（植物病理学专业论文）大豆豆荚炭疽病的病原鉴定及其防治.pdf

摘要 浙江省是全国鲜食大豆主要生产和冷藏基地。鲜食大豆品种“台湾7 5 ”因 其品质好，产量高，于1 9 9 4 年从台湾引入我省栽培，是外商指定的唯一用来出 口的品种，且目前还没有可替代的品种。从2 0 0 1 年夏开始，浙江省鲜食大豆主 栽品种“台7 5 ”豆荚上严重发生类似机械损伤的黄褐色“锈斑”，一般田块株发 病率为5 0 左右，豆荚发病率为3 0 左右，重病田块株发病率达9 0 以上，豆荚 发病率达5 0 以上，严重影响了豆荚的商品性及其经济价值。 经病原菌的分离、鉴定与致病性试验表明，引起黄褐色“锈斑”的病原菌为 c o l l e t o t r l c h u mf ，泖 懈( s c h w e i n ) a n d r u s w d m o o r e 用分离到的菌 株x s t o i 接种“台7 5 ”豆荚，引起二种类型的症状，一种是条状不规则形斑， 即类似机械损伤斑；另一种是圆形炭疽病斑，从二种病斑上分离到形态、r d n ai t s 序列与长度一致的病原菌。同样的病原菌在不同的大豆品种上，引起的主要症状 是不同的，条状不规则形病斑主要发生在“台7 5 ”豆荚上，供试的其余6 个品 种圆形斑占多数，有的品种如青酥2 号、引豆9 7 0 1 ，只是偶尔可见条状不规则 形病斑。本研究结果证明，误认为是机械损伤的黄褐色“锈斑”，是由打 蝴 引起的，是大豆炭疽病的一种症状类型，据我们所知。对大豆炭疽病不规则形病 斑的研究在国内是首次，也是首次对大豆炭疽病的症状与病原进行详细研究。 研究明确了影响大豆豆荚炭疽病发病严重程度的相关因子主要为温度和湿 度以及降雨量，在大豆始花、结荚、鼓粒时期温度偏高，将加重发病的程度：鼓 粒期的高湿天气，整个生育期的多雨天气，是该病重发的主要因子。 筛选出防治有效的杀菌剂，明确了防治适期，形成了一套系统的防治技术， 即适当调整播种期，使感病的生育期尽可能避开适温高湿影响，在病害一般发生 年份( 大豆开花结荚期雨水偏少年份) ，在始花期和盛花期各施药一次；在严重 发病年份( 大豆开花结荚期雨水偏多年份) ，宜在始花期、盛花期和鼓粒初期各 施药一次，相当于间隔7 天连续防治3 次；以7 0 甲基托布滓w p 为首选药剂， 与2 5 保鲜克e c 、4 3 好力克s c 、6 0 百泰d c 、1 0 世高w g 、2 0 好靓w p 等轮换使用。 关键词：炭疽病，形态学鉴定，i t s 序列，防效，发病因子 a b s t r a c t z h e j i a n gp r o v i n c e ，w h i c hh a sb i g g e s tp l a n ta r e ao fv e g e t a b l es o y b e a n ，i st h e b i g g e s tp r o d u c ea n dp r o c e s sb a s eo fv e g e t a b l es o y b e a ni nc h i n a t a i w a n 7 5 ，w h i c hi s g o o dq u a l i t ya n dh i g hy i e l d ，w a st r a n s f e r r e da n dp l a n t e df r o mt a i w a nt oz h e j i a n g p r o v i n c ei n1 9 9 4 ，a n dw a st h eu n i q u ev a r i e t yr e q u i r et oe x p o r tb yf o r e i g nm e r c h a n t u pt ot h ep r e s e n t ，t h e r ei sn oo t h e rv a r i e t yc a nr e p l a c et h et a i w a n 7 5 i nt h es u m m e ro f 2 0 0 1 ，ak i n do fb r o w ns t r i a l i k el e s i o n ，m u c hl i k em e c h a n i c a ln i c k ，w a so b s e r v e do n t h ep o d so fv e g e t a b l es o y b e a nt a i w a n 7 5 ，w h i c hw a st h el e a d i n gv a r i e t yp l a n t e di nt h e z h q i a n gp r o v i n c e ，t h er a t e so fd i s e a s e dp l a n t sa n di n f e c t e dp o d sw e r e5 0 a n d3 0 i nt h ef i e l do na v e r a g e ，i nt h es e r i o u sd i s e a s e df i e l d ，w h i c hcanb em o r et h a n9 0 a n d 5 0 ，s ot h ep o d s m e r c