（植物学专业论文）过氧化氢参与了水杨酸诱导的蚕豆气孔关闭过程.pdf

河南大掌研究生硕士掌位论文 s a l i c y l i ca c i d a b s c i s i ca c i d 2 - 6 d i c h i o r o i s o n i c o t i n i ca c i d s a l i c y l i ca c i db i n d i n gp r o t e i n t o b a c c om o s a i cv i r u s r e r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s p l a s m a m e m b r a n er e d o xs y s t e m h y d r o g e np e r o x i d e o x i d a t i v eb u r s t s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e c a t a l a s e s u p e r o x i d ed i s m u t a s e p e r o x i d a s e a s c o r b a t ep e r o x i d a s e d i p h e n y i e n e i o d o n i u mc h l o r i d e f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e s a a b a i n a s a b p t m v r o s p m r s h 2 0 2 o x b s a r h r c a t s o d p o d a p x d p i f d a 2 。7 。d i c h l o r o f l u o r e s c i nd i a c e t a t eh 2 d c f d a d i m e t h y l f o r m a m i d e 2 - n - m o r p h o t i n oe t h a n e s u l f o n i ca c i d n h y d r o x y o t h l p i p e r a z i n e n - 2 。e h a n e s u l f o n i ca c i d d m s o m e s h e p e s 水杨酸 脱落酸 2 - 6 = 氯异烟酸 水杨酸结合蛋白 烟草花椰病毒 活性氧 质膜氧化还原系统 过氧化氢 氧化猝发 系统获得性抗性 过敏反应 过氧化氢酶 超氧化物歧化酶 过氧化物酶 抗坏血酸过氧化物酶 二亚苯基碘 荧光索二乙酸酯 2 ，7 ( ：氯氢化荧光素乙酰 乙酸盐 二甲基亚砜 2 n 吗啡啉，乙烷磺酸 n 2 ，羟乙基哌嗪- n t 2 乙 烷磺酸 】a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y l s c m激光扫描共聚焦显微镜 - 1 过氧化氢参与了水杨酸诱导的蚕豆气孔关闭过程 中文摘要 ? 水杨酸作为植物体内一种内源性的信号分子，具有多种生理功能，尤其与植物的抗 病性密切相关，此方面的研究也倍受人们关注。前人研究认为s a 可能通过抑制c a t 而 使植物体内h 2 0 2 水平升高从而增强植物的抗病性。目前大量研究表明h 2 0 2 可能作为植 物体内又一新的信号分子，并具有广泛的生理作用。已有报道h 2 0 2 可能作为a b a 的下 游信号分子促进气孔关闭，但h 2 0 2 是否参与了s a 诱导气孔关闭提高植物抗病性这一信 号传递过程还不清楚本文以蚕豆气孔为材料利用表皮条生物分析、激光扫描共聚焦显 微术、显微注射技术、膜片钳等手段探讨了h 2 0 2 可能参与s a 诱导的气孔关闭过程n 姆 到以下结果： s a 可以浓度依赖的方式诱导气孔关闭，s a 浓度在1 1 0 0 0 1 m o l l 时诱导的气孔关闭 具有可逆性，而1 0 - 2 m o l l 的s a 导致的气孔关闭不可逆( 图2 ) ，f d a 细胞活性检测表 明这种s a 处理后气孔开度的可逆性与细胞活性丧失与否有关。h 2 0 2 具有与s a 类似的 作用1 0 - 7 m o l l 与1 0 - s m o l l 的h 2 0 2 处理表皮条后保卫细胞保持良好的活性状态，并在 h 2 0 2 洗脱后气孔开度可恢复到与对照接近的水平，而1 0 - 3 m o l l 的h 2 0 2 导致的气孔关闭 不可逆并伴随着保卫细胞活性的丧失( 图3 ) 。2 0 u m l 的c a t 与s a 共同处理时可逆转 s a 诱导气孔关闭作用的8 3 9 0 ( 图4 ) ，质膜n a d p h 氧化酶抑制剂d p i ( 1 0 m o l l ) 也 可逆转s a 作用的4 5 6 0 ( 图5 ) ，而c a t 和d p i 单独处理时促进气孔开放的作用非常 微弱。表明s a 诱导的气孔关闭可能与h 2 0 2 的产生有关。 以h 2 0 2 荧光探针h 2 d c f d a 结合激光扫描共聚焦显微术直接检测了保卫细胞内 h ，o ，的产生。