（动物学专业论文）束缚浸水应激（rwis）不同时间段对大鼠脊髓和脑干中cfos表达的影响.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他 需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文怍者签名：鬯国钮 翩繇缚彰 、 、 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂控有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授 权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本 授权书) 学位论文作者签名： 莺团钮 签字日期：2 。0 7 年 7 月厂日 | 、 导师签字： 滁 签字蹁7 年西眵日 山东师范人学硕上学位论文 束缚一浸水应激( r w i s ) 不同时间段对大鼠 脊髓和脑干中c - f o s 表达的影响 中文摘要 大鼠束缚浸水应激( r e s n 面mw a t e 和i m m 粥i o n $ 仃e s s ，r w i s ) 模型被广泛用来研 究应激性胃粘膜损伤的发生机制及其临床治疗药物的筛选等。众多实验结果表明： 束缚浸水应激( r w i s ) 状态下胃运动机能亢进、胃酸分泌增多主要是由于支配胃的 副交感神经活动加强所致。这与其它多种类型的应激所致“下丘脑腺垂体肾上腺皮 质轴”和“交感神经- 肾上腺髓质系统”活动加强的现象相反；在束缚浸水应激模型 中却是副交感神经的活动加强，而这些副交感神经来自延髓的迷走背核和疑核。 迷走神经背核( d m v ) ，疑核( n a ) 、孤束核( n t s ) 作为副交感神经的初级中 枢对胃运动均具有调控作用，但是兴奋作用还是抑制作用，文献报道颇不一致。为 了搞清楚这三个核团对胃运动到底起什么样的调控作用，本实验室前面的工作分别 电刺激或化学刺激这三个核团，结果发现这三个核团受刺激后对胃运动均起抑制作 用。那么，大鼠束缚浸水应激状态下这些核团是兴奋还是抑制? 脊髓灰质后角、前 角、侧角的神经元是兴奋还是抑制? 本文用即刻早期基因c 加s 表达的f o s 蛋白来作为 神经元激活的标志，研究了束缚浸水应激不同时间段的大鼠脊髓和脑干中各个神经 核团的神经元的兴奋情况，联系大鼠的胃溃疡程度，进一步探讨脊髓与脑于各核团 的兴奋与r w i s 之间的关系。 实验分为2 部分。实验研究i ：我们将实验大鼠随机分为五组，各组大鼠束缚一浸 水应激时间分别为0m i n 、3 0m m 、6 0m i n 、1 2 0m i n 、1 8 0r a i n ，第一组作为对照组。 取出后过量戊巴比妥钠麻醉，心脏灌流，取脊髓和脑干，后固定过夜，冰冻切片， 片厚2 5 m 。切片做f o s 免疫组化。结果发现在脊髓前、后角和脑干多个核团( n t s ， d m va p s u b p l c ，p b n ，c g o ，l r t p c ，等) 中，f o s 样免疫反应阳性细胞都有极显 著的表达，但其表达的个数与强度不完全相同，且随着r 1 帆s 时间的延长，f o s 表达 呈现一定的规律。总体来说，应激6 0r a i n 时大鼠脑干和脊髓中f o s 表达达到顶峰，但 具体到每个核团，又稍有差别。以后随时间延长，动物产生适应，f o s 表达减少。 实验研究：切断大鼠膈肌下迷走神经后r w i s1 8 0m m 。发现切断膈肌下迷走 1 山东师范大学硕士学位论文 神经后再r w i s ，大鼠脑干各核团中f o s 表达明显减少，而脊髓的表达有所增强。胃 粘膜部几乎没有溃疡点。 本研究的结果表明：r w i s 不同时问段大鼠脊髓前角、后角和脑干许多核团都有 不同程度的f o s 表达；r w i s3 0 6 0m i n 时脊髓前角、后角和脑干大部分核团的f o s 表达 达到高峰。以后逐渐下降；发现切断膈肌下迷走神经后再r w i s1 8 0m i n ，大鼠脑于 各核团中f o s 表达明显减少，而脊髓的表达有所增强。 关键词：c o f o s ：迷走神经背核( d m v ) ；孤束核( n t s ) ；最后区( a p ) ：疑核( n a ) ； 胃粘膜损伤；切断膈肌下迷走神经 分类号：q 4 2 6 2 山东师范大学硕士学位论文 e f f e c t so fr e s t r a i n tw a t e r - i m m e r s i o ns t r e s s ( r w i s ) o nf o s e x p r e s s i o ni nt h es p i n a lc o r da n d b r a i n s t e mi nr a t s a b s t r a c t t h er a tu n d e rr e s t r a i n tw a t e r - i m m e r s i o ns t r e s s ( r w i s ) i s 、i i e l yu s e dt os t u d yt h e s t r e s s