（药理学专业论文）l瓜氨酸对大鼠胃缺血再灌注损伤的保护作用及nos表达的调控.pdf

r r 徐州医学院硕士学位论丈 l i i i i i l l l li i l i i iii i i ii iiiil y 1 8 8 4 9 8 5 缩略词 c n o s e n o s g i r h e i n o s l c i t 缩略词表 a b b r e v i a t i o n 英文全称 c o n s t i t u t i v en i t r i co x i d es y n t h a s e e n d o t h e l i a ln i t r i co x i d es y n t h a s e g a s t r i ci s c h e m i a r e p e r f u s i o n i n d u c i b l en i t r i co x i d es y n t h a s e l c i t r u l l i n e l n a m e n g n i t r o l a r g i n i n em e t h y le s t e r m d a m p 0 n n o s n o n o s o d p a g e s d s m a l o n d i a l d e h y d e m y e l o p e r o x i d a s e n e u r o n a ln i t r i co x i d es y n t h a s e n i t r i co x i d e n i t r i co x i d es y n t h a s e o p t i c a ld e n s i t y p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h e r e s i s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t - s o dt o t a ls u p e r o x i d ed i s m u t a s e t n o st o t a ln i t r i co x i d es y n t h a s e 1 4 0 0 w n 一 3 一( a m i n o m e t h y l ) b e n z y l a c e t a m i d e 中文全称 结构型一氧化氮合酶 内皮型一氧化氮合酶 胃缺血再灌注 苏木素伊红 诱导型一氧化氮合酶 l 瓜氨酸 n 硝基精氮酸甲酯 丙二醛 髓过氧化物氧化酶 神经元型一氧化氮合酶 一氧化氮 一氧化氮合酶 光密度 聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠 总超氧化物歧化酶 总一氧化氮合酶 n ( 3 - ( 氨甲基) - 苄基) 乙脒 徐州医学院硕士学位论文 l 一瓜氨酸对大鼠胃缺血一再灌注损伤的保护作用及n o s 表达的调控 中文摘要 目的l 瓜氨酸为天然活性成分，近年来研究资料表明其具有心肌保护、降 血脂、降血压等多种药理活性，本研究旨在研究l 瓜氨酸对大鼠胃缺血再灌注损 伤的保护活性及作用机制。 方法本实验采用健康雄性s p r a g u e - d a w l e y 大鼠，将雄性大鼠随机分为7 组， 每组8 只，分别为假手术组( s h a mg r o u p ) 、模型组( g i rg r o u p ) 、1 4 0 0 w ( 选择性i n o s 抑制剂) 组、l - n a m e ( 非选择性n o s 抑制剂) 和l 瓜氨酸低、中、高剂量组，l 瓜 氨酸于手术前6 0m i n 灌胃给药，1 4 0 0 w 和l n a m e 于缺血前3 0 m i n 皮下注射给 药。夹闭大鼠腹腔动脉3 0 m i n 后，松开动脉夹血流复灌6 0m i n 以建立胃缺血再灌 注( g a s t r i ci s c h e m i a - r e p e r f u s i o n ，g i - r ) 模型，取胃后计数胃黏膜损伤指数；h e 染色 法检测胃黏膜形态学变化；测定胃黏膜组织中一氧化氮( n o ) 含量；测定缺血再灌 注前后胃黏膜组织中丙二醛( m d a ) 含量及总超氧化物歧化酶( t o t a ls o d ，t - s o d ) 、 髓过氧化物酶( m y e l o p e r o x i d a s e ，m p o ) 、总n o s ( t o t a ln o s ，t n o s ) 、诱导型n o s ( i n d u c i b l en o s ，i n o s ) 和结构型n o s ( c o n s t i t u t i v en o s ，e n o s ) 活性的变化；同时， 采用免疫印迹技术测定l 瓜氨酸预处理对大鼠g i r 损伤后胃黏膜组织中i n o s 、 神经元型n o s ( n n o s ) 署t l 内皮型n o s ( e n d o t h e l i a ln o s ，e n o s ) 蛋白表达变化。 