（林木遗传育种专业论文）利用cdna阵列筛选橡胶树抗寒相关基因的研究.pdf

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进一步分析最终筛选出在低温下差异表达的抗寒相关基因：转录因子( 锌 指蛋白基因、m y b ) 、蛋白质合成降解相关的泛素、2 6 s 蛋白酶体，过氧化物酶 体腺苷酸载体基因、能量代谢相关半乳糖1 磷酸尿苷转移酶。 3 在本实验中，还检测到一些在低温胁迫下存在表达变化的“假想蛋白”和 未定名的蛋白。这些蛋白在低温胁迫过程中有上调表达的也有下调表达的，可能 执行某种生物学功能，有的蛋白可能在抗非生物胁迫中具有重要的作用。 4 利用高通量的基因芯片技术，在基因转录水平分析了低温胁迫下橡胶树基 因的表达差异，并初步分析了部分低温下上调表达的基因。为研究橡胶树抗寒胁 迫的分子机理打下基础及大量克隆橡胶树抗寒相关基因提供可能，并为最终分子 培育橡胶抗寒品种作分子理论依据上及物质上的积累和储备。 关键词：巴西橡胶树 抗寒地高辛标记e d n a 阵列 a b s t r a c t i nc h i n a t h er u b b e rt r e ea r em a i n l yc u l t i v a t e di nt h er e g i o na t18 0 2 4 0 n ，w h i c h i st h en o r t ho fr u b b e rc u l t i v a t i n ga r e ai nt h ew o r l d r e c e n t l yy e a r s ，t h eg r o w t ha n d v i e l do fn l b b e rt r e ew a ss e r i o u sa f f e c t e db yc o l dc l i m a t e s ot h ef i r s tw o r kt od oi n n l b b e rt r e eb r e e d i n gi st h a th o wt os c r e e nt h ec o l dr e s i s t a n ts t r a i n s t r a n s c r i p t i o n f a c t o r sc a na c t i v a t eac l u s t e ro fg e n e se x p r e s s i o nt or e s p o n s et h ec o l ds t r e s s i nt h e r e s e a r t ho fc o l dr e s p o n s ei np l a n t s ，o n l yt h ec b fp a t h w a yo fa r a b i d o p s i sw a sc l e a r a n dp u b l i s h e d ，w h i l et h ee x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o nm e c h a n i s mo fc o l dr e s i s t a n tg e n e i nt h ec o l dr e s p o n s er e g u l a t o r yn e t w o r k si su n c l e a r , w h i c hi st h el i m i t a t i o no fc o l d r e s i s t a n tb r e a d i n g i ti sd e v e l o p m e n tr a p i d l yt h a tu s i n gt h em o l e c u l a rb i o l o g yt e c h n o l o g y t oi m p r o v e c o l dt o l e r a l = l c e ，d r o u g h tr e s i s t a n c eo fp l a n t s i nt h i sr e s e a r c h ，w eu s e dt h em e t h o do f c d n aa r r a yt os c r e e nt h eg e n e sr e s p o n s et h ec o l ds t r e s sf r o mt h ee d n al i b r a r yo f r u b b e rt r e e t h er e l a t i o n s h i po ft h e s eg e n e sa n di t sf u n c t i o nw e r ea n a l y z e d t h em a i n r e s u l t sw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 i nt o t a l 。