（果树学专业论文）根癌农杆菌介导LEAFY基因转化苹果的研究.pdf

绱要 苹果是世界上主要的果树树种之一，但荩进入结果期较晚，影响了早期经济效髓 的获得，而通过生物技术将促进开花的基因导入苹果基因组内，促进其提早开花结果 楚一条十分重要豹途簌，将获褥一劳永逡静效果。本试骏以m 2 6 苹果砧本缝臻懿 为试孝考，对影稳苹采融本茎段再生帮擐簇农籽菠夯导苹采遗转转讫静霆素送行了系绫 研究，初步建立了m 2 6 苹果砧木茎段的荐缴体系，优化了校瘸农杆菌介导m 2 6 苹浆砧 术的遗传转化体系，并以在拟南芥克隆的穰分生组织特异性基阑三翱痧( l 硒基因为目 的熬因，利用农杆菌介导法转化嘎拉、富士、m 2 6 ，并通过g u s 报告基因检测到外源 g u s 基因在再生抗性芽中的表达及聚合酶链式反应( p c r ) 检测技术初步证明获得了 整合该基因豹嘎拉荦巢、誊士莩票、m 赫赫耪痰，为遗簧转憩掇供了分子生物学滚攥。 本试验主要研究如下： 1 通过分析激素、暗培养、茎段部位、放置方式、继代时间等因素对m 2 6 茎段褥 生的影响，确立了m 2 6 蕊段高效再生体系：选取继代培养2 2 5 d 的幼嫩茎段的上、 中部蓬段，以m s 为基本培养基附加激素b a 4 胁g 几，n a a o 1 m g ，l ，以茎段形态学 下端插入培养基，暗塔棼l o d 后光照培养6 0 d ，再生率和出芽数分别达到7 3 和4 1 5 。 2 。不围菝生素对甏黧投条生鬏骞一定瓣耱裁终爨，专那霉豢5 疆g 毽挣露其雯袋， 黼头孢霉素5 0 0 m g m 对生报抑制作用不大，k m 浓度为5 m g 纨，c e f 5 0 油l g 阻是枝条 生根的最佳抗生素浓殿。 3 在m 2 6 苹果转化体系中，头孢霉素浓殿为5 0 0 l l n g l 时适于作为m 2 6 苹果砧术遗 传转化的抑菌抗生素浓度。以o d 鲫为o 5 的菌液侵染外植体3 m i n 较为适宜。欺 壤券融培葬基中添趣2 晌班的乙酰t 香潮秘3 d 的共培养鸯麟予提高m 2 6 转化鲣榱 搭熬g u s 藩毪率，麓辩瞧保证 较寒乡 穰棼再生率。共培养麓鬃逛2 砖d 送行薅逡窍 利予提高根癌农秆菌的转化的再生率和外襁体的g u s 的鬻饿率。本试验优纯的根瘸 农杆菌介导苹果遗传转化再生体系为：以禽b a 4 0 l n 以，n a a o 2 m g l 的m s 为培养 基，以m 2 6 叶片为外植体材料，经根癌农杆菌侵染3 0 m i n ，黑暗共培养3 d ，共培养 培养基中含2 胁g ，l 的a s ，用头孢霉素脱麓培养3 d ，再进行卡郧霉素3 0 m g ，l 选择愿 筑逡，经过7 8 次豹继代薅选，获褥拣毪芬、抗性莛，并送行扩繁、生摄。 4 不同静遗传转识体系其转纯效率蠢缀大的不弱。与盱片嚣_ 生髂系籀跑，以蒸毅 为外植体进行转化，转化茎段经g u s 组织化学染色检测，其g u s 的瞬时表达攀为 1 3 ：3 3 ，表达强度较弱，仅在切口和基部脊少量表达；且获得抗性芽较难，抗性劳率 仪为o 2 ，经g u s 检测、p c r 检测均呈假阳性。 5 。通过优化根癌农杼蓥介导苹果遗传转化体系，以n 7 基因为鑫的基因进彳亍转化 曦羧、富圭、蜘筠豹磷突，对获缛豹撬囊努遽行了g u s 缓绥像攀聚色、p c r 硷溺， 滋寓井源基因已经整合到转纯抗往芽的鏊戮缀中，获褥了转掰v 基因的嘎挝苹祭、 富士苹果、m 2 6 新种餍。 美键词：苹果；遗传转化：工正乃7 ：根癌农杆菌介导 a g m 飙w 跆，妇m 强班宅秘商院球静m e d i a 妊：dt l 拍s 孙r 稍秘娃曲 o f 缅e a p p l ew i t h l b 4 f y g e n e a u l h o r ：“uj i n g m a j o r ：p o m o l o g y a d v i f ：j z 酶珏g ds h 躺j i 鞠穗l u a b s t r a c t a p p l ew a so n eo ft h em o s tp o p u l a rf 椭i ts p e c i e si nt 1 1 ew o r d nh a dal o n gj u v e n i l e 曲疑s e 抽a td e l a y c di 堪r e 印d l l d i v ed e v e l o p m e n li 珏e a r l yt i m e s g e n e t i c 拓a 璐f 。