（微生物与生化药学专业论文）壳聚糖止血活性及其作用机理的初步研究.pdf

摘要摘要壳聚糖( c h i t o s a n ，c i s ) 是由甲壳素( c h i t i n ) 脱乙酰化制得，化学名为 1 3 - ( 1 4 ) 2 氨基2 脱氧d 葡聚糖】，是自然界中唯一的天然碱性多糖，也是少数具有正电荷的天然产物之一，其分子链上丰富的羟基和氨基使其易于进行化学修饰而赋于多种功能，具有止痛、止血、促进伤口愈合、抑菌、良好的生物相容性和生物可降解性等优异的性能，在医药领域有着重要的应用价值，是种很有发展潜力的生物止血愈创材料。本课题首先对7 种不同种类的壳聚糖进行一些基本理化性质的测定，包括：外观观察、脱乙酰度、特性粘度、粘均分子量、水分含量、灰分含量、酸不溶物含量、蛋白质含量、重金属含量这九个指标进行考察，以确定其是否符合医药级壳聚糖的标准。通过测定动态凝血时间、体外凝血时间、血浆复钙凝血时间，筛选出止血效果较好的壳聚糖，以便对其进行体表止血效果及止血机理的研究。实验结果表明，壳聚糖在脱乙酰度相同时，粘均分子量越大，其凝血效果越好；在粘均分子量相差不大时，脱乙酰度越低，其凝血效果越好。在大鼠体表创面止血实验中，与灭菌纱布组相比，壳聚糖明胶膜可使出血时间明显缩短，出血量也明显减少，且与创面粘附良好，能有效地密封出血创面，伤口愈合所需时间缩短，几乎无疤痕。通过活化部分凝血活酶时间( a p t t ) 、凝血酶原时间( p t ) 、凝血酶时间( t t ) 、优球蛋白溶解时间( e l t ) 、血小板聚集等实验进一步研究壳聚糖的止血机理，并在血小板聚集方面重点从二磷酸腺苷( a d p ) 途径来研究壳聚糖对血小板的活化聚集作用。实验结果表明，壳聚糖的止血机理与内、外源凝血途径无关，可能是通过a d p 途径对血小板起聚集作用，并且聚集后的产物能释放出更多的活性物质，如p 选择素( p s e l e c t i n ) 、血栓素b 2 ( t x b 2 ) 等，同时又可通过激活周围血小板、促进血管收缩、促进纤维蛋白形成等多种方式加强止血效果。关键词：壳聚糖；止血活性；筛选；机理a b s t r a c ta b s t r a c tc h i t o s a nc a l lo b t a i nf r o mc h i t i nt h r o u g hd e a c e t y l a t i o n , i t sc h e m i c a ln a m ei sp o l y ( 1 ，4 ) 2 a m i n o 一2 - d e o x y p d - g l u ，i t st h eo n l yn a t u r a la l k a l ip o l y s a c c h a r i d ea n da l s oo n eo ft h en a t u r a lp r o d u c t sw i t hp o s i t i v ec h a r g ei nn a t u r e t h ec h e m i c a lm o d i f i c a t i o no fc h i t o s a ni sv e r ye a s yb e c a u s eo ft h er i c hh y d r o x y la n da m i n oi nm o l e c u l a rc h a i n s i th a sm a n ye x c e l l e n tp e r f o r m a n c e ss u c ha sa n a l g e s i a , h e m o s t a s i s ，p r o m o t ew o u n dr e p a i r , a n t i b a c t e r i a l ，g o o db i o c o m p a t i b i l i t ya n db i o d e g r a d a b i l i t y , s oi t sag r e a td e v e l o p m e n tp o t e n t i a lo fb i o l o g i c a lh e m o s t a t i cm a t e r i a la n dh a si m p o r t a n ta p p l i c a t i o nv a l u ei nt h ef i e l do fm e d i c i n e i nt h ee x p e r i m e n t , w ef i r s td e t e r m i n e dt h eb a s i cp h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e so ft h es e v e nd i f f e r e n tt y p e so fc h i t o s a n ，s u c ha so b s e r v et h ea p p e a r a n c e ，d e a c e t y l a t i o nd e g r e e ，i n t r i n s i cv i s c o s i t y ，v i s c o s