8 4g e n e sw e r ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e du n d e rc o l d s t r e s s a n d21h a d d i 仃e r e n te x p r e s s i o ni nc o l dr e s i s t a n ta n ds e n s i t i v ec u l t i v a r s w eo b t a i n e dp a r t so f g e n e su p r e g u l a t e de x p r e s s e dt or e s p o n s et h el o wt e m p e r a t u r e ，w h i c h w e r er e l a t e dt o m e t a b o l i s mp a t h w a yo rc e l l u l a rp r o c e s s e so rs i g n a lt r a n s d u c t i o n ，a n dw eo b t a i n e dt h e b a s i cg e n ee x p r e s s i o np r o f i l eo f r u b b e rt r e ei n d u c e db yl o wt e m p e r a t u r e 2 f u r t h e ra n a l y z e da n ds c r e e n e ds o m ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dc o l dt o l e r a n tg e n e s a t l o wt e m p e r a t u r e ，w h i c hw e r et r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ( z i n cf i n g e rp r o t e i ng e n e 、m y b ) 、 d r o t e i ns y n t h e s i sa n dd e g r a d a t i o nr e l a t e du b i q u i t i n 、2 6 sp r o t e a s o m e ，m i t o c h o n d r i a l s u b s t r a t ec a r r i e rf a m i l yp r o t e i n ，g a l a c t o s e 一1 一p h o s p h a t eu r i d y lt r a n s f e r a s e 3 i nt h i ss t u d y , a l s od e t e c t e ds e v e r a l ”h y p o t h e t i c a lp r o t e i n s ”a n dt h e u n n a m e d p r o t e i n s ，w h i c hw e r eu p r e g u l a t e do rd o w n r e g u l a t e de x p r e s s i o n t or e s p o n s et h ec o l d s t r e s s t h e s eg e n e sm a yb ep e r f o r m e d t h ei m p o r t a n tb i o l o g i c a lf u n c t i o nw ed o n t k n o w a n ds o m ep r o t e i n sp r o b a b l yp l a ya ni m p o r t a n t r o l et or e s p o n s et h ea b l o t l c s t r e s s 4 t h i sp a p e ru s e dh i g h t h r o