a n t i l ew o r t hw a ss e r i o u s l ya f f e c t e d i s o l a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o no fp a t h o g e na n dp a t h o g e n i c i t yt e s t ss h o w e dt h a t ，b r o w n s t r i a l i k el e s i o nw a sc a u s e db yc o i l e t o ，j c h u l nt ，u n c a t u m ( s c h w e i n ) a n d r u s w d m o o r e i s o l a t ex s t 0 1w a si s o l a t e df r o md i s e a s e dp o d s t h e r ew e r e2t y p e so f s y m p t o m o nt h et a i w a n 7 5 sp o d s ，w h i c hi n o c u l a t e dw i t hx s t 0 1 ，o n et y p ei ss t r i a l i k e a n di r r e g u l a rl e s i o n s ，a n dt h eo t h e rt y p ei sr o u n db l o t c h ，t h ep a t h o g e n si s o l a t e df r o m t w ot y p e so fs y m p t o m s ，h a v es a m em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r sa n dr d n ai t s s e q u e n c e s t h es a m ep a t h o g e no nt h ed i f f e r e n ts o y b c a nv a r i e t i e s ，h a v ed i f f e r e n t s y m p t o m s ：s t r i a l i k ea n di r r e g u l a rl e s i o n sw e r em a i n l yo nt h et a i w a n 7 5 ，o nt h eo t h e r 6t e s t e dv a r i e t i e s ，r o u n db l o t c h e sw e r em a i n l ys y m p t o m s o nt h es o m e v a r i e t i e s ，s u c h a sq i n s h u 2 h a o ，y i n d o u 9 7 0 1 ，t h e r ew e r ef e ws t r i a l i k ea n di r r e g u l a rl e s i o n sb ef o u n d o n t h e m t h er e s u l to fo u rs t u d ys h o w e dt h a t ，t h eb r o w ns t r i a l i k el e s i o n s ，w h i c he v e rw e r e m i s t a k e nf o rm e c h a n i c a ln i c k ，w e r ec a u s e d b yc t r u n c a t u i j a n dw e r eo n e s y m p t o mt y p eo fs o y b e a na n t h r a c n o s e t oo u rk n o w l e d g e ，t h i si st h ef i r s tt i m e r e s e a r c ha b o u tb r o w ns t r i a l i k el e s i o n s a n da l s oi st h ef i r s tt i m er e s e a r c hi nd e t a i l a b o u tp a t h o g e n sa n ds y m p t o m so fs o y b e a na n t h r a c n o s e i t i ss u r et h a tt h em a i nf a c t o r s ，w h i c ha f f e c td i s e a s ei n d e x e so fs o y b e a np o d a n t h r a c n o s e ，w e r et e m p e r a t u r e ，h u m i d i t ya n dr a i n f a l l e t c h i g ht e m p e r a t u r ei nt h e v p h a s eo ff l o w e r i n g , f r u i t i n g a n d p o d p l