（园林植物与观赏园艺专业论文）珍珠黄杨组织培养及种子休眠解除技术的研究.pdf

摘要 珍珠黄杨( b u x u ss i n i c av a f p a r v i y o l i a ) 叶片细密，枝干苍劲，树形稳定， 生长缓慢，是具有较高应用和观赏价值的优美观赏树种，但这树种的野生资源 已濒于绝灭。为了保护这一树种，并满足园林绿化的需要，本论文从组织培养和 解除种子休眠这两方面内容开展相关研究，以期为加快珍珠黄杨繁殖速度，扩大 繁殖规模，进一步推动该珍稀树种的实际应用提供帮助。 1 珍珠黄杨离体再生体系的建立 通过正交试验设计并结合方差分析和多重比较，着重探讨珍珠黄杨组培过程 中外植体消毒、最佳培养基配方及培养程序。结果如下： ( 1 ) 去除种皮种子以0 1 升汞3 0 m i n + 0 1 升汞8 m i n 为最佳灭菌方案，污 染率为5 8 3 ；茎段灭菌以0 1 升汞3 m i n + 2 8 4 溶液6 m i n 为最佳方案，污 染率为2 5 5 ，成活率为7 4 5 。 ( 2 ) 最佳启动培养基为m s + 2 o m g l 。1 6 一i = l a + o 5 m g - l n a a ，出芽率达7 6 4 ， 出芽指数为1 7 l 。 ( 3 ) 最佳取材季节为4 、7 月，污染率低，出芽率高。 ( 4 ) 最佳继代增殖培养基为m s + 2 o m g 一6 一b a + o 1 m g l 。1 n a a + 2 o m g l - 6 a 。，增 殖倍数为4 2 8 ；最佳继代周期为3 0 d 左右，继代次数为4 代。 ( 5 ) 最佳生根培养基为l 2 m s o 1 n g l “n a a + 2 0 9 蔗糖，生根率为7 3 6 ，且 根系粗壮。 ( 6 ) 炼苗用珍珠岩：细沙= 1 ：1 5 的混合基质，成活率为6 3 4 ，檀株长势 良好。 2 克服珍珠黄杨种子的休眠 通过对珍珠黄杨种子生物学特性、外种皮抑制物质生物学测定，不同浓度赤 霉素处理及不同层积处理，探讨了打破珍珠黄杨种子休眠的方法。研究结果如下： ( 1 ) 种子千粒重为8 7 2 6 9 ，纵径为4 3 5 6 m m ，横径为2 3 2 1 m m 。 ( 2 ) 种子具有一定透水性，所以其休眠不是因为种皮不透水引起的。 ( 3 ) 种子外种皮甲醇浸提液中含有某些抑制物质，可以抑制白菜籽的发芽。 ( 4 ) 种子具有上胚轴休眠的特性，萌发需要经过暖温( 2 5 ) 一低温( 0 5 ) 一暖温的过程。打破种子休眠的最佳方案为先用2 0 0m g l 1 赤霉素处理4 8 h 再高温层积6 0 d 进行催芽，萌动率为9 0 ；待根突破种皮，再将种子用4 0 0m g l 。1 赤霉素处理4 8 h 后低温层积3 0 d ，发芽率为8 2 。 关键词：珍珠黄杨组织培养种子休眠层积 a s t u d yo nt i s s u ec u l t u r ea n ds e e dd o r m a n c yr e l e a s i n gf o r b u x u ss i n i c ar a f p a r v i f o l i a a b s t r a c t b u x u ss i n i c av a tp a r v i f o l i ai sak i n do ff i n eg a r d e no r n a m e n t a lt r e ew i t hh i g hv a l u eo n f l o r i c u l t u r eb u ti t sr e s o u r e sh a v eb e c o m ee x t i n c t i no r d e rt op r o t e c tt h i sp l a n ta n ds a t i s f yt h e n e e do fg a r d e n ，t h i ss t u d yi st oe s t a b l i s hai nv i t r oc u l t u r es y s t e ma n dd e v e l o pam e t h o do f r e l e a s i n gs e e dd o r m a n c yf o rb u x u ss i n i c av a t p a r v i f o l i af o re n l a r g et h er e s o u r c e sa n dp u t f o r w a r di t sa p p l i c a t i o n 1 t h ee s t a b l i s h m e n to fr e g e n e r a t i o ns y s t e mo fb u x u ss i n i e av 口r p a r v i f o l i a w i t ht h es t e r i l i z a t i o no fe x p l a n t s ，t h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n td e s i g n s a n dm u l t i p l e c o m p a r e s ，t h es