i t y a v e r a g em o l e c u l a rw e i g h ，w a t e rc o n t e n t ，a s hc o n t e n t , a c i di n s o l u b l es u b s t a n c e sc o n t e n t ，p r o t e i nc o n t e n t ，h e a v ym e t a lc o n t e n t ，t h ep u r p o s ei st om a k es u r ew h e t h e rt h e mf i tt h es t a n d a r d so fp h a r r n a c e u t i c a lg r a d ec h i t o s a n t h r o u g ht h ee x p e r i m e n t so fd y n a m i cc l o t t i n gt i m e ，c o a g u l a t i o nt i m ei nv i t r o ，p l a s m ar e c a l c i f i c a t i o nc o a g u l a t i o nt i m e ，w es e l e c t e dt h ec h i t o s a nw h i c hh a st h eb e s th e m o s t a s i ce f f e c ta n ds t u d yi t ss u r f a c eh e m o s t a s i sa n dh e m o s t a t i cm e c h a n i s mi nt h en e x ts t e p c o m p a r e dt ot h es e v e nd i f f e r e n tc h i t o s a n ，t h er e s u l t ss h o wt h a tu n d e rt h es a m ed e a c e t y l a t i o nd e g r e e ，t h el a r g e rm o l e c u l a rw e i g h t t h eb e t t e rh e m o s t a s i s ；t h em o l e c u l a rw e i g h ti sm o r eo rl e s s ，t h el o w e rd e a c e t y l a t i o nd e g r e e ，t h eb e t t e rh e m o s t a s i s i nt h es u r f a c eh e m o s t a s i se x p e r i m e n ti nr a t s ，t h es t e r i l i z e dg a u z ea st h ec o n t r o lg r o u p ，i t sc l e a r l yt os e et h ew o u n du s e dt h ec h i t o s a n g e l a t i nm e m b r a n ec a l ls h o r t e rt h eb l e e d i n gt i m e ，r e d u c et h eb l e e d i n gv o l u m es i g n i f i c a n t l y ，g o o da d h e s i o nw i t ht h ew o u n da n da l s oc a ne f f e c t i v e l ys e a lb l e e d i n gw o u n d ，s h o r tt h ew o u n dh e a l i n gt i m e ，a l m o s tn os c a r r i n g t h r o u g ht h ee x p e r i m e n t so ft h ea p t t ，p t ，t t ，e l t ，p l a t e l e ta g g r e g a t i o nt of u r t h e rs t u d yt h em e c h a n i s m so fc h i t o s a nh e m o s t a s i s 。i np l a t e l e ta g g r e g a t i o n ，e s p e c i a l l yf o c u s e do nt h ea d pp a t h w a y n ee x p e r i m e n t ss h o wt h a tc h i t o s a nh e m o s t a t i ch a sn o t h i n gt od ow i t ht h ea p p r o a c h e so fi n t e m a la n de x t e r n a lc o a g u l a t i o n , i tm a yc a u s ep l a t e l e ta g g r e g a t i o nt h r o u g ha d pp a t h w a