（老年医学专业论文）急性冠脉综合征患者恶性事件预测蛋白的研究.pdf

素本课题由下列研究基金联合资助完成： 科技部“8 6 3 课题( n o ：2 0 0 6 a a 0 2 2 4 3 7 ) m i l i l l 1 1 | 1 1 1 1 i i l l l l f i i i7 9 7 614 0f 一，illr 研究生 秉承我院“敬业、勤 文是我本人在导师指导下 了文中特别加以标注和致 经发表或撰写过的研究成 书而使用过的材料，对本 明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料 论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 日期： 军医进修学院 研究生学位论文版权使用授权书 本人保证毕业离院后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为军医 进修学院或解放军总医院。学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文 原件、复印件和电子版本，可以采用影印、缩印、扫描或其他手段保存论文 以供被查阅和借阅。学院可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除 外) 。 论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 日期： 目录 英文缩略词表( 1 ) 中文摘要( 2 ) 英文摘要( 4 ) 前言( 6 )刚蟊( ) 原理( 1 0 ) 研究对象、内容与方法( 1 2 ) 实验材料与方法( 1 4 ) 结果( 1 9 ) 讨论( 3 8 ) 结论( 4 1 ) 参考文献( 4 2 ) 文献综述 蛋白质指纹图谱技术在心脑血管疾病研究中的应用( 4 8 ) 攻读学位期间发表文章情况( 5 8 ) 致谢( 5 9 ) 军医进修学院硕i ：论文 英文缩略词表 缩略词英文全称 中文全称 a c s a m i b w s b p s c a k d a m a c e m a l d i t o f m s m b w c x m s m z n s t e m i p b s p f t p r o b n p s e l d i t o f m s s p a s t e m i t n u a 2 d e a c u t ec o r o n a r ys y n d r o m e a c u t em y o c a r d i a li n f a r c t i o n b i o m a r k e rw i z a r ds y s t e m b i o m a r k e rp a r e r ns y s t e m c o r o n a r ya t h e r o s c l e r o s i s k i l o d a l t o n m a j o ra d v e r s ec a r d i o v a s c u l a re v e n t s m a t r i x a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o n t i m eo ff i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y m a g n e t i cb e a d so fw e a kc a t i o n i ce x c h a n g e m a s ss p e c t r o m e t r y m a s s - t o c h a r g er a t i o n o n - s t - s e g m e n te l e v a t i o nm y o c a r d i a li n f a r c t i o n p h o s p h a t eb u f f e rs a l i n e p r o t e i nf i n g e r p r i n t i n gt e c h n o l o g y b r a i nn a t r i u r e t i cp e p t i d ep r e c u r s o r s u r f a c e e n h a n c e d l a s e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o n t i m e o f - f l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y s i n a p i n i ca c i d s t s e g m e n te l e v a t i o nm y o c a r d i a li n f a r c t i o n t r o p o n i n u n s t a b l ea n g i n a 2 dg e le l e c t r o p h o r s i s 急性冠脉综合征 急性心肌梗死 生物标记指南系统 生物标记模块系统 