a r 、黄绿绿僵菌膨f l a u o u i r i d e 、柱孢绿僵菌mc y l i n d r o s p o r a e 等。 1 1 2 绿僵菌的侵染机理及治病机制 1 1 2 1 绿僵菌的侵染过程 绿僵菌对寄主的侵染过程主要包括四个阶段：( 1 ) 粘附。( 2 ) 孢子萌发。 ( 3 ) 穿透虫体。( 4 ) 体内发育和致死【4 】。孢子在寄主表皮粘附是侵染的前提和开始，这个过 程主要靠两种作用力：1 非特异性的静电力。2 特异性的联合键【5 l 。孢子靠这两种力在孢 子表面粘附后即开始萌发产生芽管，芽管逐渐伸长、进一步分化产生穿透钉h 。在附着 胞形成过程中产生大量的酶，这些酶可以酶解寄主的表皮，并且可以与寄主表皮的蛋白 结合，从而使绿僵菌可以传过表皮进入寄主体内。绿僵菌穿过寄主表皮后在昆虫体内发 育。绿僵菌在生长发育的过程中会产生一系列对寄主产生毒性的物质，这些物质后来经 鉴定确定为环状六肽毒素( c y c l i c h e x a p e p t i d et o x i n ) ，称为破坏菌素( 如仇撕开) o 丌。通过研究 发现破坏菌素作为一种免疫抑制因子，它在寄主体内能够限制和削弱寄主的正常防御系 统，使得生物体比较容易受到外界病害的攻击，通过这些最终导致寄主的死亡【8 】【9 1 。 1 1 2 2 绿僵菌侵染过程中的一些主要的结构和物质。 ( 1 ) 附着胞：芽管在穿透表皮之前先分化形成附着胞( a p p r e s s o r i u m ) ，附着胞作为 绿僵菌的一个结构单位其中含有大量的线粒体、高尔基体、内质网和核糖体等细胞器。 抗溴氰菊酯绿僵菌的诱变筛选及其杀虫效果 由于所形成的附着胞的代谢活动非常旺盛，所以使得寄主表皮的局部集中机械和溶解能 量，这些都可以使得绿僵菌更加方便的进入寄主体内。产生附着胞的多少及其机构与菌 体、寄主、p h 值、营养条件等有关【1 0 1 。金龟子绿僵菌所产生附着胞有两种分别是单附 着胞和复合附着胞【l l 】。这主要是由于孢子萌发引起的，因为孢子在萌发的过程中可以 产生单芽管，也可以两端同时萌发产生双芽管，每个芽管的顶端均可以形成附着胞。在 附着胞的前端适当位置会产生穿透钉，在穿透钉的附近表皮上，通过表皮降解酶的作用， 分解体壁、破坏表皮结构，有利于穿透钉的侵入。 ( 2 ) 表皮降解酶的作用：绿僵菌要想进入到寄主体内首先要穿透寄主的体壁，所 以就需要产生一些酶类。金龟子绿僵菌在入侵昆虫体壁的过程中，能够分泌产生几丁质 酶、蛋白酶等表皮降解酶( c u t i c l e d e g r a d i n ge n z y e m e s ) 。这些酶不仅可以降解寄主的体壁 方便绿僵菌的进入，而且还会影响侵染结构的形成，所以通常将绿僵菌中降解酶的含量 作为绿僵菌毒力的一个主要指标。 表皮降解酶的作用有很多，主要作用是降解寄主的表皮解除菌株进入寄主的阻碍， 同时它还可以分解寄主的蛋白质作为营养，破坏寄主的抗真菌蛋白。表皮降解酶的活性 是决定绿僵菌侵染力和毒力的主要因素【1 2 】。金龟子绿僵菌内切蛋白酶主要有p r l 、p r 2 、 p r 3 三类l l j 。研究发现凝乳弹性蛋白酶p r l ( s u b t i l i s i n 1 i k ep r o t e a s e ) 是一组碱性蛋白酶同 工酶。p r l 的作用刚开始大家普遍认为是降解寄主的体壁，但是通过后来的研究发现p r l 还可以影响绿僵菌附着胞的形成，所以它也是绿僵菌的一个主要的毒力指标【l4 1 。