（果树学专业论文）荔枝转基因胚性愈伤组织原生质体高频率再生.pdf

福建农林大学硕士论文 中文摘要 摘要 本研究以采用基因枪转化法，将外源h t p 和g u s ( u i d a ) 基因转入荔枝( l i t c h i c h i n e n s i ss o o n ) 晚熟优良品种。下番枝，并经筛选得到的1 1 个荔枝转基因抗性 胚性愈伤组织( t r a n s g e n i cr e s i s t a n te m b r y o g e n i ec a l l i ，t r e c ) 细胞系为材料，进行 荔枝转基因抗性胚性愈伤组织长期继代保持系统的优化及其g u s 检测：选择其中 的5 个转基因抗性细胞系( q 8 1l 、q s l 5 3 5 ，q 9 2 2 1 、q 9 2 2 3 和q 1 0 1 6 ) 进行原 生质体分离和高频率再生培养；采用转基因原生质体来源的愈伤组织进行体胚诱 导，并再生转基因植株。主要研究结果如下： 1 荔枝转基因抗性胚性愈伤组织长期继代保持系统的优化。采用交替培养 基培养荔枝转基因抗性胚性愈伤组织，继代2 年，转基因抗性胚性愈伤组织仍然 保持旺盛生长而且g u s 表达量稳定。适合的交替培养基为附加1 0m g l “2 , 4 一d 的m s 培养基和附加1 0m g l 。12 , 4 - - d + 5 0m g l 。1 潮霉索的m s 培养基。 2 荔枝转基因抗性胚性愈伤组织的g u s 检测。荔枝转基因抗性胚性愈伤组 织长期继代保持过程中的g u s 组织化学检测结果是：抗性细胞系q 8 1 1 、q 8 1 5 3 5 为大量稳定表达g u s 类型；q 9 2 2 1 、q 9 2 2 3 为嵌合表达g u s 类型；q 1 0 1 6 、q 6 l 6 1 、 q 6 l 1 6 1 、0 4 2 一l 、q 4 2 - 2 、n 3 l 、n 2 1 则为稳定不表达g u s 类型。 3 荔枝转基因抗性胚性愈伤组织原生质体分离条件的优化。荔枝转基因抗 性胚性愈伤组织q 8 1 1 抗性细胞系原生质体分离条件的适宜条件是：转基因抗性 胚性愈伤组织培养1 6 1 8d 后，转入含o 8 纤维素酶c e l l u l o s er - 1 0 和o 4 离 析酶m a c r e a s er - 1 0 的c p w - 1 3 m 酶液中，在( 2 5 + 2 ) 1 2 ，黑暗条件下，连续振荡 ( 3 0 - - 4 0r m i n 1 ) l o 一1 1h 进行酶解。在最适条件下，荔枝转基因原生质体产 量达到1 8 2 x1 07 个佗，活力达9 7 5 。 4 荔枝转基因胚性愈伤组织原生质体高频率再生体系的建立。以m 2 ( 修改 的m s 附加1 o m g l 2 ，4 - - d + 0 2 m g l - 1 n a a + 0 2 m g 。l _ 。b a + 0 2 m g l 1 k t + 2 5 0m g l - 1 谷氨酰胺+ 5 0m l l _ 1 c w ( 椰乳) + o 4 5m 葡萄糖和o 1m 蔗糖) 为培养 基，培养密度为3 0 x1 0 5 个m l ，采用海藻酸盐包埋悬浮方式进行暗培养，荔枝 转基因原生质体的分裂频率可高达1 8 7 8 ，植板率达2 2 3 0 ，小克隆形成频率 达3 2 4 。 5 荔枝转基因原生质体再生愈伤组织的g u s 检测。转基因原尘质体来源的 5 个愈伤组织抗性细胞系中：抗性细胞系p q g l l 、p q s l 5 3 5 为大量稳定表达g u s n 福建农林大学硕士论文 中文摘要 类型：p q 9 2 2 1 、p q 9 2 2 3 、p q l o l 6 均为稳定不表达g u s 类型。 6 荔枝转基因原生质体再生愈伤组织的体胚发生。转基因原生质体来源的愈 伤组织以t l ( 附加1 om g l 2 ，4 - - d 、2 蔗糖和0 7 琼脂的m s 培养基) 、t 3 ( 附 加o 1m g l n a a 、3 5m g l z t 、1 0 0m g l _ 1 肌醇、5 蔗糖和1 0 琼脂的 m s 培养基) 、t l o ( 附加5 0m 1 l 1 椰乳、5 蔗糖和1 0 琼脂的m s 培养基) 为培 养基，采用分步培养诱导的方法诱导体胚发生，并再生新植株。 本研究建立的荔枝转基因胚性愈伤组织原生质体高频率再生体系，对生物技 术在荔枝品种改良的应用有重要意义，也为进行龙眼荔枝属间原生质体融合奠定 了基础。 