冠状动脉粥样硬化 千道尔顿 主要恶性心血管事件 基质辅助激光解析 电离飞行时间质谱 弱阳离子交换磁珠 质谱 质荷比 非s t 段抬高性 心肌梗死 磷酸盐缓冲溶液 蛋白指纹图谱技术 脑钠肽前体 表面增强激光解析电 离飞行时问质谱 芥子酸 s t 段抬高性心肌梗死 肌钙蛋白 不稳定性心绞痛 双向凝胶电泳 军医进修学院硕上论文 急性冠脉综合征患者恶性事件预测蛋白的研究 中文摘要 背景蛋白质指纹图谱技术( p r o t e i nf i n g e r p r i n t i n gt e c h n o l o g y ，p f t ) 是 蛋白质谱芯片和磁性微球两项分离技术与生物质谱s e l d i t o f m s 或 m a l d i t o f m s 的联合应用，通过对比分析患者蛋白质图谱与正常人图谱， 发现新的疾病相关特异性蛋白质，该技术具有高灵敏度、高特异度，检测蛋 白质分子量范围较大、精确的特性。p f t 现已成为检测分析疾病早期蛋白质 变化、寻找疾病相关生物标志物的全新方法。 目的通过p f t 对于急性冠脉综合征( a c s ) 患者进行筛查，以期寻找 对a c s 近期、远期主要恶性心血管事件( m a c e ) 预后具有预测价值的蛋白 标记物。 方法连续入选符合条件的a c s 患者2 4 4 例，根据患者住院期间以及发 病一年内是否出现m a c e 进行分组，采用p f t 比较两组患者蛋白表达峰值 的差异，确定可能与早期和一年预后相关的标志蛋白。 结果经过b w s 、b p s 软件分析发现，除目前已被广泛接受的肌钙蛋白 及脑钠肽前体具有预测预后作用之外，有1 1 个蛋白在发生近期m a c e 者中 表达减低，有6 个蛋白在发生近期m a c e 者中表达增高；质荷比为 1 1 5 1 1 1 6 d a 、2 4 7 1 5 0 7 d a 、2 8 6 7 1 8 d a 及2 0 8 6 7 1 4 d a4 个蛋白质组成的模块 可将近期m a c e 者与未发生m a c e 者准确地分组，灵敏度为8 3 3 ，特异 性为8 0 9 ，对于a c s 患者近期m a c e 的发生具有较高的预测能力。同时 发现有5 个蛋白在发生远期m a c e 者中表达明显减低，有8 个蛋白在发生远 期m a c e 者中表达增高，质荷比为6 1 1 3 5 i d a 、7 9 4 2 5 8 d a 、2 0 8 6 7 1 4 d a 及 l1 9 7 1 0 3 d a 蛋白质组合的模块可将远期m a c e 者与未发生m a c e 者准确地 分组，灵敏度达到8 6 1 ，特异性为9 0 o ，对于a c s 患者远期m a c e 的发 生具有较高的预测性。并且验证近期预后与远期预后两蛋白组合中的8 个蛋 白质与患基础病变( 糖尿病、不同分支冠脉病变) 无相关性( p 0 0 5 ) 。 比较分析发现，近期预后中质荷比为4 3 8 1 0 9 d a 在恶性心律失常者中高 2 3 军医进修学院硕上论文 b i o m a r k e r sf o rt h ep r e d i c t i o no fm a j o ra d v e r s e c a r d i o v a s c u l a re v e n t si np a t i e n t sw i t ha c u t ec o r o n a r y s y n d r o m e a b s t r a c t b a c k g r o u n d ：t h e p r o t e i nf i n g e r p r i n t i n gt e c h n o l o g y ( p f t ) ，c o m b i n e d t h es e p a r a t i o nt e c h n i q u eo fp r o t e i n u mc h i pa n dm a g n e t i cm i c r o s p h e r ea n dt h e b i o t e c h n o l o g yo fm a s ss p e c t r o m e t r y ，h a sa c c e l e r a t e dc l i n i c a lr e s e a r c ha n do f f e r e d b r o a d e rs e a r c h e sf o rf i n d i n gn o v e lb i o m a r k e r si nas e r u mp 0 0 1 a i m ：t h ea i mo ft h i ss t u d yi st of i n dn o v e lb i o m a r k e r sf o rp r o g n o s i so f m a j o ra d v e r s ec a r d i o v a s c u l a re v e n t s ( m a c e ) i np a t i e n t sw i t ha c u t ec o r o n a r y s y n d r o m e ( a c s ) m e t h o d s ：w ee n r o l