（外科学专业论文）β磷酸三钙涂层az31b镁合金成骨作用研究.pdf

l 2 4 5 5 实验结果1 1 讨论：18 结论- 2 0 四、参考文献2 1 五、本研究创新性的自我评价2 3 六、附录 综j 苤2 4 参考文献3 0 在学期间科研成绩3 3 致谢“3 4 个人简介3 5 中文论著摘要 p 磷酸三钙涂层a z 3 1 b 镁合金成骨作用研究 目的 研究i j - t c p 涂层a z 3 1 b 镁合金( p - t c p a z 3 1 b ，1 3 - t c p m g - 3 a i 一1 z n ) 材料降 解特性及其对成骨细胞的增殖、分化功能的影响。 方法 制备b - t c p a z 3 1 b 镁合金；m g 6 3 细胞与材料直接接触法体外培养；应用荧 光染色方法观察材料表面成骨细胞的粘附和增殖情况；i b - t c p a z 31 b 材料植入大 鼠股骨骨髓腔内，观测体内材料周围炎症反应和成骨效应：免疫组织化学染色法 检测材料周围骨组织中b m p 2 蛋白表达；观测金属材料表面微观结构及横截面积， 评价p - t c p a z 3 1b 的成骨作用及材料的降解特性。 结果 1 3 t c p a z 31b 镁合金与m g 6 3 细胞材料直接接触法体外培养7 2 小时， m g 6 3 细胞在材料表面粘附生长情况良好；植入大鼠体内后l 周，材料周围未见 明显炎症细胞浸润，并出现大量成骨细胞及新生骨组织；植入后4 周， i b - t c p a z 3 1 b 镁合金材料周围的新生骨组织与成熟骨组织无明显差别；植入后8 周，材料周围骨组织出现绒毛状改变，新生骨组织与和第四周时无明显区别；植 入后1 2 周时材料周围骨组织与8 周时无明显差别；植入l 周后，i ，- t c p a z 3 1 b 材料周围骨组织b m p 2 表达较a z 3 1 b 材料组明显增加。植入2 6 周时， 1 3 - t c p a z 3 1 b 在动物体内降解率为1 7 ，较a z 3 i b 材料( 3 3 7 0 ) 明显降低。 结论 b t c p a z 3 1 b 镁合会材料具有良好的细胞相容性。1 3 一t c p a z 3 1 b 镁合金 植入动物体内可控制材料周围炎症反应，促进材料周围骨组织生长，且具有良好 的骨整合性。b t c p 涂层可控制a z 3 1 b 镁合金基体在动物体内的降解。 关键词 镁合金，p 磷酸三钙，成骨细胞，增殖，骨形态发生蛋白2 ，降解 a b s t r a c t o b j e c t i v e m t oi n v e s t i g a t ec y t o t o x i c i t ya n db i o c o m p a t i b i l i t yo f1 3 - t c pc o a t e dm a g n e s i u ma l l o y ( 1 3 - t c p a z 31b ) i nv i t r o ，o s t e o g e n e s i sa n dd e g r a d a t i o nb e h a v i o ro fp - t c p a z 3 1bi n ，l v d m e t h o d s 1 3 - t c p a z 31bp l a t es a m p l e sa n d r o di m p l a n t sw e r em a d e t h ep l a t es a m p l e sw e r e c u l t u r e dw i t hh u m a no s t e o b l a s t l i k em g 6 3c e l ll i n e s t h er o di m p l a n t sw e r ei m p l a n t e d i n t ot h ef e m u ra n dm u s c l eo f r a t s t h eb i o c o m p a t i b i l i t ya n do s t e o g e n e s i so nt h es u r f a c e o fi 孓t c p a z 31bw e r et e s t e d t h eb o n ew e r ef i x e di n4 0 f o r m a l d e h y d es o l u t i o n ， d e c a l c i f i e di n15 e d t as o l u t i o nf o r3w e e k sa n de m b e d d e di np a r a f f i n t h e p a r a f f i n - e m b e d d e db o n es p e c i m e n sw e r eu s e df o rr o u t i n ep a t h o l o g i c a l e x a m i n a t i o n