l 氆a l i o no f 矗p 爹l 嚣w i 氇凌e 沁yg 赫黼糙g u l 基i n g 鬟0 w e 矗赫g 畦da o c c k 撵| ei | s 重董f i b g 瘛毪oa n 耋b 蠢羲g 辨a b e n e 蠡tt op d u c t i o n i nt h i sa n i c l e ，t h ee 掇d e n c yr c g c n e r a t i o no fa d v e n t 主t j o u s 翮d 6 吣n la p p l es t e m sa n dt r a n s f o m l a t i o nw e r es t u d i e d t h ee 蚯c i e n tr c 嚣m e 珀t i o no fm 2 6s t e m s a i l d 爿g r d 6 口c f 盯m 川- m e d i a t e dr e g e n e r a t i o na n dt r a n s f o n n a t i o ns y 8 t e mo fm 2 6r 0 0 t s t o c k w e e s t a b i i s h e d t 1 l ef l o w e fm e 蛀s t e mi d e n t i t yg e n e 伍f y ) i n 月m 6 谢叩硫w 舔主n t r o d u c e d i 棘幻m 2 南g a l a 鞠df 喀酚蠢g 硝鑫e 衙扭ms t 恻l le 珏a 1 0 5b y 氆i s 拄鼍n s 细殂疵o ns y s l e 黼。魏 w a sl e s l e d 谤g u sa s s a y s 壤出巍eg u sa c 蛀v i t yw a s 麟辨鹅辩d 扛氆el 。a f 麟。f t r a n s f o 】 i i i e ds b o o t s a n di tw a sp r 州e db yp c r a n a l y s i st h a tt h et a r g e t 脚吖g 即eh a db c e n i n t e 黟a t e di n t ot 1 1 eg e n o m e0 fr e g e n e r a t e dp l a n t s r e s u l t sw e r ea sf o l l o w e d ： 1 t h ee f f e c t so fa u x i n ，d a 衄e s s ，p a r to fs t e m ，s t e md e p o s i t e dm o d e s ，卸ds u b c u l t u m t i m e0 na d v e n t i t i o u sb u 畦w g e n e f a t i o nf 幻ma p p l es t e mw a ss t u d i e d a n dt i l ee 蛾d e n t f e 黟辩f a 童i 曲s y s 埒瑶w 嚣sd e 细e d 。n 氇em sm e d i 啪n l a i 珏i 嘴转a4 + 0 撙耋鹰a 砖辩a a 毡重糊鹦毯o l o g y 的t l o mt o u 蕊n gm e d i u ma 蝴 l o d a y sd a 瓜 c u l l u r ea t m e n l ， r e g c n e r a t i o nr a t eo fm 2 6r o o t s t o c ks t e m sr e a c h e d7 3 a n dt h ea d v e n t i t i o u ss h o o t sp e rs t e m r e a c h e d4 1 5 2 1 1 1 ea n t m i o t i c sh a de 自f e c t0 nr 0 0 t j n go fs h o o t s w h c nt h ec o n c c n t r a t i o no fk mw a s 5 。啦t h er o o t i n go ft h es h o o tw a si n h i b i t e d 。a n dl h ec o n c 髑l f a t 至o no fc e f 5 0 0 m g mh a d 撇。避海矗a 玲i 建鳓f o o t 主n g + s o 强e 印t i _ i l 掇a l 粒。蠡l r a 圭i 。珏o f 髓l 洳i o i 鞋c so n o 豳gw 鑫s l ( m5 m 莎一a 稍c e f5 m g 鹰 3 i nt h et r a i l s f o r m a “o ns y s t e mo fm 2 6 ，t h ea v a i l a b l ec o n c e n t r a t i o no fc c f o t a x i m ew a s 5 0 0 m g ，l t h ee 倒c i e n tj m m e r s i n gt i m ef o re x p l a l l t si n 爿g ，口6 州船，n ms u s p e n s i o nw a s 3 巧m i nw i t h 彳g ，d 6 口r e ，f “小o d 6 0 0 = o 5 n r e ed a y sc o c u l t i v a t i o n3d a y sd e l a y e ds e l e c t i o n a 藏蘸a s 溉蛆，主n 幽e c 珏l t i v 越i o 珏m e d 娃mi m 掣删e d 抽eg u sc x 弦s s i 蛐a n 嬉龇 r e g e n e f a t i o n 豫e 。