y ，t h ep r o d u c t so fa g g r e g a t i o nc a na l s or e l e a s eal a r g en u m b e ro fa c t i v es u b s t a n c e ss u c ha sp s e l e c t i na n dt h r o m b o x a n eb e ，t h e yc a na l s o a c t i v et h es u r r o u n d i n gp l a t e l e t s ，p r o m o t ev a s o c o u s t r i c t i o na n df i b r i nf o r m a t i o ne t a lw a y st oe n h a n c eh e m o s t a s i s k e y w o r d s ：c h i t o s a n ，h e m o s t a s i ca c t i v i t y , s c r e e n i n g ，m e c h a n i s m缩略词注释表英文缩写c i sf i b因子i i因子i 因子因子v因子因子因子因子x因子因子因子x p f 3c ta p t tp tt te l tp f 45 h tt x b 2p r pp p p缩略词注释表英文全称c h i t o s a nf i b r i n o g e np r o t h r o m b i nt i s s u et h r o m b o p l a s t i np r o a c c e l e r i np r o c o n v e r t i na n t i h e m o p h i l i cf a c t o rp l a s m at h r o m b o p l a s t i nc o m p o n e n tp l a s m at h r o m b o p l a s t i na n t e c e d e n tc o n t a c tf a c t o rf i b r i n - st a b l e i l i z i n gf a c t op l a t e l e tf a c t o r3c o a g u l a t i o nt i m ea c t i v a t e dp a r t i a lt h o r m b o p l a s t i at i m ep r o t h r o m b i nt i m et h r o m b i nt i m ee u g l o b u l i nl y s i st i m ep l a t e l e tf a c t o r45 - h y d r o x y t r y p t a m i n ep s e l e c t i nt h r o m b o x a n eb ep l a t e l e tr i c hp l a s m ap l a t e l e tp o o rp l a s m ai v中文名称壳聚糖纤维蛋白原凝血酶原组织凝血激素c a 2 +前加速素前转变素抗血友病因子血浆凝血激酶s t u a r t p r o w e r 因子血浆凝血激酶前质接触因子纤维蛋白稳定因子血小板第1 i i 因子凝血时间血浆活化部分凝血酶原时间血浆凝血酶原时间血浆凝血酶时间优球蛋白溶解时间血小板第四因子5 羟色胺p 选择素血栓素b 2富血小板血浆乏血小板血浆独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。签名：备丝蜀日期：竺! 1 2 ：! 竺：型关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。签名：鲞绚导师签名：日期：第一章绪论1 1 壳聚糖的结构和性质1 1 1 壳聚糖的来源及结构第一章绪论甲壳素( c h i t i n ) 的化学名为 1 3 - ( 1 4 ) 一2 一乙酰氨基- 2 一脱氧- d - 葡聚糖 ，是一种维持和保护甲壳动物和微生物躯体的线性氨基多糖【1 1 ，是自然界中贮藏的仅次于纤维素的第二大图1 1 纤维素、甲壳素和壳聚糖的结构天然有机化合物，资源非常丰富，广泛存在于海洋节肢动物、软体动物、环节动物、原生动物、腔肠动物、海藻、真菌( 酵母、霉菌) 和植物( 如蘑菇) 的细胞壁等中，另外动物的关节、蹄、足的坚硬部分，以及动物肌肉和骨骼接合处均有甲壳素存在，是取之不尽的可再生资源，来源广，价格低廉【2 3 】。壳聚糖( c h i t o s a n ，c i s ) 是一种生物高分子聚合物，化学名为【p ( 1 4 ) 2 氨基2 脱氧d 葡聚糖】也是自然界中唯一的天然碱性多糖。它是甲壳素经脱乙酰化处理后的产物，即脱乙酰基甲壳素，又称聚甲壳糖、甲壳胺、聚氨基葡糖、可溶性甲壳素、粘性甲壳素等。由于壳聚糖是由氨基葡萄糖单体通过b 1 ，4 糖苷键连接起来的f i g 1 1t h es t r u c t u r eo f c e l l u l o s e c h i t i na n dc h i t o s a n直链状高分子化合物，其分子链上丰富的羟基和氨基使其易于进行化学修饰而赋于多种功能。