u m p i n g ，h i g hh u m i d i t y i nt h ep h a s eo f p o d - p l u m p i n g ，t h eh i g hr a i n f a l li nw h o l eo fp h a s e so fs o y b e a ng r o w i n g ，w i l ll e a dt oa h i g hd i s e a s ei n d e x w h a t st h ee f f e c t i v ef u n g i c i d ef o rp r e v e n t i o na n dc o n t r o lw a sf o u n do u t ，w h a t st h e a v a i l a b l et i m ef o rp r e v e n t i o na n dc o n t r o lw a sm a k e nc l e a r a n df o r m e sas e to f s y s t e m a t i cc o n t r o lt e c h n i q u e s n a m e l y , a d j u s t i n gt h es e e d t i m ep r o p e r l y , t om a k et h e p e r i o do fd u r a t i o nw h i c hs o y b e a nu s u a l l yg o ts i c ka v o i dt h es u i t a b l et e m p e r a t u r ea n d h i g hh u m i di n f l u e n c ea sf a ra sp o s s i b l e a tt h ey e a rw h e n d i s e a s ec o m m o n l yo c c u r r e d ( t h ey e a rw i t hf e wr a i n yd a y sa tf l o w e r i n ga n dp o d d i n gs t a g e so fs o y b e a n ) ， f u n g i c i d ew a sa p p l i e de a c ht i m ei nb l o o m i n ga n df u l lb l o o m i n gp e r i o d ；a tt h ey e a r w h e nd i s e a s es e v e r e l yo c c u r r e d ( t h ey e a rw i t hl o t so fr a i n yd a y sa tf l o w e r i n ga n d p o d d i n gs t a g e so fs o y b e a n ) ，f u n g i c i d ew a sa p p l i e de a c ht i m ei nb l o o m i n g ，f u l l b l o o m i n ga n dp o ds e t t i n gp e r i o d ，i tm e a n sa p p l yf u n g i c i d e3t i m e sc o n t i n u o u s l yi n e v e r yw e e k ；t a k et o p s i n m7 0 w e a s t h ef i r s tc h o i c em e d i c a m e n t ，a n dt a k et u r n st o u s e2 5 b a ox i a nk e e c ，4 3 h a ol ik e s c ，6 0 b a it a i d c ，1 0 s h ig a o w g2 0 h a ol i a n g w pa n ds oo n k e yw o r d s ：a n t h r a c n o s e ，m o r p h o l o g i c a li d e n t i f i c a t i o n ，m o r p h o l o g y , i t ss e q u e n c e s ， c o n t r o l ，d i s e a s ef a c t o r s v i 致谢 本论文是在导师穰兵干耐教投的悉心指导下完苠萌，论文从选氲，方案制定和具体 实验操作到结摹分析，论文撰写和校对每一个细节都凝结着导师的心血和智慧。两年 杀- l - e 在学习生活做人等方面曲谆谆教诲和热情关怀使我终生难忘? 导师阏博的 知识，严谨求实的学术态度兢兢业业的工作作风宽厚待人的学者风范为人师表曲 人格魅力，使我终身受互，弄将在今后曲工作生活中鞭采我前进。在论文完曳之际，谨 向我的导师及其家人致以崇高的致意和诚挚的感谢， 非幸感谢晰江大学分新测试中心生物土分子实验室为本论文的完成提供良好曲实1 1 1 - 套件，期间得到了高其库研霓更毛伟华博士，徐幼平高级工程师的热情帮助与指导， 实验室浓厚的学术氛国团结友爱的精神时刻鼓舞着我在此表示表心的感谢， 威谢杭州市萧山区农杖推广中心的土力协助期间碍到寿级农艺弹王国荣。