（园林植物与观赏园艺专业论文）杨树制浆性能改良的分子育种技术研究.pdf

摘要杨树是世界上中纬度地区广泛栽培的重要用材树种，在造纸方面也有着极其重要的作用。木质素是地球上数量仅次于纤维素的有机物，在植物牛长和发育中发挥重要作用，但它却是形成造纸污染的主要来源。利用基因工程手段，在分子水平调节木质素的生物合成，降低木质素的含量或改变其组分以培育适合造纸的植物原料树种具有很大的应用价值和环保效益。本研究以南林9 5 杨叶片为植物材料，利用r n a i 技术，主要围绕木质素合成两种相关酶4 香豆酸辅酶a 连接酶( 4 c l ) 、肉桂酰辅酶a 还原酶( c c r ) 的基因，构建了4 香豆酸辅酶a 连接酶( 4 c l ) 干涉表达载体p b l l 2 1 + 2 f ，开展了农杆菌介导的杨树遗传转化，并对转化植株进行了筛选，同时对转c c r 基因的南林9 5 杨进行了分子检测和木质素含量检测，取得如下进展：1 、采用改良的t n z o l 法提取南林9 5 杨的总r n a ，利用r t - p c r 技术克隆得到4 c l基因的部分序列( 2 0 4 b p ) ，以p u c c r n a i 与p b l l 2 1 载体作为桥梁载体，通过酶切、纯化、连接、转化等一系列基因工程操作方法构建了含c a m v 3 5 s 组成型启动子和卡那霉素筛选基因的r n a 干涉表达载体p b l l 2 1 + 2 f ，利用直接导入法将构建的干涉载体导入农杆菌l b a 4 4 0 4 中。2 、用已建立的叶盘法农杆菌遗传转化体系，将p b l l 2 1 + 2 f 干涉表达载体导入南林9 5 杨中，获得了经抗k a r l 筛选的含r n a 干涉表达载体的转基因植株。3 、将已获得的移栽到大田半年的含p b l l 2 1 + c c r 干涉表达载体的转基因杨树植株进行分子检测，表明目的基因已经整合到杨树基因组d n a 上，且转基因植株的形态和生长发育未见异常，对转基因植株茎干横截面进行组织化学染色发现木质素含量明显减少，测定k l a s o n 木质素及综纤维素含量的结果显示：转基因植株k l a s o n木质素含量与对照相比平均降低了9 7 ，综纤维素含量与对照相比平均增加了3 1 4。对转基因植株的纤维形态进行测定发现纤维长宽比明显增加。结果均表明转基因植株更有利于造纸。综上所述，本文已成功的构建了r n a 干涉表达载体p b l l 2 1 + 2 f ，并对其进行了遗传转化，培育出速生、优质的杨树新品种；对含有p b l l 2 1 + c c r 干涉表达载体的转基因杨树植株进行了系统的检测，为进一步深入了解木质素生物合成提供了研究材料，也为其他树种的木质素基因工程改良奠定理论基础。关键词：杨树，r n a i ，4 c l ，c c r ，木质素a b s t r a c tp o p l a ri st h ei m p o r t a n tc u l t i v a t e dt i m b e rt r e es p e c i e si nt h ew o r l d sm i d l a t i t u d e s ；i ta l s oh a sa ne x t r e m e l yi m p o r t a n tr o l ei np a p e r m a k i n g l i g n i ni so r g a n i s mw h i c hi ss e c o n do n l yt oc e l l u l o s ei ne a r t h i tp l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei np l a n tg r o w t ha n dd e v e l o p m e n tb u ti ti sam a j o rs o u r c eo fp o l l u t i o ni np a p e r m a k i n g r e d u c e dl i g n i nc o n t e n to rc h a n g et h ec o m p o n e n tb yu s eo fg e n e t i ce n g i n e e r i n gm e a n s ，a tt h em o l e c u l a rl e v e lo fr e g u l a t i o no fl i g n i nb i o s y n t h e s i st on u r t u r ep l a n ts p e c i e ss u i t a b l ef o rm a k i n gp a p e rh a v eg r e a t e rv a l u ea n de n v i r o n m e n t a lb e n e f i t s i nt h i ss t u d y , n a n l i n 9 5l e a fi sa c ta se x p l a n t s ，r n a ii sa c ta st h em e a n s ，t h em a i nf o c u si so nt w or e l a t e de n