e a c hb o n es p e c i m e nw a sc o n s e c u t i v e l yc u ti n t o5 - l jm - t k c ks l i c e s d e p a r a f f i n i z e d s l i c e sw e r es t a i n e dw i t hh e m a t o x y i na n de o s i n ( h e ) s t a i n s ，a n de x a m i n e du n d e r m i c r o s c o p e t h es u r f a c em i c r o s t r u c t u r e o f1 3 - t c p a z 31b w a so b s e r v e dt h r o u g h s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) t h ed e g r a d a t i o nb e h a v i o ro f1 3 - t c p a z 3 1bi n v i v ow a se v a l u a t e d r e s u l t s m t ta s s a yr e v e a l e dt h a tt h ee x t r a c to f1 3 - t c p a z 31bw a sn o th a r m f u lt o t h e p r o l i f e r a t i o no ft h eo s t e o b l a s t s t h ec y t o t o x i c i t yg r a d eo fi 良- t c p a z 3 1bw a s0 t h e r e w a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e n1 3 - t c p a z 31ba n dt h eb l a n kc o n t r o lg r o u p ， s u g g s t i n gt h a tt h em a t e r i a lw a sa l m o s tf r e eo fc y t o t o x i c i t y i nt h ed i r e c tc o n t a c ta s s a y b yf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ，n os i d ee f f e c t sw e r ef o u n di nr e g a r dt ot h ec e l lg r o w t ha n d 2 c o n t r o l ( t i 一6 a 1 - 4 v ) n v i t r o , t h eh u m a no s t e o b l a s t - l i k em g 6 3c e l ll i n e ss h o w e ds i g n i f i c a n t l yg o o d b i o c o m p a t i b i l i t yo n t h es u r f a c eo f1 3 - t c p a z 31ba f t e r4 8 - h o u ri n c u b a t i o n n o i n f l a m m a t o r yc e l lw a so b s e r v e di nt h en e i g h b o rt i s s u es u r r o u n d1 3 - t c p a z 31br o d i m p l a n t s m a n yo s t e o b l a s t sa n dn e wb o r nb o n ea p p e a r e da f t e r 1w e e ki m p l a n t a t i o n c o m p a r e dw i t hn a k e da z 3 1b ，t h ed e g r a d a t i o no f1 3 - t c p a z 31bw a ss l o w e ra n dm o r e r e g u l a r i nt h e2 6 mw e e k ，a b o u t17 0 0 o fn a k e da z 3 1bw a sd e g r a d e dw h i l e2 0 6 8 o f1 3 - t c p a z 31bw a sd e g r a d e d c o n c l u s i o n f l - t c p a z 31b h a sg o o db i o c o m p a t i b i l i t ya n ds u c c e s s f u l l ya c c e l e r a t e sa d h e r e n c ea n