夏国纬 和楼曼庆的熟惜帮助与捐导，在此深表谢意 感谢林钗和s 爱英师组，李红亮师兄袁泽扶、胡小请孙志峰，许坟鼻，徐志耀， 陈乾等同学的热心帮助。 轰谢室友枯晨，方羽平，李国钧，金京朱捐晗，曹栋挂在生活学习和实玲等 t l - 矗r 面给予了兄弟疆的关怀和无私的帮助。感谢他们在我晰土六年曲生活中，陪我度过 了所有开心的和不。j 1 - , 1 1 1 日子。特别感谢胡晗同学在毅据处理和分新方面对我的指导和 帮助。 感谒 所有在生活学习上给予我关心和舞助曲瓴导煮师，同学和朋友。 谨以此文献伶我的父母。是他们多年采始终如一的关怀支持鼓励和理解，使我 能够专心学习和研究是我顺羽完曳学业的坚强后盾和感情支柱。 陈吴健 助7 耳4 是 第一章文献综述 1 1 国内外大豆病害研究概况 已记载的大豆病害有3 0 余种，其中真菌性病害最多，病毒类主要是大豆花 叶病毒( s m v ) ，线虫病主要由孢囊线虫( t i e t e r o d e r a f l y c i n e s ) 和根结线虫( 拉 丁文) 引起。 大豆锈病( p h a k o p s o r a p a c h y r h i z i ) 、炭疽病( c o l l e t o t r i c h u m g l y c i n e s ) 、 细菌性斑疹病( x a n t h o m o n a sp h a s e o l iv a r s o j e n s o ) 等，在南方发生较重。 北方春大豆区霜霉病( p e r o n o s p o r a m a n s h u r i c a ) 、灰斑病( c e r c o s p o r a s o j i n a ) 、 细菌性斑点病、孢囊线虫病发生普遍。大豆病毒病在各大豆栽培区都有发生。 为害大豆粒荚为主的有：紫斑病c e r c o s p o r ak i k u c h i i 、轮纹病a s c o c h y t a g l y c i n e s 、赤霉病f u s a r i u ma v o n a c o a t l l t o ( f u s a r i u mf o s e u n ，f u s a r i u m s e m i t e c t u m ) 、荚枯病e a c r o p h o m am a m o 、炭疽病c o l l e t o t r i c h u mg l y c i n e s 、 黑痘病s p h a c e l o m ag l y c i n e s 。 叶部病害主要有：霜霉病p e r o n o s p o r am a n s h u r i c a 、灰斑病c e r c o s p o r a s o j i n a 、褐纹病s e p t o r i a g l y c i n e s 黑斑病a l t e r n a r i a b r a s s i c a e v a t p h a s e o l i a l t e r n a r i a 五a s c i c u a t a a l e r n a r i at e n m s s i m a 、锈病p h a k o p s o r a p a c h y r h i z i 、 白粉病e r y s i p h ep o y g o n i 、细菌性斑点病p s e u d o m o n a sg l y c i n e a 、细菌性斑疹 病x a n t h o m o n a s p h a s e o iv a r s o j e n s e 、大豆花叶病s o y b e a nm o s a i cv i r u s ( s m v ) 等。 茎秆部病害有：菌核病$ c l e r a t i n i as c e r o t i o r u m , 黑点病p h o m o p s i ss o j a c ( o i a p o r t h ep h a s e o l o r u m ) 、纹枯病p e l l i c u l a r i as a s a k i i 。 根部病害有：立枯病r m z o c t o n i as o l a m 、猝倒病厅t h i u md e b a r y a n u m 枯萎病f u s a r i u mb u l b i g e n u m ( fo x y s p o r u m ) 。 孢囊线虫h e t e r o d e r ag l y c i n e s 主要发生在黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、 河北、山东、河南等省( 自治区) 。根疫病p h y t o p h t h o r a m a g a s p e r m a v a r s o j a e 是美国的主要病害，中国尚未发现，是检疫对象。 第一章文献综述 1 2 大豆炭疽病的症状与病原 有关大豆炭疽病的研究文献不多，在中国农业百科全书( 植物病理学卷) 中和有关的教材及科普文献中都是这样记载：大豆炭疽病从苗期至收获期均可发 生，子叶、子茎、叶片、叶柄、茎杆、荚果及种子皆可受害。