i n d u c e dg a s t r i cu l c e ra n dt of i n d t h em e d i c i n et h a tc a nc u r et h i sd i s e a s e t h er e s u l t s o fm a n ye x p e r i m e n t si n d i c a t e dt h a tt h er w i s i n d u c e dg a s t r i cu l c e rw a sm o s t l yd u et ot h e h y p e r a c t i v i t yo fp a r a s y m p a t h e t i ct h a tc o n t r o lt h es t o m a c hw h i l eo t h e rs t r e s s e si n d u c e d t h e e n h a n c e m e n t o f h y p o t h a l a m o - p i t u i t a r y - a d r e n o c o r t i c a ia x i s ( r n , aa x i s ) a n d s y m p a t h e t i c a d r e n o m e d u l l a r ( s a ) p a r a s y m p a t h e t i cn e r v ei n n e r v a t i n gt h es t o m a c hi st h e v a g a ln e r v ew h i c ha r el a r g e l yf r o md o r s a lm o t o rn u c l e u so ft h ev a g u s ( d m v ) a n dp a r t l y f r o mn u c l e u sa m b i g u u s ( n a ) a st h ec e n t e ro fp a r a s y m p a t h e t i cp r e g a n g l i o n i c ，n a ，d m va n dn u c l e u so fs o l i t a r y t r a c t ( n t s ) a l lr e g u l a t eg a s t r i cm o t i l i t y h o w e v e r , t h e r ea r en ou n a n i m o u ss t a n d p o i n t s a b o u tt h ee x c i t e do ri n h i b i t o r ye f f e c t so fn a ，d m va n dn t so i lt h eg a s t r i cm o t i l i t yb y n o w t oc l a r i f yt h ee f f e c t so ft h et h r e en u c l e u so ng a s t r i cm o t i l i t y , o u rr e s e a r c hg r o u ph a s e l e c t r i c a l l ys t i m u l a t e dt h e mr e s p e c t i v e l ya n df o u n dt h a tt h e ya l li n h i b i t e dg a s t r i cm o t i l i t y w h e t h e re x c i t e m e n to fn e u r o nb o d yo re x c i t e m e n to fp a s s e df i b r e sc o n d u c e dt ot h e s e i n h i b i t i n gr e s u l t sw a su n c l e a r s o ，i nt h i ss t i l 觑w eo b s e r v e dt h ef o se x p r e s s i o ni ne a c h n e u r o n e u c l e u so ft h es p i n a lc o r d sa n db r a i n s t e m so fr o t sf o l l o w i n gr w i su n d e rd i f f e r e n t t i m e s ，t od i s c u s st h er e l a t i o nb e t w e e nt h i ss t r e s sa n dt h ee x c i t e m e n to fn e u r o - n e u c l e u si n t h es p i n a lc o r d sa n db r a i n s t e m so f r a t s t h es t u d yi n c l u d e dt w op a r t s ，t h ee x p e r i m e n tia n dt h