（分析化学专业论文）共振光散射光谱的校正及其分析应用研究.pdf

- i 垒 j r j r 要 共振光散射光谱的校正及其分析应用研究 学科专业：分析化学 指导教师：黄承志教授 论文摘要 研究方向：纳米材料及生化分析 研究生：杨传孝 共振光散射技术是基于普通荧光分光光度计所丌发出来表征超分子组装化 学及其分析应用研究的新技术。应用该技术已建立了高灵敏的测定核酸、蛋白质、 痕量会属离子、表面活性剂的分析办法，表征 分子聚集的光谱特征和核酸的超 螺旋结构。本文在讨论a 1 ”d n a 、镁试剂i 阳离子表面活性剂、固红v r - 蛋白 质、丽春红0 一蛋白质四个体系的r l s 光谱特征的基础上，证明荧光分光光度计 的仪器条件和样品的分子吸收等因素会影响共振光散射( r l s ) 光谱的形状降低 检测的灵敏度。在此基础上本文引入校正因子建立了r l s 光谱校正理论，并在 普通荧光光度计上引入吸收装置测定分子吸收，根据同一台仪器所测定的数据 讨论了固红v r - 蛋白质、丽春红g 蛋白质和m e s o 四- ( 对三甲氨基苯基) 卟啉 ( t a p p ) d n a 体系的r l s 光谱的校正。 在p h2 2 l 的酸性介质中，a 1 3 + 与脱氧核糖核酸( d n a ) 发生静电作用产生以 2 9 1 0n m 为特征峰的共振光散射( r l s ) 增强光谱。a 1 3 + 没有生色基团它与d n a 作用的r l s 光谱受光吸收的影响小因而a 1 3 + 用于d n a 测定的灵敏度高，线性 范围宽。在p h6 。0 9 和离子强度为0 。0 3m o l t l 的条件下，阳离子表面活性荆氯化 十四烷基苄基二甲铵( z e p h ) 、溴化r 六烷攮：三ql 铵( c t m a b ) 与镁试剂l 钓相互作 用使其共振光散射( r l s ) 增强，产，l 以4 7 0 0t i m 、4 8 5 0 帆和4 9 5 ：0n l l 为特征峰 的r l s 信号。方法成功用于合成样和自来水样的测定。 厂上述试验表明散射光谱随体系的分子吸收和仪器条件的变化而发生变化， 因此类似荧光光谱的校正那样，通过引入校f 因子，校j 下仪器因素和体系中分子 吸收的内滤效应。 在酸性介质中偶氯染料固红v r ( f a s tr e dv r ，f r v ) 和丽春红g ( p o t i c e a ug ， p o ) 与牛血清白蛋白( b s a ) 、人血清白蛋( 2 1 ( h s a ) 、溶菌酶( l y s ) 、7 - 球蛋白“一i g g ) 等蛋白质作用产生共振光散射( r l s ) 增强信号，最大散射峰分别位于2 8 7 0 t i m 和 2 8 8 0n r l l 处。f r v 和p g 用于测定b s a 、h s a 、l y s 、y - i g g 的检测限均在2 5 0n g m l 以下。方法成功的应用于合成样和人血清样品的测定，测定结果与考马斯亮蓝法 一致。用吸收装置改变荧光分光光度计入射光的光路直接测得f r v 蛋白质和p g 一 蛋白质复合物的分子吸收，用校证因子校正f r v 蛋白质和p g 蛋白质体系的 r l s 强度。研究表明，校正由于分子对激发光和散射光的吸收对r l s 光谱的影 响后，校正共振光散射( c r l s ) 光谱灵敏度可提高2 倍左右。 共舅l 光散射光谱的校正及其分析应m m l - j e 分别在f - 2 5 0 0 和f - 4 5 0 0 荧光分光光度计上对m e s o 四- ( 对三甲氨基苯基) 卟 啉( t a p p ) 与d n a 作用的r l s 光漕进行校j f 。校正强度后，灵敏度有显著提高。 引入散射系数强( 劫，并成功的把表观吸收光谱中的散射和吸收成分分离。研究发 论文摘要 s t u d i e so nt h ec o r r e c t i o no fr e s o n a n c e l i g h ts c a t t e r i n g s p e c t r a a n dt h e i r a n a l y t i c a la p p l i c a t i o n s m a j o r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rc h e n g z h ih u a n g r e s e a r e h ：n a n o m e t e rm a t e r i a la n d b i o c h e m i c a la l i a l y s i s a u t h o r ：c h u a n x i a o y a n g a b s t r a c t r e s o n a n c e l i g h ts c a t t e r i n gt e c h n i q u e i sa n e w e l y e s t a b l i s h e d t e c h n i q u e f o r c h a r a c t e r i z i n gs u p r a m o l e c u l a ra s s e m b l i