病菌在子叶上病斑 呈圆形，红褐色至黑褐色、凹陷。茎上病斑为褐色或红锈色，细条形，凹陷和龟 裂。成株期叶片上病斑主要发生于叶脉上，呈多角形。红褐色至黑褐色。茎上病 斑与茁期茎上的相似，荚上病斑呈椭圆形或近圆形，边缘常隆起，中央部凹陷， 潮湿时各患部斑面上出现朱红色小点或小黑点。有关大豆豆荚炭疽瘸的症状，在 中国所查到的有关文献中，均只有圆形炭疽病斑的记录，未查到有关条状不规则 形病斑的报道。台湾蔡竹固在毛豆炭疽病( c o l l e t o t r i c h u mt t u n c a t u m ( s c h w e i n ) a n d r u s w d m o o r e ) 诊断鉴定操作流程一文中提到过大豆炭 疽病的不规则形病斑，但未见详细的研究报道。 根据前人的研究，能麴引起毛豆炭疽病的病原菌有平头炭疽茵 c o e t o t r j c h u mt r u n c a t u m ( 汪涛，2 0 0 6 ) ，有性态未知；毁灭炭疽菌c d e s t r u c t i r u m ( b a i r dr e ，1 9 9 7 ) ，有性态a l o m e r e l l ag l y c i n e s ；胶胞炭疽菌 o e o s p o r i o i d e s ( c h e nl s ，2 0 0 6 ) ，有性态岔c i n g u a t a ；禾生炭疽菌c g r a 噼i n i c o j a ( g a r t m a n ，g l ，1 9 9 9 ) ，有性态岔g r a m i n i c o l a ；黑线炭疽菌 d e m a t j u m 等。 1 3 植物炭疽菌的分类 炭疽菌c o l l e t o t r i c h u m c d a 是一种地理分布广泛，寄主繁多的真菌。炭疽 菌的分类研究已有2 0 0 多年的历史，随着真菌学研究的深入，炭疽菌类真菌在属 和种的命名上以及分类方法上都曾经发生过重大变更，尤其是1 9 7 0 年以前。 1 3 1炭疽菌属的命名及特征 炭疽菌c o l l e t o t r i c h u m 是由c o r d a ( 1 8 31 ) 据模式种c i n e o l ac d a 描述 的，其特征是予实体暗褐色。分生孢子梗间有刚毛，分生孢子单孢，无色，纺锤 形或镰刀形( a r x ，1 9 5 7 ) 。s a c c a r d o ( 1 8 8 4 ) 把该属归入黑盘孢目( m e l a n c o n i a l e s ) ， 第一章文献综述 s a c c a r d o 认为 i n e o a 是丛刺盘孢属( v e r m i c u l a r i a ) 的一个发育时期。 g e z z n i c u l a r i a 是由t o d e ( 1 7 9 0 ) 根据3 个种建立的属，其中只有一个种具有炭 疽菌的特征( a r x ，1 9 5 7 ) 。f r i e s ( 1 8 2 5 ，1 8 4 9 ) 对这个属的种进行考证，据后 来研究，f r i e s 当时的含义v e r m i c u a r i a 是一个庞杂属。但这并没有引起他的 足够重视，反而采用了v e r m i c u l a r i at o d ee xf r 的属名并且划分了1 2 个种， 其特征是：具有封闭或自由开口的子囊壳，且具刚毛。f u c k l e ( 1 8 6 9 ) 通过研究， 把该菌划归不完全菌类。d u k e ( 1 9 2 8 ) 检查了v e r m i c u l a r i a 和c o l l e t o t r i c h u m 二属的模式种后，认为二者的模式种c i n e o i a 和配d e m a t i u m p e t s 为同一种， 随即把这两个属合并为一个属，在合并后的属名认可上，d u k e 指出，虽然 v e r m i c u l a r l a 的名称较早，有优先权但由于c o l l e t o t r i c h u m 已成为一贯通用名 称，建议仍采用c o r d a 的名称c o l e t o t r i c h u m 。 g l o e o s p o r i u m ( 盘圆孢属) 是d e s m a z i e r e s 和m o n t a g n e 依据模式种岔 c a s t a g n e id e s m e tm o n 在1 8 4 9 年建立的无色单胞属，s a c e a r d op a ( 1 8 8 0 ) 通过研究发现，岔c a s t a g n e i 的分生孢子不是单胞而是双胞，因此又以这个种 作为模式种建立了盘二孢属m a r s s o n i as a c c ( 1 8 8 0 ) 。