（微生物与生化药学专业论文）绿脓杆菌seca+atpase抑制剂筛选模型的建立和应用.pdf

独创性声明 l i i l l l | 1 1 1 1 1 1 1 | l l l l l l 删删i l y 1 7 7 5 5 8 0 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名： 壬丐 签字日期：矽f ，o 年月4 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解j 匕塞协塑医堂瞳有关保存、使用学位论文的管理 办法。有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权j 蔓塞协塑医堂瞳可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 壬字导师签名：名7 苷、) 影 签字日期：加f o 年6 月午日签字日期： p 年多月牛日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 北京协和医学院硕士学位论文目录 目录 摘要3 a b s t r a c t 4 缩略语表5 前言6 实验材料8 一、菌株8 二、质粒8 三、培养基8 四、主要试剂和试剂盒1 0 五、 主要溶液的配制1 1 六、分离介质1 3 七、主要仪器13 实验方法1 5 一、 p e t 2 0 b 仞口s 酬6 8 ，p e t 3 0 a 仞傩p 叫m 丐质粒的构建1 5 二、重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达1 9 三、 目的蛋白的纯化2 2 四、酶活性检测2 4 五、绿脓杆菌s e c a a t p a s e 抑制剂酶水平筛选模型的建立和应用2 6 六、绿脓杆菌s e c a a t p a s e 抑制剂细胞水平筛选模型的应用3 l 七、化合物阳性样品对p a s e c a n 7 5 酶活抑制作用量效关系初探3 2 八、发酵液阳性样品中活性组分的初步分析3 2 实验结果一3 3 一、原核表达载体的构建3 3 二、绿脓杆菌p a s e c a n 6 8 和p a s e c a n 7 5 蛋白的表达3 4 三、 重组蛋白的纯化3 7 四、p a s e c a 全酶、p a s e c a n 6 8 、p a s e c a n 7 5 的酶活性比较3 9 五、针对化合物样品酶水平筛选模型的建立与应用孔雀绿比色法4 0 六、针对发酵液样品酶水平筛选模型的建立与应用- n a d h 比色法4 3 七、绿脓杆菌s e c a a t p a s e 抑制剂细胞水平筛选模型的复筛结果5 0 八、活性化合物样品对p a s e c a n 7 5 酶活抑制作用量效关系的初探5 l 九、发酵液阳性样品中活性组分的初步分析5 2 讨论5 4 结论5 7 参考文献5 8 1 院硕士学位论文目录 6 ( ) 7 7 2 北京协和医学院硕士学位论文 中文摘要 摘要 绿脓杆菌是一种重要的院内感染条件致病菌。它可以引起多种类型的感染，并 多为天然耐多种抗生素菌株，感染后不易被控制。近年来，由于广谱抗生素的大量 使用以及药物的联合治疗，导致了多药耐药株以及泛耐药株的急速出现。因此，迫 切需要发现新型低毒、高效抗绿脓杆菌药物。 s e c ( s e c r e t i o np a t h w a y ) 途径是细胞蛋白质转运中的主要途径，s e c a 是s e c 途 径中唯一己知的能量转化酶，可通过水解循环驱使蛋白质前体穿过细菌内膜，是细 菌所独有且不可缺少的。因此，本研究选择s e c a 为药物的靶点并建立相应的药物 筛选模型，以期发现新型高效低毒的抗绿脓杆菌药物。 本研究首先克隆和表达了p a s e c a n 6 8 ( 绿脓杆菌s e c a 蛋白n 端6 0 9 个氨基酸 残基组成的片段，大小约6 8 k d a ) 和p a s e c a n 7 5 ( 绿脓杆菌s e c a 蛋白n 端6 4 5 个 氨基酸残基组成的片段，大小约7 5 k d a ) 蛋白并研究其酶学性质。选择酶活较高的 p a s e c a n 7 5 作为靶酶，建立和优化了两种绿脓杆菌s e c a a t p a s e 抑制剂酶水平筛选 模型。采用孔雀绿比色法筛选了3 2 2 0 个化合物样品，得到4 个阳性样品；采用n a d h 比色法筛选了7 1 9 6 个发酵液样品，得到6 6 个阳性样品。随后，又运用细胞水平绿 脓杆菌s e c a a t p a s e 筛选模型，对上述阳性样品进行了复筛，最终确定了3 个阳性 化合物样品和6 个阳性发酵液样品，这些样品在酶水平和细胞水平对绿脓杆菌s e c a a t p a s e 均有较好的抑制作用，为进一步发展新型抗绿脓杆菌药物奠定了基础。 