a t i s f i e dm e d i u ma n dc u l t u r ep r o c e d u r ew a sd i s c u s s e d t h er e s u l t sa r el i s t e da s f o l l o w s ： ( 1 ) s o a k t h es e e d s i n3 0 m i n w i t h0 1 h g c l 2s o l u t i o n ，d i v e s to f t h es e e dc o a ta n ds o a k t h e s e e d si ni n8 m i nw i t h0 1 h g c l 2s o l u t i o n ，t h ee m p o i s o nr a t eo fs e e di s 5 8 3 t h es t e m s e g m e n t sc a nb es t e r i l i z e di n3 r a i nw i t h0 1 h g c l 2s o l u t i o n ，a n dt h e ns t e r i l i z e d i n6 m i nw i t h2 8 4s o l u t i o n t h ee m p o i s o nr a t eo fs t e m w a s2 5 5 a n d t h es u r v i v a lr a t eo fs t e m w a s7 4 5 ( 2 ) t h eb e s ta c t i v a t em e d i u mw a sm s + 2 0 r a g l - l 6 一b a + o 5 m g l - n a a t h ei n d u c e m e n t r a t ec o u l db eu pt o7 6 4 ，a n dt h en u m b e ro f a x i l l a r yb u d sw a s1 7 1 ( 3 ) t h eb e s ts e a s o n sf o rd r a w i n gm a t e r i a l sw e r ea p r i la n dj u l y a n dt h ee m p o i s o nr a t ew a s l o w ，t h es u r v i v a lr a t ew a sh i g hi nt h e s em o n t h e s ( 4 ) t h e b e s t m u l t i p l i e d m e d i u mw a sm s + 20 m g lt 6 一b a + o 1 m g 。l - n a a + 2 0 m g l1 g a 3 ，a n dt h em u l t i p l i c a t i o nr a t ew a s4 2 8 a n dt h es u c c e e de r ap e r i o dw a s3 0 d ，t h e s u c c e e de r aa l g e b r aw a sf o u re r a ( 5 ) t h eb e s tr o o t i n gm e d i u mw a s i 2 m s + 0 1 m g l n a a + 2 0 9s u c r o s e ，t h er o o t i n gr a t ew a s 7 3 6 a n dt h er o o tw a ss t r o n g ( 6 ) t h em e d i u mw i t h 2 5r u b ym i c aa n d3 5s a n dw a sb e s tf o rn u r s l i n go fp l a n t l e t s t h e s u r v i v a lr e t eo fp l a n t l e t sc o u l db e6 3 4 2 d e v e l o p i n gam e t h o do fs e e dd o r m a n c yf o rb u x u ss i n i c av a rp a r v i f o l i a w i t ht h ec o m p a r i s o no fs e e db i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，t h eb i o l o g i c a lt e s to fg e r m i n a t i m i n h i b i t o r ys u b s t a n c ei ns e e dc o a t ，t h ep r o c e s s e so fd i f f e r e n tg a 3c o n c e n t r a t i o n sa n dd i f f e r e m s r a t i f i c a t i o np e r i o d s t h er e s u l t sw a sa sf o l l o w s ： ( 1 ) t h ew e i g h to fo net h o u s a n ds e e d sw a s87 