绿僵 菌中的p r l 主要通过碳代谢的胁迫与去胁迫和表皮碳源诱导这两种机制获得。丝氨酸类 胰蛋白酶p r 2 ( t r y p s i n 一矗娩p r o t e a s e ) 也是一组碱性蛋白酶同工酶，它的作用主要是参与细 胞的控制，催化特定蛋白质的水解和失活以及控制入侵机制的分化，而与表皮的降解关 系不大，因为他对表皮或弹性蛋白没有活性【1 5 1 。p r l 和p r 2 仅在碱性条件下生成( 最适p h 均为8 左右) ，昆虫的表皮一般呈酸性，所以当表皮呈碱性的时候可以作为毒性因子产生 的一个信号。这个时候p r 2 就会分解寄主表皮的一些物质从而诱导p r l 的产生，并控制 p r l 产生的速度和数量所以它也是一种至关重要的酶。 几丁质酶( 幽饿缎陀) 同样衡量绿僵菌致病力的一个主要指标【1 6 1 。在绿僵菌感染和侵 入寄主的初期，几丁质酶的水平通常比较低，但是在一些绿僵菌成功进入，蛋白发生降 解的部位含量却很高。所以说几丁质酶的活性受到几丁质酶降解物的调控，即诱导抑 制机制的调控。 ( 3 ) 破坏菌素的作用 绿僵菌的破坏菌素是一种已经被系统研究的一类环状缩肽类的昆虫病原真菌毒素 的总称。破坏菌素主要通过破坏细胞的免疫胁迫系统、抑制寄主细胞正常活动和对寄主 一2 一 辽宁师范人学硕士学位论文 细胞产生毒性这几种方式作用于寄主细胞，引起昆虫神经中毒及肌肉麻痹【1 7 】，所以许 多时候将破坏菌素也作为衡量绿僵菌毒力的一个主要指标【i6 。同时研究发现，破坏菌 素的毒性与亲水性有一定的关系，一般来说破坏菌素的亲水性越强，它的毒力越小，而 且通过研究破坏菌素a 发现当它开环后将失去毒性，这可能是由于寄主的表皮细胞更容 易被亲脂性的物质穿过。 绿僵菌入侵寄主的过程是寄主与病原菌之间相互抑制，相互斗争的过程，所以这是 一个非常复杂的过程，它的入侵机理也非常的复杂，还有许多与入侵相关的问题亟待解 决。 1 2 绿僵菌诱变育种 1 2 1 微生物诱变育种概述 微生物的诱变育种，通常是指用人工诱变手段诱发微生物发生基因突变，并且通过 筛选从众多的突变体中选出产量高、性状优良的菌株，并且在诱变过程中找出合适的诱 变条件和适合的培养条件，使其可以在最适合的条件下合成有效产物【1 9 】。 基因突变时获得突变体的主要途径。在自然界中也广泛存在着基因突变，人工诱变 是加速基因突变的重要手段。以人工诱变为基础的微生物诱变育种，具有收效大、速度 快、方法简单的优点。目前国内和国际上发酵工业中使用的菌株大部分都是通过人工诱 变的方法获得的。 目前通用的方法是通过使用诱变剂改变使得微生物的突变频率大大提高，这些诱变 剂主要包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂。 1 2 2 物理诱变剂的种类和作用机理 物理诱变剂通常是使用物理辐射中的各种射线，包括非电离辐射( 紫外线、微波、 激光等) 和电离辐射( x 射线、y 射线、离子注入等) 。 ( 1 ) 紫外诱变 紫外诱变是一种常用的物理诱变剂，它能使微生物发生诱变的主要原因是形成了嘧 啶二聚体。嘧啶二聚体是紫外线照射时相邻的两个嘧啶碱基聚合形成二聚体 1 3 】。微生 物正常情况下进行d n a 复制时，首先是d n a 的解链形成两条单链，两条单链按照碱 基互补配对原则形成新链。