关键词：绿脓杆菌、s e c a 蛋白、抑制剂筛选、酶活 北京协和医学院硕士学位论文 英文摘要 a b s t r a c t a p “( ，d 所d 疗伽 口p ，z g 伽d 阳 i so n eo ft h em a i n o r g a n i s m sr e s p o n s i b l e f o r d 1 1 j g r e s i s t a n tn o s o c o m i a li n f e c t i o n sa n di sal e a d i n gc a u s e0 fb a c t e r e m i aa n dn o s o c o m i a l p n e u m o n i a i na d d i t i o nt ob e i n gi n t r i n s i c a l l yr e s i s t a n tt os e v e r a la n t i m i c r o b i a la g e n t s ，尸 口p ，昭砌d 阳o r e na c q u i r e sm e c h a n i s m so fr e s i s t a n c et 0o t h e ra n t i b i o t i c s i nr e c e n ty e a r s ， a st h ee x t e n s i v eu s eo fb r o a ds p e c t r u ma n t i b i o t i c sa n dc o m b i n a t i o nt h e r a p y ，m u l t i d r u g r e s i s t a n ts t m i n sa n dp a n - r e s i s t a n ts t r a i n sh a v er a p i d l ye m e 唱e d t h u s ，t h e r ei sau 唱e n t n e e dt od e v e i o pa n t i p s e u d o m o n a ld r u g sw i t hn e wl o wt o x i c i t ya n dh i g he 侬c a c y t h em o s to fs e c r e t e dp r o t e i n sa r ee x p o r t e db ys e ct r a n s i o c a s e ( s e c r e t i o np a t h w a y ) s e c aa t p a s ei st h ep r e p r o t e i nt r a n s l o c a s en a n o m o t o rt h a tu n d e 唱om e m b r a n ei n s e r t i o n a n dd e i n s e r t i o nt od r i v ep r e p r o t e i na c r o s st h eb a c t e r i a li n n e rm e m b r a n e ，w h i c hi su n i q u e a n di n d i s p e n s a b l et ob a c t e r i a t h e r e f o r e ，s e c aa t p a s ei sas u i t a b l et a r g e tf o rt h e d e v e i o p m e n t o fa n t i m i c r o b i a ld r u g s i n t h i sw o r k t h en - t e r m i n a lf i r s t6 0 9a n d6 4 5a m i n oa c i d so f p j p “d b ， d 刀口s d p ，z 曙砌d s 口s e c aw e r ee x p r e s s e di ne c o l i ，r e s p e c t i v e i y ，b o t ho fw h i c hc o n t a i n st h e a t p a s ed o m a i no fs e c a r e s u l t i n gp r o t e i n s ，t e r m e da sp a s e c a n 6 8a n dp a s e c a n 7 5 w e r ep u r i f i e d u s i n g a na 衔n i t y c h r o m a t o g r a p h y a l t h o u g h b o t hp a s e c a n 6 8a n d p a s e c a n 7 5f h n c t i o n e d ，t h el a t t e ro n ew i t hh i g he n z y m i ca c t i v i t yw a su s e dt oe s t a b l i s h s c r e