（蔬菜学专业论文）番茄大花萼突变体mc基因分子标记及种质资源的筛选.pdf

i 呲y 1 嗽7 帆8 帆帆7 惴3 m l l l 0 矾 目录 中文摘要i 英文摘要i i i 1 弓i 言1 1 1 研究目的意义、研究内容、试验技术路线l 1 1 1 研究目的和意义1 1 1 2 研究内容1 1 1 3 试验技术路线1 1 2 文献综述2 1 2 1 花萼相关基因：2 1 2 2a f l p 和s s r 分子标记在蔬菜作物上的应用研究概况3 1 2 3 番茄分子标记研究进展l o 2 材料与方法1 3 2 1 主要仪器及试验试剂。1 3 2 1 1 主要仪器1 3 2 1 2 试验试剂1 3 2 2 供试材料：1 3 2 2 1 番茄材料1 3 2 2 2 生化试剂1 3 2 3 方法1 5 2 3 1 用于标记的群体构建1 5 2 3 2 番茄基因组d n a 的提取1 5 2 3 3 引物和接头的准备1 6 2 3 4a f l p 分子标记1 7 2 3 5s s r 分子标记2 0 2 3 6 连锁关系图2 1 2 3 7 番茄种质资源的筛选2 1 3 结果与分析。2 3 3 1 田间鉴定结果。2 3 3 2 番茄基因组d n a 的提取2 3 3 3a f l p 标记2 5 3 3 1a f l p 反应体系的优化2 5 3 3 2a f l p 引物筛选及f 2 单株p c r 2 7 3 4s s r 标记3 5 3 4 1s s r 反应体系的优化3 5 3 4 2s s r 引物筛选及f 2 单株p c r 3 6 东北农业大学农学硕士学位论文 3 5 连锁关系作图3 9 3 6 利用a f l p 标记进行种质资源筛选。3 9 3 6 1a f l p 引物扩增基因组d 心d a 3 9 3 6 2 种质资源筛选结果4 0 4 讨论4 2 4 1 分子标记技术的选择。4 2 4 。2 a f l p 体系的确定及试验中相关注意事项4 2 4 2 1 酶切连接4 2 4 2 2 预扩产物稀释倍数4 3 4 2 3 关于制胶4 3 4 2 4 银染与显影4 3 4 3m c 基因的分子标记4 3 4 4 工作展望4 4 5 结论4 5 5 1 遗传分析4 5 5 2 体系优化4 5 5 3 连锁分析。4 5 5 4 资源筛选。4 5 致谢：。4 6 参考文献4 7 附录5 l 攻读硕士期间发表的学术论文。6 2 c o n t e n t s c o n t e n t s c h i n e s ea b s t r a c t i e n g l i s ha b s t r a c t i l l 1i n t r o d u c t i o n 1 1 1p u r p o s ea n ds i g n i f i c a n c e , c o n t e n t s a n de x p e r i m e n tp l a no fr e s e a r c h 。l 1 1 1p u r p o s ea n ds i g n i f i c a n c eo f t h er e s e a r c h 1 1 1 2c o n t e n to f r e s e a r c h l 1 1 3e x p e r i m e n tp l a no f t h er e s e a r c h 1 1 2s u m m a r yo f d o c u m e n t 2 1 2 1g e n er e l a t e dt oc a l y x 2 1 2 2a f l p 锄ds s rm o l e c u l a rm a r k e r st e c h n i q u e sa n dt h e i ra p p l i c a t i o ni nv e g a t a b l e b r e e d i n g 3 1 2 3m o l e c u l a rm a r k e r sr e s e a r c hp r o g r e s so f t o m a t o 1 0 2m a t e r i a la n dm e t h o d s 1 3 2 1p r i m a r yi n s t r u m e n ta n de x p r i m e n tr e a g e n t 1 3 2 1 1p r i m a r yi n s t r u m e n t 1 3 2 1 2e x p r i m e n tr e a g e n t 13 2 2e x p e r i m e n tm a t e r i a l s 1 3 2 2 1 t o m a t om a t e d a l s 1 3 2 2 2e x p r i m e n tr e a g e n t 1 3 2 3e x p r i m e n tm e t h o d s 1 5 2 3 1c o n s t r u c t i o no f t o m a t op o p u l m i o nu s ef o rm a k e r 1 5 2 3 2e x t r a c t i o no f t o t a lg e n o m i cd n a 1 5 2 3 3p r e p a r a t i o no f t h ep r i m e r sa n da d a p t e r s 1 6 2 3 4a f l pm a r k e r s 1 7 2 3 5s s rm a r k e r s 2 0 2 3 6j 印o f l i n k a g e 。