ee x p e r i m e n ti i t h ee x p e r i m e n ti ：t h er a t sw e r er a n d o m l yd e c i d e di n t of i v ee x p e r i m e n t a lg r o u p s ， f o u rr a t si ne a c hg r o u p i nc o n s c i o u sr a t s ，t h es t r e s sw a sc o n t r o l l e d b ye m p l o y i n gt h e r w i sb y0 m i n ，3 0 m l n , 6 0 m i n , 1 2 0 m i na n d1 8 0 r a i nr e s p e c t i v e l y a f t e rh e a r tp e r f u s i o n ，t h e s p i n a lc o r da n db r a i n s t e mw e r er e m o v e d ，a n dp o s t f i x e do v e r n i g h t ，t h e nc o m n a l l ys l i c e d i n t o2 5 i _ t m 饷c ko fe a c hp i e c e w eu s e dp f o si m m u n o h i s t o c h e m i s t r yt oc h a r a c t e r i z e 3 山东师范大学硕士学位论文 n e u r o n a la c t i v a t i o no fs p i n a lc o r da n db r a i n s t e m t h e r ew e r ev e r yf e ws i g n a l sf o rf o s l i k e i m m u n o r e a c t i v i t i e si nt h es p i n a lc o r da n db r a i u s t e mo fu n s t r e s s e dr a t s b u tr w i sc o u l d i n d u c e dr e m a r k a b l ec f o se x p r e s s i o ni nm a n yp a r t s ( n t s ，d m v , a p , s n b p , l c ，p b n ， c g o ，l r t - p c ，e ta t ) o fs p i n a lc o r da n db r a i n s t e m , f u r t h e r m o r e , t h en u m b e ro fc - f o s p o s i t i v en u c l e u sa n dt h ei n t e n s i t yo fc - f o se x p r e s s i o nw e r ed i f f e r e n ta m o n ge a c hp a r t so f t h es p i n a lc o r da n db r a i n s t e m r e s u m p t i v e l y , t h el e v e l so fc f o se x p r e s s i o ni n c r e a s e d d u r i n gt h eb e g i n n i n gt i m eo fr w i sa n dr e a c h e dam a x i m u ma t6 0 m i no fs t r e s s b u tt o e a c hn e r v a ln u c l e u s ，i ti sn o tc o m p l e t e l yc o n s i s t e n t f o se x p r e s s i o nd e c r e a s e df o l l o w i n ga l o n gs t r e s st i m e t h ee x p e r i m e n ti i ：a f t e rb i l a t e r a lv a g o t o m yb e n e a t hd i a p h r a g m ，r a t ss u f f e r e dr w i s f o r18 0 m i n t h e nt h ee x p r e s s i o no fc f o sw a sd e t e c t e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y w e f o u n dt h a tt h ef o se x p r e s s i o nc u td o w ni nb r a i n s t e mo f t h er a t sb u tb o o s tu pi ns p i n a lc o r d o f t h es a m er a t s t h er e s u l t