e n i n ga s s a y sf o rs e c aa t p a s ei n h i b i t o r s a r e re s t a b “s h m e n ta n do p t i m i z a t i o no f s c r e e n i n ga s s a y ，ap r i m a 叮s c r e e n i n gw a sp e r f o r r n e dw i t hc o m p o u n d sl i b r a 呵a n d m i c r o b i a if e r m e n t a t i o nc o l l e c t i o ni no u ri n s t i t u t c 4o u to f3 2 2 0c o m p o u d sa n d6 6o u to f 7l9 6m i c r o b i a if e r m e n t a t i o ns a m p l e sw e r ei d e n t i 6 e da sp r i m a 叫h i t ，u s i n gm a l a c h i t e c o l o ra s s a ya n dn a d hc o l o ra s s a yr e s p e c t i v e l y t bc o n n r mt h eh i t sf r o mt h ep r i m a 可s c r e e n i n g ，ac e l l - b a s e ds e c aa c t i v i t ) ，a s s a yw a s u s e dt oa s s e s st h e i ri n h i b i t o 叮e f r e c t 加v f v d r e s u l t ss h o w e dt h a t3c o m p o u n d sa n d6 m i c r o b i a lf e r n l e n t a t i o ns a m p i e si n h i b i t e de n z y m i ca c t i v i t yo fs e c a 加v 所切a n di m p a i r e d i t sn l n c t i o n 砌， ，d k e yw o r d s ：n p z 面m d ”傩础，增咖d 蹰s e c aa t p a s e ，i n h i b i t o rs c r e e n ，e n z y m ea c t i v i 够 4 北京协和医学院硕士学位论文 缩略语表 英文缩写 a t p a d p m a m p k a n p c r i p t g s d s s d s p a g e t r i s t e m e d d t t n a d h p e p p m s f o d k d 叩m h i s t a g m i n 缩略语表 英文全称 a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e a d e n o s i n ed i p h o s p h a t e m o l l a m p i c i l i i n k a n a m y c i n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n i s o p r o p y i p - t h i o g a i a c t o p y r a n o s i d e s o d i u md e d e c y ls u l f a t e s d s - p o l y a c 呵l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s t r i h y d m x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e n ，n ，n ，n - t e r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e d i t h i o t h r e i t o l n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e p h o s p h o e n o l p y r u v i ca c i d p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e o p t i c a ld e n s i 妙 k i l o d a l t o n r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e h i s t i d i n e - t a g m i n u t e 5 中文全称 三磷酸腺苷 二磷酸腺苷 摩尔每升 氨苄青霉素 卡那霉素 聚合酶链式反应 异丙基一p d 一硫代半乳糖苷 十二烷基硫酸钠 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 三羟甲基氨基甲烷 四甲基乙二胺 二硫苏糖醇 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 磷酸烯醇式丙酮酸 苯甲基磺酰氟 光密度 千道尔顿 转每分钟 组氨酸标签 分钟 北京协和医学院硕士学位论文前言 * 士 日l j青 铜绿假单胞菌( 觑砌历d 刀傩口p r 喇刀d s 口) ，又名绿脓杆菌，是假单胞菌属中的 代表菌种。