与直接外源1 0 4 m o l l 的h 2 0 2 的处理结果类似，外施或通过显微注射技术 而在保卫细胞内引入1 0 0 1 t m o l l 的s a 均可引起保卫细胞内d c f 荧光快速增强，同时 t i m e c o u r s e 实验显示胞内叶绿体区域荧光增强早于其它细胞区域( 圈7 c ) 。在保卫细胞 内显微注射c a t 可完全阻止s a 导致的d c f 荧光增强( 图9 ) 。当在c a t 和d p i 存在情 况下s a 处理后保卫细胞内h 2 0 2 产生仅在叶绿体部位，而质膜附近的d c f 荧光增强受 到了抑制( 图1 2 ；图1 3 ) 。表明叶绿体可能是保卫细胞内h 2 0 2 产生的主要来源，并讨 论了此叶绿体产生h 2 0 2 的可能性及机制，同时质膜n a d p h 氧化酶也可能参与了s a 诱 河南大掌研究生硕士掌位论文 导的h 2 0 2 产生。 以两步酶解法分离蚕豆保卫细胞原生质体并记录在不同处理条件下全细胞内向k + 电流的变化。全细胞电流的反转电位和被胞外b a ”迅速抑制的结果表明记录到的电流应 为k + 电流。胞外1 0 0 p m o l l 的s a 可在处理后2 0 分钟抑制内向k + 电流的7 0 左右( 图 1 8 ) ；与s a 的作用类似。1 0 - 5 m o l l 的h 2 0 2 在处理后同一时间可抑制k + 电流的4 7 ( 图 1 9 ) 。电极液中2 0 u m l 的c a t 或1 0 i ，t m o l l 的d p i 可分别逆转s a 抑制全细胞内向k + 电 流的5 2 乖j3 4 ( 图2 0 ：2 1 ) ，表明c a t 和d p i 均可不同程度的逆转s a 对保卫细胞内 向k + 电流的抑制作用，暗示了h 2 0 2 可能通过抑制质膜内向k + 电流而介导s a 诱导的气 孔关闭过程。 关键词：水杨酸，气孔，过氧化氢，信号转导 一 ， 、：， 兰苎垡墨竺苎兰尘塑! ! 垦量塑墨曼兰坠苎璺苎堡 a b s t r a e t s a g r o w i n gb o d yo f e v i d e n c es u g g e s t st h a ts a l i c y l i ca c i di sa l le n d o g e n o u ss i g n a lf o ri t s g e n e r a lf u n c t i o n si np l a n t s ，e s p e c i a l l yi tp l a y sac r u c i a lr o l ei nd i s e a s e - r e s i s t a n c er e s p o n s e s ， a n dm u c ha t t e n t i o nh a sb e e nf o c u s e do nt h i s p r e v i o u ss t u d i e sh a v es u g g e s t e dt h a ts ac a n i n h i b i tc a t a l a s e ，r e s u l t i n gi ne l e v a t e dl e v e l so f h 2 0 2 ，w h i c ha c t i v a t ed e f e n s er e s p o n s ei np l a n t s a tp r e s e n t ，i tw a sa c c e p t e dt h a th 2 0 2m a yb ean e ws i n g a li np l a n t sa n di t p e r f o r m sg e n e r a l f u n c t i o n si np l a n tp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s i tw a sr e p o r t e dt h a ii - 1 2 0 2 m a ym e d i a t ea b at o p r o m o t es t o m a t a lc l o s u r e ，b u t i tw a sn o tk n o w nw h e t h e rh 2 0 2w a si n v o l v e di ns t o m a t a l c l o s u r i n gi n d u c e db ys a ，w h i c hw a sa d v a n t a g e o u sf o rp l a n td e f e n s e h e r ew ep r o v i d et h e e v i d e n c et h a th 2 0 2m a yf u n c t i o na sa ni n t e r m e d i a t ei ns as i g n a li nh c i ag u a r dc e l l sb y e p i d e r m a ls t r i p sb i o a s s a y , l a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y , m i c r o i n j e c t i o n a n dp a t c h c l a m p s ac a ni n d u c es t o m a t a lc l o s u r ew i t hac o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n tm a n n e r , t h ec h a n g e si n s t o m a t aa p e r t u r e sw e r er e v e r s i b l ew h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fs ab e t w e e n1 1 0 0 0 l a m o l l ，b u t w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fs aa t10 m o l l ，t h e c h a n g e s i ns t o m a t a l a p e r t u r e s w e r e i r r e v e r s i b l e ( f i g u r e2 ) ，t h et e s t so f c e l lv i a b i l i t yb yf d ai n d i c a t e dt h a tt h er e v e r s i b i l i t yo f s t o m a t ac h a l l e n g e dw i t hs ac o r r e l a t e dw i t hw h e t h e rt h ec e l l sw e r ev i a b l eo rn o t s i m i l a r l y , t h em a x i m u m p r o m o t i o no f s t o m a t a lc l o s u r ew a so b s e r v e dw h e nc o n c e n t r a t i o no f h 2 0 2a t1 0 3 m o l l ，a n da t t h i sc o n c e n t r a t i o nt h ec h a n g e si ns t o m a t a l a p e r t u r e w e r ei r r e v e r s i b l ea n d a c c o m p a n i e db y t h el o s so f c e l lv i a b i l i t y , b u tw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no f h 2 0 2a t1 0 。m o l lo r 10 m o l l ，t h ec h a n g e si ns t o m a t a la p e r t u r ew e r er e v e r s i b l ea n dt h ec h a l l e n g e dc e l lk e p tg o o d v i a b i l i t y ( f i g u r e3 ) c a ta t2 0 u m lr e v e r s e dt h es a i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r i n gb y8 3 _ 9 0 ( f i g u r e4 ) ；s i m i l a r l y , d p ia t1 0 p , m o l lr e v e r s e d t h ee f f e c to fs ao ns t o m a t a la p e r t u r e sb y 4 5 6 0 ( f i g u r e5 ) ，b u tc a t a n dd p it r e a t m e n ta l o n es l i g h t l yi n c r e a s e dt h es t o m a t a la p e r t u r e s ， w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h eg e n e r a t i o no fh 2 0 2m i g h tb ei n v o l v e di n t h es t o m a t a lc l o s u r i n g i n d u c e db ys a 河南大掌研究生硕士掌位论文 一_ - 一 w ed i r e c t l ye x a m i n e dt h ep r o d u c t i o no f h 2 0 2b yl a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y b a s e do nh 2 d c f d a - s i m i l a r l yt ot h er e s u l to fh 2 0 2a t 1 0 m o l l ，s aa t1 0 0 p , m o l lb