关键词：荔枝；转基因抗性胚性愈伤组织：转基因原生质体：体细胞胚胎发生 转基因植株 i l l 祸建农林大学硕士论文 英文摘要 h i g hf r e q u e n c yr e g e n e r a t i o no fp r o t o p l a s t sf r o ml i t c h i t r a n s g e n i ce m b r y o g e n i cc a l l i a b s t r a c t i nt 1 1 i se x p e r i m e n t t h ec o n d i t i o n so fs u b c u l t u r ea n dm a i n t e n a n c eo f1lc e l ll i n e s o ft r a n g e n i cr e s i s t a n te m b r y o g e n i cc a l l i ( t r e c ) w i t hh i pa n dg u s ( u i da ) g e n e sv i a p a r t i c l eb o m b a r d m e n t ，w e r ef i r s to p t i m i z e da n dt h eg u sh i s t o c h e m i c a la s s a y s o f t r e cw e r ea l s od e t e c t e di nl i t c h ic h i n e n s i ss o o n c v x i a f a n z h i ：a n dt h e nt h e t r e cc e l ll i n e sq 8 1 l ，q 8 1 5 3 5 ，q 9 2 2 1 ，q 9 2 2 3a n dq 1 0 1 6w e r es e l c e t e d a s m a t e r i a l sf o rt h ei s o l a t i o na n dh g i h f r e q u e n c yc u l t u r eo f p r o t o p l a s t s ，a n de m b r y o g e n i c e a l l id e r i v e df r o mp m t o p l a s t sw e r ef 1 2 r t h e ru s e da sm a t e r i a l sf o ri n d u c i n gs o m a t i c e m b r y o g e n e s i sa n dp l a n tr e g e n e r a t i o n t h em a i nr e s u l t ss h o w e d a sf o l l o w s ： 1 o p t i m i z a t i o no ft h e c o n d i t i o n so fs u b c u l t u r ea n dm a i n t e n a n c eo ft r e c ， t r a n g e n i ce m b r y o g e n i c c a l l i g r e ww e l l a n d e x p r e s s e dg u ss t e a d i l yt h r o u g h a l t e m a t i v es u b c u l t u r eo ft h et w om e d i af o r2y e a r s ，a n dt h es u i t a b l em e i d af o r a l t e r n a t i v es u b c u l t u r ew e r em sm e d i u ms u p p l e m e n t e d 诚m1 0m g l “2 4 一da n d m sm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h1 0m g l “2 4 一da n d5 0m g l 1h y g r o m y c i nb 2 t h eg u sh i s t o c h e m i c a la s s a y so f l i t c ht r e c s t h eg u sh i s t o c h e m i c a la s s a y s o fl i t c h it r e c s d u r i n gl o n g - t e r ms u b c u l t u r ei n d i c a t e dt h a tt r e cc e l ll i n e sq 8 11a n d q 8 1 5 3 5w e r es t e a d i l ye x p r e s s e dg u s ；t r e cc e l ll i n e sq 9 2 2 1a n dq 9 2 2 3w e r e c h i m e r i c a l l ye x p r e s s e dg u s ；t r e c c e l ll i n e sq 1 0 1 6 、q 6 l 6 1 、q 6 l 1 6 1 、q 4 2 一l 、 q 4 2 2 、n 3 1a n dn 2 1w e r es t e a d i l yu n e x p r e s s e dg u s 3 o p t i m i z a t i o no ft h ec o n d i t i o n so fp r o t o p l a s ti s o l a t i o nf r o ml i t c h it r e c t h e o p t i m