绿脓杆菌是一种非发酵革兰氏阴性细菌，其营养要求不高，广泛分布于 医院内各种环境。它可以引起多种类型的感染，如菌血症、肺炎、腹内感染、伤口 感染、烧伤感染、尿路感染等。由于其外膜通透性低并存在着外排多种物质的主动 外排系统( a c t i v ee 用u xs y s t e m s ) ，因此多为天然耐多种抗生素菌株，感染后不易 被控制。绿脓杆菌对有并发症、使用插入式导管、进行外科手术后的病人感染力特 别强。研究显示，医院i c u ( i n t e n s i v ec a r eu n i t ) 超过6 0 的死亡病例都与绿脓杆菌 感染相判m 】。绿脓杆菌通过感染病人，其毒力可以显著增强；甚至能引起健康人体 的败血症、心内膜炎、脑脊髓膜炎、胸膜炎、盆腔炎、肾炎、胰腺炎等。综上所述， 绿脓杆菌是一种重要的院内感染条件致病菌，尤其在烧伤、外科手术后呼吸道感染 中占有重要地位。目前的临床治疗策略包括广谱抗生素的使用( 如氟喹诺酮类、氨 基糖苷类、碳青霉烯类、三代头孢菌素) 和革兰氏阴性菌选择性药物的使用( 如氨 曲南和哌拉西林) 【6 ，7 1 ，近年来又推出了p 内酰胺类抗生素和氨基糖苷类或者氟喹诺 酮类的联合治疗。但是，广谱抗生素的大量使用以及药物的联合治疗导致了多药耐 药株以及泛耐药株的急速出现。近年来，除了多尼培南【5 l 没有新的抗绿脓杆菌药物 入市。因此，迫切需要发现新型低毒、高效抗绿脓杆菌药物。 从成千上万个微生物代谢产物或其它来源的天然产物中筛选所需的抗菌药物 是非常艰难的一个过程。目前开发新型有用的天然产物药物，虽然仍有很大的潜力， 但研究工作的难度越来越大，耗时越来越长，需要的资金也越来越多。为摆脱筛选 的盲目性，提高效率，有必要进行定靶筛选，从细菌生存所必须的组成成分或者临 床有效抗生素的作用机理和细菌的耐药机理来设计筛选模型，有目的地筛选具有某 种作用机理的抗生素，试图获得抗菌作用强、对耐药菌有效、毒性小的新抗生素。 蛋白质的翻译是在细胞质中进行的，但大约有2 5 3 0 的蛋白质必须穿过细 胞内膜运送到周质或分泌到细胞外才能发挥它们正常的功能【引。细胞中含有多种蛋 白质转运的途径【9 1 ，其中最主要的途径被称之为分泌途径( s e c r e t i o np a t h w a y ) ，简 称s e c 途径【1 0 】。s e c a 是一种a t p a s e ，称为s e c 途径中的“动力泵 。该酶是s e c 途 径中唯一已知的能量转化酶，可通过水解循环驱使蛋白质前体穿过细菌内膜，已有 研究者发现其在转运过程中的结构变化i l 。研究显示在非允许温度下，温度敏感型 琥珀突变大肠杆菌b l 2 1 1 9 中的胛州基因不能表达s e c a 蛋白质，细菌不能生长， 表明它对细菌的生存是必需的【2 0 j 。真核细胞的s e c 系统中不存在对应的具有a t p 酶活性的组分，而是由热休克蛋白b i p 来完成与s e c a 相似的功能【1 2 】。因此s e c a 是 细菌所独有且不可缺少的。因此，特异性地抑制s e c aa t p a s e 活性的化合物不仅能 6 北京协和医学院硕士学位论文 抑制蛋白的转运和分泌，从而产生抗菌作用，而且很可能对真核细胞的毒副作用非 常小。目前，已有研究者通过虚拟筛选的方法得到了首个针对大肠杆菌s e c aa t p a s e 的抑制剂【1 3 j ，但是尚未有针对s e c a a t p a s e 抑制剂的大规模、实质性筛选工作，也 尚未发现针对绿脓杆菌s e c aa t p a s e 的抑制剂。 本研究在原核表达系统中表达出具有良好催化活性的p a s e c a n 7 5 蛋白，并利用 该重组蛋白建立并优化了酶水平的绿脓杆菌s e c aa t p a s e 抑制剂体外高通量筛选模 型。运用该模型对本所化合物库、发酵液库样品进行筛选，经过3 次生物学重复， 共得到化合物阳性样品4 个、发酵液阳性样品6 6 个。本研究同时将绿脓杆菌s e c a a t p a s e 抑制剂细胞水平筛选模型【1 7 】作为复筛模型，将初筛得到的阳性样品并对酶 水平筛选得到的阳性样品进行细胞水平的复筛，最终得到3 个化合物阳性样品和6 个发酵液阳性样品，为进一步发展新型抗绿脓杆菌药物奠定了基础。 