so ft h i s s t u d yi n d i c a t et h a t r w i sc o u l di n d u c e dr e m a r k a b l ec - f o s e x p r e s s i o ni ns p i n a la n t e r i o rh o r na n dp o s t e r i o rh o ma n db r a i n s t e m ，t h el e v e l so fc - f o s e x p r e s s i o ni n c r e a s e dd u r i n gt h eb e g i n n i n gt i m eo fr w i sa n dr e a c h e dam a x i m u m a ta b o u t 6 0 m i no f s t r e s s b u ta f t e rb i l a t e r a lv a g o t o m yb e n e a t hd i a p h r a g m ，lo se x p r e s s i o nc u td o w n i nb r a i n s t e mb u tb o o s tu pi ns p i n a lc o r do f r a t st h a ts u f f e r e dr w i sf o r1 8 0 m i n k e y w o r d s ：c - f o s ；d m v ；n t s ；a p ；n a ；g a s t r i cu l c e r ；b i l a t e r a lv a g o t o m y b e n e a t hd i a p h r a g m c a t e g o r yn u m b e r ：q 4 2 6 4 山东师范大学硕士学位论文 英文缩写英文全称 符号说明 中文名称 促肾上腺皮质激素 a i o d a v e r a g ei o d平均累计光密度 c - f o sp nc - f o sp o s i t i v en u c l e u s c a 最后区 c - f o s 免疫反应阳性细胞核 儿茶酚胺 c g oc e n t r o lg r a y , n u c l e u s0 脑桥中央灰质0 核 c g r p e a l e i t o n i ng e n e r e l a t e dp e p t i d e 降钙素基因相关肽 c r h c v l e o r t i c o t r o p i nr e l e a s i n gh o r m o n e 促肾上腺皮质激素释放激素 c a u d o v e n t r o l a t e r a lr e t i c u l a rn u c l e u s 延髓腹外侧网状核尾端 d m vd o r s a lm o t o rn u c l e u so f t h ev a g u s 迷走背核 f l i f o s l i k ei m m u n o r e a e t i v i t y f o s 样免疫反应 f l i nf o s l i k ei m m u n o r e a c t i v en e u r o n s f o s 样免疫反应( 阳性) 神经元 h p a a x i sh y p o t h a l a m o - p i t u i t a r y - a d r e n o c o r t i c a la x i s 下丘脑垂体一肾上腺皮质轴 h r p i e g i r t l c h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e 辣根过氧化物酶 i m m e d i a t ee a r l yg e n e i n t e r m e d i a t er e t i c u l a rn u c l e u s l o c u se o e r u l e u s 快反应基因( 即刻早期基因) 延髓中间网状核 蓝斑核 l p b nl a t e r a lp a r a b r a e h i a ln u c l e u s 臂旁外侧核 l a t e r a lr e t i c u l a rn u c l e u s 延髓腹外侧网状核 l r t - p c p a r v i e e l l u l a rr e t i c u l a rn u c l e u s小细胞网状核 n an u c l e u sa m b i g u o u s 疑核 5 山东师范大学硕士学位论文 n t s p b n n u c l e u s o f s o l i t a r yt r a c t p a r a b r a c h i a ln u c l e u s 孤束核 臂旁核 p p n s p a r a s y m p a t h e t i cp r e g a n g l i o n i cn e u r o n s 副交感节前神经元 p v n h y p