y a p p l i e de x t e r n a l l yo rm i c r o i n j e c t i o nc o u l di n d u c er a p i di n c r e a s i n gi nf l u o r e s c e n c eo fd c fi n g u a r dc e l l s m o r e o v e r , t i m e - c o u r s ee x p e r i m e n t ss h o w e dt h ei n c r e a s ei nf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y o ft h ec h l o r o p l a s to c c u r r e ds i g n i f i c a n t l ye a r l i e rt h a nt h a ti nt h eo t h e rr e g i o n so f g u a r dc e l l s ( f i g u r e7 ) m i c r o i n j e c t i o n i n t oo n eg u a r dc e l tw i t hc a t2 0 u m lc o m p l e t e l yi n h i b i t e dt h e g e n e r a t i o no fh 2 0 2 i nt h em i c r o i n j e c t e dg u a r dc e l l ( f i g u r e9 ) i nt h ep r e s e n c eo fc a t o rd p i ， t h eg u a r dc e l lt r e a t e dw i t hs al o o g m o l ls h o w e di n c r e a s ei nd c ff l u o r e s c e n c eo n l yi nt h e r e g i o n so fc h l o r o p l a s t sl o c a t e d ，b u tt h ep r o d u c t i o no fh 2 0 2w a si n h i b i t e di nt h er e g i o n so f p l a s m am e m b r a n e ( f i g u r e1 2 ；f i g u r e1 3 ) t h e s er e s u l t ss u g g e s t st h a tt h ec h l o r o p l a s t si ng u a r d c e l l sm i g h tb et h em a i ns o u r c eo fh 2 0 2p r o d u c t i o nw h e nt h es t o m a t at r e a t e dw i t hs a ， s i m u l t a n e o u s l y , p l a s m a m e m b r a n en a d p ho x i d a s e m a ya l s o c o n t r i b u t et ot h e h 2 0 2 g e n e r a t i o ni nt h eg u a r d c e l l s t h ep r o t o p l a s t so fl 蹿c i a g u a r dc e l l s w e r ei s o l a t e d b yt w o s t e pe n z y m ed i g e s t t h e v o l t a g e d e p e n d e n t k + - s e l e c t i v ec h a n n e l si nt h e p l a s m a m e m b r a n ew e r er e c o r d e d b y w h o l e c e l lc o n f i g u r e u r a t i o n w ec o n s i d e r e dt h a tt h ec u r r e n tw er e c o r d e ds h o u l db ec a r r i e db y k + b a s e do nt h et w or e s u l t sb e l o w ：o n ew s st h ed e t e r m i n a t i o no fr e v e r s a lp o t e n t i a la n dt h e o t h e rw a st h ew h o l e c e l lc u r r e n tc a l lb er a p i db l o c k e db ye x t e r n a ll m m o l lo fb a 2 + t h e w h o l e - c e l li n w a r dk + c u r r e n t sw e r ei n h i b i t e db y7 0 a f t e r2 0 m i nt r e a t e db ys a1 0 0 i _ t m o l l ( f i g u r e l8 ) ，s i m i l a r l y , h 2 0 2a t1 0 。