其分子结构和甲壳素、纤维素相似，三种物质结构式如图所示( 图1 1 ) 。1 1 2 壳聚糖的性质壳聚糖是白色、无定形、半透明、略有珍珠光泽的固体，它不溶于水和碱性溶液，可溶于稀的盐酸、硝酸等无机酸和大多数有机酸，不溶于稀的硫酸、磷酸。在稀的酸性介质中，壳聚糖分子中的- n h 2 被质子化为( r - n h ”) n ，破坏了壳聚糖分子和分子之间的氢键，使之溶于水，同时壳聚糖的主链也会缓慢水解，溶液的粘度逐渐降低，因此壳聚糖溶液一般是现用现配i j j 。多糖结构对其功能有着显著的影响，结构不同，功能就可能会不同。n 脱乙酰度和江南大学硕士学位论文粘均分子量是壳聚糖两项主要的性能指标【3 】。一般把n 脱乙酰度在5 5 7 0 的称为低脱乙酰度壳聚糖，7 0 8 5 的称为中脱乙酰度壳聚糖，8 5 9 5 的称为高脱乙酰度壳聚糖，9 5 1 0 0 的为超高脱乙酰度壳聚糖，其中后者是极难以制备的。分子量因原料不同和制备方法不同而从数十万到数百万不等【4 引，不同分子量壳聚糖的粘度也不同，使得其有很好的吸附性、成膜性、通透性、成纤性、吸湿性和保湿性。通常把粘度在1 0 0 0 厘泊以上的( 1 壳聚糖醋酸溶液) 定为高粘度壳聚糖，1 0 0 1 0 0 0 厘泊的定为中粘度壳聚糖，1 0 0 厘泊以下的定为低粘度壳聚糖。壳聚糖溶液的粘度与浓度有直接关系，粘度随其浓度的增加而迅速增加，相同浓度时，溶剂的酸性越强，溶液粘度就越低，降解相对也就越快，并且溶液的粘度随存放时间的延长而逐渐下降。在常温下，温度对溶液粘度变化的影响较小，但会影响壳聚糖分子量的降解速度【3 】。壳聚糖溶液不能配制得太浓，对于中等粘度的壳聚糖也只能配制成浓度小于5 的溶液。浓度太大时会转化为胶体，甚至形成溶胀物【6 l 。壳聚糖作为溶液存放和使用时，须处于酸性环境中。由于其具有缩醛结构，在酸性溶液中将发生壳聚糖降解，溶液粘度也随之下降，加入乙醇、甲醇、丙酮等可延缓壳聚糖溶液粘度的降低，以乙醇的作用最为明显【3 】。壳聚糖甲酸溶液比壳聚糖乙酸溶液更稳定【4 】。1 2 壳聚糖的应用近十年来的研究结果表明，甲壳素和壳聚糖在很多方面( 如：医药、生物、化工、环境、纺织、食品、保健品、化妆品、洗涤剂等) 都显示出良好的应用前景。壳聚糖在食品工业中不仅可作为保健食品，也可用于食品的保鲜防腐，果蔬饮料的澄清，用作增稠剂、乳化剂和稳定剂及食品工业的废水处理等【_ 7 】；由于壳聚糖对活性污泥的絮凝作用很强，并且毒性低，又可生物分解，所以在工业上的应用主要是作为重金属离子螯合剂及活性污泥絮凝剂【8 】；在纺织、印染工业中，用壳聚糖处理过的棉、毛织物及化纤品，可提高染色性，改善机械性和耐折皱性，提高耐用水性和电绝缘性【4 】；在农业上研究的焦点是壳聚糖可以提高植物对多种病菌( 尤其对真菌) 及昆虫的抵抗力的应用【9 】。壳聚糖在医药领域的应用一直是科学家们研究的热点，其原因主要表现在以下几个方面【1 0 , 11 , 1 2 】：，( 1 ) 自身有一定的药理活性，如抗菌活性、抗肿瘤活性、抗胆固醇升高、抗感染等特性；( 2 ) 有优良的生物相容性，即血液相容性、组织相容性、无细胞毒性和良好的机体免疫性；( 3 ) 壳聚糖作为多糖的一种，在控制细胞分裂和分化、调节细胞生长和衰老以及维持生命有机体的正常代谢等方面有重要作用：( 4 ) 良好的保湿性能，使其在化妆品和促进伤口愈合等应用方面取得了良好的效果；( 5 ) 链上丰富的羟基和氨基使其易于进行化学修饰，可作为小分子药物或一些大分子药物的载体 1 3 , 1 4 】，可以制成缓释或控释制剂；2第一章绪论( 6 ) 作为天然聚阳离子多糖衍生物，其阳离子性质使其对d n a 或细胞表面具有较强的静电作用，作为基因载体有其潜在的优势。壳聚糖在生物医药领域中的应用包括：( 1 ) 降脂、降胆固醇：近些年来，人们逐渐认识到壳聚糖的心血管保健作用，主要用于降脂、降胆固醇和防止动脉粥样硬化。壳聚糖是一种天然材料，具有强大的阴离子吸附力，适用于降低胆固醇而没有任何副作用，其降脂、降胆固醇的机制为壳聚糖在胃中能与胃酸作用形成凝胶，并进一步吸附甘油三酯、脂肪酸、胆汁酸和胆固醇等形成不溶性的复合物，通过消化系统排出体外【l5 】；并且壳聚糖具有与粗纤维类似的作用，通过胃的排空延迟而促进降血脂作用。( 2 ) 提高机体的免疫能力：壳聚糖具有一般多糖的共性，有调节和增强体液免疫和细胞免疫的功能。其机制为激活补体系统，刺激巨噬细胞活化、激活t 细胞和b 细胞等，诱导一些细胞因子如白细胞介素1 、干扰素、巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子等产生而调节机体的免疫功能。( 3 ) 抗肿瘤作用：抗肿瘤作用是目前壳聚糖研究的一个热点，大量研究发现，水溶性的壳聚糖具有明显的体内抗肿瘤作用，近年来国内外研究者发现，壳聚糖的水解产物氨基葡萄糖也具有抗肿瘤作用，其作用机理可能是n 乙酰氨基葡萄糖或氨基葡萄糖可与巨噬细胞表面受体结合，激活巨噬细胞释放白细胞介素1 ，同时引起t 细胞表面白细胞介素2 受体表达，加速t 细胞分化为成熟的细胞毒性t 细胞，而产生抗肿瘤作用i l6 。