u g h p u tg e n ec h i pt e c h n o l o g yt oa n a l y z et h ee x p r e s s l o n p a t t e mo fn l b b e rt r e eb yc o l ds t r e s s a tt h el e v e lo ft r a n s c r i p t i o na n dp r e l i m i n a r i l y a n a l y z e du p r e g u l a t e dg e n e s t h er e s u l t sm a k ei t p o s s i b l et os t u d yt h em o l e c u l 甜 m e c h a n i s mo fc o l ds t r e s sa n dc l o n eal a r g en u m b e ro fc o l d _ r e l a t e dg e n e so fr u b b e r i i t r e e ，a n df i n a l l yc u l t i v a t et h ec o l dt o l e r a n tr u b b e rt r e es t r a i n k e y w o r d s ：h e v e ab r a s i l i e n s i sc o l d r e s i s t a n c ed i gc d n a a r r a y i i i 1 1 1 2 生物膜系统2 1 1 1 3 低温胁迫下植物的生理生化变化2 1 1 2 抗寒相关基因：3 1 1 2 1 调控性抗寒相关基因4 1 1 2 2 功能性抗寒相关基因6 1 1 3 橡胶树抗寒性研究现状。9 1 1 3 1 橡胶低温胁迫下生理生化变化1 0 1 1 3 2 橡胶抗寒相关基因的克隆1 1 1 2 基因差异表达。11 1 2 1 基因差异表达1 1 1 2 2 基因差异表达的高通量分析技术1 2 1 2 2 1 基因表达序列标签( e x p r e s s e d s e q u e n e e t a g ，e s t ) 1 2 1 2 2 2 基因芯片( g e n ec h i p ) 1 3 1 2 2 - 3 基因表达系列分析( s e r i a la n a l y s i so fg e n ee x p r e s s i o n ，s a g e ) ：1 z 1 2 2 4m r n a 差异显示技术1 4 1 2 2 5 消减克隆( s u b t r a c t i v ec l o n i n g ) 1 5 1 3 基因芯片在植物上的应用1 6 1 3 1 寻找特异性相关基因并推测一些已知基因的功能1 6 1 3 2 基因差异表达的研究及新基因发现1 7 1 3 3 研究与抗逆基因表达调控有关的顺式作用元件和反式作用因子，推 测可能的植物抗性机理18 1 3 4 突变性和多态性检测1 9 1 3 5 功能基因组研究1 9 1 3 6 转基因农产品检测和植物检疫。2 0 i i i 1 4 本研究的目的意义2 0 1 5 技术路线2 l 2 材料与方法2 2 2 1 实验材料2 2 2 1 1c d n a 文库2 2 2 1 2 植物材料及处理2 2 2 2 实验方法2 2 2 2 1c d n a 阵列的制备2 2 2 2 1 1 挑克隆摇菌2 2 2 2 1 2 点膜形成c d n a 阵列培养2 2 2 2 1 3 膜上裂解提取d n a 2 2 2 2 1 4 紫外交联固定2 3 2 2 2 橡胶叶总r n a 提取和质量检测2 3 2 2 2 1r n a 提取前准备工作2 3 2 2 2 2 橡胶树叶片总r n a 的提取方法2 3 2 2 2 3 用紫外分光光度法检测r n a 纯度和浓度2 4 2 2 2 4 甲醛变性胶电泳检测r n a 完整性2 4 。 2 2 3 探针制备2 4 2 2 3 1r n a 反转录2 4 2 2 3 2 反转录后c d n a 纯化及d i g 标记2 5 2 2 3 3 c d n a 探针检测2 5 2 2 4 杂交洗涤2 6 2 2 4 1 预杂交2 6 2 2 4 2 杂交? 2 6 2 2 4 3 洗膜2 7 2 2 4 4 检测2 7 2 2 5 图片扫描及数据获取2 7 2 2 6 研究中比较方式2 8 3 结果与分析，2 9 3 1 橡胶树叶片总r n a 的检测2 9 3 2 探针质量检测2 9 3 3 芯片的质量监控3 0 3 4 芯片杂交结果3 0 3 5 不同偏差取值条件和比较方式下差异基因条数3 0 i v 3 6 通过c d n a 阵列获得橡胶树低温胁迫下基因表达谱。