2 1 2 3 7s c r e e n i n go f t o m a t og e r m p l a s mr e s o u r c e 2 1 3r e s u l t sa n da n a l y s i s 2 3 ：；1t h er e s u l to f f i e l di d e n t i f i c a t i o n ：； 3 2e x t r a c t i o no f t o t a lg e n o m i ed n a 2 3 3 3a f l pm a r k e r s ：! ! ； 3 3 1o p t i m i z a t i o no f a f l pr e a c t i o ns y s t e m 2 5 3 3 2s c r e e n i n go f a f l pp r i m e r sa n dp c ra m p l i f i c a t i o no f f 2i n d i v i d u a lp l a n t s 2 7 ：；4s s rm a r k e r s ：；! ； 3 4 1o p t i m i z a t i o no fs s rr e a c t i o ns y g e m 3 5 东北农业大学农学硕士学位论文 3 4 2s c r e e n i n go fs s rp r i m e r sa n dp c r a m p l i f i c a t i o n o ff 2i n d i v i d u a lp l a n t s 3 6 3 5m a po fl i n k a g e 3 9 3 6s c r e e n i n go f t o m a t og e r m p l a s mr e s o u r c e sb ya f l p m a r k e r s 3 9 3 6 1a m p l i f i c a t i o no f g e n o m i cd n ab y a f l pp r i m e r s 3 9 3 6 2s c r e e n i n go f t o m a t og e r m p l a s mr e s o u r c e s 4 0 4d i s c u s s i o n 4 2 4 1s e l e c t i o no f m o l e c u l a rm a r k e rt e c h n i q u e s 4 2 4 2d e t e r m i n a t i o no f a f l ps y s t e ma n dc o n s i d e r a t i o n si nt h ee x p r i m e n t 4 2 4 2 1d i g e s t i o na n dl i g a t i o n 4 2 4 2 2d i l u t i o nt i m e so f p r e a m p l i f i c a t i o np r o d u c t i o n 4 3 4 2 3p r e p a r a t i o no f p am a s t i c 4 3 4 2 4s i l v e r - s t a i n i n ga n dd e v e l o p i n g 4 3 4 3m cg e n em o l e c u l a rm a r k e r s 4 3 4 4p r o s p e c to f t h er e s e a r c h 4 4 5c o n c l u s i o n 4 5 5 ig e n e t i ca n a l y s i s “4 5 5 2o p t i m i z a t i o no fs y s t e m 4 5 5 3l i n k a g ea n a l y s i s 4 5 5 4s c r e e n i n go fg e r m p l a s mr e s o u r c e s 4 5 a c k n o w l e d g e m e n t 4 6 r e f e r e n c e 4 7 a p p e n d i x 5 1 p u b l i s h e da r t i c l ed u r i n gs p e c i a l i z i n gt h ed e g r e eo fm a s t e r 6 2 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 洼! 翅遗查墓丝盏墓挂别直明的：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我- - 匾j - r 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 亍明确的说明并表示谢意。 学位敝储妣鸯镌嘞胁睥7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：鸯螗 日期：2 口，睥6 月f 7 日 导师签名：诌研丑嗍矽岛年6 月归 摘要 摘要 番茄是世界各国广泛种植的蔬菜作物之一，也是我国的主栽蔬菜之一。但随着市场的扩 展，消费者的增多，人们对番茄的品质要求也越来越高。 本研究采用a f l p 及s s r 标记，在d n a 水平上研究番茄大花萼基因，建立番茄a f l p 及s s r 分子标记技术体系，构建与番茄m c 基因紧密连锁的a f l p 及s s r 标记。