5 m o l li n h i b i t e di n w a r dk + c u r r e n t sb y4 7 a tt h es f l m e t i m e ( f i g u r e1 9 ) b u t i n t r a c e l l u l a ra p p l i c a t i o no fc a to rd p ip a r t l ya b o l i s h e ds a - i n h i b i t e d i n w a r dk + c u r r e n tb y5 2 o r3 4 ( f i g u r e2 0 ；f i g u r e2 1 ) ，r e s p e c t i v e l y t h i si n d i c a t e dt h a t h 2 0 2m e d i a t e ds a i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r i n gb yt a r g e t i n gi n w a r dk + c h a n n e l so np l a s m a m e m b r a n e k e yw o r d s ：s a l i c y l i ca c i d ，s t o m a t a l ，h y d r o g e np e r o x i d e ，s i g n a lt r a n s d u c t i o n 过车化氢簟晦了水桶r 馘诱导的番豆气3 拱翩过程 1 前言 目前越来越多的研究表明活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 尤其是h 2 0 2 可能 作为植物体内一种新的信号分子，并广泛参与植物的许多代谢和生理调控过程。近年来， 在植物的抗病反应中h 2 0 2 可能作为水杨酸( s a l i c y l i ca c i d ，s a ) 的下游信号分子诱导抗病 相关( p a t h o g e n e s i s - r e l a t e dp r o t e i n ，p r s ) 基因表达并产生过敏反应( h y p e r s e n s i t i v e r e s p o n s e ，h r ) 及系统获得性抗性( s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e 。s a r ) ，此方面人们已 进行了广泛深入的研究。已有报道某些病原菌只能通过开放的气孔才能侵入植物体内， 因此s a 诱导气孔关闭有利于提高植物对某些病原菌的抗性，但对s a 诱导气孔关闭的 详细信号转导过程还知之甚少，h 2 0 2 是否参与此信号转导过程也不清楚? 现就s a 与植 物的抗病性及h 2 0 2 在此过程中的作用作一简要概述。 1 1 水杨酸与植物的抗病性及其作用机制 1 1 1 水杨酸与植物的抗病性 水杨酸是植物体内普遍存在的一种酚类化合物，已经证实它在植物体内有多种生理 调节作用，如植物佛焰花序生热，抑制乙烯的生物合成，调节某些植物的光周期，影响 黄瓜的性别分化，种子萌发，膜通透性改变，离子吸收，增强植物的抗病性，诱导气孔 关闭等，因而r a s k i n 等提出应将s a 看作一种新的植物激素( r a s k i n ，1 9 9 2 a ；1 9 9 2 b ) 。 近年来，s a 在植物抗病反应中的作用引起人们的广泛关注，并且有关植物体内s a 合成 代谢途径、s a 在植物抗病反应中的作用机制、s a 信号转导途径等方面的研究也取得了 重大进展。 外源应用s a 可诱发多种植物积累病程相关蛋白( p a t h o g e n e s i s - r e l a t e d p r o t e i n ，p r s ) ， 并产生抗病性( k l e s s i g 和m a l a m y ，1 9 9 4 ) 。以t m v 诱导接种烟草，抗性品种植株体内 s a 积累5 5 0 倍，且这种内源s a 的积累先于p r 基因表达和抗病性的产生，而感病品种 巾则没有观察到s a 的积累、p r 基因表达和抗病性的产生( m a l a m y 等，1 9 9 0 ) 。水杨酸 羟化酶能催化s a 转化为儿茶酚，g a f f n e y 等( 1 9 9 3 ) 构建了能结构性表达此酶的烟草植 株( n a h g 植株) ，这种转基因植株表达了大量该酶蛋白，即使受到病原菌诱导接种也不 能积累s a ，上部未处理叶片不能积累p r 蛋向也不能产生抗病性；以n a h g 拟南芥为材 料的实验结果同样支持这个结论，后来还发现n a h o 烟草和拟南芥植株不仅不能被t m v 河南大学研究生硕士学位论文 诱导产生s a r ，而且导致产生比一般感病植株更强的感病性。说明s a 的积累不仅是诱 发植物s a r 所必需，而且是限制毒性病原菌的生长和表现基因对基因遗传抗性所必需 的。