z y m e so fl i g n i ns y n t h e s i sw h i c hi s4 - p c o u m a r a r e ：c o al i g a s e ( 4 c l )a n dc i n n a m o y l - c o ad r e d u c t a s e ( c c r ) ，w es y s t e m a t i c a l l ye x p l o r e dt h ec h a r a c t e r i s t i c sa n dp a r a m e t e r si ni n h e r i t a b l et r a n s f o r m a t i o ns y s t e mb ya g r o b a c t e r i u ma n dc o n s t r u c t e dt h ee x p r e s s i o nv e c t o ro fp b l l 2 1 + 2 f , t h e na g r o b a c t i r i u mm e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n ，t h ei n t e g r a t i o no ft a r g e t e dg e n ew a sp r o v e db yp c ra n a l y s i s ，f i n a l l y , t h el i g n i nc o n t e n tw a st e s t e d t h em a i nr e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w ：1 、t h et o t a lp o p l a rr n aw e r ee x t r a c t e df o l l o w i n gt r i z o lm e t h o dw i t hs o m ea d j u s t m e n t s ，t h ep a r to ft h eg e n e4 c l ( 2 0 4 b p ) h a v eb e e na m p l i f i e db yr t - p c ra m p l i f i c a t i o n v e c t o rp b l l 2 1 + 2 fw h i c hc o n t a i n i n gk a n a m y c i ns e l e c t i n gg e n eh a sc o n s t r u c tb yu t i l i z i n gp u c c r n a ia n dp b l l2 1v e c t o r a n db yu s eo fg e n ee n g i n e e r i n gm e a s u r es u c ha sd i g e s t i o n 、p u r i f i c a t i o n 、l i g a t i o na n dt r a n s f o r m a t i o n t h ei n t e r f e r e n c ev e c t o r sw e r et r a n s f o r m e di n t oa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sl b a 4 4 0 4b yp r o t o c o lo fd i r e c tt r a n s f o r m a t i o n t h ea g r o b a c t e r i u mt r a n s f o r m a n tc a nb eu s e di np o p l a rt r a n s f o r m a t i o n 2 、t h ee x p r e s s i o nv e c t o rp b l l 2 1 + 2 fh a sb e e ni n t r o d u c e di n t on a n l i n 9 5 b yt h el e a fd i s cm e t h o dw h i c hh a sb e e ne s t a b l i s h e d a n dt r a n s g e n i cp l a n t sw e r es c r e e n e du s i n gk a ni nr o o ti n d u c e d - m e d i a 3 、t h et r a n s g e n i cp l a n t sw h i c hc o n t a i n e dp l a s m i dp b i121 + c c rc o n f i r m e db yp c rd e t e c t i o n ，s o u t h e r nb l o t t i n g ，t h e ys h o w e dt h a tt h eg e n eh a sb e e ni n t e g r a t e di n t ot h ep o p l a rg e n o m ed n a b ys t a i n i n gt h