l e d2 4 4e l i g i b l ea c s p a t i e n t s ，a n dc o m p a r e dt h e p r o t e i ns e x p r e s s i o na m o n gp a t i e n t sw i t ho rw i t h o u tm a c e a tt h ef o l l o w - u po f o n em o n t ha n do n e y e a r t od e t e r m i n eb i o m a r k e r sf o rp r o g n o s i s ，w ep e r f o r m e d m a s ss p e c t r o m e t r ya n a l y s i sb yp f t r e s u l t s ：w ef o u n d17p r o t e i n si nt h es e r u mt h a tc a nb eu s e dt oc l a s s i f y a c s p a t i e n t sw i t ho rw i t h o u tm a c e i nas h o r t t e r mp r o g n o s i sb yb i o m a r k e r w i z a r ds y s t e ma n db i o m a r k e rp a t t e ms y s t e m ；i nw h i c h6s p e c i f i cp r o t e i np e a k s w e r ei n c r e a s e da n d11s p e c i f i cp r o t e i np e a k sw e r ed e c r e a s e di np a t i e n t sw i t h m a c e ，r e s p e c t i v e l y w eo b t a i n e d4p r o t e i n s ( 115 11 16 d a ，2 4 715 0 7 d a ， 2 8 6 7 18 d aa n d2 0 8 6 7 14 d a ) c o m p o s i n gu pm o d u l a rm a r k e r sp a t t e r nt op r e d i c t p a t i e n t sw i t hm a c e ，w i t h8 3 3 s e n s i t i v i t ya n d8 0 9 s p e c i f i c i t y m e a n w h i l e ，w ef o u n d13p r o t e i n si nt h es e r u mt h a tc a nb eu s e dt oc l a s s i f y a c s p a t i e n t sw i t ho rw i t h o u tm a c e i nal o n g r u np r o g n o s i s ，n a m e l y ，8s p e c i f i c p r o t e i np e a k si n c r e a s e da n d5s p e c i f i cp r o t e i np e a k sd e c r e a s e di np a t i e n t sw i t h m a c e ，r e s p e c t i v e l y 4p r o t e i nc o m p o n e n t s ( 6 113 51d a ，7 9 4 2 5 8 d a ，2 0 8 6 7 14 d a a n d119 71 0 3 d a ) w e r ea l s oh i g h l ys e n s i t i v e ( 8 6 1 ) a n ds p e c i f i c ( 9 0 0 ) i n p r e d i c t i n gp a t i e n t sw i t hm a c e t h e s ep e a k sr e l i a b l yp r e d i c tm a c e o c c u r r e n c e i np a t i e n t sw i t ha c s ，i na d d i t i o nt ot h ew i d e l ya c c e p t e dm a r k e r so ft r o p o n i n ( t n ) a n db r a i nn a t r i u r e t i cp e p t i d ep r e c u r s o r ( p r o - b n p ) 4 军医进修学院硕十论文 i nt h es h o r t - t e r mp r o g n o s i so fm a c ei na c s p a t i e n t s ，t h ec h a r a c t e r i s t i c c h a n g e si n c r e a s e da tt h ep e a k so f m z4 381 0 9 d af o rm a l i