结果( 1 ) 缺血前灌胃给予l 一瓜氨酸( 3 0 0 ，6 0 0 ，9 0 0m g k g ) 对大鼠g i r 胃黏膜 均明显减轻胃黏膜损伤指数( 尸 o 0 0 1 ) ，此外，l n a m e 预处理增加了大鼠g i r 胃黏膜损伤指数( 尸 0 0 5 ) ；( 2 ) 大鼠g i r 损伤胃黏膜有胃黏膜糜烂、出血，局部 腺体结构紊乱，间隙扩大，并出现局部胃黏膜细胞脱落以及淋巴细胞浸润等症状， 而l - 瓜氨酸预处理组腺胃上皮基本完整、连续，腺体排列较整齐，淋巴细胞浸润 明显减少，同时，1 4 0 0 w 预处理也明显改善了上述大鼠g i r 损伤的病理学损伤； 2 徐州医学院硕士学位论丈 ( 3 ) 大鼠g i - r 损伤胃黏膜组织中m d a 和n o 含量较手术组明显升高( 尸 0 0 0 1 ) ， t - s o d 活性显著降低( p 0 0 0 1 ) ，m p o 活性明显增高( 尸 0 0 0 1 ) ，l 一瓜氨酸和1 4 0 0 w 预处理显著降低了胃黏膜组织中m d a 和n o 含量及m p o 的活性，增加了t - s o d 的活性；( 4 ) 大鼠g i r 损伤胃黏膜组织t n o s 和i n o s 活性明显增加( 尸 0 0 0 1 ) ， e n o s 活性显著降低( 尸 0 0 5 ) ，l 瓜氨酸预处理明显抑制了大鼠g i r 诱导的胃黏 膜组织t n o s 和i n o s 活性增高( 尸 0 0 1 或p o 0 0 1 ) ，同时显著增加了e n o s 的 活性( 尸 0 0 5 ) ；( 5 ) 大鼠g i - r 损伤胃壁黏液含量降低( p o 0 1 ) ，高剂量l - 瓜氨酸 预处理明显抑制了g i r 导致胃壁黏液减少( 尸 0 0 5 ) ，l - n a m e 则显著降低了大鼠胃壁黏液含量( p o 0 5 ) ；( 6 ) 大 鼠g i r 损伤胃黏膜组织i n o s 蛋白的表达显著增j j i ( p 0 0 5 ) ，l - 瓜氨酸( 6 0 0 ，9 0 0m g k g ) 预处理显著降低了胃黏 膜组织i n o s 蛋白表达妒 o 0 5 或尸 0 0 5 ) 。 结论( 1 ) 缺血前给予l 瓜氨酸对大鼠g i r 损伤具有保护作用；( 2 ) 抑制 e n o s 活性对大鼠g i r 损伤具有损害作用，而抑制i n o s 活性对大鼠g i r 损伤具 有保护作用；( 3 ) l 瓜氨酸的保护作用与下调胃黏膜组织i n o s 的表达，抑制i n o s 的活性增加，上调e n o s 的活性，进而调节胃黏膜组织n o 的生成释放过程有关； ( 4 ) l 瓜氨酸抑制了大鼠g i r 损伤胃黏膜组织中的m p o 活性增加，减少淋巴细胞 对胃黏膜组织浸润，这可能与l 瓜氨酸调节e n o s i n o s 活性有关；( 5 ) l 瓜氨酸 可以减少再灌注后自由基的产生，抑制了胃粘膜脂质过氧化，这也参与了l - 瓜氨 酸对大鼠g i r 损伤的保护作用。 关键词 胃；缺血再灌注；l 瓜氨酸；一氧化氮合酶；髓过氧化物氧化酶 3 徐州医学院硕士学位论文 二二- 二二二二| 一一 ( 课题资助：江苏省自然科学基金，n o b k 2 0 0 9 2 5 3 ；徐州医学院研究生创新计划， n o x y c x 2 0 0 913 1 4 徐州医学院硕士学位论炙 e f f e c to fl - c i t r u l l i n eo ni s c h e m i a r e p e r f u s i o ni n d u c e dg a s t r i c m u c o s a li n j u r ya n dc h a n g e so fn o se x p r e s s i o n si nr a t s a b s t r a c t o b j e c t i v e l 。