x p l 躺 s b yw h i c h ， t h e 爿g ，口易口c f e r m m m e d i a t e d t 豫n s f o h n a t i o n s y s t e m o f a p p l e w a s d e v e l o p e d o nt h eb a s i cm e d i u mm sc o n t a i n i n gb a4 0 m ln a ao 2 m l t h e1 e a fw a s d i p p e di n g 阳b 口c f e r m s u s p e n s i o nf o r3 巧m j n ，t h e nc o c u l t j v a t e dw i t h 爿g m 6 口c f e r f 蹦删f o r 3d a y si nt h ed a r ka n dt h ec o c u l t i v a t i o nm e d i n mc o n t a i n i n ga s2 0 i n g ，la f t e r3d a y so n r c g e n e r a t i o n 加e d i u mw i t hc e f o t a x j m e ( 5 0 0 l n l ) ，l e a fw a st r a n s f e r c do ns e l e c t i o nm e d i u m c o n a i l l i n gc e f o t a x m e ( 5 0 0 r n g a n dk a n 黼y c 泌( 3 0 m g 鳓聃e nk a n 嘲y e i n 一托幽a n t s 魏0 0 转、v e f e 融| a i 秘e da 襄霉f7 8t 矗n e ss e l e e | v 嚣s 毽b 贮娃l 趣f e 4 。t h e ew e r e 睫辩 靠c a n td i 搦e f e n c eb e 柳e e n 】e a fa b ds t e 礤触t 糟n s f 缸f l l a t i o n 孙e k a n 籼y c i n r e s i s t a i l ts h o o t sw e r ed 瓶c u l t yt o 心g e n e r a t e 曲ms t e m n eg u se x p r c s s i o n o fs i e mw a s1 3 3 3 ，a n dg u sa c t i v i t yw a sl o w o n l yi nt h ej n c i 蜮o np a na n db o t t o m n e r a t eo fk a n a m y d n - r e s i s t a n ts h t sw a so 2 i lw a sn e g a t i v ew i t bg u sa s s a y sa n dp c r a n a l y s i s 5 。毡氇i ss 驻d y ，姆蔗g 础c 舸蟊搬擅掰彩扫e 僦一m e d i a t 醯拄嚣稳s f & 氆a 蛀强s y s | e 礤，强e t r a n s g c n i cp l a i l t sw i t h 三肼7g e n eo fm 2 6 ，f 崎8 嬲g a l aa p p l ew e r eo b t a i n e d g u sa s s a y s ， p c ra n a l y s i sw e r em a d e ，t 1 l er e s u l t sp r o v e dt h a tt h e 工n ，h a db e e nt r a s f e 玎c di i l t 0 g e n o m eo f 妇n s f 0 玎 n e dp l a n t s 。 k 蟛髑蛸s ：a p p l e ；t f 黢s 热黼娟勰；翅翟秘确淞妇船垴勰撂脚臻幽嚣舔一越e d i a e d 缩略词表 缭珞词英文全称 中文全豫 a s b a b p 貔f c 黻 a c e t o s y “n g o n e b e n z y l y m i n o p u d e b a s e p a i r e e f o 托x i 撒o c h l o 豫热油翱l l 乙酰丁褥酮 6 _ 苄甄藻嘌岭 碱基对 头孢霉素 氯霉素 c m 出 c e 埘l t f i m e m y la m m o n i u mb r o m i d e 演化十六燧基三甲铵 曲r 肿 d e o x y n u c l e 0 6 d et r i p h o s p h a t o 脱氧拨箭三磷酸 e be t h i d i 蛀mbromde溴化如锭 矧0 鼍ae 出v l e n ed i a m 斑et e 妇a e e 蛀ca c i d乙二甄翻五鼗 g u s叠窑l 越秘f 煳i d a s c垂。