o t h a l a m i cp a r a v e n t r i c u l a rn u c l e u s s a s y m p a t h e t i c - a d r e n o m e d u l l a r s u b ps u ba l - e ap o s t r e m a t h t y r o s i n eh y d r o x y l a s e 6 下丘脑室旁核 交感肾上腺髓质 最后区周围区 骆氨酸羟化酶 山东师范大学硕士学位论文 论文正文 第一部分文献综述 不同应激引起大鼠脊髓和脑r p c - f o s 表达的研究进展 应激这一概念最早是由h s e l y e ( 1 9 0 7 1 9 8 2 ) 提出，是指机体在受到各种内外环境 的非生理性刺激时所出现的非特异性全身性反应，也是整个机体适应性保护机制的 一个重要组成部分。但是如果应激的时间和强度超过一定程度，可以引起全身多个 系统的损害。应激作为人类多种重大疾病的重要病因或诱因已经确认，在许多疾病 的发生、发展上都起着重要的作用，与病毒感染、消化性溃疡、心血管疾病、神经 精神疾病、生殖内分泌疾病以及肿瘤等多种疾病的发生、发展密切相关【1 1 。 应激时主要表现为血中促肾上腺皮质激素( a d r e n o c o r t i c o t r o p h i ch o r m o n e ， a c t h ) 、儿茶酚胺( c a t e c h o l a m i n e ，c a ) 等的升高，脑主要通过神经内分泌系统参 与对应激的调节【2 】。 对应激的神经调节研究中，快反应基因( i m m e d i a t ee a r l yg e n e ，l e g ) c - f o s 表达 的c - f o s 蛋白，在各种应激状态时能被快速地诱导表达。所以，被作为神经元活动的 标志。在脑内信号转导、神经核的定位研究中被广泛应用【3 ，4 1 。许多内、外部刺激均 可诱导c f o s 表达，但脑和脊髓中不同区域对不同刺激作出反应的时程和强度各不相 同，因而是研究某种特定条件下神经功能状态和通路的一种较理想手段 5 1 。神经元 c - f o s 蛋白的表达，一方面具有普遍性，几乎任何形式的刺激只要达到一定的强度和 持续时间，都可以引起中枢c - f o s 的表达；另一方面又呈现出内在的特异性，不同形 式的刺激，诱导c - f o s 表达的中枢部位不同。同一形式的刺激反复作用可产生中枢 c f o s 表达的“耐受性”或“习惯化”。并且不同形式的刺激引起的中枢c f o s 表达， 相互之间存在“交叉耐药性”嘲。 应激反应的主要结构功能系统，是下丘脑垂体一肾上腺皮质 ( h y p o t h a l a m o - p i t u i t a t y - a d r c 皿o c o r t i c a ，h p a ) 轴和交感- 肾上腺髓质 ( s y m p a t h e t i e - a d r e n o m e d u l l a r ，s a ) 系统 l s i 。应激引起以上两个系统的兴奋，从而 引起一系列复杂的行为、生理和心理变化。下丘脑室旁核( h y p o t h a l a m i cp a r a v e n t r i c u l a r n u c l e u s ，p v n ) 是应激激活h p a 轴的主要脑区，脑干蓝斑核( 1 0 c u sc o e r u l e u s ，l c ) 7 山东师范大学硕士学位论文 是主要的交感神经中枢。前者释放促肾上腺皮质激素释放激素( c r ho rc r f ) 和精 氨酸加压素( a v p ) ，不但激活h p a 轴，而且影响与应激有关的行为和神经内分泌活 动；后者则释放去甲肾上腺素( n e ) ，兴奋大脑边缘系统和下丘脑，调整应激时的行 为、生理和心理反应1 9 1 。 由于下丘脑p v n 是c r h 的主要分泌部位，所以在应激状态的脑内信号传递中起 着重要的作用2 1 。下丘脑p v n 的c - f o s 诱导和末梢血中a c l h 浓度的升高作为急性应激 时的两大特征性指标在应激研究中常被应用i l o l 。在下丘脑以上高位中枢中，已明确 边缘系统与应激有关i l l l 。 应激源的种类很多，如过冷、过热、低血糖、电击等单一的应激源，也可以是 束缚、束缚浸水、寒冷束缚等复合应激源嘲。其中，急性非创伤、非疼痛性应激是 人类日常生活中最常见的应激方式，对机体正常的生理活动产生广泛的不利影响。 在此，我们简单总结一下冷应激( c o l ds t r e s s ) 、束缚应激( r e s t r a i n ts t r e s s 或 i m m o b i l i z a t i o ns t r e s s ) 、束缚冷暴露应激( c o l d r e s t r a i n ts t r e s s 或c o l d - i m m o b i l i z a t i o n s t r e s s ) 、束缚浸水应激( r e s t r a i n tw a t e r - i m m e r s i o ns t r e s s ，r w i s ) 、强迫游泳应激 等几种应激对脑中f o s 表达的影响，并探讨其中枢机制，希望为神经解剖学、神经生 理学、应激神经生物学、病理生理学提供一些资料。 