c i t r u l l i n ei san a t u r a ls u b s t a n c e ，w h i c hh a sd e m o n s t r a t e d c a r d i o p r o t e c t i v e ，a t h e r o s c l e r o s i sr e v e r s i o n ，a n dh i g hb l o o dp r e s s u r el o w e r i n ge f f e c t si n a n i m a lm o d e l sa n dai n h i b i t i o ne f f e c to i lp o l y m o r p h o n u c l e a rn e u t r o p h i l s ( p m n s ) b u r s t i nh u m a n s t h ep r e s e n ts t u d yw a st oi n v e s t i g a t et h ep r o t e c t i v ee f f e c to fl - c i t r u l l i n eo n g a s t r i cm u c o s a ii n j u r yi n d u c e db yg a s t r i ci s c h e m i a r e p e r f u s i o n ( g i 一鼬i nr a t s m e t h o d st h eg i ri n j u r ym o d e l sw a si n d u c e di ns p r a g u e - d a w l e y ( s d ) r a t sb y c l a m p i n gt h ec e l i a ca r t e r yf o r3 0m i n ，a n dt h e nr e p e r f u s i n gf o rlh s i x t ym i n u t e sb e f o r e i s c h e m i a ，l c i t r u l l i n ea td o s e so f3 0 0 ，6 0 0 ，9 0 0m g k gw e r eg a v a g e dr e s p e c t i v e l y s i x t y a f t e rt h er e p e r f u s i o n ，t h eg a s t r i cm u c o s a li n j u r yi n d e x ，t h el e v e lo fn i t r i t e n i t r a t e ，t h e c o n t e n to fm a l o n d i a l d e h y d eo v i d a ) ，t h ea c t i v i t i e so fo ft o t a ls u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( t - s o d ) ，a n dm y e l o p e r o x i d a s e ( m p o ) i nt h eg a s t r i cm u c o s aw e r ee x a m i n e d m o r e o v e r , t h ee n z y m a t i ca c t i v i t i e so ft o t a ln os y n t h a s e ( n o s ) ，c o n s t i t u t i v en o s ( e n o s ) ，a n d i n d u c i b l en o s ( i n o s ) w e r ed e t e r m i n e d t h ee x p r e s s i o n so fn e u r o n a ln o s ( n n o s ) ， i n d u c i b l en o s ( i n o s ) ，a n de n d o t h e l i a ln o s ( e n o s ) w e r ed e t e r m i n e d h i s t o l o g i c a l a n a l y s i so ft h el e s i o n sw a sa l s oc a r r i e do u t 。 r e s u l t s ( 1 ) p r e t r e a t m e n tw i t hl - c i t r u l l i n e ( 3 0 0 ，6 0 0 ，9 0 0m # k g ) s i g n i f i c a n t l y a m e l i o r a t e dt h eg a s t r i cd a m a g ei n d u c e db yi r ( 尸 0 0 0i ) ( 2 ) a sl i g h tm i c r o s c o p i c s h o w e d ，i ri n j u r yp r o d u c e ds e v e r ed a m a g ei nt h es t o m