i z e dp r o c e d u r e sw e r e 踮f o l l o w s ：l i t c h it r a n s g e n i ce m b r y o g e n i cc a l l i a f t e r c u l t u r ef o r1 6 1 8dw e r et r a n s f e r r e di n t ot h ec p w - 1 3 me n z y m a t i cs o l u t i o n c o n t a i n t i n g0 8 c e l l u l o s er 1 0 0 4 m a c r e a s er - i oc o n t i n u o u s l ys h a k i n ga t3 0 - - 4 0r m i n 。f o r1 0 1 1ha t ( 2 5 2 ) i nd a r k n e s sf o ri n n o c u l a t i o n ；a n dt h ey i e l do f 1 8 2 1 0 。p r o t o p l a s t s g 1 a n dv i a b i l i t yo f 9 7 5 w e r eo b t i a n e du n d e rt h eo p t i m i z e d p r o c e d u r e si nt h er e s i s t a n tc e l ll i n eq 8 1 1 4 e s t a b l i s h m e n to f h i g h - f r e q u e n c yr e g e n e r a t i o ns y s t e mo f p r o t o p l a s tf r o ml i t e h i t r e c l i t e h it r e cp r o t o p l a s t sr e g e n e r a t e da tt h ef r e q u c e yo fd i v i s i o no f18 7 8 ， c o l o n i e sf o r m a t i o n ( c u l t u r ef o r2 0d1o f2 2 3 0 a n dc o l o n i e sf o r m a t i o n ( c u l t u r ef o r i v 福建农林大学硕士论文 英文摘要 4 0d1o f3 2 4 w h e nt h ep r o t o p l a s t sw e r ee m b e d d e di nc a - a l g i n a t eb e a d sa n d c u l u t u r e di nl i q u i dm e d i u mm | 2 ( m o d i f i e dm ss u p p l e m e n t i n gw i t h1 0m g l 2 ，4 - - d ，0 2m g l 一1 n 从，0 2m g l b a ，0 2m g l 一1 k t , 2 5 0m g l g l u t a m i n e ，5 0 m 卜l 一1 c w , 0 , 4 5mg l u c o s ea n d0 1ms u c r o s e ) w i t ht h ed e n s i t yo f 3 0 x 1 0 5 p r o t o p l a s t s m l 1i nd a r k n e s s 5 t h eg u sh i s t o c h e m i c a la s s a y so fc a l l id e r i v e df r o ml i t c h it r e cp r o t o p l a s t s a m o n g t h e5r e s i s t a n tc e l ll i n e sd e r i v e df r o ml i t c h it r e cp m t o p l a s t s ，t h ec e l ll i n e s o fp q 8 1ia n dp q 8 1 5 3 5w e r es t e a d i l ye x p r e s s e dg u s ；t h ec e l ll i n e so fp q 9 2 2 1 ， p q 9 2 2 3a n dp q l 0 1 6w e r es t e a d i l yu n e x p r e s s e dg u s 6 s o m a t i ce m b r y o g e n e s i sf r o mt h er e s i s t a n tc e l ll i n e sd e r i v e df r o mt h e p r o t o p l a s t so fl i t c h it r e c s o m a t i ce m b r y o g e n e s i so c c u r r e dt h r o u g ht h ec u l t u r i n g m e t h o d so ff r a c t i o n a ls t e p s ，i e ，f n s to nt l ( m sm e d i u mw i t h1 0m g l 2 ，4 一d ， 2 s u c r o s ea n do 7 a g a r ) 。