冷应激( c o l ds t r e s s ) 关于冷应激( c o l ds a - e s s ) ，到现在还没有一个十分精确的定义，可以简单描述为 人或动物受到寒冷刺激( 如置于2 0 c 冷水中或4 c 冰箱中) 后产生的反应。通常多讨 论它所引起的影响和一般症状，并从宏观角度上研究讨论冷应激反应机制及其对生 物体所造成的影响。 冷应激引起的寒冷适应是生物机体的一种整体适应性变化，涉及到机体多系统、 多层次的协凋效应f 1 2 1 。目前，冷应激对神经、内分泌以及细胞间、细胞内调节和信 号转导的生理影响已经进行了广泛研究，但有关冷应激相关基因的研究工作十分有 限。冷应激可以引起细胞应激反应，能降低酶的反应、扩散和细胞膜的转运速度。 冷应激对机体细胞生物学的影响与热应激十分相似，具体影响归纳如下：( 1 ) 冷应激 加快蛋白质的变性和解离；( 2 ) 冷应激降低细胞循环( 细胞循环指基因表达程序的暂 时顺序) 的进程；( 3 ) 冷应激抑制转录和翻译，导致蛋白质的合成减少；( 4 ) 冷应激能 8 山东师范大学硕士学位论文 破坏细胞骨架；( 5 ) 冷应激改变细胞膜的通透性，抑制促进细胞生长的n a + 和h + 的增 加。除此之外，由于温度的降低和冷应激细胞生物学的变化( 膜的脂肪酸组成的改 变) ，导致冷应激还能改变脂质双分子层的成分【1 3 1 。 给与大鼠单一冷应激( 如置于2 0 冷水中或4 c 冰箱中) ，可以在大鼠p v n 中见 到大量的lo s 样免疫反应( f o s 1 i k ei m m u n o r e a c t i v i t y , f l i ) 阳性细胞，特别在小细胞 部位，双重细胞染色结果显示，p v n 的f l i 阳性神经元中有- - d 部分同时呈精氨酸加 压素( a v p ) 免疫反应阳性 9 1 。以上结果表明，冷应激能激活p v n 中大量神经元，其 中有小部分是a v p 能神经元。应激后在l c 中也见到许多f l i 阳性细胞，双重染色表明， 其中大多数f l i 阳性神经元同时呈酪氨酸羟化酶( t y r o s i n eh y d r o x y l a s e ，t h ) 阳性。 这提示，冷应激能激活l c 中大多数儿茶酚胺能神经元。 束缚应激( r e s t r a i n ts t r e s s 或i m m o b i l i z a t i o ns t r e s s ) 束缚应激( r e s t r a i n ts t r e s s 或i m m o b i l i z a t i o ns t r e s s ) 是应激反应的一种。将动物束 缚于小的塑料桶内，或固定于特制的长柱型的笼内，或固定于特制的限制器内，或 将动物( 一般是大鼠) 轻度麻醉后仰卧( 有的实验采用俯卧) 于木板上，并用胶布 ( 或线绳) 将四肢粘贴( 或捆绑) 固定( 操作轻柔) 。总之，使之完全不能自由活动。 研究发现，以c f o s 表达为指标，束缚刺激后脑内许多部位的神经元起反应【1 4 4 6 1 。 主要集中在4 个机能系统：1 前脑边缘系统，包括扣带回、外侧隔核、海马b 7 , 1 s 和 杏仁核斛1 9 1 ；2 h p a 轴，其中下丘脑涉及p q 、视上核和弓状核等【2 0 1 ；3 。儿茶酚 胺能系统，包括延髓a l 和a 2 区，脑桥的a 5 区，蓝斑等口1 捌；4 5 - 羟色胺能系统，包 括脑干中缝核群 2 3 卫q 。许多神经递质或调质，如谷氨酸( g l u ) f 1 3 】、g a b a 、儿茶酚 胺( c a ) 2 2 1 、组织胺、5 羟色胺( 5 h t ) 踟、c i 强【吲、神经肽y ( n p y ) 1 1 7 、加压 素、糖皮质激素【2 1 1 ，以及一氧化氮( n o ) 【2 卯，可能参与调节作用。 但也有文献报道 2 6 , 2 7 1 束缚与条件性恐惧对大鼠下丘脑室旁核c 1o s 的诱导作用均 不明显。其原因未知。 一氧化氮( n i t r i co x i d e ，n 0 ) 作为一种非经典的新型的神经递质和信息分子， 在神经系统中具有重要作用，它通过长时程增强或长时程抑制作用，参与突触的可 塑性变化；还与疼痛、损伤、脑缺血、脑损伤和神经毒等广泛的病理作用有关，还 与行为变化、饮食活动具有重要联系1 2 引。特别是近年来的研究表明，n o 作为下丘脑 山东师范大学硕士学位论文 内的内源性物质，对下丘脑内的众多递质和激素的释放具有刺激或抑制性中介作用 2 9 1 。已有的研究3 哪发现，束缚应激大鼠下丘脑内一氧化氮合酶与c _ f o s 蛋白的共存， 说明下丘脑某些核团内的部分一氧化氮能神经元与束缚应激反应有关。 利用w e s t e r n 印迹法对束缚应激大鼠下丘脑背侧区c f o s 的表达进行了定量分析， 发现束缚应激3h ，下丘脑内e - f o s 蛋白的表达就明显增加，而且这种表达在应激解除 后3h 仍保持较高的水平1 。