d d i f f e r e n t i a t i o no fo s t e o b l a s t nv i t r o 3 - t c pc o a t i n gc a nc o n t r o lt h ei n f l a m m a t o r y r e a c t i o ns u r r o u n da z 31bm a t r i x nv i v o ，a c c e l e r a t et h en e wb o n ef o r m i n go nt h e s u r f a c eo f i m p l a n t si nt h ee a r l yp e r i o dp o s t i m p l a n t a t i o n ，h a sg o o do s t e o i n t e g r a t i o n ，a n d c o n t r o lt h ed e g r a d a t i o nr a t eo f a z 31bm a t r i x k e yw o r d s m a g n e s i u ma l l o y ；b e t a t r i c a l c i u mp h o s p h a t e ；o s t e o b l a s t ；p r o l i f e r a t i o n ；b m p 一2 ： d e g r a d a t i o n 3 英文缩略语 英文缩写英文全称 中文译名 h a 。h y d r o x y a p a t i t e 羟基磷灰石 b m p 2 b o b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n2骨形态发生蛋白一2 h e h e m a t o x y i na n de o s i n 苏木素一伊红 3 - t c p b e t a - t r i c a l c i u mp h o s p h a t e p - 磷酸三钙 t c p a z 31b p - t c pc o a t e dm a g n e s i u ma l l o yb 一磷酸三钙涂层a z 3 1b 镁合金 s e m s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e 扫描电镜 e d s e n e r g y - d i s p e r s i v es p e c t r o s c o p y 。能谱分析 m t t m e t h l t h i a z o l y l t e t r a z o l i u m 四甲基偶氮哗盐 4 论文 p 磷酸三钙涂层a z 3 1 b 镁合金成骨作用研究 刖吾 镁合金具有良好的力学性能，和天然骨一样的强度及弹性模量1 ，其在体内亦 可发生降解2 - 4 因此被选作为生物材料。然而，他们在体内表面活性低、降解过 快和由此而引起的力学性能的减弱限制了其临床应用5 。目前需要解决的问题是如 何改善材料表面活性、控制镁合金的降解，来保证在骨组织完全愈合之前，确保 材料力学性能的完整性。 。 许多的方法由此而生。用于合金的成分主要有锰，锌，钙，铝和稀土元素。 这些金属元素被证明能够增强镁合金的抗腐蚀性能及力学性能。虽然稀土元素也 能够增强镁合金的耐蚀性，但具有潜在的毒性。 合金虽然能够改善材料的耐蚀性，但不能明显改善早期骨组织对材料的反应。 体内研究a z 31 b 镁合金显示只有5 0 的材料能够与周围骨组织结合得紧密6 。无 机物占骨组织干重的6 5 7 0 ，其主要成分是钙与磷。据报道钙与磷在细胞的信号 转导中起重要作用7 。材料表面的钙离子具有活性功能，它可以促进蛋白质如纤维 蛋白，玻璃结合蛋白的粘附。这些都是细胞粘附促进蛋白，通过正电，化学和生 物作用，它们能够影响细胞在材料表面的粘附及扩展。研究显示，钙离子涂层钛 合金材料表面成骨细胞的数量及活性均比纯钛合金高。寻找一种由钙和磷构成的 涂层意义重大。b t c p 具有良好的稳定性，相对高的力学强度和合适的生物降解 率8 。应用于钛合金材料表面显示了良好的生物相容性。到目前为止，国内尚未发 现关于b t c p a z 3 1 b 体外生物活性、体内早期周围炎症反应和材料成骨作用的报 道。 材料与方法 一、材料的制备 1 、实验材料：1 3 t c p a z 3 1 b ，a z 3 1 b 及t i 6 a 1 4 v 体外实验样品均制成1 0 m m x 1 0 m m l m m 的长方体。m g 6 3 细胞株购自中国科学院上海细胞库，体内实验样 品均制成直径2 m m ，高度2 5 m m 的圆柱体。w i s t e r 大鼠购于中国医科大学动物 部。 