a c h ，m o s t l yi nt h es u r f a c e e p i t h e l i a lc e l l s ，b u ts o m ed a m a g eo c c u r r e di nt h em u c o s 如e x t e n d i n gt ot h er e g i o no fp i t s a n dg l a n d s p r e t r e a t e dw i t hl - c i t r u i l i n e ，t h ep a t h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sw e r em a r k e d l y r e d u c e d ，a n do n l ys l i g h td a m a g ew a so b s e r v e di nt h es u r f a c ee p i t h e l i u m ( 3 ) l - c i t r u l l i n e h a sa ni n h i b i t i o ne f f e c to nt h ep r o d u c t i o no fl i p i dp e r o x i d a t i o na n dt h ei n c r e a s eo ft h e m p oa c t i v i t yi nt h eg a s t r i cm u c o s a ( 4 ) g a s t r i cm u c o s a lm u c u sl e v e l so fr a t sw i t hg i - r s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dc o m p a r e dw i t hs h a mg r o u p ( p 0 0 01 ) h o w e v e r , t h ed e c r e a s e o fg a s t r i cm u c u si nt h eg a s t r i cm u c o s ai n d u c e db yg i rw e r es i g n i f i c a n t l ya t t e n u a t e db y l c i t r u l l i n e ( 9 0 0m g k g ) ( p 0 0 5 ) ( 5 ) t h ei n c r e a s e i i li n o sp r o t e i ne x p r e s s i o ni nt h eg a s t r i cm u c o s ai n d u c e db yi rw e r es i g n i f i c a n t l y s 徐州医学院硕士学住论丈 a t t e n u a t e db yl c i t r u l l i n e 俨 2m m 计3 分， 余类推。损伤宽度超过lm m 时分数加倍。每组大鼠损伤分数的平均值为损伤指 数。 2 5 石蜡切片的制备 测量完损伤指数的胃沿胃小弯剪开，一半腺胃在冰盘上快速剪取胃黏膜，置 - 8 0 冰箱备用。另一半腺胃部分在1 0 中性福尔马林固定，然后分别顺序于7 0 、 8 0 、9 5 、1 0 0 的乙醇中脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5p m 切片，间断贴片 于多聚赖氨酸处理的载玻片上备用。 2 6h e 染色 ( 1 ) 切片脱蜡复水：- 甲苯( 2 0m i n x 2 ) 脱蜡；1 0 0 酒精i 、1 0 0 酒精i i 、9 5 酒精、 1 2 徐州医学院硕士学位论文 8 0 0 0 酒精、7 0 0 0 酒精、双蒸水降浓度梯度酒精复水，各5m i n ； ( 2 ) 自来水冲洗i m i n ； ( 3 ) 苏木素( h ) 染色5 8m i n ； ( 4 ) 自来水冲洗l m i n ； ( 5 ) 分化液分化数秒，时间依苏木素染色深浅而定； ( 6 ) 自来水冲洗l m i n ； ( 7 ) 进入返蓝液返蓝处理5 - 1 0s ； ( 8 ) 自来水冲洗2m i n ； ( 9 ) 伊红( e ) 染色，1 - - - 3r a i n ； ( 1 0 ) 自来水冲洗3 0 , - 一6 0 s ，去浮色： ( 1 1 ) 脱水：升浓度梯度酒精脱水，7 5 酒精i 、7 5 酒精i i 、9 5 酒精i 、9 5 酒 精i i 各1 0 s ，1 0 0 酒精i 、1 0 0 酒精i i 各3 0 6 0s ； ( 1 2 ) 透明：二甲苯( 1m i n x 2 ) ； ( 1 3 ) 封片：中性树胶常规封片，显微镜下观察。 