这些结果提示束缚应激能使下丘脑室旁核细胞内的即刻 基因信息系统快速激活，使下丘脑神经细胞处于活动状态，并保持一段较长的时间。 表达增加的c f o s 、c - j u n 通过形成同源或异源二聚体，作为转录因子进一步调控其他 基因( 包括c r h 基因) 的表达和靶蛋白的合成【3 2 3 3 1 ，进而影响h p a 轴的活动和血浆 a c t h 、g c ( 褪黑激素) 的水平。因此下丘脑c - f o s 的水平和持续时间可能直接影响 应激的程度和时间。适当的应激能够对机体产生有利的作用，但是严重持续的应激 可以对机体产生损伤作用，因此调节下丘脑c f o s 蛋白于适当的水平可能会避免应激 损伤。 有研究m 】发现，损毁大鼠内嗅皮质，可以明显抑制束缚应激诱导的下丘脑室旁 核c f o s 的表达和血浆中a c l h 含量的上升。此结果提示，内嗅皮质参与调节束缚应 激反应时h p a 轴的功能。 有关神经元的反应与束缚时间的关系，以及神经元对束缚刺激的适应性，报道 并不多见。宿长军口5 1 等利用抗f o s 蛋白免疫组化a b c 法，观察了束缚l 、3 、6h 后脑内 f o s 阳性神经元的分布及变化。发现f o s 阳性神经元表达于前脑：扣带回、新皮质 ( 尤其是第3 和5 层) 、外侧隔核、杏仁中央核；间脑：下丘脑视前区、下丘脑外侧 区、视上核、室旁核、第三脑室室周区、弓状核、丘脑室旁核、外侧膝状体、内侧 膝状体；脑干：中脑的上丘视性层、中脑导水管周围灰质、下丘的皮质部；脑桥 的臂旁外侧核、蓝斑、a 5 区；延髓的耳蜗核、延髓内脏带( m v z ) 等处。并发现f o s 表达的时间规律是：束缚1h 最高，3h 次之，6h 最少。以上结果说明大鼠被束缚后脑 内多处核团的神经元发生不同程度的f o s 反应，但随着束缚时间的延长，动物产生了 适应，f o s 表达减少。我们的研究发现束缚- 浸水应激也有相似现蒙，说明这两种应激 都可以使动物产生适应。 随束缚时间的延长，脑内f o s 神经元的数目不再无限制增加，反而减少。这表明 束缚初期，相关的脑区神经元兴奋，表达f o s 阳性；随着束缚时间的延长，动物逐渐 1 0 山东师范大学硕士学位论文 适应这种被束缚状态，机体的应激反应也随之减弱。 但是t a nz t 3 6 1 等给大鼠束缚应激，发现p v nc 1 0 sm r n a 、f o s 蛋白的表达分别在 o 5h 、4h 达到高峰。其结果与以上结果不一致，原因待考。 研究【3 1 1 还显示针刺足三里穴能够调节束缚应激引起的下丘脑c - f o s 蛋白的变 化，对c f o s 蛋白的表达产生下调作用。提示针刺对h p a 轴亢进活动的下调作用可能 是通过下调下丘脑内c - f o s 蛋白的表达而实现的，而且这种调节作用与足三里穴位的 特殊调节作用有关，与针刺的局部疼痛无关。研究还显示针刺足三里对下丘脑c f o s 蛋白的调节作用可以持续到针刺结束后3h ，这进一步提示针刺穴位所产生的作用并 不局限于刺激的即时，还可持续一段较长的时间。这可能是针刺足三里产生远隔效 应和时间延迟效应的中枢机制，从而为针刺防治应激性疾病提供了实验依据。 药物对束缚应激的影响： 帕罗西汀( p a r o x e t i n e ，商品名赛乐特，s e r o x a d 是一种选择性5 h t 再摄取抑制 剂( s s 砒) ，临床上广泛用于各种精神障碍疾病。研究发现帕罗西汀连续6d 给药可减 少束缚应激大鼠p v nf o s 样免疫反应阳性神经元( f o s 1 i k ei m m u n o r e a c t i v en e u r o n s ， f l i n ) 数目。最近的研列3 7 1 表明帕罗西汀对束缚应激引起的下丘脑d f o s 表达有下调 作用，由此可提示c f o s 表达减少可能是帕罗西汀抗焦虑作用的机制之一。以上研究 结果还表明帕罗西汀抑制束缚应激大鼠焦虑行为和减少束缚应激大鼠下丘脑c ：f o s 表 达是一致的，帕罗西汀这种中枢性影响与抑制焦虑行为是否有关系，还有待于进一 步研究。 m o r i n o b u 等【3 8 】发现不同类型抗抑郁剂慢性给药或慢性电休克处理( 6 9d ) 对急 性束缚应激大鼠额叶皮质c 1 0 sm r n a 表达产生明显的下调作用。 束缚冷应激( c o l d r e s t r a i n ts t r e s s 或c o l d i m m o b i l i z a t i o ns t r e s s ) 这种应激与束缚浸水应激相似，其操作是将动物束缚后置于低温环境( 如冰箱) 中( 冰箱温度一般不低于4 c ) 。 b o u a z 等口9 1 将大鼠单独束缚于笼中冷暴露3h 后，发现在迷走神经背核( d m v ) 、 中缝苍白核( r p ) 、p v n 和l c ，有大量f l i n 表达；在中缝隐核、锥体旁区、延髓去 甲肾上腺区域、终纹床核、隔核，有少量表达。排便量( 未说明大便还是小便) 增 加8 倍，胃体部粘膜损伤增加1 9 5 1 1 。 