ec r o s s s e c t i o ns t e mo ft r a n s g e n i cp l a n t sw ef o u n dt h a tl i g n i nc o n t e n ts i g n i f i c a n t l yr e d u c e d i n t e g r a t e dk l a s o nl i g n i na n dc e l l u l o s ec o n t e n to ft h et r a n s p l a n t ss h o w e d ：k l a s o nl i g n i nc o n t e n to ft r a n s g e n i cp l a n t sc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lr e d u c e d9 7p e r c e n t ，h o l o c e l l u l o s ec o n t e n ti n c r e a s e db y3 14p e r c e n t ，a n dam a r k e di n c r e a s ei nf i b e ra s p e c tr a t i o t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h et r a n s g e n i cp l a n ti sm o r ec o n d u c i v et op a p e r m a k i n g i ii ns u m m a r y , w eh a v e b e e ns u c c e s s f u l l yb u i l d i n gar n a ie x p r e s s i o nv e c t o r sp b l l21+ 2 f p r o d u c e df a s t - g r o w i n g ，h i g h q u a l i t yn e wv a r i e t i e so fp o p l a r , a n dm a d eas y s t e md e t e c t i o nf o rt r a n s g e n i cp l a n t sw h i c hc o n t a i n i n gp l a s m i dp b i121 + c c r , w i l ln o to n l yg i v en o v e li n s i g h ti n t or e g u l a t o r ya s p e c t so ft h ep a t h w a ya n do nt h es t r u c t u r ea n db i o l o g i c a lr o l e so fl i g n i n ，b u ta l s op r o v i d eap i c t u r eo fg e n e t i ce n g i n e e r i n gf o rm o d i f i e dl i g n i nc o m p o s i t i o na n dc o n t e n t k e yw o r d s ：p o p l a r , r n a i ，c i n n a m o y l - c o ar e d u c t a s e ，a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n ，l i g n i n独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：第一导师签名：时间：时间：年月日年月日1 文献综述近几年来，全球造纸业的行业排序仅居电信制造业和汽车工业之后，超过了钢铁工业和航空航天工业，之所以发展到今天的生产和技术水平，一个重要的原因就是大力发展木材为原料的制浆造纸，在原料结构上已确立了以木材为主要纤维原料的生产体系，木材纤维原料比重已达9 5 。世界上林纸产业发达的国家( 如美国、加拿大、挪威、芬兰、瑞典等) 都是采用林纸结合，依靠人工林提供造纸工业用纤维原料，保证造纸原料供给和企业竞争力以及可持续发展【i 】。由于杨树具有速生丰产，适应性强，繁殖容易，纤维长，材质好等特性，成为了我国主要的纸浆用材林树种。然而，在制浆和造纸中除去木质素是一个极大的障碍，原因是木质素很结实，而纤维素很有韧劲，二者很难分开，必须通过剧烈的化学处理工艺将木质素从纤维素中除去，这样既消耗大量的化学药品与能源，又造成严重的环境污染。而常规的育种方法很难对这一性状进行有效地定向改良，因此，利用基因工程手段来调控木质素的生物合成，无论是从提高纸浆得率和质量、降低造纸经济成本还是环境保护方面，都具有重要意义，这样从源头上治理与减少污染，既可减少能源消耗，又能达到环境保护的目的【2 】。1 1 木质素的组成及分布木质素是一种复杂的酚类聚合体，它的出现与陆生植物直立生长的习性相关，是植物界中仅次于纤维素最丰富的天然芳香高聚物，占生物圈有机碳3 0 嘣】，是植物进化的一种标志。