3 1 3 6 1 低温胁迫和常温条件的基因表达差异分析3 1 3 6 2 抗寒性与不抗寒橡胶品种差异表达分析3 1 3 6 3 通过c d n a 阵列获得的橡胶树低温胁迫下基因表达谱3 4 3 7 通过c d n a 阵列筛选橡胶树低温胁迫下抗寒相关基因3 4 3 7 1 温度a 、b 、c 三种比较方式比较结果3 4 3 7 2 品种a 、b 、c 三种比较方式比较结果3 5 3 7 3 温度和品种a 、b 、c 三种比较方式下差异表达基因3 6 3 7 4 通过c d n a 阵列筛选获得的橡胶树低温胁迫下抗寒相关基因3 6 4 讨 仑3 7 4 1c d n a 阵列的高通量性3 7 4 2 关于总r n a 反转录对检测低丰度表达基因的问题3 7 4 3 杂交过程中背景高的问题3 7 4 4 通过c d n a 阵列获得的橡胶树低温胁迫下基因表达谱3 7 4 5 通过c d n a 阵列筛选获得的橡胶树低温胁迫下抗寒相关基因3 9 4 5 1 橡胶树低温胁迫下可能的抗寒相关基因3 9 4 5 1 1 转录因子基因锌指蛋白、m y b 3 9 4 5 1 2 蛋白质合成和降解的泛素2 6 s 蛋白酶体途径4 1 4 5 1 3 能量代谢相关的过氧化物酶体腺苷酸载体基因、半乳糖1 磷 酸尿苷转移酶4 2 4 5 2 低温诱导、抗寒品种抗寒基因表达的不同4 2 4 6 后续工作4 2 5 研究总结4 3 参考文献4 4 致谢5 0 v 1 文献综述 1 1 植物抗寒研究 1 1 1 抗寒机理 温度是重要的环境因子之一，限制植物的分布、生长和产量( v i s w a n a t h a n ， 2 0 0 2 ) 。当环境温度降低到一定程度时，植物体就会受到伤害，甚至死亡。根据 低温胁迫的不同程度，植物的低温伤害可以分为冻害( f r e e z i n gi n j u r y ) 和冷害 ( c h i l l i n gi n j u r y ) 两类( 曹仪植等，1 9 8 8 ) 。当温度降低到对植物正常生长产生 影响但还不至于引起结冰时，植物受到的伤害称为冷害。植物受到零下温度的胁 迫而因细胞组织结冰受到的伤害称为冻害( 高煌珠，1 9 8 6 ) 。植物对环境变迁及 不良环境有足够的适应性和抵抗能力，这种抗逆性既受系统进化的遗传基因型所 控制，又受系统发育中生理生态因素所制约。在研究中人们发现植物在长期的进 化中发展了许多对温度逆境的适应能力。例如，许多温带植物在遭受短期的低温 后，会提高自身对低温的耐受性，这种现象称为冷驯化( l e v i t t ，1 9 8 0 ) 。 植物低温驯化包括许多生理生化反应，如蔗糖、甜菜碱、脯氨酸等的增加， 脂膜变化，蛋白表达等。植物抗寒的生理生化变化是通过低温改变基因表达而引 发的，并且已经克隆了许多相关的基因( h u n g h e s ，1 9 9 6 ) 。“低温”信号传入细 胞、启动或阻遏基因表达需要一个复杂的信号系统，其中包括c a 2 + 、a b a 、蛋 白磷酸化酶、蛋白激酶和一些转录因子等。从第一个低温诱导基因被分离( g u y ， 1 9 8 5 ) 到现在已经分离了许多相关基因，也得到适应低温的许多突变体和转基因 植物。植物的抗寒性是由多基因控制和调节的，要想有效地提高植物的抗寒性， 对于植物感受和传导寒冷信号的机制，即转录因子怎样调控各种抗寒基因的表 达，抗寒基因如何发挥抗寒活性，只有弄清抗寒分子机理，进一步利用现有的生 物化学与分子生物学手段分离、鉴定抗寒基因新成员，才能更有效地应用到植物 抗寒育种中。 1 1 1 1 f 氐温引起植物寒害的原因 当温度降低到对植物正常生长产生影响但还不至于引起结冰时，植物受到的 伤害称为冷害。冷害影响到植物大部分代谢和生理过程，低温胁迫下植物体内原 生质流动减慢或停止( 李建龙，2 0 0 2 ) ；叶绿素合成受抑制，叶绿体结构被破坏， 光合作用减弱；物质代谢的分解作用大于合成作用，蛋白质、糖类物质分解并形 成一些有毒的中间产物；根系吸水能力减弱，吸水不足以补偿蒸腾的消耗，造成 地上部分干枯死亡；形成层破坏，有机物质运输受阻；呼吸作用出现异常( 曹仪 植等，1 9 8 8 ) 等。 低温引起植物胞外或胞内结冰，由于胞外空间冰点较高且有一些灰尘或冰核 细菌作冰核，所以胞外先于胞内形成冰晶。