1 1 山东师范大学硕士学位论文 束缚浸水应激( r e s t r a i n tw a t e r - i m m e r s i o ns t r e s s ，r 、m s ) 大鼠束缚浸水应激模型( r e s t r a i n tw a t e r - i m m e r s i o ns t r e s s ，r w i s ) 被广泛用来研 究应激性胃粘膜损伤的发生机制及其临床治疗的药物筛选等。这种应激模型首先将 大鼠四肢束缚，限制其自由活动，再将动物放入冷水( 水温2 0 + l ) 中，水面平胸 骨剑突水平，强迫其接受冷水刺激，这是一种强度较大的复合应激( c o m p l e xs t r e s s ) 。 有研究发现r w i s 后下丘脑p v nf o s 阳性细胞数量显著增多，且仅在p v n 观察到 f o s 表达增加，而在视上核、弓状核等下丘脑其它区域未观察到此现象 4 0 l 。这与单纯 束缚应激有所不同。 许爽等【4 1 1 观察了束缚浸水复合应激诱导的大鼠脑f o s 表达，结果发现，在边 缘系统、下丘脑、脑干均有广泛的f l i 表达。边缘系统：应激1h ，在前扣带回，杏 仁内侧核( m e ) 和前额叶皮层( f c ) 见有大量的f l i 阳性细胞；应激4h 和2 0h ，仅有 少量表达。间脑：下丘脑p v n 、视上核、内侧视前区等脑区以及丘脑室旁核，中 央中核等广泛区域均有不同程度的f l i 表达。脑于：l c 、孤束核( n t s ) 、中缝背 核( d r ) 都有高度的f l i 表达。其中以边缘系统的前扣带回，下丘脑p v n 及脑干l c 最为显著。 他们还发现f o s 表达与r w i s 时间之间的关系：在边缘系统，r w i s6 0m i n 的f o s 表达较为显著，以后逐渐减弱；随着r w i s 时间的延长，在边缘系统f l i 表达逐渐 减弱的同时，间脑和脑干的f l i 表达逐渐增强。实验还观察到应激各组的胃粘膜都有 不同程度的溃病形成【4 l 】。r w i s 首先激活边缘系统；随着r w i s 时间的延长，间脑和 脑干f o s 表达也逐渐增强，这可能与持续应激和胃溃疡的形成有关。 随着束缚浸水应激时间的延长，边缘系统前扣带回、杏仁内侧核、前额叶皮层 p g f l i 表达逐步减弱。这可能与边缘系统的功能有关。在应激反应的早期，边缘系统 参与信息的加工处理，再调动p v n c r f 和n e 系统，去调控h p a 的活动，引起全身的 应激反应m l 。根据有无边缘系统的参与，可以将应激源分为两类，一类为加工性应 激源( p r o c e s s i v es t r e s s o r ) ，它们不对生命构成直接威胁，需要经过边缘系统的加工 评价，然后作用于h p a 轴。另一类为系统性应激源( s y s t e m i cs t r e s s o r ) ，如缺氧等， 对生命有直接威胁，通过内脏传入直接作用于瑚) a 轴，不经过边缘系统【4 2 】。束缚浸 水应激不对生命构成直接威胁，属于加工性应激源，所以在应激早期，边缘系统对 其进行加工评价 4 2 4 3 1 ，因此f l i 表达明显。由于f l i 一般在接受刺激后3 0m i n 开始表 1 2 山东师范大学硕士学位论文 达，2h 左右逐渐恢复到正常水平，所以观察到随着束缚浸水应激时间的延长，f l i 表达反而减少。 我们的研究发现，与r w i s3 0 r a i n 、1 2 0 r a i n 、1 8 0 m i n 相比，r w i s6 0 m i n 时大鼠 脑干各核团f o s 表达最强。我们的结果与许爽等h 1 l 的结果不一致，而与宿长军3 5 1 等的 结果有相似之处。 关于r w i s 时脊髓的f o s 表达，未见报道。我们的研究发现，与r w i s 3 0m i n 、 1 2 0 m i n 、1 8 0r a i n 相比，r w i s6 0m i l l 时大鼠脊髓前角、后角的f o s 表达最强。 当然，应激反应中即刻早期基因( m g ) 的表达不只限于在神经系统中。t a k a s h i u e y a m a 关于r w i s 应激时间与胃肠道i e g 表达的关系有详细的报道阳：束缚浸水 6 0 r a i n 诱导胃部c - f o s 和c - j u nm r n a 表达，这些m r n a 的水平在应激期间增强，在应 激9 0m i n 结束后的3 0r a i n 达到最高：从应激开始6 0r a i n ，f o s 样免疫反应性与它们的 m r n a 存在于同一区域；其水平在应激9 0r a i n 结束后3 0r a i n 达到最高；应激结束2 4h 以后，i e gm r n a 及其免疫反应性根本无法察觉。i e g 的诱导先于粘膜损伤。此外， 这些m r n a 的信号强度与粘膜损伤的严重程度并无相关性。而我们的研究发现，应 激3 0m i n 胃粘膜即有损伤，损伤与f o s 蛋白表达之间的时间先后关系问题，尚不能明 确。但我们的实验证实，f o s 表达强度与粘膜损伤程度之间并无相关关系。 根据以上研究结果，我们推测：应激引起脑干相关核团的最高兴奋时间点( r w i