2 6 9 a n dt h ev e r t i c a ld i a m e t e rw a s4 3 5 6 m m ， t h et r a n s v e r s ed i a m e t e rw a s2 3 21m m ( 2 ) t h ep e r m e a b i l i t yo fg a sw a sn o tt h em a i nr e a s o no ft h es e e dd o r m a n c y ( 3 ) t h ed i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fm e t h a n o le x t r a c tf r o mb u x u ss i n i c av a t p a r v i f o l i as e e d c o a tc o u l ds u p p r e s st h eg e r m i n a t i o nr a t eo fc a b b a g es e e d s ( 4 ) t h ee f f e c t i v em e t h o df o rt h ed o r m a n c ys e e dr e l e a s i n gw a sf o u n da sf o l l o w s ，s o a kt h e s e e d si n2 0 0m g l g a 3f o r4 8 h ，s t o c kt h es e e d sw i t hs a n du n d e r2 5 f o r6 0 d ，t h e ns o a kt h e s e e d si n4 0 0m g l g a 3f o r4 8 h ；f i n a l l y ，s t o c kt h es e e d sw i t hs a n du n d e r0 5 c f o r3 0 d k e yw o r d s ：b u x u ss i n i c a3 z a f p a r v i f o l i a ；t i s s u ec u l t u r e ；s e e dd o r m a n c y ；s t r a t i f i c a t i o n 本学位论文知识产权声明 本学位论文是在导师( 指导小组) 的指导下，由本人独立完成。 文中所引用他人的研究成果均已注明出处。对本论文研究有所帮助的 人士在致谢中均已说明。 基于本学位论文研究所获得的研究成果的知识产权属于南京林 业大学。对本学位论文，南京林业大学有权进行交流、公开和使尉。 研究生签笔：耳 j 别唯名：彦札伍 i q 其t g ：上祝7 、专 致谢 在论文撰写完成之际，我要衷心感谢我的导师季孔庶教授，本研 究是在导师季孔庶教授悉心指导下完成的。在三年的学习、生活中导 师给予了我无私的帮助和关怀，三年来，导师那渊博的知识，严谨的 治学态度，宽广的胸怀和诚挚的待人方式时时刻刻影响我、鼓励着我， 在此谨向我的恩师及其家人致以最崇高的敬意和最衷心的感谢! 在立体论证、论文的撰写及三年的学习生活过程中，得到了汤庚国 教授、沈永宝教授、芦建国副教授、王光萍老师、陈金慧老师、席梦 利老师、逸黎明老师、匡华琳老师的悉心指导开口无私帮助，在此表示 诚挚的感谢! 在试验过程中得到了胡凤荣、陈志、黄焱、龙伟、陈加非、刘芳、 魏丕伟、程强、吴淳、吕朝萍、王鹏凯等师兄师姐师弟师妹的大力支 持和帮助。在学习和生活上得到了孙崇咪、樊兴华、孙小艳、吕乐燕 等同学的友情关怀。 最后，还要特别感谢我亲爱的父亲、母亲对我学习和_ t - 作的支持、 理解以及对我生活无微不至的关怀，使我获得了强大的精神支柱。 谨以此文献给关心和帮助过我的所以有领导、老师、亲人、朋友和 同学们。 作者：牛琳 二oo 七年六月 前言 黄杨科( b u x a c e a e ) 起源于古南大陆，分布遍及东西两半球的热带地区及亚热 带甚至温带，但分布中心或原始类型仍在热带范围内。黄杨科全世界共有4 属 ( b u x u 只舶t c o c o c c 马p a c h y s a n d r a , n o t o b u x u 曲，约1 0 0 种，生热带和温带”1 。除 n o t o b u x u s ( 7 种) 见于非洲热带和非洲南部以及马达加斯加岛外，其余3 属，我 国均产；在我国已知有2 7 种左右。分布于西南部、西北部、中部、东南部，直 至台湾省。 黄杨属约有7 0 余种。分布于亚洲、欧洲、热带非洲以及古巴、牙买加等地。 我国已知约1 7 种及几个亚种和变种，西自西藏，东至台湾，南达海南岛，西北 至甘肃南部均产，但主要分布于我国西部及西南部。 表1 华东地区黄杨科( b u x a c e a e ) 植物分布 t a b l e ld i s t r i b u t i o no f b u x a c e a ei nh u ad u n gd i s t r i c t 左上角带- 代表人工栽培 珍珠黄杨是黄杨变种，又名小叶黄杨、鱼鳞黄杨、鱼鳞木。分枝密集，小枝 节间长4 - 6 m j i l ，小枝稍被短柔毛。叶椭圆形至宽卵形，长不及i c m ，宽5 - 7 m m ， 基部宽楔形，薄革质，上面无光泽，侧脉明显隆起，先端圆或有小凹口，边缘下 曲。