木质素渗入到细胞壁中，主要沉积于一些特化细胞内，如木质部的导管分子、厚壁组织和韧皮部纤维等，具有加固细胞壁的机械强度、提高细胞运输能力以及抵御病菌微生物侵害的生物学功能【5 硎。木质素主要是由香豆醇、松柏醇和芥子醇3 种单体氧化聚合而生成。根据单体的不同，木质素分为3 种类型：由紫丁香基丙烷结构聚合而成的紫丁香基木质素( s 木质素) ；由愈创木基丙烷结构聚合而成的愈创木基木质素( g 一木质素) ；由对羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对羟基苯基丙烷木质素( h 一木质素) 。1 2 木质素生物合成途径人们对木质素单体如何合成、在何地贮藏、如何运输到细胞壁以及如何聚合为木质素等方面仍不完全清楚，合成途径的单独反应尚未准确确定，大多数酶的调节作用及其在细胞内的准确位置等也不完全清楚，但经过多年的研究，对木质素单体生物合成途径中各主要反应步骤已经有了一个基本框架性的认识，普遍认为木质素单体生物合成途径可分为三个主要部分：莽草酸途径( s h i k i m a t ep a t h w a y ) 途径，形成芳香族的氨基酸：苯丙氨酸( p h e n y l a l a n i n e ) 、酪氨酸( t y m s i n e ) 和色氨酸( t r y p t o p h a n ) ，此途径在细菌、真菌和植物中得到证实，但不存在于动物体中。苯丙烷类代谢途径( p h e n y l p r o p a n o i dp a t h w a y ) ，从苯丙氨酸开始导致羟基肉桂酸类化合物( h y d r o x y c i n n a m i ca c i d s ，h c a s ) 及其c o a 酯的生物合成。在此途径中，苯丙氨酸被转为苯乙烯酸( c i n n a m i ca c i d ) ，随后经连续的羟基化和甲基化步骤2 n - r 为p 一对羟基苯乙烯酸0 c o u m a r i ca c i d ，p c a ) 、咖啡酸( c a f f e i ca c i d ，c a ) 、阿魏酸( f e r u l i ca c i d ，f a ) 、5 羟基阿魏酸( 5 h y d r o x y f e r u l i ca c i d ，5 o h f a ) 与芥子酸( s i n a p i ca c i d ，s a ) 。在植物体中，h c a s 能够与角质、木栓质、木质素、碳水化合物、蛋白质、脂类、氨基酸、类萜、生物碱、类黄酮及其它含有羟基的多种化合物缩水形成脂类化合物，h c a 是植物酚类物质代谢的中心，涉及到植物防御机理、酶的抑制或失活及形态建成等多方面生化机理。木质素特异的途径，涉及到h c a c o a 酯还原为木质素单体及其他通过基团耦联的聚合作用【7 1 。1 3 木质素生物合成过程中的关键酶木质素的生物合成是在一系列酶催化下使苯丙氨酸或酪氨酸逐步转化为木质素单体，最终聚合成木质素的过程。木质素合成途径是植物中十分复杂的生理牛化过程，它的合成涉及的酶非常多，图1 1 显示了这些酶在木质素合成中的位置和关系。l 喘，伽bo ht 疆l “2i i l 4 1 1 1 枉黼昏费邑；葛栏桃lc a d芥子曩l i s a d棚舳l i一搬：蔫括栅井干-l 懈帕”l 幻讹”a 程木黯8 奠术震蠢图l l 木质素生物合成途径【1 2 jt h eb i o s y n t h e t i cp a t h w a y so fl i g n i n粗箭头表示木质素生物合成的可能途径，催化每一步重要反应的酶用粗体缩写表示；细箭头为木质素合成被修改或质疑的部分。c a d ( c i i l n 锄y la l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ) 肉桂醇脱氧酶；c c r ( c i n n a m y l c o a r c d u c t a s e ) 肉桂酰辅酶a 还原酶；c 3 h ( c o u m a t i ca c i d3 - h d r o x y l a s e ) 香豆酸- 3 - 羟基化酶：c 4 h ( c o u m a r i ca c i d4 - h d r o x y l a s e ) 肉桂酸- 4 - 羟基化酶；4 c l ( 4 一c o u m a r i cc o al i g a s e ) 4 - 香豆酸辅酶a 连接酶；c o m t ( b i s p e c i f i cc a f f e i ca c i d 5 - h y d r o x y f e r u l i ca c i do - m e t h y l t r a n s f e r a s e ) 咖啡酸5 羟基阿魏酸o 甲基转移酶；c c o m t ( c a f f e m y l - c o a 0 一m e t h y l t r a n s f e r a s e ) 咖啡酰c o a o 甲基转移酶：c q t ( h y d r o x y c i n n a m o y lc o a ：q u i n a t eh y d r o x y c i n n a m o y l t r a n s f e r a s e ) 羟基肉桂酰辅酶a ：奎尼酸羟基肉桂酰转移酶；c