如果在这个过程中有嘧啶二聚体的存在，因为二聚体的交联 作用，使得d n a 复制发生异常，使得子代d n a 形成缺口，形成错误的碱基序列，从 而造成新的碱基序列与原序列不同而形成突变啪1 。 ( 2 ) 离子注入 抗溴氰菊酯绿僵菌的诱变筛选及其杀虫效果 离子注入诱变是利用离子注入设备产生的高能离子束，同时将某种离子注入到生物 体，这些注入的离子可以造成遗传物质的改变，然后就可以从这些遗传物质发生了改变 的突变菌株中筛选出所需的菌株。离子束对生物体有能量沉积、交换联合、动量传递、 质量沉积、电荷的中和等作用，这些都可造成生物体的死亡、和染色体的易位、重复、 倒位更有的甚至可以直接造成d n a 分子断裂、碱基缺失。离子注入是一种新兴的技术， 离子注入具有致死率低、正突变率高、性状稳定等优点。 ( 3 ) 激光诱变 激光诱变是一种新型的诱变育种技术，由于具有方向性好、单色性等优点使它在最 近几年得到了快速的发展【2 2 1 。利用激光诱变过程中的一系列反应可以提高微生物的新陈 代谢速度和繁殖速度，这些都使得激光诱变在微生物诱变育种中的应用越来越广泛 2 3 1 1 2 4 1 。 ( 4 ) y 射线 y 射线是一种波长极短的电磁波，波长在0 0 0 1 0 0 0 4 n m 之间，能产生高速运动的 次级电子，因而可以直接或间接地改变d n a 结构，造成遗传突变。y 射线诱变机制是 当y 射线与d n a 分子发生碰撞时，可以把自身全部或部分的能量传给原子从而产生一 些次级电子，这些具有很高能量的次级电子会在d n a 分子周围产生电离作用，这种电 离作用可以直接或间接的改变d n a 结构，从而造成遗传物质的改变。直接效应是使脱 氧核糖的化学键以及碱基的化学键断裂造成重组和缺失；间接效应是使水或有机分子在 这种电离作用的作用下产生自由基，这些产生的自由基作用于细胞内的遗传物质，引起 细胞内遗传物质的损伤和缺失。同时电离辐射还能破坏d n a 分子的磷酸二酯键，造成 染色体损伤，使得微生物的遗传性状发生改变，从而达到遗传育种的目的儿矧。 1 2 3 化学诱变剂的种类和诱变机理 与物理诱变剂相比，化学诱变剂在某种程度上应用更加广泛，它是指那些能对遗传 物质起作用，引起遗传变异的化学物质。化学诱变剂通常可以造成碱基的改变，从而引 起遗传物质的改变，这点是物理诱变剂没法比的，所以说化学诱变剂与物理诱变剂相比 具有专一性。化学诱变剂主要包括碱基类似物、烷化剂、亚硝基化合物、氯化锂、抗 生素、叠氮化物、羟胺和吖啶等嵌入染料。下面介绍一些主要的化学诱变剂。 ( 1 ) 烷化剂 烷化剂主要包括常用的烷化剂有亚硝基胍、甲基磺酸乙酯、乙烯亚胺、硫酸二乙 酯等。这些烷化剂的一个共同的特点就是他们具有一个或几个活性烷基，这些烷基在细 胞内可以取代碱基中活泼的氢原子，从而使得d n a 分子中的一个或多个碱基与这些活 一4 一 、 辽宁师范人学硕士学位论文 性烷基发生烷化反应，从而改变d n a 的结构，引起突变【2 7 】目前使用的烷化剂主要甲基 磺酸乙酯( e t h y l m e t h a n es u l p h o n a t e ，e m s ) 和n 甲基n 硝基n 亚硝基胍( n t o ) ，其中的 甲基磺酸乙酯最为常用，它诱导的突变株大多数是点突变，主要发生在d n a 的鸟嘌呤 n 7 位置上，发生烷化反应后主要可以产生两种遗传效应：一种是发生转换型的突变， 即烷基化的g 与t 配对，而不是与原来的c 进行配对，这样就造成了配对的混乱；二 是造成置换现象，由于g 的n 7 烷基活化，造成鸟嘌呤的糖苷键断裂进而从d n a 分子 上脱去，脱去g 的d n a 分子，在d n a 复制的过程中，原来的g 的位置产生了一个空 位，在这种情况下它的互补位置上的碱基就不受严格的碱基互补配对规则的限制，4 种 碱基都有机会进入，从而造成d n a 次序发生改变，造成遗传突变。