二、实验所需试剂和仪器设备 d m e m 高糖培养基( 4 0 0 r a ml 谷氨酰胺) ( t h e r m o ，u s a ) 标准胎牛血清( 天津市灏洋生物制品科技责任有限公司) 0 2 5 胰蛋白酶( t h e r m o ，u s a ) 四甲基偶氮唑盐( m t t , s i g m a ，u s a ) 二甲基亚砜( d m s o ，国药集团化学试剂有限公司) 碘化丙啶( p i ，s i g m a ，u s a ) t r i t o n ( s i g m a , u s a ) 水合氯醛( 1 0 9 1 0 0 m l ，国药集团化学试剂有限公司) 福尔马林( 3 7 甲醛，国药集团化学试剂有限公司) 戊二醛( 2 5 ，国药集团化学试剂有限公司) 无水乙醇( 9 9 9 7 ，国药集团化学试剂有限公司) p b s ( 国药集团化学试剂有限公司) 二甲苯( 国药集团化学试剂有限公司) 石蜡( 国药集团化学试剂有限公司) 苏木素 伊红 多聚赖氨酸载玻片 h 2 0 2 大鼠抗人b m p 一2 抗体，即用型免疫组化s a b c 试剂盒( 武汉博士德生物公司) e d t a ( 1 0 ) ( 国药集团化学试剂有限公司) 电子天平( o h a u s ，u s a ) h i m a c c f 7 d 2 离心机( h i t a c h i ，j a p a n ) s h e l l a b c 0 2 细胞培养箱( s h l d o nm a n u f a c t u r i n gi n c ，u s a ) 微量振荡器( 江苏金坛医疗仪器厂) 超净工作台( 苏州安泰空气技术有限公司) 6 d z f 6 0 2 0 型真空干燥箱( 上海一恒科技有限公司) f i t c ( s i g m a ，u s a ) 正置荧光显微镜( o l y m p u s ，j a p a n ) 石蜡包埋机( t h e r m os h a n d o n 产地) 烤片机( t h e r m os h a n d o n 产地) d z f 一6 0 2 0 型真空干燥箱( 上海恒科技有限公司) s 3 4 0 0 n 扫描电子显微 石蜡包埋机( t h e r m os h a n d o n 产地) h i s t o c e n t r e2 切片机f i i le s s e3 2 5 电子天平b s 2 2 3 s ( s a r t o r i u s ) 三、实验过程 1 、m g 6 3 细胞传代培养 将复苏的m g 6 3 细胞接种于2 5 c m 2 培养瓶中，加入含1 0 标准胎牛血清、青霉 素1 0 0 u m l 、链霉素1 0 0i jg m l 的d m e m ( 高糖) 培养基进行培养，倒置显微镜 下观察细胞生长情况，待生长细胞铺满培养瓶底8 0 9 0 达近汇合水平时，进行 传代，实验用第5 代处于对数生长期的细胞。 2 、m t t 法测定细胞相对增殖率 ( 1 ) 材料浸提液的制备 灭菌处理后的的材料样品放入无菌试管，加入含1 0 胎牛血清的d m e m ( 高 糖) 培养基作为浸提介质( 按照i s o 相关标准规定样品厚度 o 5 1 0 r a m ，样品表 面积与浸提介质体积比例为3 c m 2 m 1 ) ，之后置于3 7 。c 培养箱中7 2 小时，即制成 1 0 0 材料浸提液( 原液) 。用浸提介质稀释原液制作7 5 、5 0 材料浸提液。 ( 2 ) 材料的细胞毒性测定 细胞和材料浸提液接触培养：将浓度为1 2 0 x1 0 3 m l 的细胞悬液加入9 6 孔培 养板( 5 0p1 孑 , - - 6 1 0 3 细胞孔) ，待细胞贴壁后吸出培养基，向其中分别加入1 0 0 、 7 5 、5 0 浸提液，每组材料每种浓度梯度做6 孔平行实验，另外6 孔加d m e m 培养基，作为空白对照。接触培养时间为4 8 小时。 细胞增殖率的测定：同上所述( 从加m t t 至测a 值) 。评价方法：计算出每 种材料各浓度组和空白对照组的a 值均值( n = 6 ) ，以空白对照组的a 值均值作为 1 0 0 细胞增殖率，则各浓度组的细胞增殖百分率( p r o l i f e r a t i o n ) 可依下式求出。 p = 各浓度组a 均值空白对照组a 均值10 0 按下表将各组材料7 5 浸提液浓 度组的p 转化为叫级细胞毒性。( 见表1 ) 结果评价标准：试验结果为o 级或1 级反应为合格；结果为2 级反映的，应结合细胞形态分析，综合评价：试验结果 为3 5 级反应为不合格。 表1 ，反应分级标准 3 、荧光染色观察材料表面细胞粘附生长 将环氧乙烷灭菌后的材料用p b s 冲洗2 次，置于2 5 c m 2 培养瓶中，每一培养 瓶置入一枚材料。其中荧光染色实验分4 组：b t c p a z 3 1 b 、a z 3 1 b 、t i 6 a 1 4 v 、 空白对照组，每组各2 枚样品。m g 6 3 细胞以5 1 0 4 m l 的密度接种子材料表面， 放入5 c 0 2 、3 7 培养箱中，2 4 小时换液1 次。 