根据命名法规，m a r s s o n i a $ a c c 是m a r s s o n i n am a s n u s ( 1 9 0 6 ) 的拼法变体，作为旱出同名看待( 王晓鸣， 1 9 8 5 ) ，因此就自动废弃g 1 0 e o s p o r i u md e s n t e tm o n t ，将m a r s s o n i n am a g n 作为保留名称，其模式种也相应改为彪c a s t a g n e j ( d e s m e t m o n t ) m a g n s a c c a r d o ( 1 8 8 0 ) 根据错误鉴定的模式种岔c a s t a g n 建立了新属m a r s s o n i a s a c c 后，本应废弃g 1 0 e o s p o r i u m 这一属名，但s a c c a r d o ( 1 8 8 2 ) 没有采用模式种标 定属的范围和特征的规则，却又重新起用了这个废弃的属名，用来容纳无色单胞 的炭疽菌，并以分生孢子座中无刚毛区别于属c 0 1 e t o t r i c h u mc o r d a 。在这种 意义下，炭疽菌增加到上千种，主要以寄主作为划分种的依据，这种分类方法是 从实用的观点出发，不能反映炭疽菌种间的亲缘关系。而且往往在同一寄主植物 属或种上出现数种炭疽菌，从而一度造成混乱。a r x ( 1 9 5 7 ，1 9 7 0 ) 对这两个属 的属名及种名进行了考证，废弃了g o e o s p o r i u m , 将c o l e t o t r i c h u mc o r d a 作 为合法的炭疽菌属名，并且通过种的重新鉴定，将炭疽菌属划分为1 3 个种和1 2 个专化型，同时查证和列举了大量异名。a r x 标定c o l l e t o t r i c h u m 属的界限为 分生孢子单胞，无色，萌发形成附着胞，其分种依据是以自然基物上繁殖体形态 3 第一章文献综述 为主，同时参考纯培养特征和寄主范围，在形态学上，尤其注重分生孢子和附着 胞的特征，从而a r x 建立了第一个以形态学为基础韵炭疽菌分类系统。经过3 0 多年的实践检验，证明他的分类系统基本上是正确的，并得到世界真菌学界的公 认( 王晓呜，1 9 8 5 ) 。 关于小丛壳属6 1 0 m e r e l l a ( s t o n e m ) s p a u l d e ts c h r 也曾发生过属级名 称的变更。s t o n e m a n ( 1 8 9 8 ) 发现许多引起炭疽病真菌的予囊型，并把它归入 g n o m o n i o p s i s 中，但这个名称已由b e r l e s e ( 1 8 9 2 ) 命名了另外一类真菌，所以 s c h r e n k 和s p a u l d i n g ( 1 9 0 3 ) 把它改作g l o m e r e l l a 因为s t o n e m a n 己把许多种 描述为g n o m o n i o p s i s ，且以g n o m o n i a ，c i n g u l a t a 作为模式种，所以模式种也 应该为：g o m e r e l l ac i n g u a t a ( s t o n e m ) s p a u l d e ts c h r 。后来人们发现这个 属实际上是c o l l e t o t r i c h u m ( g o e o s p o r i a m ) 种的子囊型，且将p h y s a l o s p o r a n s s l ，p h o m a t o s p o r as a c e 和g l a g n a d i av i a l ae tr a y 等属中具有 c o e t o t r j c h u m 分生孢子型的种，作为岔c i n g u l a t a 的异名大部分转入 g l o m e r e l l a ( s t o n e m ) s p a u l d e ts c h r ，因此，炭疽菌分类研究有了坚实的基 础，从而促使后人继续研究和补充。 1 _ 3 2 种级分类系统 以s a c c a r d o 为代表的传统分类系统 传统分类系统认为炭疽菌属( 广义) 的种在一定寄主植物上是严格专化的， s a c c a r d o 以此为根据结合某些形态学的细微差异在此属内描述了上千个种。1 9 世纪末至2 0 世纪初，生物分类学进入了一个新的时期，一些人开始怀疑这些种 的实际存在，并在交互接种和形态学比较研究上做了大量工作，结果是这些种名 多数为同一种( s o u t h - w o r t h 。1 8 9 1 ；h a l s t e d ，1 8 9 2 ，1 8 9 3 ；s h e a r & w o o d ，1 9 1 3 ； k r u g e r ，1 9 1 3 ；d a s t e r ，1 9 2 0 ：m u l l e r ，1 9 5 3 ；b o h n e i ，1 9 4 9 ，引自v o na r x1 9 5 7 ) 。 尽管由于缺乏系统研究，使他们的工作未受重视，但无疑是对v o na r x 的研究提 供了理论和实验依据。 y o n a r x 系统 v o na r x ( 1 9 5 7 ) 认识到炭疽菌属( 广义) 种划分的混乱，以现代生物学物 种概念为依据对被作为此属描述的上千个种的模式标本和原始材料进行了研究。 4 第一章文献综述 结果表明，正确的种级分类单位只是少数( 1 1 个，1 9 5 7 ；1 3 个，1 9 7 0 ：v o n a r x ， j a ，) 。