花序多顶生。花期5 月。蒴果近球形，长6 - 7 m m ( 不包括花柱) ，无毛。雌 雄同株，花期4 月，花项生或腋生，花序的顶部为雌花，中下部为雄花。蒴果8 月成熟，成熟时黄褐色，每粒果内有种子3 粒，黑色具光泽，有繁殖能力。 产于江西庐山五老峰七星衡附近，福建崇安黄岗山、浙江龙荡山海拔l b o o m 、 昌化海拔1 7 0 0 m ，安徽大别山区潜山水吼岭海拔1 4 0 0 1 7 0 0 m 、天柱峰海拔1 2 0 0 一1 6 0 0 m 、舒城晓天猪头尖海拔1 2 0 0 1 4 0 0 m 、歙县清凉峰海拔1 2 0 0 一1 7 2 0 m 、黄 山海拔6 0 0 一1 6 0 0 m 。生于溪边、松林或杂木林中。珍珠黄杨喜光耐荫，喜疏松 肥沃高山腐殖土，忌土壤板结和积水，喜温暖湿润，能耐2 0 低温，忌炎热干 燥，喜微酸性肥土，忌盐碱。与安徽杜鹃( r h o d o d e n d r o na n h w e i e n s e ) 、毛叶石楠 ( p h o t i n i av i l l o s a ) 、日本椴( t i l i a j a p o n i c a ) 、大果冬青( i l e xm a c r o c a r p a ) 、灯笼花 ( e n k i a n t h u sc h i n e n s i s ) 、黄山栋( q u e r c u ss t e w a r d i i ) 、黄山花楸( s o r b u sa m a b i l i s ) 、天 女花( m a g n o l i a m e b o l d i i ) 、天目琼花( v i b u r n u ms a r g e n t i i k o e h n e ) 等混生，也有纯林分 布。 珍珠黄杨具有极高的观赏价值，其植株矮小，树姿优美，叶小如鳞，枝叶茂 密而浓绿，经冬不凋，耐修剪，自古以来就与金雀、迎春、绒针柏并称盆景树种 的“四大家”“1 ，元代华幼武曾诗云“咫尺黄杨树，婆娑枝干重。叶深圃翡翠， 根古距虬龙。岁厉风霜久，时沾雨露浓。未应逢闰厄，坚质比寒松”。在现代园 林中既宜于庭园作绿篱及花坛边缘种植，也可在草坪孤植、丛植及路边列植、点 缀山石或室内绿化等。 珍珠黄杨具有很高的药用价值，在明代本草纲目中就有记载，主要用于 行气活血，祛湿通络等。现代医学上，从根、枝、叶等部分提取的环常绿黄杨碱 d 可用于治疗冠心病、心绞痛、心律失常、心肌缺血等。 可见，珍珠黄杨具有很高的开发价值。但由于其分布区狭窄，加之近年来被 大量挖掘作盆景栽培，资源已濒于灭绝，因此亟需加强保护，并通过科学的方法 开发利用这一珍贵资源”1 。近年来珍珠黄杨在形态、栽培、扦插繁殖”卜盯1 等方面 有了相继报道，但在组织培养及实生茁繁殖方面的研究至今仍属空白，从一定程 度上影响了珍珠黄杨的开发利用进程。本文针对珍珠黄杨的组织培养快速繁殖和 实生育苗过程中所涉及的种子休眠相关问题开展研究，旨在为规模化扩繁珍珠黄 杨，推进该珍稀植物资源的开发利用提供相关帮助。 第一部分珍珠黄杨组织培养 文献综述 1 1 植物组织培养的理论基础 植物组织培养是2 0 世纪初，以植物生理学为基础发展起来的一门新兴技术。 严格地讲，它是指植物的离体组织小块，在适宜的人工培养基和环境条件下进行 无菌培养，使培养体逐步分化出器官( 芽和根) 和形成小植株。从广义上讲，植 2 物组织培养，是指通过无菌操作，把植物体的一个器官、一种组织或单个细胞( 甚 至原生质体) 接种到培养基中，在人工控制条件下( 包括营养、激素、温度、光 照等) ，使其产生完整植株的过程哺】。 植物组织培养的核心理论依据是植物细胞的“全能性”。它包括植物细胞的 “形态全能性”和“化学全能性”两方面的概念隋1 ，即植物体的任何一个细胞都 包含有整株植物的全部遗传信息，在一定条件下具有发育成一个完整植株的能 力。高等植物是由无数不同形态、不同生理生化特点及执行不同功能的细胞组成， 一部分细胞继续保持分化能力，如分生组织，而另一部分细胞分化失去分生能力 而执行其他功能，处于不分裂状态，如永久组织。植物组织培养不仅使处于分生 状态的细胞继续保持分裂能力，同时也可使永久组织细胞恢复分裂能力，如同生 殖细胞或合子胚一样。 1 1 1 植物组织培养的历史概括 1 9 世纪3 0 年代，德国植物学家施莱登( m j s c h l e i d e n ，1 8 0 4 1 8 8 1 ) 和德 国动物学家旌旺( t s c h w a n n ，1 8 1 0 1 8 8 2 ) 创立了细胞学说，其主要观点：细 胞是生物体的基本结构单位，由它构成整个生物个体；同时认为植物细胞又是在 生理上和发育上具有潜在的全能性功能单位。根据这一学说，如果给细胞提供和 生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。1 9 0 2 年，德国著名植物 学家哈伯兰德( g h a b e r l a n d t ) 在细胞学说的基础上，大胆地提出了高等植物的 器官和组织，可以不断分割直至单个细胞的观点。他还预言离体的植物细胞具有 发育上的全能性，能够发育成为完整的植物体。