蔫麓糖：骜酶 l a ai n d o j a c e t i ca c i d吲哚乙酸 l b a 1 n d o l e b u 瑚a c i d 吲哚丁酸 - ( mk a n a m v d n卡那簿豢 f y王 ，花分生鳃缪 特异性基因五呦 | s 蠢妇r 曲运弦a n ds k g m s 蘩零避莠基 n a an a d h 斓a l i c萘己酸 o d o p t i c a ld e n s i l y 光密魔 p c rp o l v m c r a s ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链式反应 p 、骨铷p d y v i n y l 料l i d o n e - 4 0 聚乙烯眦咯烷酮4 0 m mr 幽o n 粥fm i l e每分镑的耱数 s d ss o d i u md 删e 删s l l l f a t e十二婉藻硫酸镛 1 d zn i d i a z i l r o nn 一苯基叫n 一1 ，2 ，3 一噻二唑一5 一脲 t “s 1 矗s ( 1 l y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e l l l a n e 三羟纂甲基氨基甲烷 x 哪u c 5 b r o m o 1 l l i o r o - 3 n d 0 1 y 1 一d j 酗l 髂l o s i 如 5 一溴一l 一筑o 吲哚d 擎乳糖替 独创性声明 本人声餮j 莠受交懿学位论文是本人程学绛指导下送行瓣疆究工终及取褥豹磷究 成果据我所知，除了文中特别加良标注和墩谢的地方外，论文中不包含其他人心经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑i 鱼壅些蠢璺或其他教育机构的学 位成证书而使用过的树料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已程论文 巾律了骥确豹说臻弗袭示澍意。 学位论文作者然名：女w 睁 笈字日期：凇年 6 月，彳日 学位论文版权使用授权书 拳学篮论文终考宠全了瓣鎏垫奎然塞茎有关傈餐、搜耀学位论文豹趣霆， 蠢裁傈骜并两莺家鸯必部门或橇稳送交论文的复印律稻磁蠢，允诲论文被套阔秘詹 阅。本人授权塑垫盛然盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据席谶行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制警段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学馕论文作者签名：纠鬻 熬字日期：矽0 6 年月6 日 学位论文作者挲蝗焉去囱： 工作单位： 通讯地址： 等癖签名：所，乜争 签字日期；知柳年，月，占网 电话： 邮编： 掇癌农杼菌奔导蠡 y 基因转讫苹果鲍研究 1 写i 言 苹果是世界上非常重耍的火宗水果之一【1 l 赫种植面积和产量均位眉我国水果之酋，是我国 熏要的经济作物。但由于苹果生产周期长、童期长、岛交不亲和、遗传上商度杂合等原因，大大 疆褥了键统杂交寅静静效攀社3 l 。基蠢工程授零约发鼹秀苹莱照静教嶷辩瓣了薪熬途径，袋翔蘧 甓转傀技术可以大大壤稳苹果的育种周翘，越筏蜷育一个栗褥薪瑟释黧少需要死年甚至a 十举， 黼利用基因工程技术可能在数月内实现对菜个绒者几个性状的改良1 4 。l 。而且遗传转化技术打破 了槭物物种问基因传递的界限，可以将存在于野嫩种、其他树种、甚至动物、微生物中的理想熬 因f 如抗虫、抗病基因、延缓衰老基因等) 有目的的引入到果树中，获得定向改良遗传性状的植株。 强祷，外源基因导入撼物细胞中，主要露默下几种遗传转化体系：农杆菌介替法 秘辨妇m 嘲m 一镕d 遗自，删、基医稔法蕊蚤mb o 她m 。耐”“l 、聚乙二簿法 p o l y 鼬l e n 呼y c o l ，p 鼢) 等p “9 、脂矮体融台法( “p o s o m 缸i o n 严q 、嘏激法往船洳s j ”i 、 花粉管通道法( p 0 1 1 e n i u b ep a t h w a y ) | 1 8 1 、微激光束法似妇试a s t e 一”、电穿孔法( e l e c 帅p o m t i o n ，“1 、 超声波冲击法( u l t m s o m e c a t i o n ) 瞄j 。而在苹果( 妇鼬p m f 缸m i l l ) 遗传转化中。主要应用农杆菌介 导法f 2 l 。 l 。l 校癌农蠢菌介静苹果逮簧转纯豹研究 自从j e s 等鲫酋次掇道获得苹果转基因槭株以来，转基西技术得到了广大果树科研工作者 的藏视，使农杆菌介导法进行苹果的遗传转化发展极为迅速，研究取得了显著成就，已有多个品 种和砧木获得转基因植株。与其他植物遗传转化方法相比，农杆菌介导法具有转化频率高、操作 筠举、成本低、发生基因沉默率低、导入d 限锋段较大等优点# “。藤鼹。苹果试管萤幼嫩盼嚣 或落莰彀嚣窖荔，娶予鬻髂再生，可将再生不宠芽转纯隽萃缍瘫起源缝会髂等固。因魏，秘避农 轩蓊介导法进行遗传转化，已经成为苹果最为羹骚的一种遗传转纯方法。近些年来，国内摊利用 农杆菌介导法进行遗传转化的研究见表1 。 1 2 高效离体再生系统的影响因素的研究 雍效离钵再生蓑术楚擎襞蘧簧转纯匏基饕| l ，滚传转耗成臻夔关键楚孬生系统口j 。嚣蓑，受体 系髋有叶片、愈伤组织、腥性器官、茎尖、种予殿予房等多种。而植物转基因的主要方法有农杆 菌介导法、基因枪法、激光法、花粉管通道法等。以农杆菌介导法利用苹果茎段、叶片、叶柄、 撒段、子叶等外植体均离体培养获得了再生植株删，在农杆菌介导的遗传转化体系中，主鬻是 用试蒋茁幼嫩叶片作为基翻转化的受体材料。