北京协和医学院硕士学位论文 实验材料 实验材料 一、菌株 1 大肠杆菌菌株d h 5 0 l ，本实验室保藏。 2 b l 2 1 ( 加e 3 ) ，本实验室保藏。 3 b l 2 1 19 陋刊( 口聊p 印p 即，( 俐) z c 厅? j 砌j 帆叫? ? 倒c 勿彳j j 勋刀 ，由佐治亚州立 大学生物系t a i 博士惠赠。 4 b l 21 19 p e t 2 0 b 仞a s p 叫( p ) ：高效表达绿脓杆菌s e c a 蛋白的温度敏感型大肠 杆菌表达宿主细胞b l 2 1 1 9 ，为本实验室构建并保藏。 5 b l 2 1 1 9 p e t 2 0 b ( c ) ：携带p e t 2 0 b 空质粒的温度敏感型大肠杆菌b l 2 1 1 9 ，为 本实验室构建并保藏。 6 野生型绿脓杆菌( p a 0 1 ) ，为本实验室保藏。 二、质粒 1 p e t 2 0 b ，本实验室保藏。 2 p e t 3 0 a ，本实验室保藏。 三、培养基 1 l b 液体培养基： 酵母粉 胰化蛋白胨 n a c l 加水至终体积 调p h 至7 2 2 l b 固体培养基： 酵母粉 胰化蛋白胨 n a c l 琼脂 加水至终体积 调p h 至7 2 3 y m 斜面培养基： 酵母粉 麦芽粉 8 克 0 克 0 克 升 5 克 1 0 克 1 0 克 l8 克 l 升 4 克 1 0 克 ! ! 室垫塑垦兰堕塑主堂垡垒茎 壅竺塑整 葡萄糖 琼脂 加水至终体积 调p h 至7 2 4 放线菌a 1 培养基： 葡萄糖 麦芽膏 棉子饼粉 淀粉 酵母膏 k 2 h p 0 4 州h 4 ) 2 s 0 4 c a c 0 3 n a c l 加水至终体积 调p h 至7 2 4 克 1 8 克 l 升 5 克 1 0 克 1 0 克 2 0 克 5 克 0 5 克 5 克 3 克 1 克 l 升 5 放线菌a 2 培养基： 葡萄糖 5 克 酵母膏5 克 牛肉膏5 克 大豆蛋白胨5 克 黄豆饼粉1 0 克 淀粉2 0 克 玉米浆4 克 c a c 0 14 克 c o c l 2 ( o 0 0 2 溶液) l 毫升 加水至终体积 l 升 调p h 至7 2 6 1 0 x t a b u 腩r ： k 2 h p 0 4 7 0 克 k h 2 p 0 4 3 0 克 洲h 4 ) 2 s 0 4 1 0 克 柠檬酸钠 4 7 克 加水至终体积l 升 7 5 0 葡萄糖溶液( 过滤消毒或1 0 磅消毒) o 北京协和医学院硕士学位论文实验材料 8 t a 固体培养基： 胰蛋白胨 n a c l 1 0 t ab u l j f e r 琼脂 加水至终体积 调p h 至7 0 9 t a 液体培养基： 胰蛋白胨 n a c l 1 0 t ab u f r e r 加水至终体积 调p h 至7 0 1 0 s 培养基： 蛋白胨 牛肉膏 琼脂 加水至终体积 调p h 至8 o 四、主要试剂和试剂盒 试剂或试剂盒名称 质粒小量快速提取试剂盒 d n a 胶回收试剂盒 q i aq u i c kg e le x t r a c t i o nk i t p i e r c e b c ap r o t e i na s s a vk i t p y r o b e s td n a 聚合酶 p f ud n a 聚合酶 限制性内切酶、t 4d n a 连接酶 a m p 、k a n i p t g 溴酚蓝 d n a 分子量m a r k e r 蛋白分子量m a r k e r 孔雀绿 l o 1 0 克 5 克 1 0 0 毫升 1 4 克 l 升 1 0 克 5 克 0 0 毫升 l 升 5 克 3 克 1 4 克 l 升 生产企业 北京全式金生物技术有限公司 美国q i a g e n 公司 l h e r m os c l e n 。i 。i f i c 宝生物工程( 大连) 有限公司 北京全式金生物技术有限公司 宝生物工程( 大连) 有限公司 m e r c k 公司 宝生物工程( 大连) 有限公司 a m r e s c o 公司 北京全式金生物技术有限公司 北京全式金生物技术有限公司 a m r e s c o 公司 北京协和医学院硕士学位论文 实验材料 钼酸铵 t r i t o nx 10 0 丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶 p e p n a d h a t p 、a d p a c i t o so r ( j a n i c s f a r c oc h e m i c a l 美国s i g m a 公司 美国s i g m a 公司 a m r e s c o 公司 美国s i g m a 公司 五、主要溶液的配制 ( 一) 抗生素溶液： 1 氨苄青霉素储液( 10 0 m m i ) ： l g 氨苄青霉素固体溶于1 0 m l 双蒸水中，过滤除菌后分装成小份。 