g n a n ta r r h y t h m i a ，o f m z2 213 5 4 d af o rr e c u r r e n ti s c h e m i ce v e n t a n do fm z1 151 1 16 d af o rh e a r t f a i l u r e ；w h i l ed e c r e a s e da tt h ep e a k so fm z9 2 9 8 3id af o rs u d d e nd e a t h i nt h e l o n g r u np r o g n o s i so fm a c e ，h o w e v e r ，t h ec h a r a c t e r i s t i cc h a n g e si n c r e a s e da tt h e p e a k so f m z117 0 4 9 0 d af o rm a l i g n a n ta r r h y t h m i a ；w h i l et h ec h a r a c t e r i s t i c c h a n g e sa tt h ep e a k so f m z6 11 3 5i d a i n c r e a s e df o rr e c u r r e n ti s c h e m i ce v e n tb u t d e c r e a s e df o rs u d d e nd e a t h c o n c l u s i o n ：t h e s ei d e n t i f i e dp r o t e i n sc o u l dp o t e n t i a l l yb eu s e da s p r e d i c t i v eb i o m a r k e r st oe v a l u a t et h ep r o g n o s i so fm a c e i na c s p a t i e n t s 。 k e yw o r d s ：a c u t ec o r o n a r ys y n d r o m e ，p r o t e i nf i n g e r p r i n t i n gt e c h n o l o g y , m a j o ra d v e r s ec a r d i o v a s c u l a re v e n t s ，仃o p o n i n ，b r a i nn a t r i u r e t i cp e p t i d ep r e c u r s o r 5 军医进修学院硕士论文 刖吾 冠状动脉粥样硬化性心脏病的病理变化是冠状动脉发生明显的粥状硬化 性狭窄或阻塞，或在此基础上合并痉挛或血栓形成管腔部分或全部阻塞，导 致冠状动脉供血不足、心肌缺血以至梗塞坏死i l l 。 急性冠脉综合征( a c u t ec o r o n a r ys y n d r o m e ，a c s ) 是指在冠状动脉粥样 硬化( c a ) 基础上发生斑块破裂和出血、冠脉血管痉挛以及完全或不完全血 栓性堵塞所引起的急性冠脉病变，涵盖了从不稳定性心绞痛( u a ) 、非s t 段 抬高性心肌梗死( n s t e m i ) 到s t 段抬高性心肌梗死( s t e m i ) 等一系列临 床病理生理状态，是临床最常见、最危重的心脏急症之一，也是导致冠心病 患者住院和死亡的主要原因。流行病学研究显示，全世界每年死于a c s 及心 脏猝死者多达1 9 0 0 万，a c s 已经成为威胁人类健康的重要心血管问题2 3 1 。 急性冠脉综合征( a c s ) 生化标记物的研究一直是该领域的热点问题之 一2 3 1 。随着人们对于a c s 认识的深入及治疗策略的变化，近年来人们对于 蛋白标记物研究的重点发生了转移，关注的焦点从既往所期许的更好的早期 诊断蛋白上转换到了对临床危险分层具有良好提示意义的蛋白研究上。换而 言之就是希望寻找能够早期识别预后不佳，易发生恶性事件的高危人群的预 测蛋白，通过对于预测蛋白水平的检测进行早期识别，正确评价患者危险性， 从而给予更加积极主动的干预以实现医疗资源的合理应用。许多一i i , 血管蛋白 标志物如高敏c 反应蛋白( h s c r p ) 、脑钠肽前体( p r o b n p ) 、白介素家族、 选择素等蛋白都进入了人们研究的视野，并取得了一定的成果。女n p r o b n p 对于心梗患者的死亡发生具有强烈的预测作用“1 ，而白介素6 、e 选择素等则 被认为与一i i , 肌坏死程度有关“1 ，因此可能对于a c s 患者预后具有一定的提 示意义；p e t e r 等人7 1 研究则发现p r o b n p 1 8 3 n g l 的a c s 患者8 年中死亡及心 衰的发生率较高，而髓过氧化物酶的浓度也被认为与心肌梗死忠者的死亡率 密切相关。但目前的研究的思路均是在探讨心血管领域已知活性蛋白与- a c s 患者预后之间的关系，而该类蛋白在目前已知的活性蛋白中可谓是沧海一粟， 因此思路非常局限。 