另外，也有用白化茎段作为受体材料获得转基因饺 拣豹投道1 2 7 l 。苹果斌管整娩嫩睁冀有多转离髂辩袅途径，疆在农抒莹奔撩的遗黉转佳研究中，戳 剥翊离体时片壹援荐生不定芽熬途径鸯多潮。婶薜舞效再生不定芽整实糯基因转铑静毫蓍提，怒获 襻转基因植株的关键。影响叶片高效再生因素的主要有以下几个方谢： = n f 北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 裘1 农杆菌介导苹粜遗传转化研究一览表 ! 1 2 1 11 兰! 竺竺2 ：! 壁! 曼窭黧2 篷2 竺! ：坐竺虫竺竺兰殴! 兰 品静 农抒蕾蓥株 转纯基因主要内容 逝怒重坠一一一一舷幽塑! 坚垂堡 垒! 生垒篓堡堡堡 绿袖 l b a 4 4 0 4 君“品印f i l 首次获得苹果转基因植株l 瑚 皇家嘎拉 e h a l 0 5 黼印f l i 黄他攀段获得转基因植株m 勰1 绿袖a 2 0 8 ，c 5 8 c 1 ，a 2 8 1 ，a 4 g i i 哪( 3 ) l i农杆诸转化苹果，影响毒性的因素f 删 绿袖c58c1 8 n s 脚a s 和b p 协嗣作用程进苹果转化 删 绿袖 蠢珏a 曲1 辨秭国秘 嚣蠹雷铡苹果转基因斌验骆l 兀卿pgv3雒e艄，斜l i 敲愈伤组织或的转让挚株黼 元帅， p i n k l a 由 p g v 3 8 5 0 g 呐，叫i l 研究挺商苹果叶片转化效率的因素m i 元帅，皇家嘎拉e j i a 】0 】端觑吗一j j 用蚓p 撼因作为报告基因转化苹繁f 斟i 嘎拉，富士 l b a 4 4 0 4 ，c s 8 c 1 ，e l 王a 1 0 5g 鸲掣l i早期影响转化效率的因素i 拈l 整家嘎拉辩状1 群s 掣f h 蹑傍婶片挺高转诧效率蚓 嘎控a g 霉磷肇f l l 苹果静嚣越接再生整撩效果不毽l 瑚 嘎拉 e l a 1 0 1 g 崦删i f 高浓度渊和黢= 基撺蒂哝符赫生 澳洲青苹p g v 2 4 4 9 ，c 5 8 c 1 加州j i 古商 p f 转基因植株再生1 3 印 m m a 2 8 1 ，a 3 4 8 c 5 8 嚣h 品印fl i野生烈撤癌农杆菌转化m 2 6 【帅i m笛a4 g 磷弼，l 辍撵扶转佳摄上再生p q m 拍l b a 4 4 ，e 薹a 】o l ，t 雕髓毋船c 磊e 摩妇嚣蕊聪整台i 苹果基强缝，获褥 转化植株l ”l m 2 6 c 5 8 g 雌坤r i i神f i i 转化苹果删 m 7 c 5 8 c 1 g 雌却f l i m转r o m 慕因增加m 7 生根能力 葬纳盘 e n 1 0 1 g 嶙携一j i 转亿苹聚煺攀li i 比抛r 选择更有效h 铆 彀嚣2 号，缭棰 糯a 甜档轴删l l b l 基因簿a 苹巢，强阉检测抗虫蛙誉理 想1 5 j 莽纳金，嘎拉黼心0 4 c p l l ，掣l lc 岬导入主栽苹果，s o u t h 锄鉴定州 肇家嘎拉 i 肥a 4 4 0 4 8 峨印fl i 延迟筛选2 d 提高转化效率i 蚰1 m 茄 p g v 3 1 0 1r d 扶，垆l 诱导形成愈伤组织对转化有利1 4 9 1 ：婪堑 盆塑墅! 缓娩盘! 垒i 竖堡鎏鹜琶錾丝! ：竺 1 2 1 基因墼 麟因型的依赖性是一种普遍现象，苹果栽培品种及其砧木再生能力的大小取决于试材基因 型，不同基因型品种的离体叶片再生能力差异很大【5 2 。”，它表现为种问、品种间再生能力不阎。 倍蚀较赢的三倍体和圆倍体萋因型品种比二倍体潞枣争更容易再生不定芽，这可能是多倍性的基因 2 根癌农杆菌介导z 甲基因转化苹果的磷究 测品种新陈代谢旺盛、酶活强【“5 ”。另外，苹果叶片再生能力的差异表现为不同品种间再嫩率和 每叶片再生芽数的不同【5 2 “】。一般再生能力强的品种有m 2 。、皇家嘎拉、绿袖等，再生8 力鞍强 能有王抟、新乔纳金等，褥生较难的有富士、金莲等。由于m 2 6 、爨家蠼拉等再生能力缀强，睡 藏藏为苹栗基因转纯豹羧武瑟势蟊类型。 t 2 2 外植体生理状i 黩 叶片来源、发育稷腱的不同必然导致其生理状态的差异，从而影响荐生能力。叶片本辫对再 生静影响表现在以下几个方疆： 1 2 2 1 时片的来源 c h “t e l 等凹研究发现，不同来源的苹果叶片其再生能力从大到小的顺序为：试管苗、温嫩苗、 根蘖苗。这可能是由于试验材料所在的环境疑其生理状态所决定的。 l 。2 。2 。2 咛冀熬毪 试管苗的叶片熟怯对其离体再生不定芽能力的影响很大口“”。叶片熟性与试验材料继代培养 时问、叶片位置及其大小等有关【6 ”。试材基因溅不同，最佳发育擞娥状态则不同【5 9 】。一般认为 2 8 3 5 d 目龄的试管苗幼嫩叶片再生频率晟商，单叶片平均出芽数也艘多【6 2 “i ；同时，顶部平展 弗正在扩展的幼嫩时片较下部老时更易再生不是芽。细胞学豹研究袭嘲璜部幼嫩叶片栅拦缀织和 海绵缍缓巍未势诧，老簿蠢鞠显豹缍织势纯婶l 。舅乡 ，砖片嚣大小j c 重襻生豹嚣藏遣嚣基因黧誉嚣 磷存在差异h 。y e p e s 游l ”j 认为自由苹栗时靖长度在1 每- 2 0 1 c m 、魑釉m 2 6 在l 。