s t ( ( h y d r o x y c i n n a m o y lc o a ：s h i k i m a t e h y d r o x y c i 蚴锄o y l n 彻s 胁s e ) 羟基肉桂酰辅酶a ：莽草酸羟基肉桂酰转移酶；f 5 h ( f e r u l i ca c i d5 - h y d r o x y l a s e ) 陋 魏酸5 羟基化酶；p a l ( p h e n y l a l a n i n ea m m o n i a - l y a s e ) 苯丙氨酸氨基裂解酶，s a d ( s i n a p y la l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ) 芥子醇脱氢酶1 3 1 起始反应1 3 1 1 苯丙氨酸解氨酶( p a l )苯丙氨酸解氨酶催化苯丙酸途径中第一步反应，即将苯丙氨酸脱氨基生成反式肉桂酸。p a l 与t a l 位于苯丙酸途径的入口，其中t a l 仪存在于禾草类植物中。t a l 催化酪氨酸直接生成香豆酸，p a l 催化苯丙氨酸脱氨生成肉桂酸，再经c 4 h 催化生成香豆酸，近年来发现玉米p a l 的c d n a 在e c o l i 中表达，同时具有p a l 与t a l 酶的活性。在禾草类植物中，p a l 活性也远比t a l 高，因此认为t a l 只起辅助作用【1 3 】。在苯丙烷代谢途径中，p a l 催化反应曾被认为是限速步骤，因为一些证据表明，抑制该酶及其基因表达会引起苯丙酸的积剥1 4 】。由于木质素牛物合成途径属于其代谢途径的一个分支，因此认为该酶控制木质素总量合成。然而a n t e r o l a 等【l5 】对松树悬浮细胞系的木质素单体合成机制的研究中发现，这些酶在木质素的生物合成途径中并非起限速作用。转基因研究结果证实，只有p a l 活性严重降低时才对木质素总量合成有影响，反之该酶活性升高，也不会引起木质素含量的大量增加，这些结果进一步证实p a l 在苯丙酸及木质素牛物合成途径中非限速酶【1 6 1 。1 312 肉桂酸稍基化酶( c 4 h )c 4 h 是肉桂酸向香豆酸转化过程中所需的酶。在该酶活性受抑制后，转基因植株木质素含量减少，植物生长无异常现象发生，s g i ：i , 值降低【1 7 1 引，且木质素中的s 型木质素含量减少。因此，g 型木质素可能存在另外的通路，或者c 4 h 可能与其他的酶形成多酶复合体来控制s 型木质素的形成。人们在对c 4 h 功能的研究中发现，在植物的生长发育过程中以及各种外界因子如激发子、真菌感染、机械损伤及化学诱导等刺激下，其编码基因m r n a 积累水平的变化趋势与p a l ，4 c l 趋于一致。对这三种酶编码基因的启动子序列进行分析发现，三个基因的启动子序列中具有一些共同的顺式作用元件【1 睨1 1 ，因此更加确定这些基因在转录水平遵循相似的调控模式。在此基础上，3人们推测这三种酶可能是以一种组装的多酶复合体( m e c ) 形式存在，发挥其功能。c 4 h 在其中起着结构支架作用，将多酶复合体固定到内质网上【2 2 】。1 3 2 羟基化反应1 3 2 1 香豆酸：纠至基化酶( c 3 h )c 3 h 实质上是一种p 4 5 0 单氧化物酶，最适催化底物是甲酰肉桂酯类化合物。在植物体内有许多同工酶，c 3 h 涉及的发生途径为：首先是肉桂酸经4 c l 催化生成肉桂酰辅酶a ；后在一种乙酰转移酶h c t ( 该酶具有羟基肉桂酰一辅酶a - 奎宁酸羟基肉桂酰转移酶c q t 和羟基肉桂酰辅酶a 一莽草酸羟基肉桂酰转移酶c s t 双重催化活性) 作用下，合成c 3 h 的催化底物羟基肉桂酰莽草酸和羟基肉桂酰奎宁酸【l3 1 ，h c t 属于可逆转酶类，可将c 3 h 的催化产物再进一步转换成咖啡酰一辅酶a 【1 4 1 ，进而参与木质素的整个生物合成途径，该途径的阐明对于正确认识木质素的合成与代谢机制有重要意义。1 3 2 2 阿魏酸5 - 羟基化酶( f s h )阿魏酸5 一羟基化酶( f e m l a t e 5 h y d r o x y l a s ，f 5 h 向来被认为是s 木质素合成的控制点，先前认为是在阿魏酸水平上发挥作用，后来的研究表明f 5 h 也在松柏醛和松柏醇水平上起催化作用【2 5 】。c h a p p l e - 等t 2 6 1 发现在f 5 h 活性缺失的拟南芥突变体中，仅含有微量的g 木质素。另外，将f 5 h 在该突变体中过量表达时，转基因植物中的木质素基本上都是由s 木质素组成的。由于s 木质素的单体为芥子醇，而芥子醇具有2 个甲氧基基团，无游离的c 一5 ，使得木质素缺少c c 连接而较疏松，易除去。因此，f 5 h 的超量表达是改变林木树种木质素生物合成的一种有效的手段。1 3 3 甲基化反应1 3 3 1 咖啡酸一0 l - 甲基转移酶( c o m t )c o m t 和f 5 h 均与s 木质素单体特异合成相关，可以说它们是s 木质素合成的限速酶。在大多数c o m t 抑制的转基因植株中，木质素含量变化不大，但也有个别转基因植株在c o m t 活性被抑制到足够低时，木质素含量减少【2 7 】。