人类基因组序列图谱初稿的公布，揭示了基因数量的有限性和基因结构 的相对稳定性，这与生命现象的复杂性和多变性之间存在巨大反差；基因只 6 军医进修学院硕士论文 是遗传信息的载体，生命活动的直接执行者是蛋白质8 1 。同一基因在不同细 胞、不同组织中的表达情况各不相同，即使是同一细胞，在不同的发育阶段、 不同的生理条件下、不同的环境影响下，其蛋白质的存在状态也不尽相同。 因此，蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体9 一，“蛋白质组” ( p r o t e o m e ) ，即基因组表达的蛋白质1 1 1 2 1 。蛋白质组学( p r o t e o m e ) 研究的 目的就是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与 修饰状态，了解蛋白质之间相互作用与联系，从而揭示蛋白质功能与细胞生 命活动的规律n 3 h 钉。“功能蛋白组学”( f u n c t i o n a lp r o t e o m e ) ，使整体的蛋白 质组学成为可实施，其研究对象是以生理状态下同一组织在不同发育阶段或 同一组织细胞在不同个体间或同一基因在不同组织细胞间，以及病理情况下 同一疾病的不同发展阶段的蛋白质表达模式和功能模式的变化，揭示一些重 要的生命现象和一些重大疾病的发生发展规律1 1 5 - 1 8 1 通过比较正常和病理情 况下细胞或组织中蛋白质在表达数量、表达位置和修饰状态上的差异，可以 发现与病理改变有关的蛋白质和疾病特异性蛋白质，这些蛋白质既为疾病发 病机制提供线索，也可作为疾病诊断的分子标记，还可作为治疗和药物开发 的靶标 1 9 - 2 1 1 。 目前蛋白质组学研究的主要支撑技术有许多，其中传统检测技术如酶联 免疫吸附试验( e l i s a ) 、双向凝胶电泳( 2 dg e le l e c t r o p h o r s i s ，2 d e ) 、激光 捕获微切割( l c m ) 技术、w e s t e r nb l o t 及荧光差异凝胶电泳( d i f f e r e n t i a lg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，d i g e ) 等，和以生物质谱( b i o m a s s ) 技术为代表的蛋白质 鉴定技术以及生物信息技术( b i o i n f o r m a t i c s ) 。这些检测技术在蛋白质检测中 均起到不同的作用，但综合起来其缺点主要有：有的检测需特异标志物一抗 体，而单抗制备需要经过筛选提纯等一系列复杂过程；有的检测需有大量的 标本，假如标本为一种混合物( 如组织液等) ，则标本在检测前需要进行蛋白 提取，从而限制了应用范围；有的需要进行染色，如d i g e ；有的不能将一种 蛋白质各个组分特别是小分子量组分完全分开，如双相电泳2 。 2 0 0 0 年国外建立了一种基质辅助激光解析电离飞行时间质谱( m a t r i x a s s i s t e dl a s e r d e s o r p t i o n | i o n i z a t i o nt i m e o f f l i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y ， m a l d i t o f m s ) 技术，是直接用于原位分析组织切片或印片的方法2 3 1 。 7 军医进修学院硕十论文 m a l d i t o f m s 与蛋白芯片分离技术联合应用即为表面增强激光解析电离 飞行时间质谱( s u r f a c ee n h a n c e dl a s e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o nt i m eo ff l i g h tm a s s s p e c t r o m e t r y ，s e l d i t o f m s ) ，可以对各种样本直接进行分析乜幻。s e l d i 技术是美国国立卫生研究院( n i h ) 、美国国立癌症研究所( n c i ) 、美国食 品药物管理局( f d a ) 和中国教育部高等学校蛋白质组学研究院的核心技术， 也是2 0 0 2 年诺贝尔化学奖的应用技术，其多项研究成果发表在n a t u r e 、 s c i e n c e 、l a n c e t 等3 0 余种著名杂志上。s e l d i 质谱技术克服上述传统检测技 术的缺点，可以对各种样本直接进行分析，特点是微量、精确、简易、快速， 准确率为氢原子的十分之一，适用于基础、临床等各个领域 2 3 1 0 蛋白质指纹图谱技术( p r o t e i nf i n g e r p r i n t i n gt e c h n o l o g y ，p f t ) 是蛋白芯 片和磁性微球两项分离技术与生物质谱s e l d i t o f m s 或m a l d i t o f m s 的联合应用。因为球形磁珠比芯片表面具有更多的表面积，且方便后续对未 知峰的鉴定，故具有更大优势。