异硫氰酸荧光素( f i t c ) 1 0 m g 加入l m l 二甲基甲酰胺，再加入到1 0 0 m l p h 9 5 的n a 2 c 0 3 - n a h c 0 3 缓冲液中制成f i t c 工作液。取出与成骨细胞共培养4 8 小时 后的材料，p b s 冲洗2 次，置于1 2 孔板中，4 多聚甲醛常温下固定3 0 m i n ，弃多 聚甲醛，p b s 冲洗1 次，加入o 1 t r i t o n l m l 常温5 m i n ，弃t r i t o n ，p b s 冲洗1 次。 各孔加入f i t c 工作液常温下孵育l h ，p b s 冲洗3 次，超纯水沈1 次。超净工作台 中干燥3 0 m i n ，9 5 甘油封片，j 下置荧光显微镜下观察。操作均在暗处进行。 4 、t 3 t c p a z 3 1 b 的体内植入 ( 1 ) 大鼠麻醉：将水合氯醛( 浓度i o g 1 0 0 m 1 ) ，按照0 4 m l 1 0 0 9 腹腔注射。 ( 2 ) 在股骨粗隆外侧切丌皮肤，分离肌肉，暴露股骨粗隆，用直径为2 5 m m 的手术钻垂直打孔。将d = 2 m m ，h = 2 5 m m 的金属材料样品放入孔中。肌肉覆盖， 图l ( 3 ) 分别于植入后l 、4 、8 、1 2 、2 6 周取材。各批取材方法完全相同。 ( 4 ) 将大鼠麻醉后，分别从髋关节和膝关节处离断，取出整个股骨。将金属 材料样品直接从股骨取下。 5 、材料周围骨组织的取材 将取出的整个股骨放入2 0 0 , 4 福尔马林固定2 4 小时。1 0 e d t a 脱钙3 _ 4 周。 在材料植入区两边各0 5 r a m 处修整材料。梯度酒精脱水，二甲苯透明2 小时。浸 蜡2 小时。石蜡包埋。 6 、材料周围骨组织的h e 染色 将包埋后的骨组织切成厚度为3 微米的标本。然后将其在烤片机上烤4 0 分钟。 二甲苯脱蜡3 m i n 次x 3 次，无水乙醇洗去二甲苯l m i n 次3 次，9 5 酒精l m i n ， 7 5 酒精l m i n ，自来水洗2 m i n ，苏木素染1 5 r a i n ，自来水洗3 - 5 r a i n ，1 盐酸酒 精分化3 0s c c ，自来水洗3 - 5 r a i n 。伊红染1 0 m i n ，自来水洗3r a i n ，7 1 p , 4 酒精脱 水2 m i n ，9 0 * 4 酒精脱水2 m i n ，无水乙醇脱水2 m i n 次2 次，中性树胶封固。 7 、材料周围骨组织的免疫组化 将包埋后的骨组织切成厚度为3 微米的标本，用涂有多聚赖氨酸的载玻片捞 片。烤片2 h ，二甲苯脱蜡1 5 r a i n 次x 3 次，无水乙醇1 0 m i n 次x 2 次，9 0 0 , 4 酒精 5 m i n ，8 0 酒精5 m i n ，7 0 酒精5 m i n ，蒸馏水洗3 m i n 次x3 次，3 h 2 0 2 孵育 1 5 m i n , 以消除内源性过氧化物酶活性。蒸馏水3 m i n 次x 3 次，3 7 1 2 孵育箱内酶修 复2 0 r a i n ( 免疫组化提前画圈) 充分暴露抗原。蒸馏水涮一次，p b s 洗3 m i n 次x 3 次，滴加5 0 微升兔非免疫血清，室温下孵育1 5 分钟( 最后一张片加完后开始计 时) 。甩掉血清，每张片滴加一抗工作液约5 0 微升( 以完全覆盖住组织为主) ，4 1 2 9 ， 过夜。 从4 冰箱中取出湿盒，室温放置1 0 m i n 。p b s 洗3 m i n 次x3 次，每张切片 滴加生物素标记的二抗约5 0 微升，室温下孵育2 0 m i n ，p b s 洗3 m i n 次3 次， 滴加s a b c ，室温下孵育2 0 m i n ，p b s 洗5 m i n 次4 次，平放，d a b 显色( 随时 观察染色情况) 。自来水倒入湿盒中，冲洗后把切片插到切片架上，置于自来水中 浸泡几分钟，然后蒸馏水中水洗1 次。复染：将切片放入苏木素中染5 m i n 。自来 水冲洗后放入盐酸酒精中分化1 0 m i n 。自来水返蓝2 0 分钟。酒精脱水：7 0 酒 精3 m i n ，8 0 酒精3 m i n ，9 0 酒精3 m i n ，无水乙醇5 m i n 次x 2 次。 二甲苯5 m i n 次x 2 次，取出切片，擦干，加中性树胶封固，盖片。显微镜 下观察照相。对免疫组织化学照片进行光密度( o d 值) 分析。 8 、材料表面结构分析 体内取出的金属材料，p b s 冲洗三次，2 5 戊二醛固定4 小时，酒精脱水： 7 0 酒精3 m i n ，8 0 酒精3 m i n ，9 0 酒精3 m i n ，无水乙醇5 m i n 次2 次；真 空干燥箱中干燥6 小时，喷金后行扫描电子显微镜观察材料表面微细结构及表面 元素含量。 9 、统计学分析 采用s p s s1 5 0 软件包，数据均采用均数标准差( x s d ) 表示，应用单 因素方差分析法，p 0 0 5 ) ，从下表可以看出，1 3 - t c p a z 3 1 b 浸提液无毒性，没有对细胞 的增殖造成明显抑制。 