t h e no nt a ( m sm e d i u mw i t h 0 1 m g l n a a ，3 5 m 铲l 一。z t , 1 0 0m g - l i n o s i t o l ，5 s u c r o s ea n d1 o a g a r ) ，a n dt h en e x to nt i o ( m s m e d i u mw i t h5 0r n l l c w 、5 s u c r o s ea n d1 o a g a r ) ；a n dt h e np l a n t l e t s r e g e n e r a t e df r o m $ o m a t i ce m b r y o s t h ee s t a b l i s h m e n to ft h ec u l t u r i n gs y s t e mo fl i t c h it r e cp r o t o p l a s t sa th i g h f r e q u e n c yw o u l db eo fg r e a ti m p o r t a n c ef o rt h ea p p l i c a t i o n so fb i o t e c h n o l yt ot h e v a r i e t yi m p r o v e m e n ti nl i t c h i ，a n dw o u l dm a k et h ef o u n d a t i o nf o rc e l lf u s i o nb e t w e e n l o n g a na n dl i t c h i k e yw o r d s ：l i t c h i ；t r a n s g e n i cr e s i s t a n te m b r y o g e n i cc a l l u s ( t r e c ) ；t r a n s g e n i c p m t o p l a s t ；s o m a t i ce m b r y o g e n e s i s ；t r a n s g e n i cp l a n t v 福建农林大学硕士论文缩写词 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位毕业论文作者亲笔签名：寄、板蹶 日期：p ；、；，厂 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 学位( 毕业) 论文作 指导教师亲笔签名： 保密，在 年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。口 | m l ，b 心f p t 厶z ，f f 祸建农林大学硕士论文j i 言 第一章引言 l 植物原生质体研究进展 1 1 植物原生质体培养概况 1 9 6 0 年c o c k i n g 首先采用纤维素酶酶解法获得番茄根尖原生质体，开创了酶 法大规模分离有活性原生质体的新时期，带动了4 0 多年来植物原尘质体研究的迅 速发展。自从1 9 7 1 年t a k e b e n a g a t a 首次获得烟草叶肉原生质体再生植株以来， 原生质体研究获得了进一步的发展，尤其是8 0 年代中后期以来，一度被认为是国 际性难题的单子叶禾本科作物的原生质体培养取得了突破性进展，相继获得了水 稻( f u j i m u r ae t a l1 9 8 5 ) 、小麦( 王海波等1 9 8 9 ；h a r r i se ta l1 9 8 9 ) 、玉米( 蔡 起贵等1 9 8 7 ) 、高粱( 卫志明等1 9 8 9 ) 、大麦( 颜秋生等1 9 9 0 ) 、谷子( 董 晋江等1 9 8 9 ) 等的原生质体再生植株；与此同时长期停滞不前的木本植物原尘 质体培养也有了突破。除柑桔外，檀香( r a o & o z i a s a k i n s1 9 8 5 ) 、构树( o k a & o h y a m a1 9 8 5 ) 、榆树( s t i c l d e ne ta l1 9 8 7 ) 、牛蹄豆( s a x e n a & g i l l1 9 8 7 ) 、美国鹅 掌楸( m e r k l e e ta l1 9 8 7 ) 、杨树( 王善平等1 9 9 1 ；r u s s e l l m c c o w n1 9 8 6 ，1 9 8 8 ) 、白 云杉( a r r e ee l a l1 9 8 9 ) 、桉树( i t oe ta l1 9 9 2 ) 、悬铃木( 卫志明等1 9 9 1 ) 、 泡桐( 3 2 志明等1 9 9 1 ) 、桑树( 卫志明等1 9 9 2 ) 等林木，咖啡( s c h o p k ee ta l1 9 8 7 ) 等木本经济作物的原生质体培养获得再生植株。 