( 4 ) 抑菌作用：壳聚糖为广谱抑菌剂，实验证明壳聚糖对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等都有很好的抑制作用，其作用机理是壳聚糖使细菌的细胞壁和细胞膜通透性增加，造成细胞内物质外流，达到抑菌目的。另外，粘均分子量大于1 0 0 0 0d a 的壳聚糖不溶于水只溶于稀酸限制了其在中性条件下的抑菌活性，由此开发了许多水溶性的壳聚糖，发现其在中性条件下具有更好的抑菌活性【l7 。( 5 ) 医用功能材料：甲壳素和壳聚糖具有止痛、止血、促进伤口愈合、抑菌、良好的生物相容性和生物可降解性等优异的性甜博j ，使得壳聚糖在医学领域有着广泛的应用和发展前景，已成功开发为生物支架材料、手术缝合线、止血纱布、人工肾膜、人造皮肤、骨骼修复材料、人工肝脏材料、神经修复材料、眼科材料等医用功能材料【l9 。( 6 ) 药物辅料及载体：壳聚糖及其衍生物作为药物的辅料及载体具有独特的优势，主要因为其在运送药物上能发挥稳定或保护药物中的成分、促进药物的吸收、延缓或控制药物的释放、帮助药物送达靶器官等作用1 2 u j 。我国拥有丰富的甲壳素资源，发展壳聚糖产业具有得天独厚的优势。近年，随着各国对壳聚糖的认识不断提高和应用研究的进一步深化，壳聚糖的特殊的结构特征、特异的理化性质和多重的生理药理效应使得它在医药领域的研究和应用越来越广，壳聚糖相关产品的开发和利用日益朝产业化迈进，使得其得到前所未有的利用，势必产生巨大的经济价值和社会价值【2 。江南大学硕士学位论文1 3 止血药的药理研究1 3 1 血液凝固机制血液凝固简称凝g n ( c o a g u l a t i o n ) 是指血液从流体状态转变成不能流动的凝胶状态的过程，其本质是以纤维蛋白原转变为纤维蛋白为特征。血液凝固机制的两个主要功能是：产生凝血酶以稳定血小板血栓；形成纤维蛋白凝块，机械地阻止血液流出血管。对于凝血过程的研究，m a c f a r l a n e 、d a v i e s 和r a t n o f f 都在1 9 6 4 年分别提出了血液凝固的“瀑布学说 ，即认为血液凝固是一系列凝血因子相继酶解激活的过程，最终生成凝血酶，形成纤维蛋白凝块。据此，可将血液凝固过程大致分为凝血酶原激活物形成、凝血酶形成、纤维蛋白形成三个阶段( 图1 - 2 ) t 2 2 z 3 a 4 1 。ii i! 一i i ! + 一一l：纤维蛋白原上下二三三三二图1 - 2 血液凝固过程f i g 1 - 2p r o c e s so f b l o o dc o a g u l a t i o n1 凝血酶原激活物形成凝血酶原激活物是因子x a 和因子v 、c a 2 + 、p f 3 共同形成的复合物，其中根据因子x 的激活过程的不同，可分为内源性凝血和外源性凝血两条途径。( 1 ) 内源性凝血途径：血管内皮受损后，血浆中的接触因子( 因子x l i ) 与带负电荷的胶原组织接触后，导致因子的激活而启动内源性凝血。因子与带负电荷的异物表面接触而激活的过程称表面激活。x l i a 形成后，一方面可使因子激活为x i a ，另一方面还可激活前激肽释放酶为激肽释放酶，后者以正反馈方式进一步促进x n a 的形成。高分子激肽原作为辅因子可促进因子与因子及前激肽释放酶的激活。x i a 形成后使因子激活形成i x a ，这一过程需c a 2 + 参与。x i a 形成后再与因子、p f 3 和c a 2 + 结合成复合物，4丁恶篓篷土轻十鍪是上第一章绪论即可激活因子x ，使之成为x a 。i x a 与因子、p f 3 、c a 2 + 结合形成复合物是血液凝固过程中一个极为重要的调速步骤，在有因子存在的条件下，i x a 激活因子x 为x a 的速度可提高2 0 万倍。( 2 ) 外源性凝血途径：由于血管、组织受损，血管壁及组织中的组织因子( 因子) 进入血管内，与血管内的凝血因子共同作用而启动的。组织因子是一种跨膜糖蛋白，存在于大多数组织细胞，而以脑、肺、胎盘等组织中尤为丰富。当血管损伤、血管内皮细胞和单核细胞受细菌毒素、免疫复合物刺激时，组织因子得以与血液接触，并作为v l l a 的受体与v l l a 结合形成复合物，在c a 2 + 存在的条件下，迅速激活x 因子，成为x a ，在激活过程中，v l l a 作为蛋白酶而发挥对因子x 的激活作用，而组织因子则起辅因子作用，可使v n a 的催化效力提高1 0 0 0 倍。x a 形成后又可正反馈激活因子，生成更多的x a 。2 凝血酶形成经过内源性或外源性途径生成的xa ，在p f 3 提供的磷脂膜上形成x a v c d + 凝血酶原酶复合物，激活凝血酶原为凝血酶。凝血酶除可催化纤维蛋白原外，还可激活多种凝血因子，如因子v 、使凝血过程不断加速。3 纤维蛋白形成凝血酶形成后可催化血浆中可溶性纤维蛋白原转变为纤维蛋白单体，在xi i i a 和c a 2 + 的作用下，形成不可溶性的纤维蛋白多聚体( 血纤维) ，并网罗血细胞形成凝胶状的血凝块。1 3 2 凝血指标测定的意义促凝血药和止血药研究方法的种类和项目较多，且同一项目又常有多种不同的方法。