大量实验数据表明c o m t的甲基化反应可以在醛和醇的水平上进行，并且f 5 h 的催化产物5 一羟基松柏醛和5 一羟基松柏醇是c o m t 优先催化的底物【2 8 3 0 】，这些结果意味着c o m t 催化的反应除了在肉桂酸水平进行外，还可在醛和醇的水平上发生。对c o m t 底物催化特异性方面的研究进展，能更好地反映出c o m t 在木质素合成与代谢过程中的关系，便于更清楚地理解转基因植物和突变体中木质素合成途径所发生的各种变化。1 3 3 2 咖啡酰辅酶a - 甲基转移酶( c c o m t )c c o m t 是木质素合成中另外一个催化甲基化作用的酶，与c o m t 相比，c c o m t在木质素生物合成途径作用发现较晚，其主要催化羟基辅酶a 酯的甲基化反应，将咖啡酰辅酶a 转化成阿魏酰辅酶a 。最初人们在欧芹和胡萝卜的悬浮培养液中发现了该酶的活性，由于其活性受真菌激活子诱导，起初认为该酶的功能与植物的防御机制有4关，它可能参与细胞壁阿魏酸酯的形成【3 1 3 2 】。直到1 9 9 4 年y e 等【3 3 】在研究百日草离体叶肉细胞的木质化发生机制时，首次证实了c c o m t 参与木质素的生物合成，以后的实验证据表明，该酶在连翘、烟草、西红柿、苜蓿、大豆和火炬松等许多植物的木质化组织中表达【2 3 瑚】，并且在c c o m t 活性降低的转基因植物中，仅s 木质素含量降低，而g 木质素含量并无明显改变，由此确定了木质素生物合成途径存在另一种甲基化途径 3 9 4 0 。转基因研究证明抑制c c o m t 表达的转基因烟草【4 l 】与杨树 4 2 。3 】的木质素含量下降，这进一步证实了c c o m t 的功能。1 3 4 连接反应1 3 4 1 香豆酸辅酶a 连接酶( 4 c l _ )4 c l 是苯丙烷类代谢途径的最后一个酶，处于终端位置，通常以基因家族形式存在，其同工酶具有不同的底物特异性和时空表达特性，具有各自的生理功能。且能利用不同结构的羟基苯乙烯酸为底物，因此推测，4 c l 能利用活性不同的4 c l 同工酶来控制分配不同分支途径的碳流量，进入下游的不同分支途径】。目前人们多集中在与木质素生物合成相关同工酶类的功能研究，因为调节4 c l 的表达活性能有效地调节木质素的生物合成途径，有利于培育低木质素含量的造纸原料树种。1 3 5 还原反应1 3 5 1 肉桂酰辅酶a 还原酶( c c r )肉桂酰辅酶a 还原酶( e i n n a m o y l c o ar e d u c t a s e ，c c r ) 是木质素特异途径的第一个关键酶，可催化3 种羟基肉桂酸的c o a 酯的还原反应，生成相应的肉桂醛。目前己从蚕豆、云杉细胞培养物、杨树茎形成层汁液、桉树木质部中纯化出c c r 4 5 枷】，因此人们认为此酶可能对木质素合成途径的碳流具有潜在的调控作用，对木质素单体的生物合成起着重要作用。c c r 基因在植物中以单拷贝或多拷贝形式存在，在桉树、杨树、烟草、甘蔗和火炬松中仅存在一个拷贝，而在玉米、拟南芥中则以多拷贝形式存在，并且这些同工酶在植物中具有不同的生理功能，或与植物木质化进程相关，或参与植物对病菌的防御反应【47 1 。1 3 5 2 肉桂醇脱氢酶( c a d )c a d ( c i n n a m y la l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ) 参与木质素单体合成的最后一步还原反应，主要参与g 木质素合成调控过程。通常认为被子植物中g 和s 木质素的形成与肉桂醇脱氢酶( c a d ) 催化反应密切相关，该酶负责将c c r 还原的醛类中间产物进一步还原为木质素单体。c a d 己从许多植物中分离纯化【4 8 1 ，它的相应编码基因在许多植物中也是以单拷贝或基因家族形式存在，该酶的同工酶在不同植物中的催化特性有所差异。在抑制c a d 表达的转基因烟草中，醛醇比的变化大于s g e h 值，表明c a d 活性降低，脂质松柏醛还原相对强烈一些，因此推测c a d 可能具有底物选择亲和性或者存在不同的c a d 同工酶。但松树c a d - n l 突变体中，醛醇比与野生型相比没有明显差异【4 9 j ，5表明不同植物的c a d 催化活性不同。1 4 木质素基因工程研究进展木质素牛物合成的调控研究一直是牛命科学研究中的热点，对此人们开展了大量的工作，并取得了丰富的研究成果。人们发现，利用分子生物学手段调节木质素生物合成途径中关键酶的内源基因表达效率，可以有效调控合成酶的活性，进而达到调控转基因植物中木质素含量及组分的目的，根据木质素生物合成途径中不同酶的作用部位，可通过改变酶的活性来实现对木质素生物合成的调控，近年来通过转基因植物对木质素生物合成调控的研究主要表现在两个方面：其一是通过降低木质素生物合成途径中的一些酶的活性，调控木质素单体的合成以达到降低木质素总量的目的。其二是通过调节特定酶的活性来影响木质素的组成及化学结构，这些酶类表达对木质素单体的特异合成影响较大，决定了各种单体在木质素总量中的比例【5 0 1 。以下就对这两个方面中涉及的主要酶做一个简单的介绍。