2 5 胃黏膜组织中m d a 、t - s o d 、n o s 、m p o 、n o 的测定 m d a 含量( n m o l m g p r o t ) g lt - s o d 活性( u m g p r o t ) 分别采用硫代巴比妥酸法 ( t b a 法) 和黄嘌呤氧化酶法测定。 2 5 1b c a 法测定蛋白含量 取1 0 的组织匀浆上清，采用b c a 法测定蛋白含量【2 3 1 ，具体步骤如下： ( 1 ) 根据样品数量，按5 0 体积b c a 试剂a 加入l 体积b c a 试剂b ( 5 0 ：1 ) 配制适量 b c a 工作液，充分混匀； ( 2 ) 将浓度为0 5m g m l 的蛋白标准品按0 ，1 ，2 ，4 ，8 ，1 2 ，1 6 ，2 0 山加到9 6 孔板的标 准品孔中，加标准品稀释液补足到2 0 “l ； ( 3 ) 加5 “l 样品到9 6 孑l 板中，补加标准品稀释液到2 0 “l ； ( 4 ) 各孔加入2 0 0i , t l b c a 工作液，3 7 c 放置2 0 3 0m i n ： ( 5 ) 测定a 5 6 2 ，绘制标准曲线计算出样品的蛋白浓度。 1 3 徐州医学院硕士学位论丈 2 5 2m d a 含量的测定 胃黏膜组织中m d a 含量的测定采用1 0 的组织匀浆液的上清，设定标准管， 标准空白管，测定管和测定空白管；加入1 0n m o l m l 标准品0 1m l 于标准管中， 加入无水乙醇o 1m l 于标准空白管中，加入o 1m l 的测试样本于测定管和测定空 白管中，混匀后分别加入3m i 试剂二和lm l 试剂j 于上述各管中，最后加入5 0 的冰醋酸lm l 于测定空白管中；漩涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头 刺一小孔，9 5 c 水浴8 0m i n ，取出后流水冷却，然后3 5 0 0 4 0 0 0 转分，离心1 0m i n 取上清，5 3 2n m 处，lc m 光径，蒸馏水调零，测定各管的吸光度值。 龆掣羞喜爱粪凄絮篙墓糕标准品浓度( 蛋m g 白p r 含o t t 量l ) 2 5 3t - s o d 活性的测定 t - s o d 活性测定采用1 0 的组织匀浆液的上清。分别设定对照管和测定管， 先向各管中分别加入1m l 的试剂一，再加入蒸馏水o 0 3m l 于t - s o d 对照管中， 加入样本0 0 3m l 于t - s o d 测定管管中，然后分别向以上各管中依次加入试剂二， 试剂三，试剂四各o 1m l 后，于漩涡混匀器上充分混匀，置于3 7 恒温水浴4 0m i n ， 再分别加入显色剂2m l 混匀；室温放置1 0m i n ，于波长5 5 0n m 处，lc m 光径比 色杯，蒸馏水调零，比色。 ta-msno印dr，括力。5过里蓑系耄痿害产2磊襄譬委蛋(rrg白pr含ot,量：,) 2 5 4n o s 活性测定 n o s 活性测定采用1 0 的组织匀浆的上清。分别设定t n o s 空白管、t n o s 测定管、i n o s 空白管、i n o s 测定管，首先向t n o s 空白管中加入o 1 5m l 双蒸 水，向t n o s 测定管中加入o im i 双蒸水和o 0 5m l 样本，向i n o s 空白管中加 入o 0 5m l 双蒸水和o 1m l 抑制剂，向i n o s 测定管中0 0 5m l 样本和o 1m l 抑制 剂，然后分别向以上各管中加入0 2m l 底物缓冲液、0 0 lm l 促进剂、0 1m l 显色 1 4 徐州医学院硕士学位论丈 剂，于漩涡混匀器上充分混匀，3 7 。c 恒温水浴1 5r a i n ，再分别加入o 1m l 透明剂 和2m l 终止液，充分混匀，于5 3 0n m 处，lc m 光径比色杯，蒸馏水调零，比色。 t 渺n o 唧s 话矿2 鼍篙鬻黼警幽谍斧 c o 蝴 m g 话p r o 力t ) 2 等謦黼蒜篇铲堂警面蒜一罾自( t r i c 含量o t r _ , ) c n o s 活力= t n o s 活力i n o s 活力 ( u m g p r o t ) 2 5 5n o 含量测定 n o 含量采用1 0 胃黏膜组织的匀浆上清。分别设定空白管、标准管、测定管， 首先向空白管中加入o 5m l 双蒸水和0 4m l 混合试剂，向标准管中加入0 4m l 双 蒸水、0 1m l 标准应用液、0 4m l 混合试剂，向测定管中加入0 5m l 样本、0 4m l 混合试剂，于漩涡混匀器上充分混匀，3 7 。