l 1 5 受赫荐 艇不定芽维管束，尚来形成的幼小叶片，通过增加队含量再生频率也能够提高，但小叶翁形成 过多的愈伤组织对再生不利。 1 2 + 2 。3 时片放置方式 举同苹果品种的诗 片辩敖置方式反应有穰犬差异。大多数品种类裁如绿秘、m 一歉富l 、长 甯2 等以正面向上放鼹效果最好，威赛克旭日m c i n l o s hw 4 d k ) 则以背筒向上效果最好【5 “，而正林 对放置方式要求不严格，差异的原因是叶背谳气孔较多，角质层不靛达，有利于营养的吸收。也 研究发现试管苗叶片的角质层并不发达，再擞以上部细胞为主，因此，认为可能还和细胞分化 的极性有关，这群极瞧的影响也可能翥时片蒸郝聚集豹维营袭有荧。 1 2 2 4 叶片的处理方式 完整叶片再生率很低，经切割可以大大掇掰樽生效率。另外微金属粒子的轰击也可以提商再 生效果1 “。切割或离子轰击提高再生能力的原圆可能是切割或轰击伤密刺激了伤口及其附近细胞 的分装，往日的形袋鸯秘予对培养基中营养及激素妁吸收。 3 溺0 e 农韭大学硬士学位( 毕业) 论文 】2 3 墙葬基孛激素聚豫 m s 培养基中附加不周种类的细胞分裂素b a 、k t 、z t 及生长素n a a 、i 从、b a 的研究液 明：b a 和n a a 组合最有利于不定芽再生l 删。另外，苯基脲衍生物t d z 在难再生品种的叶片树 生申裁现出明显的效果。l o 等【删报道，在苹果叶嚣培养中。1 嘞m o l ，l j 粉z 再生效栗与2 z “m o l m 摆当凌更好。k o f b 8 n l ”、 娃l e l 阁、张恚宏l 。l 等墩蠢粪缀报道。 1 2 4 基本培养基类型 在苹果离体叶片再生不定芽的研究中，再生培莽基大部分采用的是m s 培养基，低盐f l ，4 m s ， l ，2m s 落养基不利于叶片蒋生l “”i 。f a s o l o 等删认为：矿物质特别是l p 、n o 、n h + 4 的浓度辩 时片秀垒影穗缀大；面缕葵基抵氮、c a “、a 搿+ ，高i f ，著具有鞍巍瓣n o 斓毒，被诀鬼 是滔寂的诱导培养基。也有人认为净l ，翔n 。鑫每大爨元素代替m s 静夫簸元素也髓键递醉冀离体 再生。 1 2 5 前期暗处理 苹果裹俸l 一片毒生氅葵避罄孛，蓠絮嚷处理瑶玟鑫著握赢砖冀蓐生撅枣，鞋瞎培莠2 心髑势 佳泌删。f a s 。l o 【勰l 研究认为游期碴薤理蓊时片荐生搴是光照处理静2 倍，遮可能是因为豇党攒制 不寇蒋彤成，远红光促进不定芽形成，而白炽灯发出的红光要比远红光雾，直接在光照下培养， 不定芽的形成受到红光抑制，导致再生频率大大降低f 6 l 】。 】2 6 抗生素 抗謦! 素在基因转纯中的律用一是用于转讫髂的筛选，二是在共姥莽爝用予杀灭残蛩在盱冀上 的农杆菌。由于抗生素对叶片是有毒性的，困此筛选适宜浓度的抗生素对获得转化体是至关鬟袋 的。在植物遗传转化研究中，常使用头孢霉素或箍带青霉素来除菌。在苹果稃生研究中发现i ”“， 在一定浓度范围内，c e f 促进不定芽分化，但其杀菌能力强，其适宜浓度为2 0 0 旧0 0 m g l ，而c a 曲 刺激愈悔组织增建适宜浓发为黼g 脚。卡那簿索是基因转化中用予筛选转亿植株的最常用的 一静撬生素。邵建桎滞豫窳凌翳卡箨霉素强烈麴翻莓象辞背孬生，5 m g m 帮宠全捧裁芽再生。 1 3 高效遗传转化系统的影响因素 1 3 1 基因型 辇聚蘧抟转证残秘与否，在臻天程度一蔓取决予试验砉| 辩戆基嚣墼。据壤递，农耔蓥奔导获褥 苹聚转基因植株的基嚣型晶释主要有绿籀l “、诧抑瀚、皇家嘎拉嘲、嘎挝1 3 q 、澳渊青苹f 捌戳及 砧术m 。i 删、m 。f “1 等。研究淡明：苹果基因转化频率与再生效率之间有极大的联系，通常是辑嫩 效率趟高，转化频率也越离f ”1 ，这是转化效率依赖于试材基因型的主要原因。因此，在遗传转化 4 校癌表杼莹奔导z 颡吖蒺因转纯苹果的磺究 审，应选择适宜静韩棱髂糖瓣。 1 3 2 菌株类型 不同植物体对农杆落侵染的敏感性不同，褥不同农杆菌对植物体的侵染能力也不扁，农稀藩 与镶耱箨之闻是否毒褰嫒絷力的配合，直接彰昀副转恁效率的裹低p l 。爨蓠，在苹果主应雳瓣农 稃薅菠株类型主要有鼙熊碱型的强a 4 4 0 4 擀。”，琥珀碱墅a 2 8 l 滞弼，e 融1 0 l 泌删和 e l 重a 1 0 5 f ”“，胭脂碱型c 5 8 p 9 叫和p g v 类f 4 9 删。早期检测g u s 藻因瞬时表达，以具有g u s 旋逃的抗性愈伤组织诱导率为评价指标，发现e i l a l 町菌株的转化效率约是u ；a 4 4 0 4 或c 5 8 的 1 0 倦多【3 7 】，e h a l 0 5 约魁l b a “0 4 的8 倍l 叫。所以选用侵染能力强的农杆菌菌株类型有刹乎 进 掌筚果遗传转化研究。 1 3 3 蕊滚浓度及外德俸在菌滚中的浸泡时阀 农杆菌菌液浓度与侵染能力相关。合适的荫液接种浓度及外植体襁荫液中浸泡的时闻，有助 于挝商转化效率并兼顾剿以靥的除菌。菌液浓度太低或浸泡时间太短，按种到伤口面的农杆菌数 量太少，在共培养时转化效率低；菌滚浓度过离或浸泡时闻过长，常姆皴农杼菌繁殖过度，对攮 秘毒砉瓣造戏毒害终焉，降褥转芘效率。不弱瓣， 挺传嚣其对农抒菝戆壤黪毪蚕霹，楚用豹蘩滚滚 璇不同。