表2m t t 评价i $ - t c p a z 3 1 b 对细胞增殖的影响( 吸光度) ( x + s d ，n = 6 ) p - t c p a z 3 1 b 与空白对照组相比，p 0 0 5 二、1 3 t c p a z 3 1 b 对材料表面细胞粘附与增殖的影响 金属材料与细胞共同培养4 8 小时后，1 3 - t c p a z 3 1 b 表面细胞胞浆及细 胞核染色较深，粘附、生长良好、无明显坏死细胞；a z 3 1 b 材料表面无细胞 生长；t i 6 a 1 4 v 材料表面有细胞生长，但其中夹杂着黄色坏死细胞。这说明 1 3 - t c p 促进了1 3 - t c p a z 3 1 b 材料表面细胞的粘附、生长与增殖。 表3 1 3 - t c p a z 3 1 b 的细胞毒性评价 图2b t c p a z 3 1 b 、a z 3 1 b 、t i 6 a 1 4 v 及空白对照组细胞生长良好，而 a z 3 1 b 组表面细胞形态欠佳，细胞固缩，反光明显一细胞均为死细胞。 三、b t c p a z 3 1 b 材料大鼠体内的炎症反应和成骨作用 植入后第l 周，b t c p a z 3 1 b 材料周围即可出现一些骨样组织及大量成骨细 胞，此时我们并没发现任何炎症细胞；但对于a z 3 1 b ，大量问充质干细胞出现， 其中夹杂着个别淋巴细胞。第4 周时，b - t c p a z 3 1 b 材料周围的新生骨组织与成 熟骨组织无明显差别；而a z 3 1 b 材料周围此时刚刚出现新生骨组织及些许成骨细 胞。第8 周时，b - t c p a z 3 1 b 材料周围骨组织出现绒毛状改变，新生骨组织与和 第四周时无明显区别；a z 3 1 b 组材料周围则出现大量软骨细胞。第1 2 周结果与 第8 周无明显差别。 1 2 乞碜 ， ， 事 n 。- l j ，? i 一广 1 一 i 瓢 n r 一、。 f ：! l ， j ， t l ， i i 盟鼍 7 l r 毒n ： r ：，：、 s ：二。 譬：一一弋 l ：_ i 麓雕! 、，姑，。 n 、渔巴2 ：、 孰 卜i 奠、 套 睁? ：f 、 。 i 。、弋t ， i 帆 j昏 tk 、 翰 麓 善 + ：； 二鼍。+ 一 、p t ： 1 飞 盐k 皿 a - d ：a z 3 1 b ， a - i 周，b - 4 周，c - 8 周，d - 1 2 周 e - h ：b - t c p a z 3 1 b ， e - 1 周，f - 4 周，g - 8 周，h - 1 2 周 i - h 图3 t i 6 a 1 4 v ， i - i 周， j 4 周， k - 8 周，1 - 1 2 周 大鼠体内植入材料的炎症反应和成骨作用( h e 染色) 1 3 f一p。 t ， ， 幸 ， 、 l t t 静一。，“、分瓣罐 筇喏 。a：、， 、r。 叩 v心，、t畔畦s 、。 。：一 、 、f，_ 、l 、 _ 广g k9，；：；tke 四、9 t c p ，a z 3 l b 对材料周围骨组织b m p - 2 表达的调节作用 b t c p a z 3 1 b 材料植入w i s t a r 大鼠l 周后，其周围骨组织b m p - 2 染色较深， 和对照组a z 3 1 b 及t i 6 a 1 4 v 相比，差异明显；植入4 周时，染色较淡，植入8 周、1 2 周时，无明显变化，和对照组a z 3 1 b 及t i 6 a 1 4 v 相比，差别无明显意义。 ! ，_ 、7 4 、0“，。一_ 。_ ，： 一、 ，- 。 、 。 。，7 i 。 、。 。、j0 1 离。、 ： - ! 、! 、j ，： 周 、 4一：一! j y 、 j ， 。 ： “ 。o ，f j 0 一 ， ，： ，青 。 一 一 4 周j i j ! j | j ：i ij；l。j：三0：；jj_。!i|、i4 01， 或。哆 一、 ? 7 ji ，_ ， 、：，： 一 、 ”“萄? ；，。 ：7 i ，。彬一+ 毒 - 鼍。，、| ， 石 r ， 材料植入w i s t a r 大鼠体内第1 周时，所有材料周围b m p - 2 表达m o d 值均较 高，但1 3 - t c p a z 3 1 b 材料周围骨组织表达更高，和a z 3 1 b 及t i 6 a 1 4 v 材料周围 骨组织相比，差异明显。植入4 、8 、1 2 周时，所有材料周围骨组织b m p - 2 表达 均下降，b t c p a z 3 i b 与a z 3 1 b 及t i 6 a 1 4 v 周围骨组织相比，差别无明显意义。 