并对4 8 份 种质资源进行筛选，以获得含有番茄m c 基因的种质资源。本实验主要研究成果如下： 1 分析了组合0 8 0 8 6 x 0 8 0 8 5 以及其有性杂交f l 、f 2 代分离群体的田间表现，并建立了 大小花萼混合池。鉴定结果表明：两个亲本间花萼性状表现差异明显，父本为0 8 0 8 5 ，母本 为0 8 0 8 6 ，f l 代为大花萼，f 2 代群体表现实际分离比为3 1 7 5 ：l ，x 2 检测符合3 ：1 的分离 比例。分析表明：父本0 8 0 8 5 所含的m c 基因所控制的性状是由显性单基因控制的性状。 2 筛出4 个与番茄m c 基因紧密连锁的标记，其中3 个a f l p 标记e 3 2 m 3 6 d 、e 6 5 m 6 3 - d 和e 4 7 m 7 5 - a ，与m c 基因的连锁距离分别为7 2 c m 、5 1 e m 、1 2 3 c m ；一个s s r 标记s s r l 6 2 ， 与m c 基因的连锁距离为1 0 9 c m 。 3 应用获得的a f l p 标记e 6 5 m 6 3 d ，以4 8 份种质资源为试验材料，结合田间鉴定， 进行a f l p 标记的检测，结果表明，二者结果高度吻合，这一结果为分子育种及进一步的基 因克隆奠定了基础。 关键词番茄；m c 基因；分子标记；种质资源 a b s t r a c t i d e n t i f i c a t i o no fss ra n da f l pm a r k e r sl i n k e dt o m a c r o c a l y x l o c u s i nt o m a t oa n dsc r e e no f j 一 、 i d e r m p l a s mk e s o u r c e s a bs t r a c t t o m a t oi so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tv e g e t a b l e s ，a l s oo n eo ft h ec h i e fc u l t i v a t e dv e g e t a b l e si n c h i n a h o w e v e r , w i t ht h ee x p a n s i o no ft h em a r k e t ，t h ei n c r e a s i n go fc o n s u m e r s ，t h er e q u i r e m e n t so f t h et o m a t o sq u a l i t ya r ei n c r e a s i n g t h i ss t u d yu s e sa f l pa n ds s rm a r kt os t u d yt h em a c r oc a l y xo ft h et o m a t og e n e s ，a n d e s t a b l i s ht h em o l e c u l a rm a r k e r ss y s t e m so fa f l pa n ds s r , c o n s t r u e tt h ea f l pa n ds s rm a r k e r s w h i c hi s t i g h t l y l i n k e dw i t hm cg e n eo ft o m a t o 4 8g e r m p l a s mr e s o u r c e sa r es c r e e n e df o r c o n t a i n i n gt h em cg e n e i nt h i ss t u d y , k e yf i n d i i l g sa r e a sf o l l o w s ： 1 a n a y l s et h ef i e l dp e r f o r m a n c e o f0 8 0 8 6 x 0 8 0 8 5 ，s e x u a l h y b r i d i z a t i o n a n ds e g r e g a t i n g p o p u l a t i o n ，a n de s t a b l i s ht h em i x e dp o o lo fb i ga n ds m a l lc a l y x 1 1 1 er e s u l t ss h o wt h a t ：d i f f e r e n c e s b e t w e e nt w op a r e n t a lt r a i t sa r es i g n i f i c a n t l y , m a l ep a r e n ti s0 8 0 8 5 ，f e m a l ep a r e n ti s0 8 0 8 6 ，g e n e r a t i o n f li sb i gc a l y x , t h ep e r f o r m a n c eo f t h ea c t u a ls e g r e g a t i o nr a t i of o rt h eg e n e r a t i o nf 2i s3 1 7 5 ：1 ，x 2 t e s ti nl i n ew i t ha3 ：1 s e g r e g a t i o nr a t i o a n a l y s es h o wt h a t ：t r a i t sd o m i n a t e di nt h em a l ep