苹果对农杆菌较为敏感，在转纯过程中括用蓠液浓度o d 为o 0 4 埔6 谬“，没漱时 间弗在4 6 m i n i ”i 。 1 3 4 酚类物质 v 拓医基因瓣活纯蹇接潺控羲孓d 融懿镑移，是丧毒 莛基舜转织弱秀关。一些摹楚的懿荧豫 台物都可以激活v 打区蕊困，这包括：j k 茶酚、没食子酸、焦性没食子靛、p 一羟基苯甲酸、瓤儿 茶酸和香草醛等，而苹槊遗传转化研究中常用的v i r 区基因活化诱导物质是酚类化合物乙酰丁香 酮f a c e t o s y 咖g o n e ，a s ) ，它的诱导效果最佳。萁通宜浓度为5 0 1 0 蛳m o l i j 3 “。j a m e s 等f 刈发现， 在农杆菌介导转化绿袖苹粜时，与a s 同时加入诱导稳定剂甜菜碱或脯氨酸，对v i r 区基因滔他 鸯协同作臻。 l 。3 5 共培养时阙、种特放置方向及切割方式 外植体与农杆菌接种后的共培养，在整个转化过程中是一个非常灏骤的环节，农杆菌的附着 及h d n a 的切割、转移和攘合都在共培养期间内完成。所以，共培养技术条件的掌握是成功转 他的荚键因素之一1 2 4 l 。共培养对阍对转纯效率宵缀大影晦，不同转化瓣瓣残不嗣菊拣类型所爨戆 爨德共培养对闯不璃。农释蘸转诧对，著不侵入剿植物细蘧中，嚣是撼t ，d 融转移l l 毽秘缀胞， 农杆菌附着后不能立即转化，只有在剖伤部位生存1 6 h 之后才能诱发肿瘸所以共培养时间过短， 农轩菌尚未附着，t - d n a 还没有充分切割，转移和整合；时间过长，横物细胞易受毒害，厝继 培养时雉以除菌，农杆鲻容易过度生长。确定最健共培养时间的方法魁采用早期g u s 基因瓣时 5 溺1 0 农韭大学硕士学位( 毕韭) 论文 袭遮，在苹果上确定最链黎培养时阀在2 0 d ，其体长短依基舔型、农格菠萤撩类型、萤液浓发簿 而定口”，另外共培养时培莽基中高浓度的细胞分裂索比生长素更有利于转化i 硎。 芙于共培养时叶片放麓方向，文献报道不一。一般认为叶背面( 远轴瓣) 接触培养基有利于熬 目辚化，但也有人得出相殷的结论。张志宏等1 7 q 认为欺培养时叶背面接触培养基效果较好。关f 叶片切割方式，j a m e s 等l ”l 蓠次用n l 。盘转化获得转基因植株，后来也有用时块辫9 l ，整时划痕1 4 5 l 及篷焘痰矧获褥较裹转毒l ：皴率豹壤遵。 1 3 6 预培养、脱菌培养和选择培养 1 3 矗1 预培养 臻缕莠撂韩蓬终在拔狰转纯蕊离嚣培葵一毅砖翔。羲培莽辩翅台遴刘森窝予舞嘉尹 滚基魏戆 麓谯攀和转纯率，时同太彀酶低多 植体鹣转纯率，甚至农杼萤侵染豹外稳体死亡，一般淤2 。7 d 为宣，但并不是所有的植物都需要经过预培养，这需簧根据外植体的基因犁而定。另外预培养时 间与g u s 阳性率与转化举之问存在一定关系，一般认为成平行关系，即阳性率高，转化率黼， 但有时无平行关系，如苹果叶片转化前预培养6 d g | u s 阳性率最高，但却没有获得g u s 抗性愈 伤缎织一j ，这说明瞬时表i ；鏊是步 源d l a 进入受体绷腱，两基因转化稳定寝达是外源d n a 楚会 裂援d a 上，象葭嚣者秘荚，嚣叉不等运。嚣魏，是否需要疆涪葬，颊嬉莽多长对逮要摄援不 簿， 撼体面定。 1 ：6 2 脱菌培养 缀寐共培葬的， 植体表甄及浅层维织中， 筝在大最农抒菌，为了詹缎培养研究必须进行麟壤 臻葵，逶掌在莛莠基孛热入蔡整扶圭素亲除藏。撬袅素主要寿f 弱痨，这嚣静撬生素辩淼轻 萤嚣宵杀伤和抑菌作用，翊时对植物细胞也有一定的生物效应。苹采再擞试验己证明搿硐，在一 定浓度范围内c e f 促进不寇芽的分化，c a r b 促进愈伤组织的形成，抑制不定芽的分化。所以，转 化时研用c e f 来抑制农杆菌的生长，浓度一般在5 0 0 m g 几左右。也有暑h _ c a r b 混用达到较好抑菌 效果的报道1 2 ”。为了控制农杼菌的增殖生长，在按培养结束时加入抗生索，除去过多增殖的农杆 蓊露避行培养，毽妇箨止壤瘸藐生素乡 檀体中又蠢农抒落生长，一般5 嗡次继饯培莠，仍不戆恕 残淫静农轷萤杀死，特剐跫筵垒在鞭管素帮翅蕤瓣骧孛豹农毒手萤，霭在壤器过援中一直囊入抗鸯 素。 1 3 6 3 选择培养 转 二植物细赡和菲转化纲藏之闻存在羞生长毙，转诧细照蠢予数题少，在竞争中常娃子劣 势t 必须进行遥簿e 在苹鬃遗话转纯中，鬻援黥逸择标记基因楚擎f 疆，它编码台成熬疆霉素磷 酸转移酶，对卡那霉素、新霉素、g 4 1 8 等氨基糖瞥豢抗生素均具有抗性m8 “。由于苹果对幸鄹 霉素极为敏感，则在选择培莽基中加入k m 抑制q e 转化细胞的生长，选择压般在5 2 5 m g 几。 试验袭明 “，新霉素或潮蒜煮要比卡那霉素或g 4 1 8 更有利丁选择转化植物细胞。关丁苹果的 6 羧癌农丰 莛奔导z 疆基因转证苹果瓣磋巍 选强培养方式，常采用意帮选择或延迟选择两嵇。蕾者是指共培养彗柬嚣就转入趣有选择疆瓣培 养蒸上进行选择培养；脐者是指共培养结束后，先转到只含有脱菌抗生素的培养基上培养一段时 间，再转入加有选择压的培养基上进行选择培养。由于苹果对卡那霉豢极为敏感，研究中多采用 后者进行选择培养，y a o 等4 8 l 在皇家嘎拉苹果，j 二研究发现，延迟选择2 d ，获得了很好的转化效果， 转化频率这熨4 6 。 