1 4 0 1 4 0 1 2 0 1 当0 0 8 毒 o 0 6 盘 睾0 0 4 o 0 2 0 l481 2c 周) 图5 ，b t c p 促进体内a z 3 1 b 周围骨组织b m p 2 表达 五、b t c p a z 3 1 b 材料的生物活性 植入后第l 周，1 3 t c m 忆3 1 b 材料表面即出现蛋白样物质粘附，此时材料表 面微细结构尚可清晰；而a z 3 1 b 材料表面除了在干燥过程中出现的大量裂隙之 外，并无细胞及蛋白的粘附。第4 周，1 3 - t c p a z 3 1 b 材料表面出现大量钙化结晶 矿物质，而a z 3 1 b 材料表面仅见些许蛋白及红细胞。第8 周，b t c p a z 3 1 b 材 料表面出现降解产物及沉积物；而a z 3 1 b 材料表面则覆盖一薄层蛋白。第1 2 周， b t c p a z 3 1 b 材料表面与第8 周并无差别；a z 3 1 b 材料表面与1 3 - t c p a z 3 1 b 材 料表面无明显差别。 a - d ：a z 3 l b ， i 1 - t i 6 a 1 4 v ， h - ! 。1 2 w a - 1 周，周，e - 8 周，d - 1 2 周 争1 周，“周，g - 8 周，h - 1 2 周 i - 1 周， j - 4 周，k - 8 周，l 一1 2 周 图6b - t c p a z 3 1 b 材料的生物活性观测( 材料表面电镜扫描) 六、金属材料表面钙磷代谢 材料植入w i s t a r 大鼠1 2 周之内，b - t c p a z 3 1 b 材料表面的钙磷的含量是逐 1 6 渐下降的，降低的原因可能是材料表面1 3 t c p 的降解不断被周围组织成骨利用； 1 2 周之后无明显变化，原因可能是材料表面1 3 t c p 的降解与体内沉积到材料表面 的钙磷达到了平衡。而a z 3 1 b 材料表面钙磷的含量是逐渐上升的，这说明材料表 面有钙磷的沉积，并且随着时间的延长是逐渐增多的：1 2 周之后也不会不明显， 这说明体内材料表面钙磷的沉积与成骨对于钙磷的利用达到了平衡。 图7 大鼠体内金属材料表面钙磷含量变化规律 七、b t c p a z 3 1 b 材料体内的降解特性 金属材料植入w i s t a r 大鼠体内1 周时，所有材料横截面积几乎无任何变化。 植入2 6 周后，b t c p a z 3 1 b 材料周围发生了些许降解，而a z 3 1 b 材料则发生明 显降解，横截面积极不规则。植入2 6 周时，1 3 - t c p a z 3 1 b 在动物体内降解率为 1 7 ，较a z 3 l b 材料( 3 3 7 ) 明显降低。由此可以看出，b t c p 可以延缓a z 3 l b 材料的降解。 l 周时，a - a z 3 1 b ，b - - b t c p _ a z 3 1 b ，c - n 6 砧4 v ， 2 6 周时，d - a z 3 1 b ， e - 1 3 一t c p a z 3 1 b ，f - t i 6 a 1 4 v 图81 3 t c p a z 3 1 b 材料体内的降解特性( 材料的横截面扫描电镜图) 讨论 镁合金作为生物可降解植入材料，降解速率过快，释放大量气体及缺乏较长 时间力学完整性限制了其临床应用。钙和磷是天然骨组织无机物中的主要成分， r f a m e t ye ta l8 体外实验证明i $ - t c p 具有良好的力学性能及合适的降解速率。在 本实验中用b - t c p 作涂层。 作为一种生物材料，良好的细胞相容性和细胞活性是材料应用的基础。本实 验中m g 6 3 细胞在侈- t c p a z 3 1 b 镁合金表面粘附和增殖好于a z 3 1 b 镁合金及 t i 6 a 1 4 v 。这说明f l - t c p 涂层具有良好的细胞相容性和细胞活性。 作为一种生物降解材料，当其植入动物体内时，气体的产生是不可避免的。 w i t t ee ta l2 报道镁合金植入动物体内1 周时开始出现气泡，第2 3 周后消失。等 人报道植入后1 月发现气体产生。w i r ee ta l9 也报道多孔镁合金a z 9 1 d 植入兔子 股骨髁后膝关节周围出现气体样腔隙。但是，本实验全过程中，所有材料周围组 织中没有发现任何气泡。这可能是我们实验材料太小，或者产生的气体在体内具 1 8 在植入后第一周，1 3 - t c p a z 3 1 b 镁合金材料周围没有任何淋巴细胞浸润。这说明 1 3 - t c p a z 3 1b 具有良好是组织相容性。 早期成骨作用对于骨科植入材料来说非常重要。骨发生包括成骨细胞的粘附， 增殖，分泌和骨基质的形成。由于钙磷是无机骨组织中的主要成分，许多钙磷复 合物被用作涂层来改善体内植入材料的生物活性。人们将羟基磷灰石应用于钛合 金表面来改善其骨引导性1 0 - 1 2 。动物体内实验显示含有羟基磷灰石涂层的多孔钛 合金，和涂层多孔钛合金材料相比，骨长入率明显增加1 3 。用透钙磷石，磷酸八 钙和羟基磷灰石处理过的钛合金材料具有更好的生物活性1 4 - 1 6 0 本实验中h e 染色 及免疫组织化学b m p 2 染色均说明1 3 - t c p 涂层具有良好是生物活性并且促进骨 材料交界处早期骨的发生。