a r e n ti s c o n t r o l l e db yas i n g l eg e n e 2 s c r e e no u tf o u rm a r k e r sw h i c ht i g h t l yl i n k e dt om cg e n eo ft o m a t o ，a m o n gt h e mt h e r ea r e t h r e ea f l pm a r k e r se 3 2 m 3 6 一d ，e 6 5 m 6 3 - da n de 4 7 m 7 5 - a ，l i n k a g ed i s t a n c ei s7 2 c m ，5 1 c ma n d 1 2 3 c m ，o n es s rm a r k e rs s r l 6 2 ，l i n k a g ed i s t a n c ei s1 0 9 c m 3 a p p l i c a t i o n t h eo b t a i n e da f l pm a r k e re 6 5 m 6 3 一d ，u s e4 8g e r m p l a s mr e s o u r c e sa s e x p e r i m e n t a lm a t e r i a lt od e t e c tt h ea f l pm a r k e r s ，t h er e s u l t ss h o wah i 曲d e g r e eo ff i t ，t h i sr e s u l t s m a k eaf o u n d a t i o nf o rm o l e c u l a rb r e e d i n ga n dg e n ec l o n i n g k e yw o r d st o m a t o ；m cg e n e ；m o l e c u l a rm a r k e r ；g e r m p l a s mr e s o u r c e s i i i c a n d i d a t e ：l ix i a o l e i s p e c i a l t y ：o l e r i c u i t u r e s u p e r v i s o r ：x u x i a n g y a n g 引言 1 引言 1 1 研究目的意义、研究内容、试验技术路线 1 1 1 研究目的和意义 番茄( l y c o p e r s i c o n e s c u l e n t u m ，m i l l ) 是茄科( s o l a n a c e a e ) 番茄属( l y c o p e r s i c o n ) 的 一年生或多年生植物，原产于南美西部高原地带。它是世界各国广泛种植的蔬菜作物之一， 具有较强的适应性，广泛分布于世界各地，被列为全世界产量最高的3 0 种农作物之一。据联 合国粮农组织统计，1 9 9 7 年全世界番茄栽培面积为3 0 9 4 万h m 2 ，总产量为8 4 8 7 3 万吨。据 农业部统计，2 0 0 1 年我国番茄栽培面积达到了1 0 0 万h m 2 。位居亚洲首位，世界第二。番茄 的产量高，风味独特，营养丰富，富含维生素类和糖类，含有的色素类物质番茄红素和胡萝 卜素具有抗氧化的功能，具有预防紫外线辐射和癌症的保健疗效，既可生食又可作加工之用， 同时又具有特殊的医用价值，在当今世界人们饮食结构中占有非常重要的地位，因而吸引着 越来越多的消费者。但随着市场的扩展，消费者的增多，人们对番茄的品质要求也越来越高。 不但要求营养方面的相关品质，更多的注重番茄的外观品质，如果实的光泽度、果皮颜色等。 本实验主要研究与其外观品质密切相关的花萼性状，采用a f l p 及s s r 分子标记方法在d n a 水平上研究番茄大花萼基因，建立番茄a f l p 及s s r 分子标记技术体系，构建与番茄m c 基 因紧密连锁的a f l p 及s s r 标记。为分子标记辅助选择育种打下基础，为培育番茄大花萼的 品种提供理论和技术上的支持。 1 1 2 研究内容 首先，播种试验用的亲本，利用正常花萼品种和大花萼的品种杂交构建标记f 2 代群体。 其次，利用a f l p 和s s r 两种分子标记方法对亲本进行筛选，获得与大花萼基因连锁的标记， 利用所获得的连锁标记对种质资源进行筛选，同时对这些需要鉴定的种质资源进行田间调查， 比较二者的吻合率，确定标记的准确性。为番茄大花萼的育种提供一定的理论依据，以此加 快育种进程。 1 1 3 试验技术路线 臣困 上杂交 东北农业大学农学硕士学位论文 1 2 文献综述 1 2 1 花萼相关基因 区巫望习卣 2 0 0 2 年，v r e b a l o v 等发现番茄中的1 个m a d s b o x 基因与果实的成熟密切相关。 v r e b a l o v 等发现如果番茄中r i p e n i n g - i n h i b i t o r ( r n ) 位点发生突变，番茄果实不能成熟， 而且会出现萼片变大的现象。用外源乙烯处理这些突变体植株的果实后，果实也不成熟，但 会诱导一些对乙烯反应的基因来维持果实中的乙烯水平。通过定位克隆发现r i n 位点上存在2 个串联的m a d s 盒基因，分别定名为l e m a d s - r n 和l e m a d s - m c ，前者调控果实成熟过 程而后者影响萼片先育和花序决定性。这2 个基因的功能通过正义转化t i n 番茄和反义转化 野生番茄得到鉴定。