n 甲基n 硝基n 亚硝基胍是一种超诱变剂，诱变效果好，非常适用于营养缺陷型突变株，但是由于具有 一定的毒性，操作的时候要注意安全。 ( 2 )碱基类似物 碱基类似物的分子结构类似于天然碱基，它的主要作用是在d n a 复制过程中使 d n a 分子发生错配，从而造成m r n a 的转录紊乱，表现性改变。但是由于碱基类似物 诱导的产生的负突变率高，往往得不到好的突变体，所以不是一种常用的突变剂。 ( 3 )嵌入染料 嵌入染料是指像吖啶橙、溴化乙锭( e b ) 等可插入到d n a 碱基对之间的染料，它 也是一种较强的诱变剂，可以造成两条链错位或移码突变【2 引。 ( 4 )无机化合物 常用的无机化合物是氯化锂和亚硝酸，其中氯化锂是一种白色结晶，使用时配成 0 1 0 5 的溶液，亚硝酸容易分解，通常是现配现用。无机化合物具有低毒性的优点， 但是由于诱变效果一般所以使用的也不是很广泛。 1 3 利用绿僵菌防治常见害虫的研究 1 3 1 绿僵菌菌剂剂型的确定 目前常见的菌剂剂型主要为水剂和油剂【2 9 1 ，水剂的特点主要是灵活、简便，而油剂 更有利于发挥绿僵菌菌株的致病性【3 0 】【3 l 】。b a t e m a n 等人( 1 9 9 3 ) 通过在室内对分生孢子 致病力的研究发现在低温条件下油剂在比水剂更加有效【3 2 】【3 3 】。同时m i l n e r 等( 1 9 9 7 ) 也对绿僵菌的分生孢子的水剂与油剂的防效进行了比较。他使用在大米发酵培养基中培 养的分生孢子同许多不同的介质混合使得绿僵菌的孢子浓度达到2 1 0 y 个分生孢子 m l ，以此来确定与绿僵菌配合比较好的介质，最后将这种剂量稀释1 0 0 0 倍，喷在作物 上，同时在这些作物上放上供试蝗虫，观察蝗虫的致死率，并且将死亡的蝗虫在3 0 抗溴氰菊酯绿僵菌的诱变筛选及其杀虫效果 下恒温培养，观察产孢情况。结果显示，油制剂的防治效果明显要好于水制剂，而且在 在稀释条件下的致死率也很高，水剂的致死率在1 0 0 倍稀释浓度下致死率只能达到 2 0 左右。同时研究显示在各种介质都在高剂量下使用时d ct r a t e 的防效最快，而在 低剂量下使用的时侯花生油快。原因可能是由于分生孢子的外壁的特点决定的，因为分 生孢子的外壁具有亲脂性这使得它们容易悬浮于油剂中，同时油剂本身对寄主的粘着或 依附能力也较强，使得分生孢子更容易进入寄主的体内，这些特点使得绿僵菌能够更加 有效的侵染寄主，而且可以使得分生孢子向虫体中更加容易感染的地方运输阱1 。此外， 油剂对分生孢子具有一定的保护左右，例如在低温条件下油剂可以更加有效的保护分生 孢子，更好的发挥绿僵菌的作用。同时除了防效高的优点，还有一个比较大的有点就是 油剂比较适合在f f l 间使用，因为油剂更加适合超低容量喷雾技术。这样可以使得绿僵菌 以小体积尽量喷洒较大的面积，这正是低容量喷雾技术的优点，所以油剂更加有利于田 间使用。w r i g l e y 等( 1 9 7 3 ) 介绍了矿物油在超低容量喷雾中的使用特点，这是因为在许 多地区可利用的油类主要为植物油，但是这也随之产生了一个问题，就是植物油本身的 粘度比较大，这个特点不能进行低容量喷雾，所以在研究中发现加入一些轻石油更有利 于低容量喷雾。