在果树的原生质体培养上，柑桔处于领先的地位。以色列的v a r d i 等( 1 9 8 8 ) 1 9 7 5 年首先在柑桔若干品种上获得原生质体再生植株，为木本植物第一例，目前 有多个种类取得成功，包括：锦橙( 邓秀新等1 9 8 9 ) 、华盛顿脐橙( h i d a k a k a j i u r a1 9 8 8 ) 、桃叶橙( 邓占螯等1 9 8 9 a 1 9 8 9 b ) 、本地早( 邓秀新等1 9 8 9 ) 、 四季桔( l i n ge ta l1 9 8 9 ；s i me ta l1 9 8 8 ) 、柚柑( c i t r u sy u k o ) f h i d a k a & k a j i u r a 1 9 8 8 ) 、澳洲指桔( v a r d i1 9 8 6 ) 、山金柑( 邓秀新1 9 8 9 ) 、九里香( j u m i n & n i t o 1 9 9 5 ) 等。此外还陆续报道有梨( o e h a t t e ta l1 9 8 6 ) 、樱桃( 0 c h a t te t a l1 9 8 7 ，1 9 8 8 b ) 、 苹果( p a t a t - o c h a ae t a l 1 9 8 8 ；h u a n c a r u n a - p e r a l e s & s c h i e d e r1 9 9 3 ；丁爱萍等 1 9 9 4 ；s a l t o & s u z u k i1 9 9 6 ) 、李( o c h a t t1 9 9 2 ) 、枇杷( 林顺权，陈振光1 9 9 4 ，1 9 9 6 ) 等木本果树的原生质体培养获得再生植株；草莓( i n f a n t e r o s a t i1 9 9 3 ；n y m a n & w a l l i n1 9 8 8 ，1 9 9 2 41 9 9 2 b ) 、香蕉( p a n i s e t a l1 9 9 3 ；m e g i ne ta l1 9 9 3 ) 、番木瓜( c h e n & c h e n1 9 9 2 ) 等草本植物的原生质体培养获得再生植株以及猕猴0 5 ( z h a n ge ta l 1 9 9 6 a ，1 9 9 6 b ；张远记等1 9 9 5 ；肖尊安等1 9 9 2 4 1 9 9 2 b ，1 9 9 3 ；t s a i1 9 8 8 ；m i i 福建农林大学硕士论文 j i 言 o h h a s h i1 9 8 8 ) 、葡萄( k o v a l e n k o & g a l k i n1 9 9 0 ) 等藤本植物的原生质培养获得再 生植株。 1 2 植物原生质体遗传操作研究进展 由于植物原生质体培养技术的出现和逐步完善，开发了一系列基于原生质体 培养的遗传操作技术，扩大了植物的变异范围和创造了许多新物种、新种质，有 的已开始在生产上应用并发挥高产优质的作用( 颜昌花敬和张玉华1 9 9 5 ) 。植 物原生质体的遗传操作，主要集中在遗传转化和细胞融合的研究。 在遗传转化方面，以原生质体为受体的转化方法主要有p e g 法、电激法、热 击法、激光法、超声波法、基因枪法以及农杆菌介导法等( 路铁刚等1 9 9 5 ) ， 其中的p e g 法、电激法、热击法、激光法、超声波法等一般仅依赖于原生质体为 转化受体。1 9 8 0 年d a v e y 首先采用原生质体直接摄取d n a 进行转化，到目前通过 原生质体作为受体获得了许多重要植物的转基因植物，如烟草( s h i k k i t oe t a l 1 9 8 5 ；m e y e r e ta l1 9 8 5 ；k r e n se t a l1 9 8 2 ) 、水稻( t o r i y a m a e ta l1 9 8 8 ) 、玉米( r h o d e s 1 9 8 8 ) 、草莓( n y m a ne t a l1 9 9 2 b ) 等。 在原生质体融合方面，p o w e r ( 1 9 7 0 ) 等最先提出了体细胞杂交设想并进行 了原生质体诱导融合的研究。接着t a k e b e & n a g a t a ( 1 9 7 1 ) 首次获得烟草叶肉 原生质体再生植株：c a r l s o n 等( 1 9 7 2 ) 报道了首例粉蓝烟草与郎氏烟草两种不 同的烟草原生质体融合并首先得到了种间体细胞杂种； m e l c h r e s 等( 1 9 7 8 ) 首 次把马铃薯和番茄的原生质体融合，得到属间杂种植株，花、叶、果实具有杂种 特点，有的还长出了能进行营养生殖继而长成新植株的葡萄茎。马铃薯和番茄原 生质体融合的成功为人类利用细胞融合技术创造新种开辟了道路。随后k a s k a 和k a m e g a ( 1 9 9 4 ) 报道将番茄叶肉原生质与胡萝h 悬浮培养细胞原生质体进行 电融合，经选择获得科间杂种。近年来人们在体细胞之间杂交成功的基础上开始 了配子一体细胞杂交的研究。