在野生番茄中，l e m a d s - r n 和l e m a d s 吐纪在染色体上串联排列，分 别编码2 4 2 和2 4 4 个氨基酸，编码区相隔2 6 k b ，l e m a d s 吼形在萼片、花瓣和心皮中表达， 而l e m a d s - r n 则主要在果实中表达，并随果实成熟而表达增强。在砌突变体中，这2 个 记忆之间的区域发生缺失突变，形成了嵌合基因，编码的蛋白质由l e m a d s - r n 蛋白的钱 2 1 5 个氨基酸嵌合而成。在l e m a d s - r n 基因的启动子指导下，表达出嵌合m r n a ，该r n a 在萼片、花瓣和心皮中均不表达( 与野生型番茄不同) ，而在果实中随果实成熟而表达丰度提 2 引言 高( 与野生型番茄一致) ，通过该实验表明某些m a d s b o x 基因在植物中还可起调控果实成 熟的作用。( v r e b a l o ve t a l ，2 0 0 2 ) 在百合中，转l f m a s d l 反义基因植株中l 朵花的雄蕊极短、花药缺失；转l f m a s d l 正 义基因植株中发现1 个花萼变瓣的突变体。在转l f m a s d 3 反义基因植株中发现1 个植株的苞 叶部分瓣化，花柄变短。( 赵印泉等，2 0 0 7 ) 1 2 2 a f l p 和s s r 分子标记技术在蔬菜作物上的应用研究概况 1 2 2 1 分子标记技术 标记技术有很多种，主要可以分两类：一是对基因的间接反映，即包括描述生物外部特 性特征的传统形态学标记( m o r p h o l o g i c a lm a r k e r s ) ，研究染色体核型和带型的细胞标记 ( c y t o l o g i c a lm a r k e r s ) 及体现生物生化特征特性的生化标记( b i o c h e m i c a lm a r k e r s ) ，这三种标 记都是基因表达得的结果，标记数目有限，多态性较差，易受环境的影响，不能满足种质资 源鉴定和育种工作的进行。二是对d n a 水平遗传变异的直接反映，即d n a 分子标记 ( m o l e c u l a rm a r k e r s ) ，这种标记能够反映生物个体或种群基因组中某种差异特征的d n a 片段， 它具有不受生育期、环境和基因表达与否的限制，数量极多，遍及整个基因组，多态性高， 遗传稳定的特点。目前研究的热点已转移到应用d n a 分子标记上来，利用分子标记技术的 方法很多，依据所用的分子生物学技术，大致可以分为两大类：以p c r 为基础和以s o u t h e r n 杂交为基础。 目前应用的方法主要有简单序列重复( s s r ，s i m p l es e q u e n c er e p e a t ) 、单引物扩增反应 ( s p a r ，s i n g l ep r i m e ra m p l i c a t i o nr e a c t i o n ) 、单链形态多态性( s s c p ，s i n g l es t r a n d c o n f o r m a t i o n a lp o l y m o r p h i s m ) 、简单序列重复间扩增( i s s r ，i n t e r - s i m p l es e q u e n c e or e p e a t s p o l y m o r p h i s m ) 、任意引物p c r ( a p p c r ，a t h i t r a r i l y p r i m e dp c 鼬、随机扩增多态性 d n a ( r a p d ，r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) 、r a p d 变性梯度凝胶电泳( r a p d - d g g e ， d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s e s ) 、d n a 扩增指纹( d a f ，d n aa m p l i f i e df i n g e r p r i n i i n g ) 、 扩增片段长度多态性( a f l p ，a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 、序列特异性扩增区 ( s c a r ，s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n ) 、序标位( s t s ，s e q u e n c et a g g e ds i t e ) 、割裂 扩增多态性序列( c a p s ，c l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i cs e q u e n c e ) 、特异扩增多态性( s a p ， s p e c i f i e da m p l i c a t i o np o l y m o r p h i s m ) ，以上的方法都是以p c r 为基础的分子标记技术。较普 遍应用的分子标记有a f l p 、r f l p 、r a p d 、s s r 等标记。作为第一代分子标记技术的r f l p 结果稳定可靠，重复性好，适应于建立遗传连锁图，但检测出的灵敏度不高，不适应于目前 对d n a 分析精度越来越高的要求；r a p d 为第二代分子标记，其技术简便易行，灵敏度高， 但在不同实验条件、设备及操作的情况下得到的实验结果差异很大。