该技术通过不同化学性质表面类型的芯片或 磁珠将血清等复杂的蛋白质的混合物分离成蛋白质小组，采用m a l d i s e l d i 同时对标本中成千种蛋白质进行全景检测分析，绘制成蛋白质指纹图谱，并 显示标本中各种蛋白质的分子量，相对丰度。p f t 通过对比分析忠者图谱与 正常人图谱，发现新的疾病相关特异性蛋白质2 3 。其特点是待测样品来源 广泛( 可直接从原始的样品中进行捕获) ，样本需要量小( 仅需1 0 u 1 ) ，高 灵敏度( 检测范围为l 一5 0f m 0 1 ) ，高特异度，检测蛋白质分子量范围较大( 5 0 0 d a 5 0 0 k d a ) ，精确，结果重复性好，小型试验或高通量检测均可，全过程 仅约l h ，适用于基础、临床等各个领域。p f t 现己成为检测分析疾病早期蛋 白质变化、寻找疾病相关生物标志物的全新方法钉。蛋白指纹图谱仪于2 0 0 3 年经国家食品药品监督管理局批准进入中国市场。 目前p f t 被广泛地应用于多种人类重大疾病的研究中，包括： 肿瘤疾病的诊断：据国内外对1 2 种肿瘤血清及尿液检测结果统计， s e l d i t o f m s 检测敏感性和诊断特异性均为8 0 9 0 3 ，明显高于传统 肿瘤标志物的检测方法； 用于某些疾病的分类和分期检测：例如对淋巴瘤进行分类、分型： 对感染性疾病，如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒的病因学诊断 3 4 , 3 5 1 ， 军医进修学院硕上论文 对烈性传染病鼠疫和严重急性呼吸综合症( s a r s ) 的病原学诊断3 6 1 ； 对早期s a r s 病人血清进行s e l d i 检测，发现在临床发病早期( 1 7 d ) ， 即可检测出相关的特异蛋白1 3 7 1 0 这些均是窗口期检查，优于以往的检测技术， 也是其它技术( 如免疫荧光技术) 无法做到的。 对其他疾病的检测和诊断：通过s e l d i 技术证明，1 3 淀粉样多肽片段在 神经原中的沉积是导致老年性痴呆发病的主要原因1 3 8 1 对慢性肾病f 3 9 1 肾移 植的急性排异反应的检测具有特殊诊断、治疗及指导用药意义“0 4 1 1 ； 还发现：艾滋病感染者中不发病人群的抗艾滋病病毒的生物标志物 4 2 1 特异乳腺癌调节蛋白1 4 4 1以及肝癌“3 1 等肿瘤基因甲基化改变对肿瘤形成机 理的机制性研究1 4 5 1 0 同时，p f t 在- i i , 脑血管领域也已经获得初步应用。a l l a r d 1 等采用s e l d i 技术首次发现载脂蛋白c i ( a p o c i ) 和载脂蛋白c i l l ( a p o c i i i ) 可区别 缺血性和出血性脑卒中。另一位学者“7 1 也证实采用s e l d i 技术对于急性一1 1 , 肌 梗死忠者肌钙蛋白的分型测定具有重要意义。m a r s h a l l “钉等用s e l d i t o f m s 测定补体c 3 仅链及纤维蛋白原的早期降解蛋白指纹，能更早地发现- 1 1 , 肌梗死。 中国学者也发现质荷比为1 7 3 4 3 6 d a 的蛋白质在急性心肌梗死( a m i ) 患者中 呈低表达，提出该蛋白可作为鉴别诊断早期a m i 和u a 的血清标志物1 4 9 1 0 因此，蛋白质指纹图谱技术一p f t 的出现，为临床提供了一个高效的检测 工具，赋予研究者更为广阔的视角，帮助大家从浩瀚的蛋白库中寻找最符合 要求的蛋白标志物。 我们设想采用p f t 对确诊a c s 忠者蛋白质谱进行分析，比较不同预后患 者蛋白表达的差异，从而为临床医学寻找预后预测性更佳的标志物。 9 军医进修学院硕士论文 原理 质谱( m a s ss p e c t r o m e t r y ，m s ) 在2 0 世纪初就已经产生，多用于无机物 或小分子有机物的鉴定，8 0 年代末“软电离”技术应用于生物大分子( 如蛋 白质) 的鉴定领域 5 0 1 0 所谓“软电离”是指样品分子电离时保留整个分子的 完整性，不会形成碎片离子。软电离质谱用于大分子的鉴定，主要有以下特 点：灵敏度高，快速，能图示提供样品的精确分子量和结构信息，既可定性 又可定量，并能有效的与各种色谱联用。目前用于蛋白质鉴定的质谱主要有 两种：电喷雾制品和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱，即 m a l d i t o f m s 2 1 。但要鉴定某一蛋白质通常还得联合几种鉴定技术“h5 2 1 。 质谱法的基本原理是，样品分子离子化后，根据离子间质荷比( m z ) 差异来 分离确定样品的分子质量。 蛋白芯片分离技术与m a l d i t o f m s 联合即为s e l d i t o f m s 3 2 1 。 s e l d i 蛋白芯片是根据不同蛋白质具有的疏水、亲水、阳离子、阴离子、金 属离子螯合等化学表面特性，以及抗原抗体、受体配体结合及脱氧核糖核酸 与蛋白质结合等生物表面学特性，专家们发明了化学表面芯片与生物表面芯 片两类芯片。将多种性质不同的待测蛋白质被捕捉到相应芯片的芯池中。 