根据寄主寄生物关系，v o na r x 又在o e o s p o r m i d e s 和d e m a t i u m 下分别承认了9 个和3 个生物型( f o r m a ) 。v o na r x 划分种的依据是：以自然 基物上繁殖体形态学为主，尤其注重分生孢子和分生孢子附着胞( c o n i d i a l a p p r e s s o r i a ) 的特征，同时参考纯培养特征和寄主范围。 根据实物标本和原始文献研究表明v o na r x 建立分类系统的依据是正确的， 对多数种的划分也是可取的。但v o na r x 定义下的某些种范围过大，从丽减少了 实际种数，使某些种过于庞杂，如c 鲥o e o s p o r i o i d e s ( p e n ) s a c c ( 6 0 0 余个异名) ，d e m a t i u m ( p e r s ：f r ) g r o v e ( 9 6 个异名) 和cg r a m i n i c o l a ( c e s ) w i l ( 3 5 个异名) 。这些种都是多个种的混杂( c o m p l e xs p e c i e s ， s i m m o n d ，1 9 6 5 ) 或是多个种群( s p e c i e sg r o u p s ，s u t t o n ，1 9 8 0 ) 。对这些种 的异名或生物型应进一步研究确定其正确分类地位( s u t t o n 1 9 6 6 ，1 9 6 8 ，1 9 8 0 ； s i m m o n d s ，1 9 6 5 ；王晓鸣、李建义，1 9 8 7 ) 。另外，v o nh r x 在c 盯o e o s p o r l o i d e s 和d e m a t i u m 下分别承认了9 个和3 个型。对c o e o s p o r j o j d e s 下的型仍 采用原种级双名是不允许的( v o s s ，1 9 8 3 ) ，而且这些型多数为种( s u t t o n ，1 9 8 0 ) 。 s u t t o n 系统 s u t t o n 早就认识到y o na r x 系统存在的问题，并通过对大量标本和分离物 的纯培养物研究在炭疽菌属( 广义) 下承认了1 9 个种和3 个种群( s u t t o n ，1 9 6 6 ， 1 9 6 8 ，1 9 8 0 ) 。s u t t o n 划分种的依据是在一致的培养条件下纯培养物的形态学、 培养学特征和寄主范围。比较s u t t o n 系统和y o na r x 系统，有更多的理由接受 s u t t o n 对种的划分。但他强调采用一致的纯培养条件下获得的纯培养物作为鉴 定依据，这一点能否被接受还未确定，因为一方面获得一致条件下的纯培养较繁 锁，另一方面纯培养条件下和自然条件下菌体的形态( 如分生孢子梗、分生孢子) 是有差别的。 国内对炭疽菌属的分类 我国炭疽菌属的系统分类研究，始于1 9 世纪8 0 年代李建义领导的炭疽病协 作组。之后便处于停滞状态。王晓呜、李建义( 1 9 8 7 ) 根据v o na r x ( 1 9 5 7 ，1 9 7 0 ) 和s u t t o n ( 1 9 8 0 ) 的分类系统，提出了以自然形态特征为主，培养特征和寄主 范围为辅的综合指标作为分种的依据，他们整理鉴定了1 9 7 3 - - 1 9 8 4 年期间采自 5 第一章文献综述 陕西各地的近3 0 0 份炭疽菌标本。鉴定出1 4 个合格种，其中新种1 个，由异名 恢复的合格种1 个，中国新纪录种1 个。与v o nh r x ，s u t t o n 分类系统比较，李 建义，王晓鸣的分类方法比较深人，更理想一些，但据研究，并不是所有采集的 标本都具有子实体，子实体是否成熟也直接影响分类的结果，所以以自然形态特 征为主的分类方法可能会忽略或者遗漏那些不易产生子实体的炭疽菌的种。因此 为了达到分类条件的一致性必须以培养特征为主，寄主范围为辅，兼顾有性态与 无性态，同时适当考虑自然形态特征来划分炭疽菌的种较为合理。 1 3 j 各个系统在种级分类标准的差异 1 3 3 1 形态学的分类标准 一 真菌的种大多数不能依据它们的寄主植物和基质环境生长特性来划分，而是 根据表型的形态学特征来划分( v o na r x ，1 9 5 7 ) 形态学特征是炭疽菌属划分 种的主要依据( v o nh r x ，1 9 5 7 ，1 9 7 0 ；s u t t o n ，1 9 8 0 ；王晓明等，1 9 8 7 ) 炭 疽菌属的形态学可分为营养体形态学和繁殖体形态学，前者主要指菌丝体及其交 态结构，如厚垣孢子，菌核，附着孢。对厚垣孢子研究极少，而菌核的产生与否 以及形态、大小明显受基质种质和环境条件影响，也不是好的分类特征，但在自 然基质上大量菌核产生是c o c c o d e s ( 马铃薯炭疽病菌) 区别于其它种的一个 特征。附着孢与繁殖体形态学才是区分炭疽菌属的主要依据( 吴文平，1 9 9 5 ) 13 3 2 纯培养特征与种的划分 不同种的炭疽菌在p d a 平板上呈现的菌落变异很大，这种变异甚至存在于同 一种的不同分离物之间。