具有促凝血和止血的中药，其作用除有血管因素参与外，主要是对血浆中各种凝血因子及血小板因子的影响，其主要研究方法包括以下几个凝血指标的测定1 2 5 ，2 6 2 7 】：1 凝血时间( c o a g u l a t i o nt i m e ，c t ) c t 是指血液自离体与异物面接触至凝固所需的时间。血液离体后，接触带负电荷的表面( 玻璃器材) 时，因子被激活，其后一系列凝血因子相继活化，最后使纤维蛋白原转变为纤维蛋白而凝血。c t 的长短主要与血液中各种凝血因子的含量和功能及血液中凝血因素及抗凝血因子的活性有关。测定c t 是观察受试药物对凝血机制有无影响而必须进行的第一个实验。常用的全血c t 测定方法有试管法、凝血板法、玻片法、毛细玻管法。2 活化部分凝血活酶时间( a c t i v a t e dp a r t i a lt h r o m b o p l a s t i nt i m e ，a p t t ) a p t t 是指以各种激活剂( 如白陶土、鞣酸) 激活待检测血浆中的凝血因子和因子，再以磷脂作为凝血的活性表面，激活内源性凝血途径，使凝血酶原转变为凝血酶，凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，导致血浆凝固，记录加入试剂到血浆凝固所需的时间。用于检测内源性凝血途径的功能，与因子i i 、v 、前血管紧张素及高分子量激肽原有关。3 凝血酶原时间( p r o t h r o m b i nt i m e ，p t ) p t 是指在血浆中加入组织因子制剂和钙离子，启动凝血，使凝血酶原转变成凝血酶，凝血酶使纤维蛋白原转变成纤维蛋白，从而促使血浆凝固，记录从加入试剂到血浆凝固所需要的时间。p t 测定为检查外源性凝血系统功能最常用的方法，其长短与血浆中因子i 、i i 、v 、和x 的浓度和抗凝物质的存在有关，同时p t 测定也是血栓与止血实验室常规的基本实验之一。江南大学硕士学位论文4 凝血酶时间( t h r o m b i nt i m e ，t t ) t t 是指在待测血浆中加入适量的凝血酶溶液，纤维蛋白原转化为不溶性的纤维蛋白，从而促使血浆凝固，记录从加入试剂到血浆凝固所需要的时间。t t 测定实验是检查受试者血浆纤维蛋白原转变成为纤维蛋白能力的过筛实验，是检测凝血、抗凝及纤维蛋白溶解系统功能的一个简便实验。5 优球蛋白溶解时间( e u g l o b u l i nl y s i st i m e ，e l t ) 优球蛋白是溶于盐而不溶于水的一类球蛋白，它含有纤维蛋白原、纤维蛋白酶原及其激活物，不含纤溶抑制物。优球蛋白溶解时间较敏感，因其抗纤维蛋白溶解不被p h 为4 5 的醋酸沉淀，故排除了抗纤维蛋白溶酶的影响，e l t 缩短表明纤溶活性增强。e l t 与全血血块溶解实验一样，可以由于纤溶酶原被溶解而出现假阴性，e l t 延长属正常而无意义。1 3 3 血小板功能实验血小板的粘附、聚集、收缩与释放等基本生理特性在止血中有重要意义，在正常循环血液中，血小板处于静息状态，当血管破损时，血小板受到损伤部位激活因素刺激后，血小板开始在受伤部位粘附、活化、释放，然后出现血小板的聚集，成为血小板凝块，起到初级止血作用，接着血小板又经过复杂的变化产生凝血酶，使邻近血浆中的纤维蛋白原变为纤维蛋白，互相交织的纤维蛋白使血小板凝块与血细胞缠结成血凝块，即血栓；同时血小板的突起伸入纤维蛋白网内，随着血小板微丝( 肌动蛋白) 和肌球蛋白的收缩，使血凝块收缩，血栓变得更坚实，能更有效地起止血作用，这是二级的止血作用。伴随着血栓的形成，血小板释放血栓烷a 2 ；致密颗粒和q 颗粒通过与表面相连管道系统释放a d p 、5 羟色胺、血小板第4 因子、d 血栓球蛋白、凝血酶敏感蛋白、细胞生长因子、血液凝固因子v 、和血管通透因子等多种活性物质，这些活性物质通过激活周围血小板，促进血管收缩，促纤维蛋白形成等多种方式加强止血效果。二磷酸腺苷( a d p ) 、花生四烯酸0 蚣) 、血小板活化因子( p a f ) 是体内的活性物质。a d p 通过和血小板膜表面上的特异性受体的结合，增加三磷酸肌醇( i p 3 ) 量，动员胞内贮存的钙离子( c a 2 1 释放到细胞质中，使胞内c a 2 + 浓度升高，而使血小板活化，引起血小板粘附、聚集【2 8 , 2 9 】。在组织缺血时，受损组织释放出a a ，通过环氧化酶途径转变为前列腺素环内过氧化物( p g g l ，p g h 2 ) ，进而增加血栓素a 2 ( t x a 2 ) 的生成t 3 0 】。在脑梗塞心肌梗死患者中，p a f 的产生是明显增加的【3 l 】。在上述血小板活化途径中，a d p 促进t x a 2 生成，而t x a 2 与p a f 可进一步促进a d p 释放，因此a d p 途径居于重要地位【3 2 1 。( 1 ) 血小板粘附( p l a t e l e ta d h e s i o n ) ：是指血小板能够在血小板膜糖蛋白i b 、血浆血管性血友病因子( v w f ) 、内皮成分( 胶原或微纤维) 的作用下粘附于伤1 2 1 、血管、异物表面的生理功能。当血液和异物接触一定时间后，由于血小板粘附在异物表面，使血液中血小板数目减少，测定接触异物前后血小板数之差，即得粘附于异物表面的血小板数，由此可计算出血小板粘附率。