1 4 1 木质素总量合成的生物调控苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 位于苯丙烷代谢途径的入口，它催化苯丙氨酸脱氨生成肉桂酸，再经肉桂酸4 羟基化酶( c 4 h ) 催化牛成香豆酸。抑制p a l 表达的转基因植物的木质素含量下降，伴随非正常生长【5 1 1 。s e w a l t 等【5 2 】发现抑制p a l 表达的转基因烟草木质素含量降低，伴随着s g 比值升高，但转基因烟草的表型严重变形。而在转基因苜蓿和烟草中，c 4 h 酶表达受抑制后，植株木质素含量减少，植物无异常生长现象发生，且s g e k 值降低【5 3 5 5 】，这种结果与p a l 活性受抑制后s g l k 值升高的结论相矛盾。造成这种现象的原因可能是：( 1 ) 通向g 和s 木质素特异合成通道在很早的时期就已各自分开；1 2 ) c 4 h 对s 木质素的生物合成有着较强的调控能力，而g 木质素的途径也许可跨越c 4 h 的催化步骤；1 3 ) c 4 h 可能有一种特殊形式存在于酶复合体或其它代谢通道中，调控s 木质素的生物合成【5 7 1 。4 c l 是苯丙烷类化合物生物代谢总途径中的最后一个酶。是连接苯丙酸途径与木质素特异合成途径的关键酶，将羟基肉桂酸乙酰化生成羟基肉桂酰_ c o a 酯。l e e 掣5 5 】采用反义基因抑制拟南芥中4 c l 酶的活性，拟南芥中木质素的组成成分发生变化，g木质素单体含量显著减少，而s 木质素单体含量则没有变化，s g 比值升高，但转基因烟草的结果却与此不同，两种木质素都降低，s g 比值降低f 5 6 】【5 8 1 ，h u t 5 9 】等在转基因杨树中发现茎中木质素含量下降，s g = l 值不变，认为4 c l 催化的反应尚未出现s 与g 木质素带线流向的分支，不会影响s g 比值。三种转基因植物的研究结果并不一致，但抑制4 c l 的转基因植物的木质素含量均明显下降，表明该酶在木质素单体合成途径中为限速酶。k a j i t a 等 删对4 c l 活性下降的转基因烟草进行制浆实验，结果表明转基因株系木质素易去除，化学药品耗用量少，纸浆产量增加，可见4 c l 是：较为理想的用于改良造纸资源植物的目标基因。6c c r 是木质素生物合成途径中的还原酶，已有研究报道，抑制c c r 的植株木质素含量均降低，而且伴随一些非正常酚类物质的增a n t 6 1 螂】，部分转基因株系生长停滞，叶型卷缩，花期延长，导管变形，一些转基因株系的木质部呈褐色等，影响植株的生长发育。人们在对转反义c c r 的拟南芥超微结构观察时发现，其木质化的组织木质素含量减少，导管和束间纤维的次生壁结构松散幅度大，转基因植物易被酶消化。p i q u 锄a l 等畔】通过抑制烟草中c c r 基因的表达，得出转基因烟草的木质素无论是数量和质量上均发生了改变，木质素含量大幅度下降。c h a b a n n e s 等【6 5 】研究同样表明，将反义c c r 基因转入烟草中，木质素含量降低，c c r 基因表达受到抑制。对c c o m t 的分子调控的研究主要集中在烟掣4 1 】【6 7 】，苜蓿【6 8 1 和杨树6 9 7 0 】上。获得抑制c c o m t 表达的转基因植株，木质素含量明显降低，z h o n g 7 0 】等将反义c c o m t 转入杨树，也发现木质素含量明显下降，且结构疏松利于脱木质素，获得的转基因植株的生长发育正常。而p i n e o n 获得的植株发生了矮化的现象。但在转基因苜蓿则没有发现生长发育异常的现象。1 4 2 木质素单体特异合成相关酶的调控分子调控c a d 研究在苜蓿、杨树和烟草中取得了许多进展，反义抑制c a d 转基因烟草、苜蓿与杨树的木质素含量未明显降低，因此，许多学者认为在木质素生物合成中，c a d 并非限速酶。b a u c h e r 还对c a d 被抑制的转基因杨树进行了造纸制浆的实验，结果表明转基因杨树的k a p p a 值降低，说明抑制c a d 虽然没有降低木质素的含量，但改变了木质素的组成结构，有利于脱木质素的制浆化学工艺【硎 7 1 川】。过去对抑制c o m t 表达的转基因研究比较多，在大多数c o m t 受抑制的转基因植物中【7 “7 7 1 ，木质素含量变化不大，但也有个别转基因植物，当c o m t 活性抑制到足够低，木质素含量有所减少【7 8 】，l a p i e r r e 等 。7 9 】对c o m t 活性仪存1 0 的转基因杨树进行制浆实验，其木质素结构变得致密，在造纸中影响质量和漂白，故影响制浆效率。在木质素组成方面，s 型木质素有下降趋势，g 型木质素无明显变化，s g 值下降。在研究中发现，f 5 h 特异控s u s 木质素的合成。在f 5 h 活性缺失的拟南芥突变体中，仅含有微量的s 木质素，将f 5 h 置于c 4 h 启动子下游并在该突变体中过量表达，发现转基因植物中的木质素基本a s 木质素组成【8 0 1 ，同样将该基因导入正常植株中进行表达，也会使s 木质素含量增多，且使其在植物中的组织分布特异性消失【8 1 1 ，可见该酶是调控s 木质素合成的关键酶。f 5 h 对于植物木质素的组分改造很有意义，可能会提高s 木质素在木质素总量中的比例，对纸浆生产极为有利。目前没有报道这些转基因植株的生长发育出现异常。