i b - t c p a z 3 1 周围第一周新生骨组织和大量成骨细胞的 募集，以及材料表面有机蛋白的出现，证明1 3 - t c p 涂层促进了早期骨的发生。第 四周，材料周围骨组织与成熟骨组织基本上无明显差别。材料表面吸附蛋白较无 层组明显增加。这可用以下机制解释：1 ) 多孔j 3 - t c p 涂层非常适合成骨细胞在其 表面粘附，生长，增殖。2 ) 细胞外钙离子浓度的增加刺激了成骨细胞和破骨细胞 的生物活性1 7 。材料周围较高浓度的钙离子刺激成骨细胞增殖分化，而抑制破骨 细胞介导的骨吸收硌。3 ) 镁离子的释放速度减慢，也刺激了成骨细胞的增殖。 生物材料的表面结构对骨材料整合非常重要。b - t c p a z 3 1 b 材料第8 周 及第1 2 周骨材料界面出现的绒毛状组织。其形成机制可能是新生骨组织长入疏 松多孔b - t c p 内形成。这说明1 3 - t c p a z 3 1 b 具有良好的骨整合性。 b m p 一2 是t g f1 3 2 超家族成员之一，在常规骨骼发育和骨折愈合过程中起 着重要作用，它能够活化与细胞转移，增殖和分化有关的转录因子。我们实验结 果发现1 3 t c p a z 3 l b 材料周围骨组织中b m p 2 表达，在第l 周较对照组差异明 显。这说明t c p 涂层在植入早期具有良好的骨引导性。b m p 2 与细胞膜表面特 殊受体s e r i n e t h r e o n i n ek i n a s e 结合，使l 型a n di i 型受体形成复合物，转化信号进 入s m a d s 途径r s m a d s 离开细胞膜进入细胞，与c s m a d s 结合成复合物进入 细胞核。在细胞核中d n a 结合蛋白的作用下，s m a d s 多具体复合物作用于特殊 1 9 促进了骨的生成和矿化。 合适的降解速率是可降解生物植入材料应用于临床的关键。钙磷涂层不仅能 够改善材料表面上生物学活性，而且还能保护材料基体免受外界环境的快速腐蚀。 c u i 报道钙磷涂层( 包括羟基磷灰石，磷酸八钙，和磷酸二钙结晶) 能够保护a z 3 1 b 在3 o n a c i 溶液环境中免受其快速腐蚀1 9 。也有研究报道电镀羟基磷灰石涂层 能够明显降低a z 9 1 d 镁合金在仿生液中的降解速率2 1 。p - t c p 涂层早期能够隔离 a z 3 1 基体与体液。体外实验证明1 3 - t c p 能够早期降低纯镁的降解速率2 2 。本实验 中，1 3 - t c p a z 3 1 b 与a z 3 1 b 在第二十六周时的降解速率差别明显。这可通过以 下解释：1 ) 1 3 - t c p 在植入早期像保护层一样对a z 3 1 基体起到保护作用；2 ) 1 3 - t c p 涂层早期良好的成骨作用使其早期周围形成大量新生骨，骨组织含水量较其他组 织低；3 ) p t c p 涂层转变成更加结实稳定的h a 相2 3 。 总之，本实验证实了p - t c p a z 3 1 b 在体内及体外均具有良好的生物相容性 及骨引导性，并且能够降低基体a z 3 1 b 的降解速率。本实验成果为进一步评估 1 3 - t c p a z 3 1 b 临床应用的可靠性提供了理论依据。 结论 1 1 3 t c p a z 3 1 镁合金材料具有良好的细胞相容性，并且对成骨细胞生 长、增殖有促进作用。 2 1 3 t c p a z 3 1 镁合金植入动物体内促进材料周围骨组织生长，具有良 好的骨整合性。 3 b t c p 可控制a z 3 1 b 镁合金基体在动物体内的降解。 2 0 参考文献 1 s t a i g e rm p , p i e t a ka m ，h u a d m a ij ，d i a sgm a g n e s i u ma n di t sa l l o y sa so r t h o p e d i c b i o m a t e r i a l s ：ar e v i e w b i o m a t e f i a l s2 0 0 6 ；2 7 ：17 2 8 - 3 4 2 w i t t ef k a e s evh a f e r k a m ph ，s w i t z e re ，m e y e r - l i n d e n b e r ga ，w i r t hc j ，e ta 1 i nv i v o c o r r o s i o no ff o u rm a g n e s i u ma l l o y sa n dt h ea s s o c i a t e db o n er e s p o n s e b i o m a t e r i a l s2 0 0 5 ；2 6 ： 3 5 5 7 6 3 3 w i t t eef i s c h e rj ，n e l l e s e nj ，c r o s t a c kh - a ，k a e s