总之植物体内s a 水平与植物抗病性的产生密切相关。另外，s a 与植物基因表达的 研究也取得了一定的进展。通过分子生物学手段已鉴定了对s a 信号作出应答必需的顺 式作用元件和反式作用因子。研究发现，编码烟草尸矗q 等基因拟南芥p r 3 基因的启 动子均为s a 诱导性启动子，其中p r a 启动子中位于3 0 0 一7 0 0 b p 区域内的至少一个元 件是保持对s a 诱导作出高灵敏度反应所必需的( b e i l m a n n 等，1 9 9 2 ；v a n 等，1 9 9 0 ) 。 11 2s a 的作用机制 s a 在植物抗病性中的作用机制也是近年来的研究热点。c h e n 等( 1 9 9 1 ：1 9 9 3 ；1 9 9 5 ) 从烟草组织细胞中分离鉴定出s a 介导的信号传递中的一种成分，发现它是一种分子量 为2 4 0 2 8 0 k d 的可溶性水杨酸结合蛋白( s a b i n d i n gp r o t e i n ，s a b p ) ，它由一分子量为 5 7 k d 的豫基和一个或多个多肽链组成，并进一步用s a b p 特异的单克隆抗体从烟草的 c d n a 文库中筛选出了编码s a b p5 7 k d 单体的克隆c k l ，通过比较发现，从该c d n a 序列推导的氨基酸顺序与各种生物中的过氧化氢酶( c a t ) 的同源性高达6 0 9 0 ，为了 确证s a b p 是否是c a t ，他们直接测定了s a b p 降解h 2 0 2 的能力。结果表明，s a b p 有 很高的c a t 活性，并且s a 与3 a t ( 3 。氨基一1 ，2 ，4 一三唑，c a t 的专一性抑制剂) 一样可 以使烟草叶片中h 2 0 2 含量增加5 0 6 0 。除烟草外，在其它植株如黄瓜、番茄、拟南芥 中也存在类似的可被s a 结合并抑制其活性的过氧化氢酶。而且通过对4 0 种酚类和异烟 酸类化合物的鉴定结果也表明，这些化合物结合c a t 的能力与它们诱导p r 基因表达和 增强植物抗病性的能力是一致的。实验还表明，施用外源h 2 0 2 也能诱导烟草中p r 蛋白， 只是其诱导效应低于s a 处理，从而提出s a 的作用机制至少部分与h 2 0 2 有关，初步认 为s a 首先与c a t 结合，抑制了c a t 的活性，使植物体内h 2 0 2 水平升高，从而起到诱 导和增强植物抗病性的作用。而且，最近也有报道水杨酸处理可抑制大麦c a t 活性及导 致c a tm r n a 水平下降，尤其是当水杨酸浓度大于3 0 m m o l l 以上时上述两种作用尤为 明显( 宋泽双等，1 9 9 8 ) 。这一结果进一步支持上述s a 通过抑制c a t 活性提高h 2 0 2 水 平来增强植物抗病性的这一结论。 然而，s a 的作用机理可能不是单一的。如原永兵等( 1 9 9 7 ) 和r a o ( 1 9 9 7 ) 等的研 究结果表明02 5 1 00 m m o l l 的s a 能明显提高叶片中h 2 0 2 水平，其机制不仅在于s a 抑制了过氧化氢酶活性，从而抑制了h 2 0 2 的降解使其积累，而且还由于s a 提高了超氧 化物歧化酶( s o d ) 活性，促进了超氧阴离子( 0 2 - ) 向h 2 0 2 的歧化反应，因而增加了 h 2 0 2 的生成量，而且s a 还诱导了特异的过氧化物酶( p o d ) 同工酶，这也可能与h 2 0 2 的积累有关。植物中h 2 0 2 是叶绿体光合电子传递链、线粒体呼吸链、光呼吸和脂肪酸 b 一氧化的副产物，包括超氧化物歧化酶( s o d ) 等酶催化的某些酶促反应也是产生h 2 0 ： 的重要来源，同时植物体内也存在着丰富的h 2 0 2 清除酶类，除了存在于过氧化物酶体、 乙醛酸循环体、线粒体、液泡以及非特异性微体的c a t 以外，通过抗坏血酸谷胱甘肽 氧化还原途径清除植物体内h 2 0 2 也是种重要的方式，其中后者直接负责清除h 2 0 2 的 酶是抗坏血酸过氧化物酶( a s c o r b a t ep e r o x i d a s e ，a p x ) 。它对h 2 0 2 的亲和力远大于c a t 。 已经证明高等植物的a p x 存在着多种同工酶，一类是光合器官型，包括位于叶绿体基质 中的a p x 和与类囊体膜结合的a p x ；另一类是非光合器官型，在胞浆线粒体和乙醛酸 循环体中均己发现，而且上述两类a p x 的酶学特性是明显不同的( 沈文飚等，1 9 9 7 ；曹 宛虹，1 9 9 4 ) 。d u r n e r 等( 1 9 9 5 ) 发现高浓度s a 和i n a ( 2 , 6 二氯异烟酸) 几乎完全抑制 烟草叶片中可溶性a p x 活性，而且这个过程是可逆的，与不可逆的a p x 自杀性底物对 氨基苯酚对a p x 的抑制是完全不同的，至于机理，r u f f e r 等( 1 9 9 5 ) 认为s a 是通过螯 合铁离子从而专一性的抑制诸如c a t 、a p x 、顺乌头酸酶等含铁的酶类。