1 4 植物开花相关基因的研究 高等植物的开花不论对植物本身还是对于入豢都是十分重要的。歼花是高等植物生活史止的 一个质变过程，是植物个体发育过程的中心环节“】。植物的开花研究白1 9 0 4 年i 【l e b s 的碳，氦 眈_ = c 作至今已有将近l 年的历史，1 9 7 0 年以簿主要进行鸵是有关野筏生理方面的工作l 髂+ 嘲， 1 9 粥年鞋螽集孛子拜藏避糕靛蘧鹫学控割方瓣豹疆究阻9 ”。嚣蔫在穰携野蓖调控孛应瘸瓣蒸霆 包括网源异型基因如属于m a d s b o x 基因家族的基因，花分生组织决定蒸因，开花时阔决定基因 等。 l + 4 1 同源异型基因 瓣源异鍪薹强f 猕m 凇沁窑e n 蜂是淫控各炎蕊辑富形或的器害耱糍熬霜，是近年援耪发寅势予 搬物学研究中的重点。这贱基因是由于对熬磷芬蔡和金鱼革获褥的番炎麓器官的同源异塑突变体 的研究而发现的。现已知，在这两种研究花器宙发育的模式植物中，材3 类同源异型基因决定形 成花的四轮器官( 从外到内为：花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊) 。这3 类基因分别具有不同的功能活性( 分 别以a 、b 、c 表示) ，a 炭基因的功能活性局限于第1 和第2 轮，b 在第2 、3 轮，c 在第3 、4 轮，秘a b c 模型：a 类麓闲擎独捧惩决定形成第l 轮静萼片，a 帮嚣焚目决定形成第2 轮的诧 瓣，b 摹le 共嚣决定第3 轮豹雄蕊，丙c 单猿撵翔嚣| ，形成第4 轮豹心皮。现已在掇毫莽菜串竟 隧的是有a 功能的基因霄胛1 和埘) 2 ，具b 功能的有一尸3 和拼，c 功熊的有a g 相应在盘熟 草中具有a 功能的是聊m ，b 功能的是d 孙和以d ，c 功能的是_ p 览嚣，只是拟南芥菜中的一舰 在众煎草中未发现其同源藏冈【”。这三类同源界型基因编码的蛋白质的n 端均带有一个保守性很 暇的d n a 结合序列m a _ d s 盎，因此该守区被命名为h 疰a d s - b o x i ”，嗣时在人、蝇中也发现了网 撑的基因家族圆鼢哦、蠢8 、z 班磁鞠鼹日，这撩家蔟静成员可纛参与琴强懿分耗过程，且议在 它们起作用的轮中大量表达。 1 4 2 花分生组织决定熬因 芯分生组织决定基因棚o w e rm e d s t e mi d e n t i t yg e n e ) 决定薪形成的艨基的发育方向，是继续营 嚣生基数发育方式，还燕转囱蕊的发育，这类彗陵键摆投霆隧戳越戏0 糙联露互) l 帮露琵2 、暇乒、 。w 、一艇掰4 1 秘陡) 帮4 尹2 、( 磁玩。瑚暾g 哇) 等。z 乳1 所起静撩遮开花静功毙是懑j 攘阻 j 韪自主促进途径中促进开花基因( 如， 翻、，p 嚣和用叫) 的作用而表现m 来的；c f 和耽c 熬因 照洒过阻遏某些花分生组织特征基因而推迟开花的，而最为引人注目是从拟南芥0 m 6 蝴括 7 河农韭大学硕士学健( 毕韭) 论文 珐口渤n “挣克隆熬王珂基潮，岛1 9 9 2 年w e i 鐾e 落i ”j 首次克隆了五弼，基因菇发瑷其在成藐牵 起关馘作用以来，许多学者对该基因进行了深入的研究，并且已从苹柴、柑桔、葡萄、水稻、烟 草、潞茄、黄瓜等植物中克隆到其同源基因【9 1 “】。拟南芥u 吖基因是一个决定花序分生组织转 换为张分生组织的功能基因，蕻表达水平是决定成诧的关键。换句话说，它具有特化分生组织的 功能，可戳整合环境信号遴蕊促进分生组织的转换l ，且三凡7 基因是角嗡基因和拼基因的主安 激淫颡予；程逶茈霾嚣舅登蒸圜黔表这，这也说骥窀砖予诱导花形成蹩努霰瓣。透过转基困疆耪 也谶安：n ，基因在3 5 s 瑶蕊子驱动下，转基强拟南芬菜所有的翻芽全部转变为花，主茎的顶端 转变为顶花p 。 1 4 3 开花时问决定基因 嚣蕊鞋溺决定基因馨o w e t 涵eg e 鬻毫类基瓣雏突变会镬突变髂敬嚣蕊时阕援军或延迟。魏 括；( 粉m s 蹦撼琢如) 、工榭磁d e p e f d e 鞋d ) 、黝、弼等，抑制开花的酿拼l 基因。糍 植物的开花过程中，日照长殿是一个关键的因素，能够调控开花的起始，然而开花时间决定基阑 可以举鼹日照长度的影响，像们的表达能触发开花l ”j 。c d 是拟南芥中汗花时间的决定因子， 它的突变导致长日照下开花时问的延迟，非诱导的短日照条件下正常开藏【1 ”j ，说明c 0 有可能怒 一个鼗录调控因子，的袭达靼可迅速诱导髓掣秘z 觋1 基因斡转录：褥霸e d 和凹i 基因不受 甚照长度懿影薅，西藏这三个基嚣可薤是壹接棒麓予燕麓慈形成酚嚣露蔟瓣，氇证骥了透过基鞠 工程技术调控植物的开花时间是可能的。 1 4 。4 开花基因转化植物的研究现状 隧簧分子生鐾学技东的弓l 入为植镑舞花的研究提供了耨的途径，邀过遗传转佳将己克隆蛇相 关嚣稳纂毽导入蓬株，簌瑟获褥秀莛缝靛改毫翡撩拣。1 9 9 5 年n d a l “l 等瓣艘1 基霾导入熬巍 芥使大约1 8 d 开花的野生越南芥1 0 d 就可觅花芽。1 9 9 5 年w e j 叠e f ”崤五科基因导入杨树，结暴 使原本需要8 年才能开花的杨树品种提前到7 个月就能开花。1 9 9 6 年s i m o n ”l