对黄绿绿僵菌大田测试中使用由5 0 煤油和5 0 花生油混配而成的试 剂进行防治，后来实验指出煤油含量提高到7 0 同时可以将植物油含量减到3 0 ，这 样不仅可以有效降低粘度提高孢子浓度而且还可以有效降低成本【3 引。在现在的实际应 用中，通常使用矿物油与植物油的比例为7 ：3 ，采用这种比例作为田间或者室内使用 时绿僵菌油剂常用的配制比例【3 6 1 。 1 3 2 室内的毒力测定 由于绿僵菌的致病性主要表现为触杀性而不是其他杀虫剂的胃毒作用，所以喷粉 法、浸渍法、喷雾法这些事室内和田间进行试验的时候主要方法口7 1 。在对蝗虫进行室 内毒力测定时所采用的方法一般为点滴法，就是将绿僵菌的菌液滴于试验用蝗虫的前 胸背板上，绿僵菌菌液的点滴量通常为2 u r n 头。将这些滴加绿僵菌的蝗虫在实验条件 下培养，统计这些蝗虫的致死率。这种室内毒力测试的方法通常作为高毒力菌株的筛选 的一种常用方法p 引。 1 3 3 绿僵菌生物防治在国外的应用情况 到目前为止喷洒技术还不算成熟，有很多的问题依然没有解决，在生产中的应用也 是在一些小规模的田间进行了使用，从这些小规模阳间使用来看效果还是很显著的。 b a t e r n a n 等于在模拟的田间环境中进行绿僵菌油剂的实验，这种试验模式的优点是在实 验室中可以模拟大田环境，从而根据实验数据选择不同的剂量与株系，并且通过得到的 一6 一 辽宁师范大学硕士学位论文 结果来选择制剂、喷雾器、计算适合的行走速度、隔离带的宽度和流速等等口钔。这个 实验自开展以来取得了非常大的成就，研究显示绿僵菌油剂对于田间蝗虫具有很好的防 治效果。在非洲南部一块儿面积为l h m 2 的田块上，采用喷洒孢子油剂的方法来防治蔗 蝗，使得该田块的虫口减少了9 0 9 5 ，并且绿僵菌孢子随着一些染病蝗虫的迁出将 绿僵菌传播到了一些没有喷赛绿僵菌油剂的小区，这样可以更加充分的发挥绿僵菌这种 生物农药的优点；在非洲北部的谷子种植带，采用动力牵引的喷雾机施药来喷洒药品， 在9 h m 2 的试验地上回收样品并且统计致死率，这些地块中的最高致死率可以达到8 5 左右。 1 3 4 绿僵菌油剂在我国国内的研究现状 我国学者在长期的绿僵菌应用方面取得了很多研究进展。中国农科院首先在我国国 内使用绿僵菌来防治东亚飞蝗。在1 9 9 2 年1 2 月中国农科院作为我国国内最先从英联 邦国际生防所( i i b c ) 引进绿僵菌的科研机构，一次性引进了4 株绿僵菌菌株。之后 陆庆光等人选取东亚飞蝗 l o c u s tm i g r a t o r i am a n i l e n s i s ( m e y ) 作为实验材料，来验证引进 的四种绿僵菌菌株对的毒性的毒力测定啪1 。并且在1 9 9 4 年夏天进行了绿僵菌油剂防 治东亚飞蝗的田间实验，地点选在天津北大港水库蝗区进行了绿僵菌油剂的田间喷雾试 验，在处理后l o 天校正致死率达到8 1 5 ，在人工模拟实验小区中第l o 天的致死率达 到了1 0 0 。这些结果显示，绿僵菌对于东亚飞蜱的防治具有良好的效果h ；在上面实 验的基础上1 9 9 9 年，中国农科院生防所又进行了绿僵菌防治蝗虫的实验，这次的地点 选择在了内蒙草原。结果表明对五种常见蝗虫( 亚洲小车蝗、白边痂蝗、毛足棒角蝗、 红翅皱蝗、轮文异痂蝗) 的防治效果也都达到了显著水平。喷洒绿僵菌油剂1 2 天后对 蝗虫亚洲小车蝗这一主要蝗虫品种的防效可以达到8 8 1 。