而d u r n e r 等( 1 9 9 5 ) 则认为在h 2 0 2 存在的情况下，s a 或其它酚类化合物抑制c a t a p x 是通过充当它们的 过氧化活性的单电子供体底物来完成的，相应地，c a t a p x 则由氧化型的中间产物转变 为呈失活状态的部分还原型的中间产物，而s a 或其它酚类化合物则转变为水杨酸自由 基( s a ) 或酚自由基，这不仅改变了细胞内的氧化还原环境，而且可以启动脂质过氧 化和修饰生物大分子，由此产生的过氧化产物可能促进p r 基因的表达和s a r 的建立。 但l e o n 等f 1 9 9 5 ) 发现h 2 0 2 可以通过两种途径促进烟草叶片中s a 的生物合成，包括直 接诱导催化游离苯甲酸( b a ) 转化为s a 的苯甲酸2 - 羟化酶( b a 2 h ) 活性和b a 含量 增加，这一结果暗示了h 2 0 2 也可能处于s a 介导的s a r 建立的上游，而并非仅仅处于 下游。k a w a n o 等( 2 0 0 0 ) 提出了s a 提高植物抗病性的可能作用机制的模式图： 河南大掌研究生硕士掌位论文 器冀糍矿“ 烟草悬浮细胞中s a 作用机制模式图 1 2 植物细胞h 2 0 2 的产生及其生理作用 1 2 1 植物体内h 2 0 2 的产生机制 植物细胞在胁迫条件下( 包括高温、低温、机械损伤、渗透胁迫、u v 辐射等) 可 产生多种活性氧( r o s ) ，包括0 2 7 、h 2 0 2 、o h 、1 0 2 等。目前，氧对生命“双重性” 的作用己成为生命科学的一个研究课题，以往的研究多集中于活性氧对植物体的伤害作 用方面，近年来，随着人们对r o s 认识的深入，发现r o s 有可能作为第二信使参与植 物体内多种代谢过程。 目前，人们普遍认为植物具有种先天的“免疫系统”氧化猝发( o x i d a t i v eb u r s t ， o x b ) ，即植物细胞在胁追条件下能迅速产生一些活性氧分子( r o s ) ，进而启动体内其 他信号级联过程( s i g n a lc a s c a d e s ) ，引起特有的生理反应。o x b 现象最早是d o k e 于1 9 8 3 年在研究马铃薯组织切片和原生质体过敏反应中发现的。近十多年来，关于不同胁迫条 件诱导o x b 已在植物组织、悬浮细胞、原生质体中进行了广泛的研究( d o k e ，1 9 9 7 ) 。 植物细胞中产生活性氧的途径很多，但是有关植物氧化猝发过程中活性氧形成的 分子机制及其作用位点目前仍有争议，多数报道( 孙玉和阵珈，1 9 9 7 ) 认为其主要发生 于胞外，由质膜氧化还原系统产生。另外植物细胞壁中的过氧化物酶和叶绿体p s i 也可 能与植物氧化猝发有关。质膜电子传递系统或质膜氧化还原系统( p l a s m a m e m b r a n e r e d o x s v s t e m p m r s ) 普遍存在于原核生物及所有动植物体内( r u b i n s t e i n a n dl u s t e r , 1 9 9 3 ) ，产 过章0 1 匕盔。参与了水杨酸诱导的蚕豆气丑关闭过程 生0 2 j 的n a d p h 氧化酶既是p m r s 的一个重要成分。h e n d e r s o n 和c h a p p e l l ( 1 9 9 6 ) r f 究 表明，n a d p h 氧化酶作为哺乳动物细胞中的一种嗜中性氧化酶在有氧代谢的呼吸猝发 ( r e s p i r a t o r yb u r s t ) 中起重要作用。现己证明，植物细胞中也有类似于动物细胞的嗜中 性n a d p h 氧化酶，而且此n a d p h 氧化酶在o x b 中的作用已从一些添加剂抑制实验中 得到证实，如作为n a d p h 氧化酶的自杀性底物抑制剂d p i ( d i p h e n y l e n ei o d o n i u m ) 可 阻止一些由真菌刺激产生的o x b ，也可抑制事先加入n a d p h 的玫瑰细胞线粒体膜上 h 2 0 2 的产生( a u h 和m u r p h y , 1 9 9 5 ) 。d o k e 与m i u r a ( 1 9 9 5 ) 在研究马铃薯块茎切片过 敏反应时发现，激发子( e l i c i t o r ) 可激活块茎细胞膜上的n a d p h 氧化酶并迅速产生0 2 。0 2 一跨膜扩散性较小，最有可能存在于膜外，通常h 2 0 2 是o x b 的主要积累产物。玫 瑰细胞用n ，n - 二乙基二巯基氨基甲酸酯( s o d 抑制剂) 处理后，h 2 0 2 的产生停止，表 明0 2 - 在膜外产生，被s o d 迅速歧化为h 2 0 2 后，通过质膜在胞内( 或胞间) 运输( a l l a n 和f l u h r , 1 9 9 7 ) 。 除质膜n a d p h 氧化酶外，h 2 0 2 也可由一种p h 依赖性的细胞壁过氧化物酶( p o d ) 产生( p e n g 和k u c ，1 9 9 2 ) 。在病原菌作用下，质外体p h 伴随细胞膜上离子的跨膜转运 而暂时升高，进而激活了p h 依赖性的细胞壁过氧化物酶，在该酶的催化下，0 2 迅速被 还原为0 2 7 和h 2 0 2 ( b o l w e l ! 等，1 9 9 5 ) 。质膜上n a d p h 氧化酶可与胞壁p o d 起串联 作用。