冰晶溶液比液态溶液的水势低得多， 并且温度越低水势差值越大，因而胞内的水分通过质膜流出，导致细胞严重脱水 ( g u ye ta l ，1 9 9 0 ) 脱水会对细胞产生多种伤害，包括对膜的结构和功能造成的 伤害。 1 1 1 2 生物膜系统 生物膜是植物细胞及细胞器与环境的一个界面结构，大量研究表明，植物冷 害首先发生在细胞膜系统( l e v i t te ta l ，1 9 8 0 ；s t e p o n k u se ta l ，1 9 9 3 ) 。而膜系统 的损伤首先是冷冻引发的细胞严重脱水所致，严重脱水导致生物膜发生膜脂相 变，细胞器膜结构的破坏，是植物在低温逆境中造成伤害和死亡的重要原因( 简 令成、吴素萱1 9 6 5 ) 。h e b e r ( 1 9 6 8 ) 通过菠菜分离叶绿体的冰冻实验，精确地证 实冻害首先是破坏叶绿体的膜结构，然后才导致光合磷酸化( a t p 酶) 的失活。 此后，大量研究结果进一步揭示和证实，低温对细胞膜体系的损伤是造成植物 寒害的根本机制，其主要原因是由于冰冻引起的细胞脱水而导致膜脂双层向六 角形i i 相的转变以及膜的破裂( 简令成，1 9 8 3 ；s t e p o n k u s e ta l ，1 9 9 3 ) 。由此 可见，植物的抗寒力是决定于膜结构的冷稳定性。植物在低温锻炼后抗寒力的 增强，是由于这种低温锻炼提高了膜的冷稳定性( 简令成，1 9 8 3 ；简令成等， 1 9 9 4 ) 。所以，探讨提高膜的冷稳定性的因素是增强植物抗寒力的根本途径( 简 令成等，1 9 9 4 ) 。 1 1 1 3 低温胁迫下植物的生理生化变化 1 1 1 3 1 渗透调节物质积累 植物在环境胁迫下会产生一些具有保水作用的渗透调节物质，如脯氨酸、甜 菜碱、可溶性糖和醇类物质等( 陈建新，2 0 0 0 ) 。在低温胁迫下，植物通过诱导 渗透调节物质的生物合成酶基因的大量表达，可以增加这类物质的积累，维持渗 透压的平衡，从而避免低温伤害( 周筱娟，2 0 0 4 ) 。 低温下植物不饱和脂肪酸增加，并且质膜中磷脂含量及其与蛋白比值也发生 变化，从而提高质膜的稳定性。例如自由脯氨酸含量的变化，低温条件下，游离 脯氨酸的大量积累被认为是对低温胁迫的适应性反应。番茄积累脯氨酸的体细胞 突变体中，脯氨酸积累与其抗寒性提高一致( d e l a u n e ye ta l ，1 9 9 3 ) ，植物在寒 冷驯化过程中糖、甜菜碱、氨基酸( c h o l e w ae ta l ，1 9 9 7 ) 等渗透物质也可以提 高膜系统的稳定性。但是拟南芥寒冷驯化中脯氨酸水平的增加却发生在抗寒性提 2 高之后，还发现有一些突变体与不顺应的野生株一样具有很低的脯氨酸水平，但 是却具有抗寒能力( w a n n e re ta l ，1 9 9 9 ) 。同样糖、甜菜碱、氨基酸( c h o l e w ae t a l ，1 9 9 7 ) 等渗透物质、可溶性蛋白、膜脂组分等与抗寒性的关系均没有定论， 因此w a n n e r 等推测在植物寒冷驯化是所发生的生理生化变化中。一些是提高抗 寒性必需的，而另外一些不是必需的，仅仅是低温的结果( w a n n e re ta l ，1 9 9 9 ) 。 植物抗寒性是一个数量性状，在如此多的变化中，区分哪些变化使植物产生了抗 寒能力似乎是很困难的( x i ne ta l ，2 0 0 0 ；t h o m a s h o we ta l ，1 9 9 9 ) 。 1 1 1 3 2 酶系统与植物抗寒性及抗氧化酶活性的变化 植物抗寒性是植物对低温逆境长期适应而形成的一种生理遗传特性。抗寒能 力的作用过程：基因一蛋白质( 酶) 一代谢一生理功能的过程。一般情况下抗寒 植物的细胞酶系在较低温度条件下仍较稳定，但对于来自热带的冷敏感植物而 言，在引起冷害的临界温度条件下往往会导致多种酶系结构、功能或数量发生变 化( 刘祖棋等，1 9 9 4 ) 。在植物低温适应机理中酶分子多态性方面的研究发现， 植物抗寒能力的变化与许多酶系统构型变化、同工酶的改组及功能活力的改变有 关。在多酶系统中，每一种酶的活性都受温度的影响，产生特异形态的反映，其 综合结果就是使它们能在低温下行使其功能，保证各类物质代谢的适应性变化， 为抵抗低温损害提供物质基础( 简令成等，2 0 0 1 ) 。 当植物遭受低温时，生物膜发生相变，膜结构发生改变，使膜上酶系活性发 生变化，引起细胞生理生化过程异常。低温下植物体内积累过多的对植物有毒害 作用的活性氧( r o s ) 。