e sa n dt h e i ra n a l y t i c a la p p l i c a t i o n sd e v e l o p e d b yac o m m o ns p e c t r o f l u o r o m e t e r w i t ht h i st e c h n i q u e ，w eh a v ep r o p o s e dh i g h l y s e n s i t i v e a n a l y t i c a l m e t h e d so fd n a ，p r o t e i n s ，t r a c ea m o u n tm e t a l l i ci o n sa n d s u r f a c t a n t s ，c h a r a c t e r i z e dt h ec h a r a c t e r i s t i cs p e c t r u mo fm o l e c u l a ra g g r e g a t i o n ，a n d t h es t r u c t u r eo ft h es u p r a m o l e c u l a rd o u b l e - s t r a n d e dd n a b y e x a m i n i n g r l s s p e c t r a l f e a t u r e so ff o u rs y s t e m si n c l u d i n ga i ”d n a a z o v i o l e t - c a t i o n i cs t t r f a e t a n t s f a s tr e d v r 呻r o t e i n s ，p o n c e a ug 呻r o t e i n si n t h i st h e s i s ，a n dp r o v e dt h a tt h ei n s t r u m e n t a l c o n d i t i o n so f s p e c t r o f l u o r o m e t e rh a v es t r o n ge f f e c to nt h es h a p eo fr e s o 啪c el i g h t s c a t t e r i n g ( r l s ) s p e c t r a m o l e c u l a ra b s o r p t i o no fs a m p l ew i l l l o w e rt h ed e t e c t i o n s e n s i t i v i t yo fr l sm e t h o d t h u sac o r r e c t i o nt h e o r yw a se s t a b l i s h e db yi n t r o d u c i n ga c o r r e c t i o n f a c t o r , w h i c hm e a s u r e dm o l e c u l a ra b s o r p t i o nd i r e c t l yo nac o m n l o n s p e c t r o f l u o r o m e t e rb yu s i n g a n a b s o r p t i o n c e l l h o l d e r a c c o r d i n g t od a t at h a t m e a s u r e do nt h es a m ei n s t r u m e n t ，t h ec o r r e c t i o n so fr e s o n a n c e l i g h ts c a t t e r i n gs p e c t r a o ft h et h r e es y s t e m si n c l u d i n gf a s tr e dv r - p r o t e i n s ，p o n c e a ug - p r o t e i n sa n d 征，p ，t ， 8 - t e t r a k i s 4 ( t r i m e t h y l a m m o n i u m y l ) p h e n y p o r p h i n e ( t a p p ) - d n a h a v eb e e n d i s c u s s e d i na c i d i cm e d i u mo fp h2 21 ，t h ei n t e r a c t i o no fa 1 3 + w i t hd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( d n a ) r e s u l t si ne n h a n c e dr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gs p e c t r a ，c h a r a c t e r i z e db yt h e p e a ka t2 9 1 r i