c 恒温水浴6 0m i n ，然后分别向每管加 入试剂三o 2m l 和试剂四o 1m l ，充分涡旋混匀3 0s ，室温静置4 0m i n ，以4 0 0 0 转分离心1 0r a i n ，取上清0 8m i ，并加入0 6m l 显色剂，混匀，室温静置1 0m i n ， 于5 5 0r l m 处，测各管吸光度值。 2 5 6m p o 活性测定 m p o 活性采用1 0 胃黏膜组织的匀浆上清。分别设定试剂空白、对照管、测 定管，首先向试剂空白管中加入0 2m l 双蒸水、0 2m i 试剂四、3m l 显色剂，向对 照管中加入3m l 双蒸水、o 2m l 样本、0 2m l 试剂四，向测定管中加入o 2m l 样 本、0 2m l 试剂四、3m l 样本，充分涡旋混匀，3 7 恒温水浴3 0m i n ，然后分别向 每个管中加入o 0 5m l 试剂七，混匀，6 0 恒温水浴1 0r a i n ，于4 6 0l l m 处，测各 管吸光度值。 2 6 胃壁黏液测定 按b o l t o n 2 2 1 的阿利新蓝法测定胃壁结合黏液。大鼠缺血再灌注后，取胃，沿 胃大弯剪开后将胃黏膜外翻，浸入阿利新蓝中宦温放置2h 将胃取出，染液离心后， 1 5 徐州医学院硕士学位论文 取上清液在6 5 0 眦波长处比色，计算染料结合量。 2 7 蛋白提取 按照裂解液( r i p a ) ：蛋白酶抑制剂( p m s f ) = 1 0 0 ：1 配置匀浆液，配好的匀浆液 ( m 1 ) ：组织重量( g ) 1 0 ：1 ，在冰浴中匀浆，匀浆液于1 2 0 0 0 转分、4 离心1 5m i n 后取上清，采用b c a 法进行蛋白浓度测定 2 3 1 。 2 8 免疫印迹法测定i n o s 、n n o s 和e n o s 蛋白的表达 ( 1 ) 将已制备的蛋白提取液各取l o 山测其蛋白浓度后，将各样品用匀浆液稀释至 相同浓度，加入1 3 体积的4 蛋白处理液，9 5 1 0 0 。c 水浴变性1 0m i n ，成为加 样液； ( 2 ) 装配凝胶板：将2 块胶版( 玻璃板) 对齐，在水平桌面上固定于夹板中加紧，务 必使底面平齐( 以防漏胶) ，垫上胶垫，将夹板垂直固定在胶架上，以备灌胶； ( 3 ) 配胶：先配分离胶( 1 2 5 ) ，按试剂盒说明书配方进行，一般一块胶所需7m l 左右： ( 4 ) 上分离胶：立即用吸管沿玻璃板壁使胶均匀缓慢留下，避免形成气泡，灌至黑 灰线交界处水平，留出浓缩胶所需空间，然后在分离胶表面加双蒸水水封( 防止 空气中的氧氧化分离胶) ，加时也应该沿玻璃板壁均匀缓慢留下，速度过快会破 坏分离胶的形状。凝胶时间在1 5 2 0r a i n ，待看到水与分离胶之间出现一条折线 时，表明胶已凝固。倒掉上层封水，并用滤纸吸干； ( 5 ) 配浓缩胶( 5 ) ：按试剂盒说明书配方进行，一般一块板所需胶4m l 左右： ( 6 ) 上浓缩胶：同样方法将浓缩胶加于分离胶上，至胶板顶端约1 - 2m m 处，迅速 插梳，将梳子垂直插入浓缩胶内，避免形成气泡。如有气泡，迅速重插，待浓 缩胶凝固后，两手同时拿住梳子轻轻拔出( 避免损坏上样孔) ； ( 7 ) 将其放入电泳槽中( 半开状态) ，倒上电泳液，内槽倒满，外槽超过电极丝，用 吸管吸去内槽内的气泡( 以免影响上样观察) ，并吹开每个上样孔； ( 8 ) 上样与电泳：用小枪头( 1 0 山) 吸取样品，避免样品外溢，不同样品更换枪头， 以免交叉污染。第- - ：f l 与最后一孔上阴性对照( 蒸馏水：上样缓冲液= 3 ：1 ) 。中 1 6 徐州医学院硕士学位论丈 间各孔可上等量蛋白样品( 1 0 0g g l a n e ) 和m a r k e r ( 3r t l ) 。盖上电泳槽盖子开始电 泳( 看到电泳液中有上行的气泡说明已经开始电泳) ，恒压1 0 0v ，约两小时二十 分钟后溴酚蓝跑到胶板底部； ( 9 ) 裁膜：将厚滤纸及n c 膜裁制成8c m x 2c m 大小，将n c 膜一角切掉做好标记； ( 1 0 ) 裁胶与铺膜：根据m a r k e r 选取裁胶的范围，将胶切成8c m x 2e m 大小。铺膜 的顺序( 由下至上) ：黑壳、海绵、滤纸、胶、n c 膜、滤纸、海绵、红壳； ( 1 1 ) 转膜：黑内红外( 黑负红正) ，将转膜装置放入槽中，转膜装置盒内倒入转膜液 ( 淹没整个装置内部) 槽中加入冰水混合物。盖好盖子( 红对红，黑对黑) 以恒流 3 5 0m a ，转膜一小时二十分钟； 0 2 ) 封闭：将n c 膜取出，w a s h i n gb u f f e r 洗1 - 2m i n ，洗去n c 膜上的转膜液，然 后加封闭液封闭两小时； 注意：转膜后一定要注意膜的保湿，避免膜干燥，否则会出现较深的背景 0 3 ) 一抗孵育 a 将抗i n o s 和