常用的方法有玻璃珠柱法。( 2 ) 血小板聚集( p l a t e l e ta g g r e g a t i o n ) ：是指血小板与血小板之间的相互黏附、聚集成团。血小板聚集包括第一相聚集和第二相聚集，第一相聚集( 即初级聚集或原发性聚集)代表血小板聚集物的形成，是由于血管壁损伤部位血小板黏附，通过损伤的组织或红细胞释放出的二磷酸腺苷所致，此相聚集的特点是聚集发生迅速，可逆，即聚集后的血小6第一章绪论板又自行分离。第二相聚集( 即二级聚集或继发性聚集) 代表了血小板的释放过程，此相聚集的特点是聚集过程缓慢，不可逆。通过测定血小板聚集时间的长短即可反映出实验样品对血液中血小板数量的影响。常用的方法是比浊法。( 3 ) 血小板活性物质的释放：血小板含有各种不同的颗粒，每种颗粒释放的成分也有差异，q 颗粒的成分是很快释放的，包括血小板第四因子( p l a t e l e tf a c t o ri v ，p f 4 ) 、有丝分裂因子、渗透因子、p 一血小板球蛋白( p t h r o m b o g l o b u l i n ， 3 - t g ) 等，较强的激活性刺激则引起致密颗粒成分的释放，包括a d p 、c a 2 + 、5 羟色胺( 5 - h y d r o x y t r y p t a r n i n e ，5 h t )等。近年来的研究证明，受激血小板还有血栓素b 2 ( t h r o m b o x a n eb 2 ，t x b 2 ) 、p 选择素( p - s e l e c t i n ) 等的释放。1 4 课题来源本课题是国家自然科学基金8 6 3 项目资助研究工作的一部分，项目名称是“功能性壳聚糖基组织器官止血修复材料的产业化技术研究”，批准号2 0 0 7 a a 0 9 16 0 3 。1 5 课题背景和意义1 5 1 止血材料的研究随着人口老龄化进程的加快、中青年创伤的增加，我国外科手术量快速增加，目前全国每年外科手术量已接近1 0 0 0 万台。手术中的出血和渗血是临床上首要解决的问题，特别是：( 1 ) 多血管的实质性脏器的损伤性出血，如肝、脾、心、肺的手术或创伤出血和渗血，常规的止血方法难以奏效，以致于切除脏器的一部分时常会对机体功能造成很大的永久性损伤；( 2 ) 恶性肿瘤的病灶切除和大范围的淋巴结、转移灶清扫的出血和渗血。在这些情况下，如果不能及时止血、止渗漏则会带来非常危险的并发症，甚至器官衰竭、生命危险等。因此，在手术中采取及时有效的止血、止渗漏措施，促进器官切除断面和组织清扫、创面的修复愈合、防止手术组织间粘连，是提高手术疗效、降低术后并发症和死亡率的关键，具有非常重要的意义，故而有效的止血方法和止血材料极为重要。目前用于体内局部止血的三类医疗器械产品主要有纤维蛋白胶、可吸收性明胶海绵、胶原蛋白海绵、氧化纤维素等，这些止血材料均有不同的止血效果和功能，但总体上止血效果不理想。其中临床应用较为广泛的纤维蛋白胶是从动物血浆中提取的蛋白质生物制品，止血效果好，但存在着一定的抗原性和血液病毒性疾病传播的危险。较为高端的产品是美国强生公司( j o h n s o n & j o h n s o n ) 的可吸收性氧化再生纤维素止血产品( 商品名：s u r g c e l ) ，多糖的原材料不易引起免疫反应，同时制成的编织布或非织物具有一定的拉伸强度和弯曲性能，临床使用较为方便，但氧化再生纤维素的止血速度相对较慢，对于较大的出血止血效果不理想，同时也没有促进创面愈合的功能。最近有研究结果提示，氧化纤维素的酸性可能引起神经纤维变性。因此目前尚缺乏快速止血、生物安全性高且具有愈创功能的生物医用材料。7江南大学硕士学位论文1 5 2 多糖的结构与活性的研究多糖是自然界含量最丰富的生物聚合体，几乎存在于所有生物体，是构成生命活动的四大基本物质之一，也是生命有机体不可缺少的组成部分，并履行一系列不同生理功能。在多糖的研究和应用领域，最吸引人的还是多糖所表现出的抗肿瘤、抗病毒、抗炎和免疫调节等生物活性和功能，对多糖生物活性的研究已经成为当代生命科学、食品科学和药学研究的热门领域。然而在多糖的早期研究中，人们只注意到它作为能源物质以及生物体内骨架结构物质的重要性。由于多糖的各糖基间的连接方式比蛋白质和核酸复杂的多，还存在不同糖环结构、连接位置、异头碳构型( q 或b ) 以及支链等，使多糖结构的测定远比蛋白质和核酸困难，这也是多糖研究比较滞后的重要原因之一。近年，由于多糖结构测定方法迅速发展，基本解决了这一难题，多糖结构和功能的研究也取得了重大的突破。目前，对多糖的结构与活性之间的构效关系还没有完全了解，但通过比较一些多糖的结构和活性也获得了一些初步规律。多糖的糖苷键连接方式、侧链的有无和长短、侧链的连接位置、分子量、溶解度以及在溶液中的链构象等因素都会影响其活性【3 3 】。多糖分子结构的微小变化也会引起生物活性的改变。t l l a l e sc i p f i a n i 等【3 4 】发现了一系列来源于药用植物的具有抗溃疡活性的酸性异木聚糖，其中有两种纯多糖虽然主链相同，但糖醛酸含量、糖基种类及相对分子量都不同，故而其抗溃疡活性也不同。