s e l d i t o f m s 采用的是目前疾病蛋白质组学所依赖的技术平台 2 d e m s 53 5 4 1 ，即首先用2 d e 分离疾病状态与正常状态的蛋白组，利用激光 脉冲辐射使芯池中的待测分析物解析形成电荷，这些解析的不同质荷比( m z ) 的离子在仪器测试场中飞行时间长短不一，分子量大的时间长，分子量小的 时间较短，由此绘制出被测物质的质谱图，该图经计算机特殊软件处理还可 绘制成模拟图谱，同时显示各种蛋白质的分子量、含量等多种信息。将一个 人蛋白质的测定图谱与正常人或某种疾病的图谱或基因库中的图谱相对照， 通过分析找到差异表达蛋白，就能知道这个人的图谱是正常或是患有某种疾 病，或是存有某种尚未明了的新的特异蛋白生物标志物。然后用m s 对这些差 异蛋白进行鉴定，并试图从这些差异蛋白出发找出疾病发生发展的机理、诊 断标志物或治疗靶点 5 5 - 5 7 1 。 蛋白质指纹图谱技术( p f t ) 联合应用了蛋白芯片和磁性微球两项分离 技术与生物质谱s e l d i t o f m s 或m a l d i t o f m s 弛州1 技术。捕获目的蛋 1 0 军医进修学院硕十论文 白是该技术的关键，由于s e l d i 磁珠表面的结合面积远远大于蛋白质芯片， 从而其灵敏性比蛋白质芯片更高1 5 8 1 。实验中另一个关键步骤是基质的应用， 基质即能量吸收分子，是指分析中辅助去吸附和离子化的分子，对样品的离 子化起关键作用，在蛋白质溶解到基质溶液之后，溶液挥发掉，在芯片表面 形成蛋白质和基质的共结晶，这些晶体吸收激光的能量，产生离子化的蛋白 质，经由蛋白芯片检测器检测出来。p f t 检测分四步骤“钉：标本准备，蛋 白芯片纳米磁珠的预处理，上样和芯片检测。 芯片阅读器( p r o t e i n c h i pr e a d e r ) 、飞行时间质谱检测系列( p b s i i c 系列) 和数据分析系统( 包括b i o m a r k e rw i z a r ds y s t e m ，b w s 和b i o m a r k e rp a a e m s y s t e m ，b p s 两个软件) ( 美国c i p h e r g e n 公司) ，是p f t 的重要组成部分1 。 蛋白芯片阅读器是该技术核心，通过芯片磁珠捕捉到所要求检测的各种蛋白 质。b w s 是一个较为简单的统计学软件，它用方差分析对质谱检测所收集获 得的蛋白质谱的数据进行初步的统计学分析，并且为b p s 提供数据。b p s 是 一个数据挖掘软件，其采用的是决策树模型，对目标对象进行分组及相关性 进行分析，自动或半自动地从海量的数据中发现模型、相关性变化、反常规 律性、统计上的重要结果和事件，以推理不明确的医学诊断问题。 军医进修学院硕十论文 研究对象、内容与方法 一、研究对象 本研究设计为一个前瞻性研究，连续入选y 2 0 0 7 年4 一1 0 月因发作性胸痛 就诊，起病时间在6 小时之内，具有相应心电图和或心肌酶学变化，临床诊 断为急性冠脉综合征( a c s ) 而入解放军总医院心内科监护室住院治疗并接 受冠状动脉造影检查的患者。排除标准包括：非心源性疼痛、外伤、出血、 肿瘤、慢性消耗性疾病，因各种原因不能配合的患者及不愿参加该研究的患 者。研究对象的入选工作均有经过同意培训的专科医师按照上述入选标准进 行，所有研究对象均为中国北方汉族人群，入选患者的基线特征如表1 中所示。 患者入选后由经过统一培训的专科医师采集病史、进行体格检查、心电图及 心肌酶学检查。所有最终入选患者均被详细告知本研究目的、内容及操作计 划并签署知情同意书，本研究设计经过解放军总医院医学伦理委员会的审核 并完成登记。入选忠者的临床资料及3 0 天和1 年预后数据由经过培训的临床医 生通过表格调查方式完成，院外随访通过专人电话及电子邮件随访完成，起 病3 0 天内( 近期) 和1 年内( 远期) 的临床恶性事件将被记录在案并进行最后 的统计分析。主要恶性心血管事件( m a j o ra d v e r s ec a r d i o v a s c u l a re v e n t s ， m a c e ) 的定义包括：死亡，恶性心律失常，心力衰竭，休克、再缺血事件 等。 二、研究内容 符合条件的研究对象在入院后接受经过统一培训的专业医务人员的病史 询问，收集患者病情变化资料，确定起病时间，评价患者心血管疾病的危险 因素并根据心血管疾病的危险因素数量进行分层。研究对象在入院即刻抽血 检测心肌酶学、炎症反应指标及蛋白指纹分析并详细记录起病时间与标本留 取时间。入院后由2 名心内介入专科医生完成冠状动脉造影检查，明确血管病 变情况；同时，并通过心脏超声检查及左室造影评价入选忠者心脏功能情况。 三、研究方法 心肌酶学及炎症指标的检测：该项检查由解放军总医院生化检验科采用 标准自动化分析仪器应用统一试剂盒完成。入院后即刻采集的血标本立即转 送到生化科由专业人员完成检测，肌酸激酶及同工酶( c k m b ) 、高敏c 反应 1 2 军医进修学院硕 论文 蛋白( h s c r p ) 的检测采用免疫抑制法，肌钙蛋白( t n ) 的检测采用化学发 光法，上述测定方法批内变异小于l ，批间变异小于3 。 蛋白指纹图谱分析：由北京协和医院蛋白分析研究所统一完成测定。所 有患者于治疗前空腹采集并离心后的标准化质控血清( 见下一章1 4 ) ，冻存 于8 0 。