p e n t a l ( 1 9 8 6 ) 等用粘毛烟草小孢子四分体原生质 体与烟草的体细胞原生质体融合成功得到了三倍体植株，即所谓配子一体细胞杂 交，以区别于常规的体细胞杂交。 果树的原生质体融合也受到了果树育种学家的高度重视。值得特别指出的 有：o h g a w a r a 等( 1 9 8 5 ) 首先获得了枳壳和t r o v i t a 甜橙的体细胞杂种，这是 果树上第一例体细胞杂交成功的报道：v a r d i 等( 1 9 8 7 ) 首次获得柑橘类的胞质 杂种；o c h a t t 等( 1 9 8 9 ) 把野生梨和樱桃的原生质体融合，首次获得了亚科间( 梨 亚科和李亚科之间) 原生质体杂种：邓秀新等( 1 9 9 5 ；1 9 9 4 ) 获得了柚子与伏令 福建农林大学硕士论文j f 言 夏橙的体配融合杂种三倍体胚状体，这是果树乃至木本植物体配融合研究获得杂 种材料的首例报道，对开辟培育无籽果树品种新途径具有重要意义。柑橘类、樱 桃与野梨、猕猴桃、柿、菠萝、西番莲等植物细胞的成功融合都有大量报道。细 胞融合和转化将成为创造新品种及定向改良植物遗传性的最有效途径。 从果树上已经融合成功的例子看来，有效的原生质体融合技术关键在于：有 高效的原生质体再生体系、选择合适的诱导融合方法、有效的杂种筛选和鉴别系 统；针对融合目的，还必须考虑双亲的特点并加以适当处理，以满足有效融合体 系及育种目标的需要。 建立高效的原生质体再生体系：在原生质体融合中，至少一方要有再生能力。 为获得融合杂种，融合的双亲中要有一方已建立高效的原生质体再生体系。在融 合较成功的柑橘、猕猴桃、瑗番莲等果树中，皆以建立良好的再生体系为基础。 目前，香蕉、龙眼等果树已建立高效的原生质体再生体系( p a n i s1 9 9 3 ；赖钟雄 1 9 9 6 ) 。 采用合适的诱导融合方法：目前果树原生质体融合主要采用两种方法：p e g 诱导融合法和电融合法。前者为经典的融合方法，但存在p e g 毒害、融合效果 不佳和操作不方便等缺点。后者是2 0 世纪7 0 年代末、8 0 年代初出现的融合新 方法，对原生质体损害小、融合率高、重复性好、便于观察，受到广泛重视及应 用。在果树上，电融合的成功使用在2 0 世纪9 0 年代以后，目前在柿子以及柑橘 的多个体细胞杂交组合，已采用电融合方法获得体细胞杂种。 开发不对称融合系统：开发不对称融合系统，有利于提高原生质体融合的应 用价值，也有利于杂种的筛选，是将来的发展方向。在果树上，v a r d i 等( 1 9 8 7 ) 率先采用供体一受体融合系统，获得具有枳橙胞质和酸橙细胞核的柑橘胞质杂 种。邓秀新等( 1 9 9 5 ) 采用体配融合系统，获得了柚子和伏令夏橙的体配三倍体 杂种胚状体，可望成为果树无籽育种的新途径。其它的非对称融合方法，如原生 质体一亚原生质体融合系统、体细胞与生殖细胞或生殖细胞之间的融合，有待进 一步引入果树的原生质体融合研究。这些不对称融合方法的出现大大提高了果树 原生质体融合研究的应用价值。 设计有效的杂种筛选系统：有效简便的杂种筛选系统对于提高获得融合杂种 的效率是十分关键的。在传统的互补选择法、机械选择法和根据杂种细胞生长差 异的机械选择法的基础上，已发展出一些新的筛选系统，如单对原生质体融合体 系、供体一受体融合系统、筛选系统的结合、离心处理、利用杂种细胞的杂种优 福建农林大学硕士论文引言 势、利用荧光活性细胞自动分类器选择融合体等。在果树的原生质体融合中，目 前仅见供体一受体融合系统和筛选系统的结合方法得到应用。 采用快速准确的杂种鉴定技术：在目前的果树体细胞杂种鉴定中除了采用 形态学及细胞学等传统的手段外，已逐渐使用r a p d 、r f l p 等分子生物学手段 来鉴别。 1 3 植物原生质体培养在品种改良上的应用 植物原生质体没有细胞壁的物理障碍，又保持细胞的全能性，便于进行遗传 操作，可以克服常规育种上的某些局限性，对植物品种改良显示了重要的作用。 1 3 1 遗传转化 植物原生质体是遗传转化较为理想的受体系统，被广泛用于植物遗传操作 ( 李向辉1 9 9 1 ) 。原生质体由于没有细胞壁可以直接摄入外源d n a 、r n a ，外 源的细胞器如叶绿体、线粒体、细胞核、染色体，也可摄取细菌，蓝藻，病毒， 噬菌体等，并且还可通过如p e g 、电激法、超声波法等促进外源遗传物质的摄 入，由于有新的遗传物质的导入，植物可能会出现些新的性状，从而为植物品 种的改良提供了丰富的材料。 植物的原生质体可以与含外源基因的农杆菌共培养，通过t i 或r i 质粒等载 体转移外源基因，可实现原生质体的转化。这种形势的遗传物质交流在实现单个 目的基因的转移，定向改变性状方面有比原生质体融合更大的优势。而且植物原 生质体在壁刚刚再生而尚未分裂时，与植物的创作条件类似，共培养时有利于农 杆菌的侵染，可以提高转化频率。 再者，原生质体还是瞬间表达( t r a n s i e n te x p r e s s i o n ) 研究的优良体系。遗传 转化可以定向转移外源基因。是植物品种改良强有力的新手段。 1 3 2 原生质体融合 传统的有性杂交难以实现远缘的种属之间的结合，从而大大阻碍了育种进 程，而植物的细胞融合和体细胞杂交，无疑为植物的远缘杂交育种开辟了崭新的 途径。