工作浓度：1 0 0 p g m l 2 硫酸卡那霉素储液( 4 0 m m i ) ： o 8 9 硫酸卡那霉素固体溶于2 0 m l 双蒸水中，过滤除菌后分装成小份。 工作浓度：4 0 嵋m l ( 二) 琼脂糖凝胶电泳相关溶液： 1 5 0 t a e 溶液： t r i s2 4 2 9 ，乙酸5 7 1 m l ，0 5 me d t a ( p h8 o ) 1 0 0 m l ，去离子水定容至1 l 。 2 1 琼脂糖凝胶： 琼脂糖1 9 溶于l t a e 溶液1 0 0 m l ，混合后加热溶解，按5 p l 1 0 0 m l 的比例 加入g o l d e nv i e w ，倒入制胶模块，冷却后即可使用。 ( 三) s d s p a g e 相关溶液： 1 3 0 储备胶溶液( 2 9 ：1 ) ： 丙烯酰胺2 9 0 9 ，亚甲双丙烯酰胺1 o g ，去离子水溶解，定容至1 0 0 m l 。 2 分离胶缓冲液储液( 1 5 mt r i s - h c lp h8 8 ) ： t r i s1 8 1 7 9 ，去离子水溶解，浓h c l 调p h8 8 ，定容至1 0 0 m 1 。 3 浓缩胶缓冲液储液( 1m t r i s h c lp h6 8 ) ： t r i s1 2 1 1 9 ，去离子水溶解，浓h c l 调p h6 8 ，定容至1 0 0 m l 。 4 1 0 s d s ： s d s1 0 9 ，去离子水溶解，浓h c l 调p h7 2 ，定容至1 0 0 m l 。 5 1 0 电泳缓冲液( p h 8 3 ) ： t r i s3 0 2 9 ，甘氨酸1 8 8 9 ，1 0 s d s1 0 m l ，用去离子水定容至1 0 0 m l 。 6 1 0 过硫酸铵： 1 1 北京协和医学院硕士学位论文实验材料 l g 过硫酸氨，用去离子水定容至1 0 m l 。 7 2 s d s 电泳上样缓冲液： l m t r i s - h c l ( p h6 8 ) 1 0 m l ，2 0 m l 甘油，4 9s d s ，3 1 9d t t ，l m g 溴酚蓝， 加去离子水至1 0 0 m l 。 8 t e m e d 原液：置于4 ，避光保存。 9 考马斯亮蓝染色液 0 2 5 9 考马斯亮蓝g 2 5 0 ，2 2 5 m l 甲醇，4 6 m l 冰醋酸，2 2 5 m l 去离子水。 l o 脱色液： 1 0 0 m l 冰醋酸，3 0 0 m l 甲醇，6 0 0 m i 去离子水。 ( 四) 蛋白纯化相关溶液： 1 裂解缓冲液( t k m d ) ： 1 0 m mt r i s o a c ，p h7 6 ，5 0 m mk c l ，1 0 m mm g o a c ，l m md t t 。 2 上样( 清洗) 缓冲液( b i n d i n gb u f f e r ) ： 2 5 m mt r i s ，5 0 0 m mn a c l ，5 0 m m 咪唑，浓h c l 调p h 至7 8 3 洗脱缓冲液( e l u t i o nb u f f e r ) ： 2 5 m mt r i s ，5 0 0 m mn a c l ，3 5 0 m m 咪唑，浓h c l 调p h 至7 8 4 蛋白保存缓冲液： 2 5 m mt r i s ，浓h c i 调p h 至7 8 ( 五) 酶活性检测相关溶液： l 、孔雀绿比色法检测液1 1 4 i 1 ) 酶反应缓冲液：置于4 保存。 o 5 mt r i s - h c i ，o 2 mk c l ，0 2 mn h 4 c i ，l0 m md t t ，2 0 m mm g ( o a c ) 2 2 ) 颜色试剂：置于室温保存。 a 孔雀绿：0 4 5 孔雀绿( 2 2 5 m g 加去离子水至5 0 0 m 1 ) b 钼酸铵：4 2 钼酸铵溶解至4 nh c i ( 8 4 9 钼酸铵和8 0 m ll o n 盐酸稀释至 2 0 0 m 1 ) c 将a 和b 按3 ：l 混合并过滤，然后加入t r i t o n x 1 0 0 ，至终浓度0 1 。 3 ) 2 0 m ma t p 储液：1 0 0 m ma t p 储液稀释5 倍使用，置于2 0 保存。 4 ) 3 4 柠檬酸钠溶液：置于4 保存。 将3 4 9 柠檬酸钠用去离子水溶解，定容至1 0 0 m l 。 2 、n a d h 比色法检测液 1 ) 2 h e p e s 储液：2 0 0 m mp h 调至7 8 2 ) 2 0 m g c l 2 储液：2 0 0 m m 1 2 北京协和医学院硕士学位论文 实验材料 3 ) 5 0 m n c l 2 储液：1 0 0 m m 4 11 0 0 m m a t p 溶液 5 ) 1 0 0 p e p 储液：1 0 0 m m 6 ) 1 0 0 n a d h 储液：1 0 0 m m ( 六) 其他溶液： 1 i mi p t g 溶液： 2 3 9i p t g 用去离子水溶解， 存。 