不同种的纯培养物在菌落颜色、气生菌丝体、菌核产生 与否、分生孢子团颜色与生长速度等特征上存在差异，在种的划分中有参考价值， 但也应认识到这些特征随着基物种类、培养条件、培养时间和菌株来源等不同而 变化。吴文平等( 1 9 9 5 ) 的研究表明采用来自自然基质上的薪鲜分离物( 单孢1 2 代) 在一致的纯培养条件( 培养基，温、湿度) 下获得的纯培养特征在种间差 异大而在种内变异小较稳定，在种的划分中有重要的价值。 1 3 3 3 炭疽菌属种的寄生专化性 传统的炭疽菌属分类系统认为不同的种与它们的寄主之间存在着严格的寄 第一章文献综述 主专化性，并依此为主要依据在此属内描述了上千个种。事实上，炭疽菌属的成 员多数是有较广的寄主，可寄生或腐生于不同科、属和种的植物上，而不存在那 样严格的寄主一寄生物之间种与种的专化关系( v o na r x ，1 9 5 7 ，1 9 7 0 ；l e b e a u ， 1 9 5 0 ：c h e s t e r s o r h b y ，1 9 6 5 ：s u t t o n ，1 9 6 2 ，1 9 8 0 ：b a x t e r ，1 9 8 3 ，1 9 8 5 ) 。另 一方面，一种植物可同时被几种炭疽菌寄生。如大豆g l y c i n e 舾jl 可被c g o e o s p o r i o i d e x ，cd e s t r u c t i v u m 和cd e m a t i u m 等3 种炭疽菌寄生。尽管 在寄主植物种和炭疽菌属的种之间不存在严格的专化关系，但炭疽菌属的成员除 c 刃o e o s p o r i o i d e s 和ed e m a t i u m 的寄主谱十分广泛外，多数种在自然界经 常发生在某个科或属的植物上，如芸苔炭疽菌h i g g i n s i n n u m 寄生十字花科芸 苔属( b r a s s i c a ) 植物；毁灭炭疽菌寄生豆科植物等。这种关系在种的鉴定中是 十分有用的( y o na r x ，1 9 5 7 ，1 9 7 0 ：s u t t o n 。1 9 8 0 ；b a x t e r ，1 9 8 5 ) 。 1 4 分子生物学技术在炭疽菌分类中的应用 1 4 1 免疫学方法 国内江彤( 2 0 0 6 ) 等以4 个胶孢炭疽菌炭疽菌菌株的分生孢予为免疫原免 疫家兔制备抗血清，采用琼脂双扩散和对流免疫电泳的方法对不同来源的2 0 株炭疽菌进行了免疫学对比研究。结果表明：4 种抗血清可分别与1 5 个同种胶 孢炭疽菌抗原中的大多数发生阳性反应，两只能与少部分不同种炭疽菌的抗原 发生阳性反应。这说明同种的胶孢炭疽菌不同菌株间的亲缘关系较近，而不同种 的炭疽菌间的亲缘关系较远。 1 4 2r a p d 技术在分类鉴定上的应用 随机扩增d n a 多态性( r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p i c d n a s ，r a p d s ) 是由 w i l l i a m se ta l 和w e l s he ta l ( 1 9 9 0 ) 于1 9 9 0 年建立的一种有效的遗传标记 技术，现已广泛应用于动植物及微生物的遗传变异、分子进化和基因组研究等领 域，该技术是在p c r 基础上，利用一系列不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸 链( 通常为l o b p ) 为引物在d n a 聚合酶的催化下，以d n t p 为原料，对所研究基 因组d n a 进行p c r 扩增，所得扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离， 7 第一章文献综述 e b 染色后置于紫外灯光下检测其多态性( 惠东威等，1 9 9 2 ) 。如果被测基因组 在扩增区域发生d n a 片段插入、缺失或碱基突变，那么扩增产物就增加、缺少而 发生分子量的改变通过一系列引物进行r a p d 分析，其探测区域可能覆盖大部 分甚至整个基因组，其结果将比较全面地反映被测生物的d n a 多态性，从而可以 反映生物问的亲缘关系。 曾大兴( 2 0 0 4 ) 通过r a p d 分析对3 8 个不同寄主来源的弯孢类炭疽菌菌株的 系统发育及分类进行研究。结果表明：许多弓i 物的r a p d 扩增带型在种内是相似 或一致的，而种间差异较大。u p g m a 聚类分析的结果表明：3 8 个弯孢类炭疽菌 菌株被聚为6 个类群，群内菌株之间遗传相似性较高，而群间遗传相似住较低： 群与群之间分界明显，表明种的分界相当明显。因此，r a p d 分析所反映的种间 亲缘关系，将有助于疑难种分类地位的确定和近似种的区分。r a p d 分析的结果 还揭示了一些近似种的分类关系，如按传统方法分别鉴定为c o l l e t o t r i c h u m t r u n c a t u m cc i t e h a n s 和辣椒炭疽菌c a p s i c i 的许多菌株聚类在同一群 内，有很高的遗传相似性，实验结果支持它们为同一个种。实验中还发现5 条辣 椒炭疽菌的特有片断，分别由引物o p e 一1 4 、0 p