植物细胞的全能性是植物组织培 养的理论基础，即植物的每个细胞都具有该植物的全部遗传信息和离体发育成完 整植株的能力“”。为了证明这一论断，他还在人工培养基上进行了培养植物叶细 胞的试验。但限于当时的技术水平，培养没有得到成功。由此h a b e r l a n d t 成为 植物组织( 细胞) 培养的先驱，被誉为“植物组织培养之父”。 植物组织培养从提出设想到实践成功，经历了漫长而艰巨的历程。1 9 0 4 年 e h a n n i n g 在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚，并使这些胚在离体 条件下长到成熟，这是胚培养的第一例报道1 。1 9 0 8 年s s i m o n 研究白杨嫩茎在 培养基中的发育，观察到了愈伤组织的发生和根、芽的形成。1 9 2 2 年w k o t t e 用稀释的k n o p 溶液加入相当复杂的有机物质培养豌豆和玉米的根尖，获得成功， 这是有关根培养的最早实验。进入2 0 世纪3 0 年代，以法国的r j g a u t h e r e t 和美国的p r w h i t e 为首的科学家形成了两个植物组织培养研究中心，工作不断 取得进展。1 9 3 3 年我国李继侗和沈同进行银杏离体胚培养获得成功，并发现胚 乳提取物能促进银杏离体胚的生长。1 9 3 4 年w h i t e 由番茄根建立了第一个活跃 生长的无性繁殖系，有关离体根的培养试验才获得真正的成功，1 9 3 7 年他首先 配制成综合培养基，发现了b 族维生素对培养离体根的生长具有重要意义】。同 年法国植物学家g a u t h e r e t 等人第一次用烟草的茎段形成层和胡萝b 根的小块 组织，使细胞增殖并诱导愈伤组织，但没诱导出器官来。 2 0 世纪4 0 年代以后，植物组织培养的研究日趋繁荣。1 9 4 3 年w h i t e 撰写了 “ah a n db o o ko fp 1 a n tt is s u ec u l t u r e ”( 植物组织培养手册) ，是第一部有 关植物组织培养技术的专著阳1 。1 9 4 8 年，我国植物生理学家崔徵和美国科学家发 现，腺嘌呤或腺苷不但可以促进愈伤组织的生长，而且还能解除培养基中生长素 对芽形成的抑制作用，诱导芽的形成，从而确定了腺嘌呤与生长素的比例是控制 芽和根形成的主要条件之一，并发现它们的比例高时产生芽，低时形成根。生长 调节物质的比值学说一直沿用至今。1 9 5 2 年法国的g m o r e l 和m a r t i n 首次证实， 通过茎尖切段离体培养，可以由感染病毒的大丽花中获得去病毒( v i r u s f r e e ) 植株。1 9 5 3 年w h m u i r 发现了用摇床振荡的液体培养，使g h a b e r l a n d t 培养 单细胞这一设想成为可能。1 9 5 6 年m i l l e r 发现了激动素，并发现它促进芽产生 的效果比腺嘌呤高出3 万倍。现在具有和激动素类似活性的合成的或天然的化合 物已有许多种，总称为细胞分裂素。细胞分裂素类的发现和应用，大大推动了组 织培养技术的发展，成为2 0 世纪5 0 年代此领域的一大突破。1 9 5 8 年，美国植 物学家f c s r e w a r d 等人，用胡萝卜根细胞进行培养，终于得到了完整植株，并 且这一植株能够开花结实，证实了h a b e r l a n d t 在五十多年前关于细胞全能性的 预言。 进入2 0 世纪6 0 年代以后，植物组织培养开始走向大规模的应用阶段，同时 研究工作也更加深入和扎实。利用组织培养技术再生植株的植物种类已达到近 1 0 0 0 种，其中木本植物达2 0 0 多种，并且在不断增加1 。同时，原生质体培养、 花药培养、细胞悬浮培养、人工种子技术等也随之发展并得到应用。此外，植物 组织培养技术还应用于突变体的筛选，植物种质的保存及基因工程等方面的研 究。1 9 6 0 年，c o c k i n g 采用酶法游离原生质体获得成功，至2 0 世纪8 0 年代，原 生质体培养已成为一个研究热点。1 9 6 4 年古哈( g u h a ) 和马赫旌瓦里 ( s c m a h e s h i w a r i ) 在毛叶曼陀罗的花药培养中成功地由花药诱导出单倍体植 株。2 0 世纪7 0 年代初期，我国掀起了单倍体育种的高潮，1 9 7 4 年，用单倍体育 种法育成世界上第一个作物新品种一单育一号烟草品种。目前，游离花药培养技 术的改进，加速了单倍体植株和纯合体植株在单倍体育种中的应用，花药培养已 被用于从杂种群中筛选优良子代。用组织培养法快速繁殖作物是组织培养应用于 生产的最主要和最有成效的实例，最早使用组织培养技术进行快速繁殖的是法国 科学家莫里尔( m o r e l ) ，1 9 6 0 年他用茎尖培养的方法大量繁殖兰花获得成功。 据穆拉希格( m u r a s h i g e ) 在1 9 7 8 年第四届国际组织和细胞培养会议上的报告， 用组培法进行快速繁殖的植物已达2 5 5 种。2 0 世纪8 0 年代，研究出用组织和细 胞培养法低温保存种质，给保存和抢救有用基因带来希望。 1 1 2 植物组织培养技术的应用 目前组织培养技术大大拓宽了传统遗传育种的界限，使人们在育种中有更大 的自主性，主要体现在下列几个方面。 