将死后的蝗虫尸体培养，在 两到三天后在死亡蝗虫的体表长出了绿僵菌菌丝m 1 。 1 4 目前存在的问题和展望 随着生物防治技术的快速发展，人们在绿僵菌的室内室外的应用方面已取得很大的 进展，在一些地块儿的实验显示绿僵菌油剂对于田间害虫的防治具有良好的效果，但是 绿僵菌研究中还是存在许多的问题，要想在商品化生产还是具有一定的难度。主要还应 在以下方面加强研究。 ( 1 ) 加强绿僵菌系统分类学这一基础的研究。虽然随着生物技术的发展，可以通 过利用分子生物学序列测定解决绿僵菌属的分类疑难，但是这些利用分子生物学手段得 到的结论有许多与形态分类学得到的结果相矛盾。因此，在以后的研究过程中需要对绿 僵菌属其它座位的基因进行进一步的序列测定和比较，通过现代分子生物学与以前形态 抗溴氰菊酯绿僵菌的诱变筛选及其杀虫效果 学研究相结合的方法，将测定出来的大量的分子生物学数据并且结合传统形态学特征来 构建物种树，这样可能会从根本上解决绿僵菌形态分类上这些疑难问题。 ( 2 ) 诱变出高毒力的绿僵菌菌株是进行生产应用的基础。理化诱变是育种工作的 常用方法，但这种诱变多数情况下会造成基因的缺失，而且正突变率较低，如何通过更 加合适的诱变方法和技术来获得更好的突变菌株也是今后研究的重点。 ( 3 ) 更加深入研究绿僵菌的侵染过程和致病机理，可以帮助我们更好的利用绿僵 菌这种宝贵的资源。在这方面还有许多的研究不够充分，例如，为什么寄主随着龄期的 增长它对绿僵菌的抗性会增加，有人怀疑是由于随着寄主龄期的增长体内的酶会发生一 些变化，从而影响寄主的抗性；还有就是绿僵菌产生的多种毒素的作用位点，以及起作 用的方式等等。搞清楚这些问题不仅有利于绿僵菌的早日生产应用而且还可以对其他胜 方真菌的起到一定的借鉴作用，进而更加有效的利用我们宝贵的生物资源。 ( 4 ) 改进绿僵菌剂型来提高生物防治的效果。影响制剂中活性成分稳定的因素可 以分为可控制因素和不可控制因素两类，前者如制剂载体的种类、制剂含水量、增效剂、 保护剂和包装的使用等；后者主要有环境温度、湿度和光照等。我们如何加强那些可控 制因素研究来减弱环境对制剂中孢子活性的影响是今后研究的重点。 1 5 本实验的目的及意义 。 随着化学农药使用的越来越广泛，它所带来的环境污染问题也变得越来越严重。而 绿僵菌作为无污染的生物农药，往往起效慢、杀虫效率低的缺点。如果能把化学农药和 生物农药混合起来使用既可以减少环境的污染又可以增加农药的长效性。通过以前的研 究发现，常用的化学农药对绿僵菌有一定的抑制作用，本实验研究的目的就是通过物理 化学诱变筛选出对化学农药具有一定抗性的绿僵菌菌株。 一8 一 辽宁师范人学硕士学位论文 2 几种常用微生物培养基对绿僵菌生长的影响 绿僵菌培养过程中常用的培养基主要有四种分别为p d a 培养基、p p d a 培养基、s d a 培养基和s d a y 培养基，本实验主要通过观察绿僵菌在这四种培养基中的生长情况，找 出适合下面实验需要的培养基。 2 1 材料和方法 2 1 1 实验材料 ( 1 ) 供试培养基 p d a 培养基马铃薯2 0 0 克葡萄糖2 0 克琼脂1 5 2 0 克水1 0 0 0 m l p p d a 培养基马铃薯2 0 0 克葡萄糖2 0 克琼脂1 5 2 0 克蛋白胨l o 克水1 0 0 0 m l s d a 培养基葡萄糖4 0 克蛋白胨1 0 克琼脂1 5 2 0 克水1 0 0 0 m l s d a y 培养基葡萄糖4 0 克蛋白胨l o 克琼脂1 5 2 0 克酵母膏l o 克水1 0 0 0 m l 1 1 2 供试菌株 供试菌株由辽宁师范大学重点实验室提供 2 1 2 实验方法 挑取绿僵菌单菌落分别接种在四种培养基中，在2 8 的恒温培养箱中培养，观察记 录绿僵菌的生长情况。