o t t e 和b a r z ( 1 9 9 6 ) 的研究表明，通过n a d p h 氧化酶产生的r o s 可促进p o d 所催化的氧化过程。a l l a n 和f l u h r ( 1 9 9 7 ) 利用h 2 0 2 的荧光探针2 ，7 l 二氯氢化荧光索 乙酰乙酸盐( 27 ，7 d i c h l o r o f l u o r e s c i nd i a c e t a t e ，h 2 d c f d a ) 标记烟草细胞并结合激光扫 描共聚焦显微术( l a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y ，l s c m ) 研究发现，氨基酸和多胺 类激发子所产生的r o s 对外源的过氧化氢酶( c a t ) 敏感：而c r y p t o g e i n 刺激产生的 r o s 对c a t 则不敏感。表明氨基酸和多胺类激发子作用于细胞壁p o d ；c r y p t o g e i n 则作 用于质膜n a d p h 氧化酶，表皮细胞所产生的h 2 0 2 可通过质外体途径进入保卫细胞。 另外，在植物细胞中，大部分重要的r o s 是与光依赖的事件相联系的。光合电子传 递系统是植物细胞中r o s 的个重要来源( a s i a ，1 9 9 4 ) ，尤其在各种胁迫( 强光、干 旱、低温等) 条件下，这些r o s 是光合电子传递不可避免的产物。t e r a s h i m a 等( 1 9 9 8 ) 的研究表明，5 低温可诱导黄瓜叶片叶绿体类囊体中h 2 0 2 的大量产生及抗坏血酸过氧 1 0 河南大学研究生硕士学位论文 化物酶( a p x ) 的活性下降，同时p s i 也遭到一定的破坏。p s i i 的抑制剂a t r a z i n e 也可 强烈抑制强光条件下气孔保卫细胞中h 2 0 2 的产生( a l l a n 和f l u h r ，1 9 9 7 ) 。但植物在进 化过程中也相应地产生光氧化保护机制，其主要作用是光合的调节( j o n e s 和k o k ，1 9 6 6 ) 。 现已发现，伴随着光合的调节叶绿体中有大量的r o s 产生( f o y e r ，1 9 9 7 ) ，尤其在c 0 2 同化不足的情况下，0 2 可成为同化力( a t p 和n a d p h ) 的最适代谢库。一方面，植物 可通过光呼吸消耗过多的a t p 和n a d p h ，同时产生一定的c 0 2 以弥补c 0 2 同化的不足 以保护光合器官免遭光胁迫伤害；另一方面，植物可通过m e h l e r 反应消耗0 2 等，在m e h l e r 反应中，p s i 的电子从光合屯子传递体铁氧还蛋白( f d ) “泄露”给分子0 2 以形成0 2 一， 0 2 在超氧化物歧化酶( s o d ) 作用下歧化为h 2 0 2 。在叶绿体基质或类囊体膜上a p x 可 将0 2 - 分解为0 2 。除0 2 外，单脱氢抗坏血酸( m d a ) 是光合电子另一个受体分子，其 在体内的产生和减少直接参与m e h l e r 反应中0 2 7 的调节。p s i 中0 2 的还原，0 2 7 的歧化 及h 2 0 2 的还原，抗坏血酸( a s a ) 的再生都与m e h l e r p o d 循环及抗坏血酸- 谷胱甘肽 循环有密切关系。 i 2 2h 2 0 2 在植物体内的生理作用及其信号传递 h 2 0 2 在植物体内具有广泛的生理生化效应，它可直接作用于蛋白质、脂类、多糖和 核酸，参与和影响多种生物代谢体系，如增强植物的抗病性、诱导气孔关闭、促进次生 壁的分化等。这里着重介绍植物病原菌相互作用过程中h 2 0 2 的生物学功能。 h 2 0 2 在植物抗病性反应中起着多种积极的生理作用，这方面研究也取得了较多工作 积累( 郭泽建等，2 0 0 0 ) 。很早人们就发现植物受病原菌侵染时会在感染部位最先出现局 部性坏死，即所谓的过敏反应( h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e ，h r ) ( l e v i n e 等，1 9 9 4 ) ，进而引 发一个光谱、长效的系统抗 胜( a l v a r e z 等，1 9 9 8 ) 。h r 的最早事件是o x b 导致0 2 7 的产 生及h 2 0 2 在细胞内的积累( l a m b 和d i x o n ，1 9 9 7 ) 。葡萄糖氧化酶( g o ) 存在于一些细 菌和真菌之中并具有抗生素功能，催化葡萄糖氧化并释放出h 2 0 2 。转g o 的马铃薯植株 内有明显的h 2 0 2 积累，而且对e r w i n i ac a r o t o v a v a 和晚免疫菌有明显的抗性( w u 等， 1 9 9 5 ) 。快速的细胞壁氧化交联起着强化细胞壁作为物理屏蔽来延缓和阻止病原菌的侵入 和扩散以及保护细胞免受第二次感染的作用。伸展蛋自( e x t e n s i n ) 是一类富含羟脯氨酸 的糖蛋白( h r g p ) ，存在于植物细胞壁，b r a d l e y 等( 1 9 9 2 ) 的研究表明r