m a 1 ”h a sn oc h r o m o t h o r e a n di t sl i g h ta b s o r p t i o nh a sl i t t l ee f f e c to n t h er l ss p e c t r ao ft h ei n t e r a c t i o nb e t w e e na 1 3 + a n dd n a s ot h es e n s i t i v i t yo f d e t e r m i n a t i o no fd n aw i t ha 1 ”i sv e r yh i g h a n dt h el i n e a rr a n g ei sw i d e as i m p l e a s s a y o fc a t i o n i cs u r f a c t a n t si nw a t e r s a m p l e s w a s d e v e l o p e d b a s e do nt h e m e a s u r e m e n t so fe n h a n c e dr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g 。o nt h ec o n d i t i o n so f p h 6 0 9 a n di o n i c s t r e n g t h o 0 3 m o l l ，t h ei n t e r a c t i o n s o fa z o v i o l e t ( a v ) w i t hc a t i o n i c s u r f a c t a n t s ，i n c l u d i n gz e p h i r a m i n e ( z e p h ) ，a n dc e t y lt r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e ( c t m a b ) ，r e s u l ti ne n h a n c e dr l ss i g n a l sc h a r a c t e r i z e db yt h ep e a k so f 4 7 0 0n m ， 共攘光散射光誊的拉正反其分析应用研究 -_。_-。_。_。_。_。_。_。-。-。_-_。_。-_-_一4 8 5 0n t na n d4 9 5 0 砌d e t e r m i n a t i o n so fc a t i o n i cs u r f a c t a n t si n s y n t h e t i ca n dt a p w a t e rs a m p l e sw e r e s u c c e s s f u l l ym a d e w i t ht h er e c o v e r yo f9 0 5 。10 8 2 t h ee x p e r i m e n t ss t a t e da b o v eh a v es h o w e dt h a tr l ss p e c t r av a r yw i t ht h e m o l e c u l a r a b s o r p t i o n o f s y s t e m s a n dt h ei n s t r u m e n t a l c o n d i t i o n s j u s t1 i k et h e c o r r e c t i o no ff l u o r e s c e n c es p e c t r a ，w eh a v ec o r r e c t e dt h ei n s t r u m e n t a lf a c t o r sa n d t h e i n n e rt i t t e r i n go ft h em o l e c u l a ra b s o r p t i o ni nt h es y s t e m sb yi n t r o d u i n gac o r r e c t i o n f a c t o r i na l la c i d i cm e d i u m ，t h ei n t e r a c t i o no ff a s tr e dv r ( f r v ) a n d p o n c e a ug f p g ) w i t hp r o t e i n si n c l u d i n gb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) ，h u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a ) ， p e p s i n ( p e p ) a - c h y m o t r y p s i n ( c 埘) a n dl y s o z y m e ( l y s ) w a sc h a r a c t e r i z e db y m e a s u r i n ge n h a n c e