主要统计绿僵菌的菌落生长和产孢情况。 2 2 结果分析 抗溴氰菊酯绿僵菌的诱变筛选及其杀虫效果 图2 1 绿僵菌在四种培养基中第四大的生长情况 注1 ) a b c d 分别为s d a 、s d a y 、p d a 、p p d a 培养基 f 1 9 2 1 t h eg r o w t hs i t u a t i o no f m e t a r h i z i u ma n i s o p l i a ei nf o u rd i f f e r e n tm e d i u m 从图2 1 中可以看出绿僵菌在这四种培养基中均可生长，而且菌落直径相差不大。 但是在菌落形态上存在较大的差别。绿僵菌在p d a 与p p d a 培养基中的生长情况基本 类似，菌落均呈现出绿色，而且菌落厚实。只是在第四天绿僵菌开始产孢是p p d a 培养 基的产孢子量比较大，且产孢时间提前。 绿僵菌在s d a 培养基中呈黄绿色、菌落比较薄、到第四天可以正常产孢子。 绿僵菌在s d a y 培养基中呈白色( 中间略发黄) 、菌落厚实、第四天不能正常产孢 子。 表2 1 绿僵菌在四种培养基中生长的菌落平均直径 t a b l e2 1t h ea v e r a g ed i a m e t e ro fm e t a r h i z i u ma n i s o p l i a ei nf o u rm e d i u m 培养基菌落平均直径( 锄) s d a 培养基 s d a y 培养基 p d a 培养基 p p d a 培养基 3 4 0 3 2 3 6 o 2 3 3 6 o 2 9 3 5 o 3 5 从表2 1 中可以看出绿僵菌在这四种培养基中菌落直径差别不大，只是产孢情况 p d a 和p p d a 培养基比较好，所以在下面的实验中采用p d a 培养基作为绿僵菌生长的 基础培养基。 辽f j 。师范人学硕十学位论文 2 3 小结 这四种培养基一般是作为微生物培养的常用培养基，本文是以绿僵菌为培养材料对 四种培养基的培养效果进行了验证，显示p d a 和p p d a 比较适合绿僵菌的生长。但是 这个只是针对绿僵菌而言，不同微生物生长所需要的营养成分不尽相同，以后可以选取 多种微生物进行培养，来观察不同微生物所需要的营养成分。 同时，因为后面的实验需要绿僵菌大量产孢，所以选用p d a 培养基，而在其他的 一些实验中，比如只观察菌丝生长情况的实验中就可以使用s d a y 培养基，这样可以有 效观察菌丝的生长情况，从而避免孢子产生对实验结果的干扰。 抗溴氰菊酯绿僵菌的诱变筛选及其杀虫效果 3 绿僵菌与三种常用农药的相容性实验 绿僵菌作为一种常用的杀虫真菌，具有安全、环保的优点，但同时又存在杀虫效率 低的缺点，解决这一问题比较好的方法就是绿僵菌与化学杀虫剂的混合使用，这样可以 发挥绿僵菌和化学农药各自的长处，一方面通过与化学农药的混合使用可以缩短绿僵菌 的致病时间，另一方面又可以发挥绿僵菌作用时间长的优点，并且可以解决化学农药产 生抗药性的问题。本实验采用常用的三种常用农药与绿僵菌配伍，统计它们对绿僵菌菌 丝和孢子的抑制作用。 3 1 材料和方法 3 1