c 冰箱中储存，统一送往中心实验室进行蛋白指纹图谱分析检测。 冠脉造影检查：入选患者在入院后均需接受冠脉造影检查并详细记录血 管病变数量。将冠脉造影中管腔内径丧失大于7 0 的血管定义为病变血管， 根据患者累及血管的数量不同分别记录为单支血管病变，两支血管病变，三 支血管病变，其中三支病变合并左主干病变，根据临床习惯仍归属为三支病 变。应用左室造影检查评价入选患者心功能状态情况。 心脏超声检查：患者入院后接受心脏超声检查，该检查由解放军总医院 心内科超声室指定专业技术人员统一完成。采用2 维方法检测心脏腔室结构的 变化及室壁运动的变化情况，以组织多普勒技术进一步评价运动减低阶段的 情况，记录运动减低阶段的数量，同时采用2 维法测定心脏功能。上述检测均 需反复测定3 次后记录平均值。 军医进修学院硕十论文 实验材料与方法咖， 一、实验材料 1 试剂： 尿素裂解缓冲液，u 9 裂解缓冲液，含9 m o l l 尿素( u r e a ) ( s i g m a ) ，和 i c h a p s ( 2 c h a p s ( s i g m a ) ，5 0 m m o l lt r i s - h c l ( s i g m a ) ) 的磷酸盐缓 冲溶液，目的是裂解打开蛋白质四级结构； 醋酸，( s o d i u m a c e t a t e ) ( s i g m a ) ； 磷酸盐缓冲溶液( p h o s p h a t eb u f f e r e ds o l u t i o n ，p b sb u f f e r ) ( s i g m a ) ，即 w a s h i n gb u f f e r 缓冲液，目的是去除残留的去污剂以防样品在下一步操作中播 散，只有当缓冲液p h 值低于蛋白质等电点( 蛋白质带正电荷) 时，蛋白质才 能被弱阳离子磁珠捕获； 弱阳离子交换磁珠( m a g n e t i cb e a d so fw e a kc a t i o n i ce x c h a n g e ，m b w c x ) ( 美国布鲁克道尔顿公司) ，即m b w c x ，利用与p h 值低于蛋白质等电点( 蛋 白质带正电荷) 缓冲液结合，以使磁珠带负电荷，通过带负电荷的残端捕获 蛋白质，达到蛋白质被弱阳离子磁珠捕获的目的； 芥子酸( s i n a p i n i ca c i d ，s p a ) ( s i g m a ) ，即基质( e a m ) ，s p a 具有高质 荷比的基质峰、少量的多重质子化现象的特性；s p a 饱和溶液为4 0 0 u l5 0 乙 腈( a c e t o n i t r i l e ) ( s i g m a ) 和0 5 - - - 氟乙酸( t r i f l u o r o a c e t i ca c i d ) ( s i g m a ) 的 饱和溶液，是能量吸收分子，其作用是与蛋白质共结晶，形成的晶体吸收激 光能量，产生离子化的蛋白质或者肽段，经由离子探测器检测出来； 1 t f a ( s i g m a ) 溶液，群l e l u t i o nb u f f e r 洗脱液，避光，密封，4 c 保存， 使用周期不超过5 天： 2 主要器材、仪器： 高速低温离心机，湘仪离心机仪器有限公司，型号t g l 6 w s ； 8 0 冰箱，s a n y o 公司，型号m d f u 5 3 v ； 蛋白指纹图谱仪，即一种线性激光解吸电离飞行时间质谱仪，美国 c i p h e r g e nb i o s y s t e m 公司，型号p b s i i c 。 二、实验方法 1 4 军医进修学院硕士论文 1标本准备 1 1血清样品收集：清晨( 7 ：0 0 ) 空腹抽血4 m l 至负压无菌不抗凝管，采 集后立即置于冰上并送到研究所，4 8 。c 冰箱静置，保证在4 8 c 以下运输，2 小时内尽快分离血清及细胞。由于溶血会对蛋白质组的结果造成很大影响， 送检时剔除溶血样品； 1 2 室温4 0 0 0 r m i n 离心5 分钟分离血清。吸取l m l 至0 1 5 m l 离心管。离心 管预先置冰上并标号。防止溶血，不戴有滑石粉的乳胶手套，带一次性薄膜 手套( 以下一样) ； 1 3 将血清置于高速低温离心机，以1 2 0 0 0 r m i n 再次离心5 分钟，去除所 有残留细胞碎片和不溶物； 1 4 在冰上将离心后血清分装为l o o p f 管，共5 管( 余量可按5 0 0 1 t l 管 分装，以备对峰的进一步鉴定时使用) ，保存于8 0 。c 冰箱。避免反复冻融( 仅 1 次) 。预先标记好离心管( 统一的标号) ，并输入相应的病人资料( 见附录) 。 得到标准化质控血清； 全血4m l ，负压无菌不抗凝管 j 4 8 c 静置、运输 1 l r2h 内 分离血清，吸取1m l 到1 5m l 离心管 室温，4 0 0 0 r r a i n ，离一已, 5 m i n 吸取血清1m l 到1 5m l 离心管( 预先置冰上并标号) 中4 2 。跏5 曲 分装1 0 0 叫管，共5 管( 统一的编号) j 标准化质控血清，保存+ j - _ 8 0 。c 冰箱 1 5 血清样品处理：