dr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gs i g n a l s t h em a x i m u mr l sp e a k s w e l - e2 8 7 0n l l la n d2 8 8 0n n 2 ，r e s p e c t i v e l y t h el i m i t so f d e t e r m i n a t i o nf o r b s a ，h s a ， l y s 7 - l g gw e r eb e l o w2 5 0n g m 1 t h ep r e s e n tm e t h o di ss u c c e s s f u l l ya p p l i e dt o d e t e r m i n ep r o t e i n si ns y n t h e t i cs a m p l e s ，a n dt h et o t a lc o n t e n to f p r o t e i n si nh u m a n b l o o dp l a s m as a m p l e s ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t sf o rd e t e r m i n a t i o nh u m a r ib l o o ds e r u m b yt h i sm e t h o da r ec o n s i s t e n tw i t ht h o s eo b t a i n e db yt h ec o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u e g - 2 5 0 a s s a y b yu s i n ga l la b s o r p t i o nc e l lh o l d e rt oc h a n g et h ep r o p a g a t i o nd i r e e t i o l l o ft h ei n c i d e n tl i g h tb e a mo fac o m m o n s p e c t r o f l u o r o m e t e r , t h em o l e c h i a ra l l s o r p t i o n s o f f r v - p o r t e i n s a n d p g p o r t e i n ss y s t e m s w e r e d i r e c t l y m e a s u r e d t h r o u g h a s p e c t r o f l u o r o m e t e r , a n d c o r r e c t e dt h er l si n t e n s i t i e s o f f r v - p o r t e i n s a n d p g - p o r t e i n sw i t hac o r r e c t i o nf a c t o r w i 也m e a s u r e m e n t so ft h ec o r r e c t e dl 陀s o l l a l l c e l i g h ts c a t t e r i n g ( c r l s ) s i g n a l so ft h ei n t e r a c t i o no f f a s tr e dv r ( f r v ) w i t h p r o t e i n s a n dp gw i t h p r o t e i n s ，r e s p e c t i v e l y w eh a v ep r o v e dt h a tt h ep r e s e n tc o r r e c t i o nf o rt h e r l s s i 拇e t r a i nt e r m so f t l 豫m o l e c u l a r a b s o r p t i o no fe x c i t a t i o na n ds c a t t e r i n gr a d i a t i o n c o u l di m p r o v et h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t yb ya b o u tt w of o i d w ec o r r e c t e dt h er l s i n t e n s i t y o ft h e i n t e r a c t i o no f a ，d 爿，6 t e t r a k i s 【4 - ( t r i m e t h y l a m m o n i u m y l ) p h e n y l ) 】p o r p h i n e ( t a p p ) w i t hd n ao nf 一2 5 0 0 a n d f - 4 5 0 0s p e c t r o f l u o r o m e t e r s ，r