k o i c h ia k i y u a m a等【弱j 测定了对2 ，3 二苄基一4 丁内酯木聚糖( 2 ，3 d i b e n z y l 4 b u t a n o l i d el i g n a n ) 和3 , 4 二苄基四氢呋喃木聚糖( 3 ，4 d i b e n z y l t e t r a h y d r o f u r a nl i g n a n ) 的苄基进行氧化的程度对其抗菌活性的影响。r y ok a k u t a n i 等【3 6 】用酶法制备了一系列不同大小的糖原，用于研究其结构与免疫刺激活性间的关系，结果显示相对分子量和链长是影响糖原活性的主要因素。1 5 3 课题意义1 选用不同种类( 主要是粘均分子量和脱乙酰度) 的壳聚糖，通过不同的凝血指标，从而筛选出止血效果较好的壳聚糖。2 对筛选出的止血效果较好的壳聚糖进行止血机理初步的阐述，对于进一步明确壳聚糖的止血构效关系和阐明其止血机理具有重要的学术意义，对于促进壳聚糖的开发应用、加快壳聚糖产业的发展以及开发新型的医用材料具有很大的应用价值。1 6 国内外研究进展从1 8 2 3 年法国科学家a o d i e r 从甲壳类昆虫翅膀中提取出另一物质，命名为c h i t i n 开始，到后来研究清楚其结构，c h i t i n 是由n 乙酰氨基葡萄糖缩聚而成，或者说组成c h i t i n的单体是n 乙酰氨基葡萄糖，整整用了1 0 0 年【3 j ，而甲壳素的脱乙酰产物便是壳聚糖。从1 8 1 1 年发现甲壳素到1 9 1 0 年间，全世界仅有2 0 篇关于甲壳素和壳聚糖的研究论文发表，科学家的研究工作主要集中在纤维素及淀粉上。1 9 2 6 年至1 9 4 9 年，这一段时间内糖化学和糖生物学的研究很活跃，甲壳素和壳聚糖的研究取得了长足的进步，主要为一些制备方法、化学分析方法及其它的物理化学方面8第一章绪论的性质的研究，此时美国已经开始少量生产甲壳素和壳聚糖，1 9 3 4 年在美国首次出现关于工业制备壳聚糖的专利。我国于1 9 5 2 年开始研究甲壳素和壳聚糖，国内研究于1 9 5 4 年发表第一篇试验报告，1 9 5 8 年我国学者包光迪出版第一本国内关于甲壳素和壳聚糖的书甲壳素的利用；8 0年代上半期在国内第一次掀起研究甲壳素和壳聚糖的热潮，如：1 9 8 3 年化学世界发表的谢雅明的综述文章，1 9 8 4 年，蒋挺大的甲壳素的相转移催化苄醚化，同年发表壳聚糖的絮凝作用的论文，被认为是最早系统研究壳聚糖絮凝作用的论文。2 0 世纪末2 1 世纪初，科学家对壳聚糖的研究主要集中于医药学方面，特别在促进组织修复及止血方面，科学家们做了大量的研究工作，m a l e t t e 等人1 3 7 】在1 9 8 3 年发表了对壳聚糖止血功效的研究，并于同年申请了专利，实验中使用1m l 正常人血，不加抗凝剂1 0m i n 形成血液凝块；加入2m g m l 的壳聚糖醋酸溶液1m l ，凝血时间小于2m i r a 加入0 8m l 上述壳聚糖溶液，凝血时间小于3 5m i n ；加入0 6m l 同样溶液，凝血时间小于4m i n 。实验进一步发现壳聚糖的凝血作用对肝素化的血液同样有效，在5 支盛有肝素化人血的试管中，分别加入上述壳聚糖醋酸溶液1m l 、0 8m l 、0 6m l 、0 4m l 和0m l ，加1m l 壳聚糖溶液出现血液凝块时间为1 5m i n ，加o 8m l 壳聚糖溶液出现血液凝块时间为1 7 5m i n ，加入0 6m l 、0 4m l 壳聚糖溶液出现血液凝块时间则更长一些，而未加壳聚糖溶液的试管中始终未发生凝血，说明壳聚糖可以对肝素化血液促凝；r a o 等【38 】在人、牛、猪、羊、狗、鼠、等多种动物血液中加入2 ( 质量分数) 壳聚糖醋酸溶液，并考察了壳聚糖的全血凝血时间，结果显示，即使是痕量的壳聚糖也能导致所检测的各物种红细胞的聚集，同时较大程度缩短了全血凝血时间。在众多的止血材料中，壳聚糖是一种很有发展潜力的生物止血愈创材料，其止血、抑菌、促进伤口愈合等功能，已成为功能性生物止血材料研究的一个热点。k l o k k e v o i d等【3 9 】报道了壳聚糖溶液治疗兔舌切口流血的效果，流血时间和对照组相比缩短了约4 3 ，并使注入肝素后的流血时间恢复到了正常水平；f u k a s a w a 等【4 0 j 研究发现，壳聚糖具有抑制体内溶解纤维蛋白的活性，降低巨噬细胞分泌纤溶酶原激活剂的能力：w a n g等【4 l 】对壳聚糖海绵和胶原海绵的止血效果研究发现，壳聚糖海绵使用前在2 0 氨水中浸泡一段时间，在兔颈部静脉出血治疗中，两者表现出了止血前相似的流血量，壳聚糖能紧密粘附在肌肉上，而胶原海绵则能轻易脱落；同时壳聚糖还具有一定的抗菌、止痛、促进伤口愈合及减少疤痕的作用是一种理想的伤口敷料1 4 2 , 4 3 】。虽然也有文献提出了多种可能的止血机制，但是到目前为止，壳聚糖止血机理尚未有定论。s u g a m o r i 等人用壳聚糖盐酸盐作止血研究，分别与医用棉、胶原相比，发现壳聚糖能够刺激血小板大量释放p f 4 和d 血小板球蛋白畔】：有人认为壳聚糖可能是通过红细胞相互交联聚集或通过再聚合形成空间点阵诱捕红细胞形成血凝块促进止血的，并且这一过程并不依赖血小板和凝血因子1 4 5 】；有人认为与血液中钙离子的浓度有关，并且能够刺激细胞膜上糖蛋白g