1 ) 快速繁殖 4 这是目前林木组织培养应用最多、最广泛和最有效的一个方面。采用植物组 织培养方法可以使试管苗具有很快的繁殖速度。由于试管苗所具有的生产性能及 主要的经济指标与采用其它无性繁殖方法所繁殖幼苗差异不大，且该技术具有不 受季节和气候的限制，周年均可进行，要求空间较小，节省劳力，材料不受病虫 害，繁殖速度比常规方法快数万倍到数百万倍，成本低，易于批量生产和管理方 便等特点，因而被人们广泛用于观赏植物、经济林木的工厂化生产。 胚状体再生途径是最快的人工离体无性繁殖方法，具有分化率高，结构完整， 根系发达，繁殖速率比其它途径快的优点，因此对它的研究十分活跃。全世界目 前已成功诱导体胚形成的1 0 0 多种植物中，有4 0 多种木本植物获得了体细胞胚。 据初步统计，已从冷杉属、落叶松属、云杉属、松属、黄杉属和北美红杉属的至 少2 0 种不同的针叶树的外植体诱导成功了体细胞胚“”。在阔叶树种中，杨属、 柳属、栗属、檀香属、枫香属、鹅掌楸属、桉树属等2 0 多个树种的组织培养中 观察到体胚发生或获得再生植株“”。目前，我国从事林木体细胞胚胎发生和植株 再生技术研究，见报道的还有中国科学院遗传所、中国科学院上海植生所、中国 科学院植物所、南京林业大学、四川农业大学等单位。涉及树种有华北云杉、火 炬松、马尾松、桃树、鹅掌楸、枫香、杉木、尾叶桉等树种“”。但能进行工厂化 快速育苗的种类还较少，限制其直接应用的主要因素是胚状体形成的内外因素比 较复杂且遗传变异频率较大“”。 2 ) 苗木脱病毒技术 长期以来，人们已意识到病毒对农作物造成的严重危害，并探讨了各种解决 办法，但收效甚微。随着植物组织培养技术的不断发展和完善，人们已将这一技 术应用到植物脱病毒的生产实践中，并取得了十分理想的效果。目前，通过植物 组织培养过程生产的果树、蔬菜、花卉等脱病毒苗，已在国内外的农业生产上得 到普遍应用“”。 一。 病毒在植物体内的分布是不均匀的，w h i t e 早在1 9 4 3 年就发现植物生长点附 近的病毒浓度很低甚至无病毒。在受侵染的植株中，顶端分生组织一般是不含病 毒的，或者是只携带浓度很低的病毒“”，利用组织培养方法，取一定大小的茎尖 进行培养，再生的植株就有可能不带病毒，从而获得脱病毒苗，再用脱毒苗进行 繁殖，则种植的植物就不会或极少发生病毒。 植物脱毒技术和快速繁殖技术的有机结合，不仅解决了病毒对苗木的侵染问 题，同时解决了脱毒苗的快速繁殖问题，并获得了良好的经济效益。目前组织培 养在甘蔗、菠萝、香蕉、草莓、梨“”1 等主要经济作物上己成功应用，采用的外 植体己不仅限茎尖，其它如侧芽、鳞片、叶片、球茎、根等都可以应用“。 3 ) 远缘杂交 育种学家经常进行远缘杂交，以期选育出理想品种。然而，在远缘杂交中多 数远缘杂种不能形成正常后代，致使杂交难以获得成功。把植物组织培养技术与 常规远缘杂交方法结合起来，对远缘杂交所形成的幼胚进行离体组织培养，使远 缘杂种幼胚在离体条件下发育并形成完整的试管植株，培育出优良的新品种。例 如用胚乳培养可获得三倍体植株，为诱导形成三倍体植物开辟了一条新途径沁“。 三倍体加倍后得到六倍体植株，此方法可育成多倍体新品种“。 采用细胞融合技术也可以克服远缘杂交的局限性，理论上讲可在包括种内、 种间、属间、科间甚至界间的原生质体间进行，它能克服有性远缘杂交育种中的 不亲和性，从而获得体细胞杂种。1 9 7 2 年通过原生质体融合从烟草中获得第一 个种间杂种，可部分地克服有性杂交的不亲和性，获得体细胞杂种心”。 原生质体培养是进行细胞融合的前提，与草本植物相比，木本植物原生质体 培养起步较晚。到目前为止，世界上木本植物仅见5 种橙子、3 种柑子、苹果、 枇杷、桑树、欧洲山杨及其它杨属树种、榆树、悬铃木、泡桐和猕猴桃等树种报 道，其中用材树种仅有6 种1 。南京林业大学与中国科学院上海植物生理研究所 合作，先后获得了杨树、桑树、泡桐和悬铃木等用材树种的原生质体。另外南京 林业大学曾成功地进行了美洲黑杨与小叶杨原生质体分离、培养，并开展了美洲 黑杨与胡杨、美洲黑杨与青杨原生质体融合和细胞杂交研究“”。原生质体培养和 体细胞杂交已成为应用日益广泛的现代育种手段，在林木育种中显示出广阔的前 景川。 4 ) 突变体育种 利用植物组织培养技术可以在实验室内完成诱变筛选过程，极大地节省人力 物力，并缩短选育时间、如可以把试管苗置于低温的条件下诱变和筛选抗寒植株， 也可以把试管苗置于盐分含量高的培养基上筛选耐盐突变体新品种。这种通过试 管苗筛选植物抗性突变体的方法具有很多的优越性，因此，目前在林木育种实践 中已被应用3 。 培养细胞处于不断分化状态，容易受培养条件和外加压力( 如射线、化学物 质等) 的影响而产生诱变，从中可以筛选出对人类有用的突变体，从而育成新品 种。目前，用这种方法已筛选到抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白、矮杆高产的突 变体，有些已用于生产陋“。 5 ) 次生代谢产物生产 利用组织或细胞培养技术进行植物次生代谢产物的生产是一个十分活跃的 研究领域。植物几乎能生产人类所需要的一切天然有机化合物，人们一直从各种 植物中提取可用于工业、医药生产的次生代谢产物。