a f l p 为第三代分子标 记，a f l p 技术集r f l p 和r a p d 的优点于一身的同时克服了二者的缺点，是近年来发展起 来的最具生命力的分子生物学技术，也是分子标记的重大突破。 3 东北农业大学农学硕! ：学位论文 表1 1 不同分子标记技术的比较 t a b 1 - 1c o m p a r a t i o no fd i f f e r e n tm o l e c u l a r - m a r k e r 1 扩增性片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) a f l p 技术原理即用限制性内切酶消化d n a ，使所产生的限制性片段两端在t 4 d n a 连 接酶作用下与特定的己知序列的双链接头( d o u b l es t r a n da d a p t e r s ) 连接产生模板d n a ，人工合 成的引物由与接头核心序列及与接头毗邻的酶切末端相互补的d n a 序列再加上3 端1 - 3 个 选择性碱基组成，因此只有那些在两个酶切末端内侧具有与选择i 生核苷酸互补碱基的限制性 片段才能被引物识别与扩增。扩增产物通过变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分离，经荧光、硝酸银 染色或放射性自显影分析，揭示出被扩增基因组相应区域的d n a 多态性。a f l p 被认为是迄 今为止最有效的分子标记方法，可以揭示出大量的多态性带，结果稳定，重复性好。a f l p 自身的特点有：1 ) 检测不受环境、季节和时间以及组织部位和发育阶段的影响，可以在植株 的早期鉴定和预测；2 ) 可以对无任何分子生物学研究基础的物种进行研究，不需要知道基因 组d n a 的序列就可构建其指纹图谱；3 ) d n a 用量少、反映灵敏、快速高效，适合于大规 模样品的研究：4 ) a f l p 指纹图谱多态性丰富，绝大部分显性标记，但也有一小部分为共显 性标记，能检测整个基因组的遗传变异；5 ) 带形稳定，重复性好，结果可靠。 与现有标记技术相比，a f l p 的优越性主要有：1 ) 与r f l p 相比，a f l p 是基于p c r 的分 子标记技术，它只需要少量的模板d n a 且无需s o u t h e m 杂交；2 ) 与r a p d 相比，a f l p 的引 物为1 6 2 0 个核苷酸组成，较r a p d ( 只有1 0 个核苷酸) 多，其可靠性和重复性更高；3 ) 与s s r 相比，s s r 设计引物时需构建e d n a 文库，并进行大量的测序，成本昂贵，a f l p 则 无需预先知道模板d n a 的序列，因此不受基因组来源和复杂度的影响，也没有种属特异性； 4 ) a f l p 分辨率高、多态性水平高、检测位点多，每个反应可以检测的位点多达5 0 - - 1 0 0 个； 5 ) 具有显性和共显性的特点；6 ) 易于标准化和自动化，适合大批量样品分析；7 ) 理论上a f l p 4 引言 可以产生的标记数目是无限的，可用于构建基因组高密度的连锁图谱。此外，a f l p 还应用 于作物优势群的划分( 吴敏生等，2 0 0 0 ) 、对杂种优势进行遗传学因素的研究( c h a r l e s 等，1 9 9 2 ) 和预测杂种产量( 吴敏生等，2 0 0 0 ) 。尽管a f l p 标记技术具有上述诸多优点，也存在一些缺 点：1 ) a f l p 技术过程复杂，基因标记的获得程序复杂，成本较高；2 ) a f l p 分析中需要同位 素或非同位素标记引物的程序，就必须要配备有放射性同位素操作过程中特殊的防护措施以 及配套的仪器设备；3 ) a f l p 标记技术对操作人员的技术水平要求高，在一般实验室开展此 项技术尚存在一定困难；4 ) 扩增时有假阳性结果和假阴性结果出现，以及凝胶背景杂乱等。 上述问题在实际操作中，主要通过简化操作步骤来解决，如酶切与连接两步一次反应完成。 目前a f l p 在商业上应用还受到很大的限制，但随着a f l p 技术的不断改进，a f l p 技术将 有更广阔的应用前景。 2 随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i ed n a ，r a p d ) 该技术由w i l l i a m s 等在1 9 9 0 年提出。r a p d 的原理是根据p c r ( 聚合酶链式反应) 技术， 以基因组d n a 为模板，利用人工合成的一定序列的短d n a 片段为引物与模板d n a 杂交， 通过d n a 聚合酶在特定的反应程序下，引物结合位点间的模板d n a 单链片段。获得的多态 性标记数量与d n a 模板的长度和引物的长度有关，随机序列引物的设计应考虑到研究的 d n a 模板的大小，p c r 过程的引物长度一般是1 0 个碱基左右。在实验中可选择多套不同引 物以获得与目的基因相关的多态性片段，为减少筛选引物的花费可充分利用前人使用的引物 序列。扩增后的产物在聚丙烯酞胺凝胶上电泳，溴乙啶染色观察。 3 限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) r f l p 的原理是利用限制性内切酶对d n a 作用位点特定回文顺序识别的专一性，将大片 段的d n a 分子降解为较小的片段。等位基因的差异在酶切位点间的d n a 片段的长度、碱基 序列等差异通过电泳分离酶解产物表现出来。对于大分子d n a 片段还需要通过s o u t h e r n b l o t 、放射性标记探针杂交、放射性自显影等步骤才能观察到。在应用时，通过