e s p e c t i v e l y n ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t yw a sr e m a r k a b l y i m p r o v e d b yi n t r o d u c i n gs c a t t e rc o e f f i c i e n t ( 璐) ，w ec a ns e p a r a t et h ea b s o r p t i o n a n ds c a t t e r i n gc o m p o n e n t sf r o ma p p a r e n ta b s o r p t i o ns p e c t r u m i ti sf o u n dt h a tt h e s h a p eo fs c a t t e r i n gc o m p o n e n t ss e p a r a t e df r o mf 一2 5 0 0a n df - 4 5 0 0s p e c t r o f l u o r o m e t e r i si d e n t i c a l k e yw o r d s ：r e s o n a n c e l i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) ，d e o x y r i b o n u d e i ca c i d ( d n a ) ， a l u m i n u mi o n ( a 1 3 + ) ，c o r r e c t e dr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ( c r l s ) ，c a t i o n i cs u r f a c t a n t , a z o v i o l e t ( a v ) ，f a s tr e dv r ( f r y ) ，p o n c e a ug ( p g ) ，p r o t e i n 缩写符号对照襄 英文名称 缩写符号对照表 r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g c o r r e c t e dr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g c a l f t h y m u s d n a f i s hs p e r md n a y e a s tr n a a z o v i o l e t z e p h i r a m i n e c e t y lt r i m e t h y la m m o m u m b r o m i d e s o d i u md o d e c y ls u l p h o n a t e s o d i u ml a u r y ls u l p h a t e 1 3 - c y c l o d e x t a i n f a s tr e d v r b o v i n es e r u ma l b u m i n h l l l t l a ns e r u ma l b u m i n l y s o z y m e c t - c h y m o t r y p s i n y - g l o b u l i n p e p s i n a ，p ，托8 - t e t r a k i s 4 - ( t r i m e t h y l a m m o n i u m y l ) p h e n y 】p o r p h i n e p o n c e a ug l - t r y p t o p h a n l p h e n y l a n i n e l s e r i n e l l y s i n e 中文名称缩写符号 共振光散射rls 校限麸振光散射 c r l s 小牛胸腺d n a c t d n a 鱼精子d n a删a 酵母r n ay r n a 镁试剂i a v 氯化一 冈烷基苄基二甲铵z e p h 澳化n 1 六烷基三甲铵 c t m a b 十二二烷基磺酸钠 s d s 十二：烷錾硫酸钠 s l s 凸环糊精p c d 固红v r f r v 牛血清白蛋白 b s a 人血清白蛋白h s a 溶菌酶珂s 洳糜蛋白c h y 卜球蛋白y - i g g 胃蛋白酶pep m e $ o 四f 对三甲氨基苯基 h 啉t a p p 丽春麴。g l 色氪酸 l 苯刚氨酸 l 丝氨酸 l 赖氨酸 p g l - t r y l - p h e l - s e x l - l y s 第一章绪论 第一章绪论 1 1 光散射现象【l 2 l 光散射现象广泛存在于光与粒子的作用中，是指光通过介质时在入射光方 向以外的各个方向上所观察到的现象。介质的分子由电子和原子核组成。光电 磁波的电场振动导致分子中电子产生受迫振动形成偶极子。根据电磁理论，扳 动着的偶极子是一个二次波源，它向各个方向发射的电磁波就是散射波。 光散射与介质的不均匀性有关，除了真空之外的其他所有介质都有一定程 度的不均匀性，从而产生散射光。