上述研究表明，c 4 h 、4 c l 、c c o m t 、f 5 h 、c c r 和c a d 是较为理想的用于造纸资源植物材性与品质改良的目标基因。但我们不应该忽略对其他问题的探讨，例如降低植物木质素含量是否有损于植物疏导和支持系统完整性的保持，植物是以何种补7偿机制维持其正常代谢，转基因效应引起植物发生怎样的超微结构变化，转基因植物能否经得住恶劣的自然环境的考验，转基因效应是否随着生长时期加长回归野生型状态以及这种趋势变化如何等等。1 5r n a i 机制和原理转基因沉默现象是n a p o l ic 等人1 9 9 0 年首次发现的【8 2 1 ，同年，v a n d e rk r o l 等人在矮牵牛中发现类似的现象【8 0 】。1 9 9 8 年，a n d r e wf i r e 等首次在线虫中发现基因转录后水平沉默现象是由d s r n a 引起的【8 l 】。随后的研究表明，r n a i 现象在各种真核生物如脉孢菌，植物，锥虫，水螅，涡虫，线虫，果蝇，斑马鱼以及小鼠，甚至在原核生物如大肠杆菌中都广泛存在8 3 棚7 1 。双链r n a 可以特异性地降解相应序列的m r n a ，从而特异性地阻断和抑制相应基因的表达，进而导致转录后水平的基因沉默【9 8 1 洲。随后的研究表明，r n a 干涉广泛存在于从真菌到植物、从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物中【1 0 1 1 。目前认为r n a 干涉的可能机制分为三步( 图1 2 )m r n a 降解产物图1 2r n a 干涉的可能分子机制i l 吲t h ep o t e n t i a lm o l e c u l a rm e c h a n i s mo f r n a i第一步：d s r n a 的形成。由于r n a 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因，细胞中出现双链r n a 分子【9 鲫7 1 。细胞d p d s r n a 的形成途径有多种，如基因组中d n a 反向重复序列的转录产物。同时转录反义和正义r n a 复制中间体和以单链r n a 为模板有细菌和病毒的r n a 依赖r n a 聚合酶( r d r p ) 催化合成d s r n a ，然而细胞是如何判定那些r n a 和d n a 是“异己 进而产生相应的d s r n a ，其机制尚不清划1 0 3 1 。第二步：s i r n a 的形成。在这个阶段，导入的d s r n a ( 通过直接注射、基因转座或病毒入侵) 被切割成大小为2 1 - - 2 3 个核苷酸的干涉r n a ( s i r n a ) 。s i r n a 也被称为“向导r n a s ( g u i d er n a s ) ”，它是3 末端有两个碱基凸出，5 末端为磷酸的双链r n a 。通过对果蝇的研究表明，该阶段需要消耗a t p ，同时也需要d i c e r 酶( 一种具有r n a a s em 活性的核酸酶) 的参与，特异地切害1 d s r n a 1 m 1 0 6 1 。然后，f l 了s i r n a 的反义链指导合成一种被称为r n a 诱导的沉默复合体( r n a i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ，r i s c ) 的核蛋白体。第三步：r n a i 的形成。由r i s c 介导切割目的m r n a 分子中与s i r n a 反义链互补的区域，从而实现干扰基因表达的功能【9 7 】。同时，s i r n a 可作为特殊的引物，在依赖于r n a 的r n a 聚合酶( r n a d i r e c t e dr n ap o l y m e r a s e ，r d r p ) 的作用下，以目的m r n a为模板合成d s r n a ，后者又可被降解为新的s i r n a ，重新进入上述循环【1 0 7 1 0 8 1 。因此，即使外源s i r n a 的注入量较低，该信号也可能迅速被放大导致全面的基因沉默。上述2 1 2 5 n t 的s i r n a ，可以很容易地从一个细胞传递到另一个细胞，实现远距离传输。在线虫中，也很容易穿过生殖腺，进入生殖细胞，传递到下一代【1 0 9 】。有目的地运用这种机制，人为地制造特异性基因沉默，就产生了r n a 干涉技术 1 1 0 1 。现在发展的r n a 干涉技术，用转基因法导入构建好的质粒，此质粒里含有靶基因序列的反向重复，且质粒表达受高效的特异启动子的控制。这种方法构建的转基因动物或转基因植株的优越性是【1 1 1 】：r n a i 效应可遗传。c h u a n g 等人【1 1 2 1 构建了可以在细胞内转录为双链r n a 的d n a 嵌合结构，利用农杆菌把此结构转化到拟南芥中，成功地利用r n a i 干扰作用证实了拟南芥中与花发育有关的基因的功能，并证明r n a i 在对应的转基因植物中是稳定的，并可传给后代。蓬) d s r n a 的表达受特异启动子的控制，可以有目的地在一定的时间内启动r n a i 。一些在动物发育过程中有关键作用的基因，如果在d n a 水平采