2 a t p 储液 o 5 5 l g a ”用去离子水溶解， 除菌，分装一8 0 储存。 定容至l o m l 。0 2 2 m 滤膜过滤除菌，分装储 定容至1 0 m l ，浓度1 0 0 m m 。0 2 2 岬滤膜过滤 六、分离介质 h j s t r a p t mh p 镍离子亲和层析柱g eh e a l t h c a r c h 汀r a p r mp h e n y l s e p h a r o s ef a s tf l o wlm l 疏水层析柱g eh e a l t h c a r e h i t r a p 啪d e a ef fl m i 弱阴离子交换层析柱g eh e a l t h c a r e p d 10 脱盐柱( s e p h a d e x t mg 2 5 ) g eh e a l t h c a r e m i l l i p o r e 超滤管3 00 0 0 l a 七、主要仪器 蛋白电泳仪 漩涡振荡混合器 高速低温离心机 微量高速离心机 超声细胞粉碎机 电子分析天平 电子p h 计 低温冰箱 无菌工作台 微量加样器 低温恒温水浴箱 h z q q 恒温摇床 紫外可见分光光度计 高压灭菌锅 b i o r a d 公司 v o r t e x 公司 s i g m a 公司 长沙湘仪离心机仪器有限公司 上海新芝科学仪器公司 上海精科天平 t h e i 讣，i o 公司 s a n y o 公司 苏州安泰空气技术有限公司 g i l s o n 公司 无锡上佳生物技术有限公司 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 a m e r s h a m 公司 s a n y o 公司 1 3 实验材料 床 b m gp o l a r f l u o s t a rg a l a x y 多功能分析 测试仪 a m e r s h a m 公司 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 北京市六一仪器厂 北京市六一仪器厂 北京市六一仪器厂 1 4 北京协和医堂堕堡主堂垡丝奎 壅型堕i l _ _ _ _ - _ _ - _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。一 实验方法 p e t 2 0 b 仞船p 删，p e t 3 0 a 仞嬲p 叫万质粒的构建 目的基因的获得 1 1 引物的合成 根据绿脓杆菌p a 0 1j p 叫基因序列分别设计合成了上、下游引物。引物序列如 下( 引物由上海生工合成) ： p 口s p c i 6 8 j 匕访 5 g a ga t at a 竖垒丝! g 嗽i ) tt t gc g c c t tt g3 _ 游5 垒垒g 丛( 肋行di i i ) a c ag c g c c tt c at g a3 p 口s p 叫乃：上游5 g a ga t a 魄坐鳇( 黻i ) t 鸭c g cc t t 呜3 下游5 垒垦g 璺丛( 胁门di ) c a gt t gc t tg c gg a3 1 2p c r 反应 以绿脓杆菌p a o l 基因组d n a 为模板，通过p c r 方法分别扩增出目的基因片 段。p c r 反应体系如下： p n s e c a n 6 8 ： 模板( p a o l 基因组d n a )1 山 上游引物( 2 0 p m )l 肛l 下游引物( 2 0 p m )l p l 2 p f um i x t u r e 2 5 l 无核酸酶d d h 2 02 2 “l 总体积5 0 l p n s e c a n 7 5 ： 模板( p a 0 1 基因组d n a )l “l 上游引物( 2 0 p m )1 “l 下游引物( 2 0 p m )l p l 2 p f um i x t u r e 2 5 i 无核酸酶d d h 2 02 2 l 总体积5 0 山 1 5 北京协和医学院硕士学位论文实验方法 p c r 反应条件如下： 9 5 预变性 5m i n 9 5 变性4 5 s 1 5 4 退火 4 5 s l 3 0 个循环 7 2 延伸 2 om i n i 7 2 延伸1 0m i n 。 p c r 反应结束后，将p c r 扩增产物在l 琼脂糖凝胶上进行分离，之后进行胶 回收纯化扩增产物。 1 3 d n a 片段的回收( 按照q i a q u i c kp c rp u r i f i c a t i o nk i t 说明书操作) 1 ) 割胶，置于一干净e p 管中，称重。