根据介质中牧予太小不同，散射可分为t y n d a l l 散射和分子散射。当粒子的尺、j 大于入射光波长( 山) 时发生反射并服从反射定 律。如果介质中粒j r 直径( 曲与入利光波长射i 近，便产生t y n d a l l 散射；如果介 质中粒子很小，d 0 0 5 如时便，6 ：生以r a y l e i g h 散射为主的分子散射，分子散 射比t y n d a l l 散射弱得多。 根据入射光和散射光波长的不同光散射又可以分为弹性光散射、非弹性 光散射和准弹性光散射。在散射中没有频率位移的称为弹性光散射( e l a s t i cl i g h t s c a t t e r i n g ) ，或称为经典散射( c l a s s i c a ll i g h ts c a t t e r i n g ) 、静态光散射( s t a t i cl i g h t s c a t t e r i n g ) ；由分子跃迁引起的拉曼散射( r o m a ns c a t t e r i n g ) 、热波引起的布里渊 散射( b r i l l o u i ns c a t t e r i n g ) ，入刳光波长和发射光波长不同称非弹性光散射 ( i n e l a s t i cl i g h ts c a t t e r i n g ) = 由多普勒( d o p p l e r ) 效应引起的散射光，入射光频率和 散射光频率有微小的变化称准弹性光散射( q u a s i e l a s t i cl i g h ts c a t t e r i n g ) 或动念光 散射( d y n a m i ct i g h ts c a t t e r i n g ) 。r a y l e i 班散射、浑浊介质的t y n d a l l 散射和透明 介质的分子散射是弹性光散射。本文所及共振光散射，主要涉及到共振r a y l e i g h 散射，还有t y n d a l l 散射，荧光和动态光散射，其成分的多少取决于散射粒子 的大小、激发和发射波长及仪器的狭缝宽度。 1 2 共振光散射技术的发展 1 9 9 3 年，p a s t e m a c k 等口1 用普通荧光分光光度计以光散射法研究卟啉类化合 物反式双( n 甲基吡啶嫡- 4 基) ：苯卟吩及c u 2 + 衍生物在d n a 分子上的堆积， 建立了共振光散射( r l s ) 技术，从而将r l s 技术与超分子组装过程联系起来。 利用该技术在研究生物大分子识别、组装和聚集时，出现灵敏而丰富的信号【4 。7 j ， 是区分卟啉是否聚集的一种好方法。如图1 - 1 【5 1 所示，用分光光度法只能获得微 弱卟啉聚集信号，面使用共振光散射技术在普通荧光分光光度计上却可以获得 非常强烈的聚集信号。 共舅l 光散射光谱曲校正及其分析墨堋研究 r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gb yp o r p h y r i na g g r e g a t e s o r x 计 8 一 古 a 2 三 嘟” 1 。 蹴 争 s 如 3 5 04 0 0 4 5 0 5 0 0 5 6 06 0 0 w e v e l e n g h ( n r r l ) 0 0 8 性 4 0 05 0 0 8 3 0 w “e 1 日帅e r i m ) as y n c h r o n o u ss c a n0 1 1 1a f l u o r i m e t c ry i e l d sf b a t t t r e s f r o mm e a g g r e g a t eo n l y f a s t e m a c l f e t a l 忡m c h e m 埘, , y 3 3 2 0 珏2 0 鳟f 1 霸研 f i g 1 - 1 r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gb y p o r p h y r i n a g g r e g a t e s 1 9 9 5 年，刘绍璞等博j 研究了罗丹明染料与离子缔合物的共振发光光谱，利 用离子缔合物的二次散射光谱建：菠了定量测定痕量金属离子的分析方法一。“。 1 9 9 6 年，黄承志等首先利用卟啉在核酸分子表面聚集时产生的增强r l s 信号与 d n a 浓度问的线性关系，建立了生物大分子的共振光散射光谱分析法【l 习。由于 r l s 技术克服了传统光散射法灵敏度低、仪器及实验条件要求严格的缺点，因 而发展迅速，被广泛应用于核酸1 1 3 - 1 9 1 、蛋自质1 2 0 - 2 7 】和金属离子口8 3 0 l 的测定。 用普通荧光分光光度计除了可以获得r l s 信号外，还可以用荧光分光度计 的三维函数获得包括二缎光散射( s l s ，疋。- 2 如) 、反：二级光散射( a s l s ， a 。m = 0 5 如) 、拉曼光散射在内的三维光散射光谱。图1 2 是耐尔蓝硫酸盐( n i l e b l u es u l f a t e ，n b s ) 以d n a 为模版自组装的三维光散射光谱j 。 