但由于野生资源的不断减少 及人类需要的不断增加，再加上这类植物往往生长较慢、生长环境特殊及其生长 环境不断遭到破坏等原因，导致这些植物天然产物供不应求，价格昂贵。因此， 通过大规模植物组织培养来生产这类有价值的产品具有十分重要的意义。目前从 红豆杉细胞培养中提取紫杉醇托”，紫草细胞大规模培养生产紫草宁”，长春花 细胞培养生物碱妇盯等，都已取得了很大进展，利用高山景天“们的组织培养生产 次生代谢产物的研究正在进行中。 6 ) 缩短育种周期 通过花药培养得到的单倍体植株，经加倍后产生的纯合二倍体，被看作是进 行遗传研究的良好材料。农业生产上培育优良的杂交种，需要以基因型一致的纯 系为亲本。采用植物组织培养的方法，获得纯系材料，比采用传统方法获得纯系 材料大大缩短育种周期。农作物或园林花卉多数是异花授粉植物，要获得纯系品 种较难，一般需要经过7 8 个世代的自交，才能获得遗传上稳定的性状。而木 本植物从种子发芽到能开花结实一般需要经历l o 2 0 年以上的时间，若为了获 得稳定的纯系必须进行自交，经过7 8 个世代自交，则需要有1 0 0 年以上的时 间，即使能够自交，其结实率也往往很低。但是如果采用单倍体育种方法，可大 大缩短育种时间，且不发生性状分离，简化育种程序，提高选择效率。 7 ) 培育人工种子 人工种子是g u r a s h i g e 于1 9 7 8 年在国际园艺植物学术讨论会上首先提出的， 模拟了天然种子的基本构造，将植物离体培养中产生的体细胞胚或能发育成完整 植株的分生组织( 芽、愈伤组织、胚状体等) 包埋在含有营养物质和具有保护功 能的外壳内，形成在适宜条件下能够能够像天然种子一样正常生长发芽出苗的颗 粒体。因此，可用于那些难以制种的优良杂交种的种子繁育和固定杂种优势“。 8 ) 种质资源保存 世界自然保护联盟( i u c n ) 在1 9 7 8 年出版德植物红皮书一书中指出： 在全世界分布的约2 5 万种维管束植物中，估计约有2 万2 5 万种( 占整个区 系成分的1 0 ) 处于很稀少或受严重威胁的状况”。因此面对世界种质资源日 益枯竭，大量有用基因损失的现状，植物种质保存已引起科学家和各国政府极大 重视。离体培养保存研究始于上世纪7 0 年代1 ，主要是通过改变培养物生长的 某些条件，使细胞生长降至最小限度，但不死亡，从而达到保存种质的目的。如 将葡萄试管苗保存在温度9 。c 以下，植株便停止生长，每年只需接转一次。几百 个葡萄品种，即使每个品种重复6 个，只需1 m 2 场所就可保存下来“。同时还便 于种质交换和转移，避免有害病虫的人为传播。而常规基因库不仅要占用大量土 地，并且每年的维护管理费用高，还耗费较多人力和物力。因此，用组培技术保 存种质资源不仅可以节省大量人力、物力和场地，而且对于挽救珍稀濒危植物有 极大的意义。 1 1 3 木本植物组织培养的研究概述 1 1 3 1 林木组织培养的研究现状 经过1 0 0 多年研究，植物组织培养已成为一门日臻完善的技术。但木本植物 由于其生长发育条件、器官部位等与草本植物相比存在较大差异，它们中较多的 多酚类物质会阻碍细胞分裂，因此，木本植物再生系统很难建立。树木第一株试 管苗是由美国的w i n t o n ( 1 9 6 8 ) 利用颤杨根段愈伤组织培养获得的。”。1 9 7 3 年 s o m m e r 等在b r o w n 实验室第一个利用胚培养诱导出针叶树( 火炬松) 试管苗。据 不完全统计，至今已有2 0 0 多种木本植物经组织培养得到再生植株1 。能进行大 面积推广的树种只有十余种：如桦木属、柳树属、柚木、杉木、杨树等。同时发 达国家对一些重要的造林树种通过快速繁殖进行批量生产，用于种子园建设及造 林：如云杉和花期松( 德国，加拿大) 、辐射松( 新西兰) 、油棕( 英国) 、火炬 7 松( 美国) 、杨树、枥树和山毛榉( 德国、荷兰) 。在国内进行组织培养和试管繁 殖的木本植物计有1 5 0 种。 我国林木组织培养工厂化育苗工作起步较晚，但发展迅速。其中杨、桉、杉 木、柚木、相思、大岛樱、槐树等树种的组培育苗技术工艺已经成熟，进入工厂 化生产。据报道，河北省林科所年生产杨树等组培苗，规模为l o o 一1 5 0 万株； 广东省林业科学研究所累计已生产桉树无性系1 0 0 0 万株，并于1 9 9 5 年在越南胡 志明市建成一间年产1 0 0 万株苗木的组培育苗工厂。江西林科院近年来对香花 槐、红叶石楠、美国红栌进行了工厂化育苗，目前已生产并培育出2 0 0 余万株的 组培苗，并应用到造林及园林绿化中“”。 2 1 世纪林业发展的方向是无性系林业，而无性系林业的发展在很大程度上取 决于林木组织培养的水平，因此林木组织培养可以加快无性系林业发展的进程， 为林木遗传育种提供一条有效的育种途径，也为现代的生物技术奠定了基础。 1 1 3 2 林木组织培养技术特点 目前，大多数研究者将木本植物组织培养过程大致分为启动培养、继代培养、 壮苗培养和生根培养以及移栽共五个阶段，研究内容主要有： 1 ) 外植体的选择与预处理 植物不同的器官和组织，。对离体培养的反映是不同的，其形态发生的能力也 是不同的。外植体的种类是影响组织培养效果的主要因素之一。即使是相同的器 官，由于其生理学或发育年龄的差异，也会影响形态发生的类型及方式。在林木 组织培养中，应根据需要选择一种或几种适合的外植体。