过剩的活性氧会导致膜脂过氧化加剧，引起膜蛋白的变 性，最终导致植物受到伤害和死亡( a p e l k ，2 0 0 4 ) 。植物抗氧化酶系统包括超氧 化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、过氧化物酶( p o d ) 、抗坏血酸过氧 化物酶( a p x ) 和谷胱甘肽还原酶( g r ) 等。低温胁迫下这些抗氧化酶活性会 发生变化，冷敏感植物在低温胁迫下抗氧化酶活性呈先增加后下降的趋势；而抗 冷植物在低温胁迫下能维持较高的抗氧化酶活性( p a y t o np ，2 0 0 1 ： 杨盛昌， 2 0 0 3 ； z h o ub y ，2 0 0 5 ) 。 1 1 2 抗寒相关基因 植物在低温胁迫下，会产生一系列生理生化反应，诱导一系列基因的表达。 不同植物反应不一样，一些植物表现为原有蛋白质表达水平的增加，一些植物则 产生低温诱导蛋白。植物低温诱导蛋白是植物在低温作用下由于基因表达的改变 而诱发合成的新蛋白质( 林善枝，2 0 0 4 ) 。最早发现的植物低温诱导蛋白是b r i g g s 和s i m i n o v i t c h 在越冬期黑槐树皮中发现的2 3 条新蛋白谱带( b 对g g sdr ， 1 9 4 9 ) ，随后人们在大量植物中发现低温蛋白的产生。但人们对不同植物材料中 和不同低温诱导条件下出现的诱导蛋白之间的异同以及它们提高植物抗寒性的 机理仍然不是很清楚。 冷胁迫诱导基因的表达产物按其作用可分成两大类。一类是保护基因，直接 保护细胞免受环境胁迫的伤害的具有编码功能蛋白的基因。如l e a 蛋白、渗调 蛋白、抗冻蛋白、水通道蛋白、伴侣蛋白、脂肪酸去饱和酶和脂肪迁移蛋白等功 能蛋白，为各种渗透保护剂的生物合成所需的酶以及清除活性氧自由基 ( g i b s o n e ta 1 ，1 9 9 4 ；h u g h e se ta 1 ，1 9 9 6 ；i n g r a i ne ta 1 ，1 9 9 6 ；s h i n o z a k ie ta 1 ， 1 9 9 7 ；b r a y ，1 9 9 7 ) 。另一类是调控基因，编码调节蛋白的基因。包括转录因子 ( 如b z i p 转录因子、m y c 转录因子、m y b 转录因子及d r e b 转录因子等) 、 蛋白激酶和与磷酸肌醇代谢有关的酶等， 信号中起重要作用( t h o m a s h o w ，1 9 9 0 ； 1 1 2 1 调控性抗寒相关基因 1 1 2 1 1 蛋白激酶基因 它们在调控基因表达、感应和转导胁迫 刘强等，2 0 0 0 ) 。 蛋白激酶是真核细胞信号传导的重要组分，参与环境胁迫信号的传递是蛋白 激酶的重要功能之一，蛋白激酶主要催化蛋白质的磷酸化，刘强等( 2 0 0 0 ) 从模 式植物拟南芥中克隆了一些同时受干旱、高盐及低温诱导的蛋白激酶编码基因， 分别编码受体蛋白激酶( r p k ) 、促分裂原活化蛋白激酶( m a p k ) 、核糖体蛋白 激酶以及转录调控蛋白激酶。在众多的蛋白激酶中m a p k 研究得较清楚。从拟 南芥中分离到的被干旱、高盐及低温胁迫诱导的m a p 蛋白激酶基因有a t m p k 3 ( 编码m a p k 激酶) 和a t m e k k i ( 编码m a p k k k 激酶) 两种。m i z o g u e h i 等人利 用酵母t w o h y b r i ds y s t e m 方法证明，a t m e k k l 参与了拟南芥植物中传递干旱、 高盐、低温以及触伤胁迫信号的m a p 激酶级联途径。a t p k 6 和a t p k l 9 是从拟 南芥中分离的核糖体蛋白激酶基因( m i z o g u e h ie ta l ，1 9 9 5 ) 。基因表达特性研究 表明，它们均被干旱、高盐及低温诱导，仅在诱导的表达时间上略有差异。转录 调控蛋白激酶基因是最近从拟南芥果实中分离鉴定出的一种新的蛋白激酶基因， 它编码的氨基酸序列与酵母d b q 基因编码的氨基酸序列具有很高的同源性，因 此定名为a t d b f 2 ( l e ee ta l ，1 9 9 9 ) 。a t 。d b f 2 激酶在拟南芥信号传递中的功能 目前尚不了解。植物蛋白激酶通过多重复杂的信号传导途径对干旱、高盐及低温 胁迫作出反应，不同传递途径之间存在交叉转导作用( b o g r ee ta l ，1 9 9 7 ) 。