2 第一章绪论 f i g 1 - 2 3 - dl i g h ts c a t t e r i n gs p e c t r u mo f t h ei n t e r a c t i o no f n b s 、 ，i t l lc t d n a 本实验室在2 0 0 1 年通过改装荧光分光光度计样品室的光路，在液液界面 p ”j 和气- 液界面m j 上建立起全内反射共振光散射技术( t i r r l s ) ，并把它应 用到分析中。研究表明这一技术具有较好的选择性和灵敏度。 2 0 0 2 年，b a o 等p5 j 用r l s 技术成功的设计出高灵敏度检测d n a 的微阵列 ( 闰1 3 ) ，为利用r l s 技术构建d n a 芯片丌创了美好的前景。图1 4 t 3 6 是两种 应用r l s 技术构建的用于d n a 分析的平台。 f i g 1 3 o u t l i n eo fe x p e r i m e n t a lp r o t o c 0 1 c d n ap r o b e sg e n e r a t e db yt h ec o l a b e l i n g o fl u n gr n aw i t hc y 3a n dh y b r i d i z e dt oa na r r a y 共舅l 冀射光鞠 的投正及其分析应用研兜 f i g 1 - 4 s c h e m a t i co ft w od i f f e r e n tr l sb i o a s s a ys y s t e m sa n dp l a t f o r m s a n u c l e i ca c i do rd n am i c r o a r r a y b h o m o g e n e o u sb i o a s s a y i nm i c r o t i t e rw e l l s 1 3 共振光散射技术的原理和定量基础 光散射源于溶液折光指数的涨落【3 一。折光指数可分为实部和虚部两部分 3 7 1 ，虚部与摩尔吸光系数有关【3 酊，表征体系光散射特征的瑞利比( r a y l e i 曲r a t i o ) 与折光指数的关系可表示为： 月( 9 0 0 ，= 笔斧t 魄) 2 + 魄 肚黔 2 + 等 c v 式中r ( 9 0 0 ) 是在与入射光成9 0 0 角处检测到的瑞利比，a 是a v o g a d r o 常 数， 是介质的折光指数，山是入射光波长，c 是溶液的摩尔浓度。a h a c 和a k l a c 分别是1 ，0m o l l 溶液中折光指数实部和虚部的增量，g 是表示光散射增加的 c a b o u n e s 因子。d m 是在波长为 处的脖尔吸光系数。 如果入射光波长远离分子吸收带，则a 七a c = 0 ，在散射粒子直径d o 0 5 凡 时，所获得的光散射光谱主要决定于折光指数的实部，散射光强度遵从r a y l e i g h 散射定律，即散射光强度与波长的四次方成反比【2 ，4 0 】。 卜丁2 4 2 r 3 n v - 舌矗一。 ( 2 ) 4 其中，为散射光强度，而为入射光强度，a 为入射光和散射光波长。为单 第一章绪论 位体积内粒子数目，矿是一个粒，j ：的体积， l 和”o 分别表示散射相和介质的折 光指数。 如果入射光波长接近分子吸收带，o u o c 0 ，即除折光指数的实部对光散 射有贡献外，虚部也有相当大的贡献。如果分子形成了聚集体，便产生强烈的 共振r a y m g h 光散射增强。光散射强度和散射粒子浓度i 目的关系可表示为f 4 i 】： ，- ，。燮舞型忙黯+ 等卜 腚肛屯巡笫等 则有 ，2k c ( 4 ) 式( 4 ) 6 0 为共振光散射技术的定量基础，当测量条件一定，k 为与散射粒子 体积( 叼、均匀介质的平均折光指数( ”) 和入射光波长( 如和旬有关的常数。 1 4 共振光散射技术在分析化学中的应用 1 4 1 共振光散射技术在核酸分析中的应用 d n a 是由两条多核苷酸链组成的双螺旋结构高分子化合物，主要为右手螺 旋型( b 式) 。每条核苷酸链通过磷酸基与糖基57 和37 位的氧原子形成二酯键 连接起束，链之间的作用力主要为配对碱基之恻的氢键。两个磷酸酯之闻的距 离是0 6n l l l 。每个糖基的l 位均连有嘧啶或嘌呤碱基，它们分别为腺嘌呤 ( g ) 、鸟骠呤( a ) 、胞嘧啶( c ) 、胸腺i 瓷啶( t ) 。c i n 键与碱基的长轴之唰 有一央角，c i + 一c j7 轴偏离碱綦对的一边，导致糖基与磷酸基之间形成大沟 ( m a j o rg r o o v e ) 和小沟( m i n o rg r o o v e ) 两种空隙，其中小沟深0 7 5i l i t i 、宽0 6 m ，大沟深0 8 5n m 、宽1 2n m i 圳。 8 0 年代中后期金属卟啉与d n a 作用的机理研究较多，以d a b r o w i a k 、 p a s t e m a c k 等【4 6 】的工作最具代表性。