常用的外植体有胚( 自 然状态下的合子胚和试管内受精的胚) 、分化的器官组织( 嫩茎、嫩叶、形成层、 根、花瓣等二倍体组织) 、带芽的外植体( 茎尖的顶芽、腋芽、根茎连接处的萌蘖 等) 、花粉以及雌配子体中的单倍体细胞。 外植体预处理的方法主要有反复嫁接、低温、黄化等。外植体的来源主要有 两种：成年型和幼年型( 包括成年树上的幼年部分) ，一般情况外植体越幼嫩就 越容易获得再生植株。外植体的选择和处理对褐变有较大影响，c h e v r e 分析了 欧洲栗的酚类含量的变化，结果表明，幼龄材料酚类化合物含量少，而成龄材料 比较多。不同季节取材，对植株的再生能力影响差异很大，通常春季是植物生长 旺季，植株再生能力也最强，是进行组织培养的最适季节”。 2 ) 培养基及培养条件 培养基的选择是组织培养技术研究的主要部分，不同的培养基其组成成分不 同，培养效果也有差异。常见培养基的成分通常包括大量元素、微量元素、铁盐、 有机物、糖源以及支持物等。木本植物在不同的组织培养阶段对培养基要求不同， 随着植物生理学和生物化学的研究不断深入，培养基成分越来越复杂，常见的木 本植物组织培养基有m s ( m u r r a s h i g ea n ds k o o g ，1 9 6 2 ) 、f f p m ( m c c o w n sw o o d y p 1 a n tm e d i u m ，1 9 8 0 ) 和d k w ( d r i v e re ta 1 。1 9 8 4 ) 等。每种培养基中盐浓度 不同，培养基中的盐浓度对外植体褐变和试管苗玻璃化均有一定影响。培养条件 包括光照( 光周期) 、温度和培养基的p h 值，具体是指暗培养、变温处理和培养 r 基的酸碱度。大多数木本植物要求p h 值在5 o 6 0 。近年来，也有专门研究培 养容器( 封口材料) 对组织培养过程影响的报道”“。 3 ) 植物激素 基本培养基能保证培养物的生存与最低生理活动。但只有配合使用适当的外 源激素才能诱导细胞分裂的启动、愈伤组织生长以及根、芽的分化等合乎理想的 变化。植物激素( 广义上包括植物生长调节剂) 是植物新陈代谢中产生的天然化 合物，通常只要极其微小的量对植物的生长发育产生影响。常用的植物激素种类 包括生长素类( i a a 、i b a 、2 ，4 一d 、n a a 等) 、细胞分裂素类( 6 一b a 、k t 、z t 、 t d z 等) ，赤霉素类( g a ) 、乙烯类和脱落酸( a b a ) 以及新型植物激素油菜素内 脂等h ”。在木本植物组织培养中较常用的激素是生长素和细胞分裂素。植物生长 激素通常被用来诱导愈伤组织形成及其增殖。细胞分裂素的主要作用是促进细胞 的分裂和扩大，使茎增粗，而抑制茎伸长，诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长。 4 ) 其它添加物 常见的培养基添加物有活性炭( a c t i r a t e dc h a r c o a l ，a c ) 、聚乙烯吡略烷 酮( p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e ，p v p ) 、抗坏血酸( a s c o r b i ca c i d ) 、水解酪蛋白 ( c a s e i na c i d sh y d r o l y s t a t e ，c h ) 等。其中，p v p 和抗坏血酸主要用于防治 植物材料褐变方面的研究；水解酪蛋白的主要成分是氨基酸，是含有约2 0 种氨 基酸的混合物。 目前，关于a c 的研究开展较多。活性炭能够吸附各种微量物质和微小颗粒， 非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养基分泌的酚、醌 类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5 一羧甲基糖醛及激素等，因而可用来防止 组织培养中细胞褐变的发生和发展。卜学贤等( 1 9 8 8 ) 研究表明，每毫克的a c 大约能吸附1 0 0pg 左右的生长调节物质。这说明只需要极少量的a c 就可以完 全吸附培养基中常用浓度的生长调节物质“”。通常的使用浓度范围为0 5 l o g l 3 。但未能证明当足够敏感的外植体与吸附了生长调节物质的a c 紧密接触 时，是否仍能利用这些被吸附的生长调节物质，或者少量的未被吸附的生长调节 物质仍在起作用。a c 的作用目前普遍认为的主要有：提供暗环境；吸附离体培 养物中的抑制物；吸附离体培养中的生长调节剂；对物质的解吸附“”。a c 对防 止产生玻璃苗有良好的作用。此外，a c 在生根方面有明显的促进作用，即活性 炭可减弱光照有关，可能是由于根顶端产生促进根生长的i a a ，但i a a 易受可见 光的光氧化而破坏，因此活性炭的主要作用就在于通过减弱光照保护了i a a ，从 而间接促进了根的生长“”。 但影响a c 对生长调节物质吸附的因素较多，包括a c 本身粒度的大小、培养 基状态、p h 值和培养温度等。a c 的粒度越小，吸附能力越强，随着粒度增大， 吸附能力急剧下降。a c 在固体培养基中吸附速度小，而在液体培养基中吸附速 度大。此外，低的p h 值和较高的培养