按1 0 0 m g 1 0 0 “l 加入较重3 倍体积的 b u f r e rq g ； 2 ) 5 0 ，1 0 m i n 使胶全溶，每2 3 m i n 将e p 管上下颠倒混匀； 3 ) 胶完全溶解后，混合液变为黄色，将其加入到q i a q u i c k 柱中以结合d n a ， 1 5o o o g 离心1 m i n ，弃去流出液； 4 ) 加o 5 m lb u f f e rq g ，1 50 0 0 g 离心1 m i n ，弃去流出液； 5 ) 加o 7 5 m lb u 侬rp e ，静置2 5 m i n ，l50 0 0 g 离心lm i n ，弃去流出液； 6 ) 1 50 0 0 g 离心l m i n ，彻底出去残留的p e ； 7 ) 将吸附柱置一干净离心管中，再柱中央加入3 0 5 0 le b ( 预热6 0 ) ，室温 静置1 m i n 。1 30 0 0 甲m 离心l m i n ，洗脱d n a ，2 0 保存。 2 克隆载体的构建 2 1 p c r 产物末端加a 反应 由于高保真d n a 聚合酶扩增得到的p c r 产物为平末端，没有3 突出的a ， 因此需要用t a q 酶对p c r 产物进行加a 处理。 加a 过程： 经纯化的平末端d n a 片段 1 5 “l 加a 反应液4 l l i t a q 酶( 2 5 u “1 )l “l 总体积 2 0 i 7 2 反应3 0 m i n 。 2 2 加a 尾的p c r 产物与p g e m t 载体相连 加尾的p c r 产物与p g e m te a s y 载体按摩尔比3 ：1 1 0 ：l 的比例在t 4d n a 连接 酶的作用下进行连接。 反应体系如下： 1 6 北京协和医学院硕士学位论文实验方法 2 r a p i dl i g a t i o nb u f f e r p g e m - t v e c t o r p c rp r o d u c t s t 4d n a i i g a s e t o t a lv o i u m e 5 “l l 斗l 3 l l “l 1 0 “l 连接反应条件：4 链接1 2 1 6 小时，或室温链接l 小时。 连接后的重组质粒命名为t 巾傩p 鲥6 8 ，t p 伽p 鲥乃。 2 3d h 5 q 感受态细胞的制备 1 ) 取冻存的e c o “d h 5 c 【在l b 固体培养基上划线，3 7 过夜培养。 2 ) 挑取单菌落，接种于1 0 0 m ll b 液体培养基中，3 7 ，2 0 0 叩m 振荡培养至o d 6 0 0 值0 3 0 4 。 3 ) 将菌液转移到冰预冷的5 0 m l 离心管中，冰浴1 0 m i n 。4 ，4 1 0 0 r m i n 离心 1 0 m i n 。 4 ) 倒出培养液，倒置离心管以除尽残留的培养基。每5 0 m l 初始培养液用3 0 m l 预冷的0 1 m o l l 的c a c l 2 重悬每份细胞沉淀。4 ，4 1 0 0 r m i n 离心1 0 m i n 。 5 ) 倒出重悬液，倒置离心管以除尽残液。每5 0 m l 初始培养液用2 m l 预冷的 0 1m o i l 的c a c l 2 重悬每份细胞沉淀。 6 ) 加入等量5 0 甘油，混匀，使其终浓度为2 5 ，2 0 0 l 每管分装后放入8 0 冰箱保存。 2 4 质粒的转化和蓝白筛选 1 ) 从8 0 冰箱取出一管d h 50 c 感受态细胞，置冰上融化，加入1 0 p l 连接产物， 轻轻混匀，冰上放置3 0 m i n 。 2 ) 4 2 热激9 0 s ，然后迅速转移至冰上冷却2 m i n 。 3 ) 向e p 管中加入8 0 0 “i 不含抗生素的l b 液体培养基，将e p 管至于摇床上，3 7 1 2 0 r p m 孵育l h 。 4 ) 将孵育后的菌液取l0 0 2 0 0 山均匀涂布于含l0 0 州m ia m p 的l b 平板上( 平 板事先混合有2 x g a l4 0 “l 和l mi p t g7 肛1 ) ，置于3 7 培养箱内培养1 6 2 4 h 。 2 5 转化子的质粒提取 1 ) 从蓝白筛选的平板上挑取白色转化子接种于含相应抗生素的l b 液体培养基 中，3 7 2 0 0 r p m 培养】2 】6 h 。 2 ) 取所得菌液l 4 m l ，1 00 0 0 9 离心l m i n 收集菌体，弃去培养基。 3 ) 加入2 5 0 p lr e s u s p e n s i o nb u f f e r ( 含r n a s e a ) ，重悬菌体。 4 ) 加入2 5 0 “il y s i sb u f f e r ，温和地上下颠倒混合4 6 次，使菌体充分裂解，形 成透亮的溶液( 5 m i n ) 。 1 7 北京协和医学院硕士学位论文 实验方法 5 ) 加入3 5 0 in a t u r a l i z a t i o nb u 艉r ，轻轻颠倒混合4 6 次，直至形成紧实的凝 集块，室温下静置2 m i n 。 6 ) 1 50 0 0 9 离心1 0 m i n ，小心转移上清液至d n a 吸附柱中。1 50 0 0 9 离心1 m i n ， 弃去流出液。 7 ) 向吸附柱中加入6 5 0 p l