它们 分别在感受外界刺激、参与信号传递、增加蛋白质合成及调控转录等不同方面起 重要作用。 4 1 1 2 1 2c r l 胁i 也元件 y a m a g u c h i s h i n o z a k i ( 1 9 9 4 ) 从r d 2 9 a 基因启动子中鉴定出一个9 b p ( t a c c g a c a t ) 的d n a 调控元件，命名为d r e 元件( d e h y d r a t i o n r e s p o n s i v e e l e m e n t ) 。同年，从c o r l 5 a 基因的启动子中又鉴定出另一调控元件c r t ( c r e p e a t ，t g g c c g a c ) ( b a k e re ta 1 9 9 4 ) 。这两个元件均含有c c g a c 核心序 列，即l t r e ( 1 0 w - t e m p e r a t u r e r e s p o n s i v ee l e m e n t ) 元件( j i a n ge ta l ，19 9 6 ) 。 c r t d r e 是一种d n a 调节元件，能刺激转录而对低温和水份缺乏作出反应， c r t d r e 调节子的表达提高了植物的耐冻性和耐早性。c r t d r e 存在于 c o r 6 6 ，c o r l 5 a ，c o r 4 7 和c o r 7 8 等基因的启动子上，因而成为c o r 基因 表达的调节物。 1 1 2 1 3c b f d r e b 转录因子基因 在低温信号传导途径的研究过程中，对大量的冷相关基因的结构分析结果表 明，多数冷相关基因的启动子区域都存在顺式作用元件- - c r t d r e 核心序列元 件，如拟南芥的c o r l 5 a 、油菜的b n l l 5 和小麦的w c s l 2 0 等。现已分离了拟南 芥中与d r e c r t 特异结合的蛋白质( s t o c k i n g e re ta 1 ，1 9 9 7 ；l i ue ta 1 ，1 9 9 8 ) ， 这些蛋白质被命名为失水应答元件结合蛋白( d r e b i n d i n gp r o t e i n s ，d r e b ) 或 c 重复区结合因子( c r t - b i n d i n gf a c t o r s ，c b f ) ，包括d r e b l b ( c b f l ) ，d r e b l a ( c b f 3 ) ，d r e b l c ( c b f 2 ) ，d r e b 2 a 和d r e b 2 b 。它们特异地结合到d r e c r t 元件上，调控冷相关基因的转录，诱导抗寒及抗旱的发生。h a a k e 等( 2 0 0 2 ) 又 发现了这个家族中的第4 个成员c b f 4 。c b f l 、c b f 2 和c b f 3 这3 种c b f 结合 到c o r 基因的d r e 序列上，诱导一系列c o r 基因的表达，因此有人认为c b f 转录因子是低温时激活一些c o r 基因的开关。 c b f 家族基因都含有相同的a p 2 结构域，a p 2 是一种d n a 结合结构域， 约6 0 个氨基酸，在拟南芥a p e t a l a 2 、a i b t e g u m e n i a 、t i n y 及其他一些 蛋白中也存在，其作用是与c o r 基因启动子中的c r t d r e 片段结合，诱导抗 寒及抗旱的发生( g i l m o u r sj ，1 9 9 8 ；s h i n o z a k i k ，2 0 0 0 ) 。 当把植物转移到低温但非冰冻的条件下，1 5 m i n 后c b f 转录水平将明显提 高，持续2 h 左右( g i l m o u r ，1 9 9 8 ；l i u ，1 9 9 8 ) 。g i l m o u r ( 2 0 0 0 ) 等将c b f 3 基 因导入拟南芥，不需低温刺激就可诱导一系列c o r 基因如c o r 6 6 、c o r l 5 a 、 c o r 4 7 和c o r 7 8 等的表达，使未经低温驯化的植株就有较高的抗冻性。j a g l o 等( 2 0 0 1 ) 将c b f l 与c a m v 3 5 s 启动子融合构建了表达载体，然后转化甘蓝油菜， 其转基因植株的低温和干旱抗性升高( 甄伟等，2 0 0 0 ) 。 在所有的低温应答元件中，c b f ( d r e b i ) 基因起调控响应低温胁迫网络节点 的作用。