然而植物细胞由于有一层厚厚的细胞壁包裹着，进行细胞融合相对来说要 困难一些。因此，以原生质体操作代替细胞操作，来实现细胞融合已成为开辟新 品种的一条有效的途径。i ! i c a r l s o n 等在1 9 7 2 年获得第一株烟草体细胞杂种植株 以来，原生质体融合技术在植物中已广泛应用。据不完全统计，到2 0 0 3 年初，已 获得木本植物近1 0 0 个组合的体细胞杂种植株( 金晓玲等2 0 0 3 ) ；t e r a d ar 等最 早在1 9 8 7 年，将稗草与水稻的原生质体融合，获得了杂种水稻植株，至1 9 9 9 年底。 4 福建农林大学硕士论文 引言 已获得1 7 例水稻体细胞杂交组合的杂种植株( 高东迎等2 0 0 1 ) ：现已有1 0 多种植 物性细胞的2 0 多个不同组合的配子一体细胞杂交实验，有的已获得再生植株( 郭 学民等2 0 0 5 ) 。 植物原生质体融合目前广泛使用的是p e g 法和电融合法。通过p e g 等化学诱 导剂诱导可使不同亲本，不同来源和不同性质的原生质体融合，可以实现染色体 组的转移。避免有性杂交不亲和性，雌雄不育和胚败育等带来的有性杂交的障碍， 扩大了杂交的育种范围，可创造新种质。电融合其原理是在短时间强电场的作用 下，细胞膜发生可逆性电击穿( r e v e r i s b l eb r e a k d o w n ) ，瞬时失去其高电阻和低通 透特性，然后在数分钟后恢复原状。在植物细胞杂交领域，用电融合方法可以高 频率地融合植物原生质( z i m m e r m a n n e ta l1 9 8 1 ，郑强1 9 8 5 ) ，并已获杂种植株 ( k o h ne ta l1 9 8 5 ，b a t e se ta l1 9 8 5 ) ，其优点在于操作简单，无化学毒性，对细胞 损伤小，融合同步，可在显微镜下观察融合过程以及融合率高的特点( 王克明 2 0 0 4 ) 。 1 3 3 突变体的筛选 植物原生质体培养再生植株是由单个细胞发育而成的，因而可用于突变体的 筛选，而且原生质体对外界因子的反应比较敏感，更有利于选择突变体。 在植物原生质体培养或融合再生的植株中，出现变异植株在植物育种中有如 下应用。首先，产生变异为选择新优材料提供了可能，为品种选育提供了材料， 因为可以从原生质体培养产生变异的植株中选出有利用价值的材料，已在马铃薯 和水稻中取得成功。马铃薯r u s s e tb u r b a n k 原生质体再生植株中出现近千个变异 类型，从中选出了两三个较有价值的品系( s h e p a r de ta l1 9 8 0 ) 。在水稻上，在原 生质体再生植株中也选出了不少优良变异个体，如我国研究者从中选出抗穗颈穗 瘟病的植株，日本选出了1 个矮杆水稻新品种世锦，与对照相比增产1 0 。 此外，还有报道称日本研究者曾从水稻品种越光原生质体再生植株后代选育出 抗白叶枯病、抗倒伏、品质优良的新品种初梦( 王景余等1 9 9 3 ；o g u r ae ta l1 9 9 1 ) 。 其次，由于原生质体培养再生植株变异是在培养过程中发生的，不需经过其它特 殊的操作和选择，因此，能够缩短育种年限，节约时间，加速育种进程。通常情 况下，从水稻原生质体再生植株r l 到r 4 的培育和选择只需要3a 时间，而通过常 规手段育成新品种则需要5a ，灿粳杂交育种需要8 1 0a ，相比之下，前者所需的 时间最短( 刘继红等2 0 0 3 ) 。第三，在现有研究条件下，通过酶解法能够分离 得到大量的原生质体，使得变异发生面广、幅度大、整齐度高而且稳定快，因而 福建农林大学硕士论文 弓【言 可以获得大量的变异材料。如s h e p a r d 等在马铃薯栽培品种r u s s e tb u r b a n k 叶肉 原生质体再生植株中观察到很多变异类型，因而可以用于选择的材料也就增多 ( s h e p a r de ta l1 9 8 0 ) 。但出现此类变异对于植物育种和资源利用来说也有其不足， 因为就种性保持而言，产生变异的植株是不利的，因为它不利于供体材料原有性 状和遗传特征的保留，尤其在以原生质体作为超低温保存的材料时，如果发生变 异，则不利于材料的保存。 2 原生质体培养技术 2 1 原生质体的分离与纯化 目前采用酶解方法分离原生质体是获得大量有活力原生质体的唯一途径。酶 解是一个复杂的过程，原生质体的产量和活力受到分离材料的种类、状态，酶解 液的组成成分，酶解时间、温度和方式，p h 值等因素的影响。 2 1 1 起始材料 一般来说，几乎植物体的任何部分都可以分离出原生质体，如根、茎、叶、 花、果实、种胚、下胚轴、肿瘤组织以及愈伤组织、悬浮培养细胞等( 陈正华 1 9 8 6 ) 。但要获得高质量的原生质体，则需要选用生长旺盛、生命力强的材料。 在选择材料时，需考虑以下几个因素：经酶解后可得到大量的原生质体，即产量 高；原生质体稳定性好，不易破裂，经得起各种实验操作：原生质体活力高，生 命力旺盛，具有形态分化潜力，培养后容易再生植株。 在以往的双子叶植物培养中，大多以叶片为分离原生质体的材料。