他们对h 2 t ( 4 p y ) p 等的金属配合物研究 结果表明，余属卟啉与核酸定位结合时，主要采取插入式、外沟结合和外部堆积 三种不同的方式【4 k 诱导圆二色( i c d ) 光谱的符号为区分卟啉化合物与d n a 结 台模式提供了方便的信号 4 ”。在s o r e t 区f 的i c d 光谱表明卟啉与d n a 是外 部结合，负的i c d 光谱表明卟啉与d n a 是插入结合模式，分裂的i c d 光谱表 明d n a 具有螺旋结构特征。 1 9 9 3 年，p a s t e m a e k 等1 3 】将光散射技术用于研究卟啉j 型聚集，即沿长轴 包含线性振荡子极化的棒状组装。并把这一技术与吸收光谱法相结合，研究卟 琳化合物及二酸的难积【5 1 ，建立了用共振光敝射技术研究生色基团聚集的新方 法【4 1 。1 9 9 6 年，黄承志掣。2 】将此技术用二j 二核酸的分析研究开辟了光散射技术 在生化分析中的应用。水溶性卟啉试剂m s o 阴( 对三甲氨基苯基) 卟啉( t a p p ) 等卜r黯 n 盯 共舅l 光，艮射光谱的校正反其分析应用研究 是晟早被用于核酸光散射定量分析的染料。它是一个带正电荷的大环分子，与 b 型d n a 作用不是插入式，而是卟啉取代基上的正电荷与核酸骨架上的磷酸根 之间的静电作用【5 4 j 导致卟啉t a p p 在d n a 分子上堆积，从而产生增强的r l s 信号，测定c t d n a 的检测限为4 8 1 0 - s m o l l 。基于带正电荷的染料与d n a 的 磷酸根之阳j 的静电作用导致染料在d n a 分子上聚集，以及金属络合物和季铵 盐类与d n a 作用产生增加的r l s 信号，建立了酞菁染料5 5 l 、碱性三苯甲烷类 染料【1 4 ，5 6 侧、带f 电荷的醌亚铵类染料陋17 ，3 1 , 6 1 击7 1 、金属络合物【9 6 8 7 0 】、季铵 枯类9 】等测定d n a 的r l s 方法。这些方法灵敏度较高，检测限均在n g 级。 1 4 2 共振光散射技术在蛋白质分析中的应用 在静电作用为主的体系中，肖溶液的p h 小于蛋白质的等电点时，蛋白质 带f 电荷。阴离子染料与蛋白质之削通过静电作用形成蛋白质染料的复合物， 染料在蛋白质分子上堆积形成较大的粒子，因而产生强烈的r l s 增强信号。利 用这种现象对蛋白质进行分析测定。目前广泛使用的染料有：阴离子卟啉【2 6 2 7 , 4 0 1 、三苯甲烷【2 0 。2 1 t8 0 。8 2 1 、咕吨染料【2 3 1 8 3 , 8 4 1 、偶氮染料陋1 0 3 1 。这些染料的共同特 点是带有一个咀上羟基、羧基或磺酸基。此外，还有一些染料在一定的酸度条 件下与带相反电荷的蛋白质作用产生增强的r l s 信号。在一定浓度范围内增强 的r l s 信号与蛋白质含量成j f i 比，以此作为蛋白质分析的光散射探针【2 4 ” 1 0 4 。o ”。纳米粒子由于比表面积大易于吸附介质中的带电微粒而带电荷，因而也 可以作为测定蛋白质的光散射探针1 1 0 8 】。有些表面活性剂对带相反电荷的蛋白质 有光散射增强作用，可用于蛋白质的分析测定【i 吲。研究表明增强的r l s 信号 与蛋白质的分子量大小和电性有关i 加钔。 1 4 3 若振光散射技术在环境分析中的应用 有机染料的光散射探针除了用于核酸、蛋白质分析外，还可用于环境分析 中。利用离子缔合物的共振光散射增强与微量会属离子间的线性关系建立了 用碱性三苯甲烷类染料阴离子金属离子体系测定痕量的汞( ) 口s 】、铬( v i ) 田l 、 硒( i v ) “检测限在n g 级；测定钳】的检测限为2 1 1 2 0 m l 。在磷酸介质 中，用阴离子( 1 3 ) 金属离子罗丹明b 体系测定环境水样中的铬i ) 和铬( i i i ) ”1 2 方法的检测限为2 2p g m l ，结合离子交换分离法，可用于环境水样中铬的形态 分析。痕量的表面活性剂对带相反电荷的有机染料有光散射增强作用，据此建 立了用曙红测定阳离子表面活性剂的光散射方法 1 1 3 l 。 1 4 4 共振光散射技术在纳米粒子研究中的应用 姚刚4 1 用金纳米粒子与蛋白质作用的r l s 光谱，建立了测定蛋白质的灵 敏方法文献【1 0 8 ，“5 】证明纳米粒子可用作生物分子的探针。共振光散射技术还 可以用来表征纳米粒子的粒径印和研究液相纳米粒子的特性【“t 1 1 引。 此外r l s 技术还广泛用于表面活生剂物理常划9 l 、肝素”2 0 - 2 ”、糖原1 2 2 l 和药物p l ”3 j 的分析测定中。 6 第一幸n e 1 4 5 全内反射共振光散射技术在分析化学中的应用 r l s 技术虽然灵敏度高，但抗干扰能力并不强。通过液液界面把分析物富 集在界面上建立全内反射共振光散射技术( t i r - r l s ) 1 32 1 ，克服了r l s 技术抗 干扰能力不强的弱点，具有较好的选择性。在水四氯化碳界面上用该技术测定 金霉素口2 】，灵敏度比同样体系用荧光光度法测定的灵敏度高，检测限为9 8 x l o 9 m o l l ，其选择性更好。由于钍0 v ) 一h s a 二元化合物与十二烷基苯磺酸钠共吸 附于水四氯化碳界面上形成两亲层，产生强烈