c b f 通路主要包括两步级联放大步骤( t h o m a s h o w 等2 0 0 1 ) ：第一步， c b f 基因的诱导表达，即正常生长温度下存在的一些未知激活因子( 如：i c e ) 能 在低温下诱导c b f 基因家族的表达；第二步，c o r 基因的诱导表达，即c b f 诱导下游逆境基因的表达。这种级联放大能使植物迅速启动多种生理变化，以应 对低温对植物造成的伤害。h o s i 是一个c b f s 的负调节蛋白，f r y z 为转录阻 遏蛋白，l o s 2 、s e r 6 、i c e 为正调节蛋白。最近的结果显示拟南芥c b f s 的表 达也被a b a 、光和生物钟所调控。这些说明在c b f 低温响应途径和非温度信号 传导途径之间的存在着广泛交互作用。 1 1 2 。1 4 a b a 应答基因( a b r e ) 另一个研究较多的顺式作用元件是脱落酸应答元件( a b ar e s p o n s i v e e l e m e n t ，a b r e ) 。脱落酸( a b a ) 在植物发育的诸多重要过程( 如胚胎发育、种子 休眠与萌发等) 中起重要的调节作用。同时，又在植物对逆境胁迫( 干旱、低温等) 的反应中起着共同调节因子的作用( 向旭等，1 9 9 8 ) 。a b a 应答基因包括两种类型 ( k i y o s u e ，1 9 9 4 ；向旭，1 9 9 8 ) ：a b a 依赖型，即该基因的表达依赖a b a 的积累； a b a 非依赖型，即该基因表达除受a b a 的影响外，还受其它因子( 如干早、低 温等) 的影响，a b a 的存在对其表达不是必需的，如大部分l e a 基因、c o r 4 7 、 i i t 4 5 等。通过对多种a b a 应答基因启动子元件的顺序比较，可以发现所有a b a 应答基因上游均含有相同的a c g t 核心序列。 a b a 也可诱导拟南芥中冷相关基因的表达。由这点开始信号传导途径一分 为二，依赖a b a 途径和不依赖a b a 的途径( s h i n o z a k i ，1 9 9 6 ) 。h a a k e ( 2 0 0 2 ) 报道，冷诱导表达的拟南芥c b f l 、c b f 2 、c b f 3 基因是不依赖于a b a 的，而 干旱诱导表达的c b f 4 基因是由a b a 控制的。 研究发现随着a b a 水平的增加，c b f l 3 转录物水平也提高，低温诱导c b f 转录因子和非低温诱导c b f 4 两者都可能由a b a 调控，并激活c r l 胁i 也的表 达( j a g l o o t t o s e n ，1 9 9 8 ；l i u ，1 9 9 8 ；g i l m o u r ，2 0 0 0 ) 。与以前的数据相同，c b f 表达水平的增加可以诱导冷相关基因的表达，在a b a 处理后c b f 蛋白水平有明 显的增加，说明a b a 诱导c b f l 3 转录物水平增加可激活c r t 的表达。因此 c r t 的激活作用也经由新的a b a 诱导信号途径。因此，交互作用发生在两个被。 认为互相分离的途径，包括两套不同的转录因子和一定条件下，干旱途径修复 c b f ( k n i g h t ，2 0 0 4 ) 。 1 1 2 2 功能性抗寒相关基因 1 1 2 2 1 冷诱导基因c o r 低温驯化诱导了大量的蛋白质的合成，其中大多数既可对低温作出快速反 应，又能受a b a 和脱水胁迫的诱导，称为冷诱导基因( c o l d - i n d u c e dg e n e s ) 或 冷调节基 ( c o l d r e g p t l a t e dg e n e so rc o l d r e s p o n s i v eg e n e s ，c o r ) 。j a g l o o t t o s e n 等 ( 1 9 9 8 ) 在拟南芥中利用共隔离分子标记法发现，c o r 基因包括c o r 6 6 、 6 c o 特性、简单的氨基酸组成( 即仅由几种氨基酸组成) 和重复的氨基酸序列，且可 溶于水相缓冲液中。c o r 基因由4 个基因族组成，每个基因族又是由2 个基因 一前一后串联组成，在低温、干旱及受脱落酸( a b a ) 诱导的胁迫中都表达。进一 步研究发现，这4 个c o r 基因分散分布在拟南芥基因组中，它们既不与c b f 基 因连锁，各自之间也不相互连锁。 模式植物拟南芥的c o r l 5