叶片取材 容易，需时较短，培养条件较容易取得一致，分离效果好，且变异小；另外原生 质体有叶绿体，若将叶片原生质体用作与愈伤组织及其悬浮培养物来源的原生质 体融合的亲本，有利于肉眼识别异核体，但叶片原生质体单独培养时有存在再生 问题。近年来，起始材料的适用范围有了较大扩展。目前，以愈伤组织、悬浮细 胞和体细胞胚为材料制备原生质体是最主要的方式；禾本科植物原生质体培养获 得成功的试验，几乎都是用从幼胚或成熟胚诱导形成的胚性愈伤组织或胚性细胞 系来游离原生质体。采用这些材料制备原生质体方法简便、产量高、不污染、不 易破碎。 除材料的种类外，材料的生理状态对于原生质体活力有很大的影响。不同材 料和不同生理状态的材料内部的渗透压是不相同的。马铃薯的原生质体内部渗透 压受基因型、细胞年龄、培养时的条件以及取材的时间和部位等因素的影响，是 一个变动的数值( 戴朝曦等，1 9 9 5 ) 。 6 福建农林大学硕士论文0 i 言 2 1 2 基因型 同一植物不同基因型的原生质体脱分化与再分化所要求的条件不同，所以在 相同条件下，不同品种的再生能力不同。王光远和夏镇澳( 1 9 8 7 ) 在水稻原生质体 培养中曾用2 6 个品种进行组织培养，其中仅有3 个品种( 粳稻农虎6 号、国香l 号和 上农香糯) 能成功地用于原生质体培养，获得再生植株。据统计，小麦获得原生 质体再生植株的基因型只有大约l o 个( 易自力等1 9 9 9 ) 。基因型的选择在植物原 生质体培养中起着重要作用，它不仅影响原生质体的产量和活力，而且还影响植 株的再生( 郭学民等2 0 0 5 ) 。c h e n g 和v e i l l e n u x ( 1 9 9 1 ) i 正b y 芙薯( s o l a n u mp h u r e j 曲 从原生质体培养到愈伤组织形成受2 个独立位点的显性基因的调控。因此，现有 条件下，并不是所有植物种都能获得原生质体再生植株。为了提高原生质体培养 的成功率，要采用多品种和适当品种作为原生质体培养的起始材料。 2 1 3 材料的预处理 在游离原生质体之前对材料进行预处理，可以改善材料的生理状念，提高原 生质体的产量和质量，提高分裂频率，有的还可以提高植板率( 黄学林和李筱菊 1 9 9 5 ，李文彬1 9 9 1 ) 。特别需要指出的是，采取促使生理状态一致的预处理， 还有利于提高原生质体培养技术的重复性和稳定性。 预处理的方法很多，常用的有切割处理；黑暗处理( 陈季楚等，1 9 9 5 ) ，低 温生理，叶片预培养及撕去下表皮处理，叶片萎蔫处理和预质壁分离处理( 陈维 伦，陶国清等，1 9 8 7 ) 等。豌豆、烟草、水稻、野豌豆、马铃薯的叶片分别采用 黑暗、失水、淹水、质壁分离、力i l k s t s ( 硫代硫酸银) 预培养等方法预处理( 转引 自俞长河1 9 9 7 ) ，草莓的试管苗叶片在降低蔗糖的培养基或黑暗下预培养一周 ( i n f a n t e & r o s a t i1 9 9 3 ；n y m a n & w a l l i n1 9 8 8 ，1 9 9 2 a ) ，苹果试管苗在增殖培养基中 添加l 蛋氨酸( w a l l i n w e l a n d e r1 9 8 5 ) ，野梨叶片在b 5 液体培养液预培养2 0 h ( o c h a t t & c a s o1 9 8 6 ) ，都提高了原生质体的分离产量。 对于荔枝胚性悬浮培养物，除材料来源、继代天数、酶和甘露醇浓度明显影 响原生质体分离外，酶解前的预高渗处理有独特的作用( 俞长河1 9 9 7 ) 。荔枝悬 浮培养物经预高渗处理后，离心时原生质体的破裂大大减少。可保持原生质体的 完整性，还减轻了分离时原生质体的聚集和自动融合，提高了产量和活力。若不 经高渗预处理，有严重的聚集和自动融合现象，融合的巨型原生质体有较大液泡， 在离心或培养过程中最终破裂，融合串约为5 一8 ，而高渗预处理后降为1 一2 ( 俞长河1 9 9 7 ) ，i s h i i ( 1 9 8 8 ) 认为分离时原生质体融合是由于胞间连丝外露， 7 福建农林大学硕士论文 j 言 而高渗预处理使原生质收缩，切断胞间连丝。r e t h m i e r 等( 1 9 9 1 ) 认为高渗预处理 降低果胶酶对细胞膜的损伤，防止胞内物质的渗漏和原生质体破裂。酶解前的预 高渗处理可以提高梨、苹果( o c h a t tsj1 9 9 0 ) 、甜橙( i s h i is1 9 8 8 ) 、杨树( 王影等 1 9 9 5 ) 和咖啡( g r e z e sje ta l1 9 9 4 ) 的原生质体的分离效果和分裂频率。 2 1 4 酶类 酶制剂的纯度、浓度、活性以及酶解处理时间显著影响原生质体的产量和活 力。要选择纯度高的酶类，根据酶解材料细胞壁的特性以及酶活性大小确定适宜 的酶液组合。所使用的种类和浓度因植物种类与材料不同而异，使用浓度不宜过 高，酶解时间不宜过长，否则对原生质体损伤严重。木本植物的细胞壁成分比草 本植物的坚厚，含有较多的半纤维素，分离原生质体时可适当添加半纤维素酶( 王 蒂2 0 0 4 ) 。 目前用于植物原生质体分离的酶类有纤维素酶、