（森林培育专业论文）酵母盐胁迫应答基因的克隆及表达分析.pdf

摘要 日懿严重的土壤盐渍化使通过遗传工程手段提商植物的耐盐性成为未来环境 霹袭鼗浚震霉嚣遥蓊筑先籍凌酌凌题。遥去抟掰究工 管在蓥定移分离一些在穗耪薅 盐过程中有潜力的基因方面取得了显著的进展。为了了解盐胁迫应答反应的分子基 獭，势寒搦关键靛辩薤基瑗，奉磷究竟黧了盐诱器簿霉e s t s 秘簿母瓣簸基蠢h a l l ， 弗对其凝达进行了分析。 戮鲁氏酵母蘧( z g o c c h a r o m y c e s r o f f x i i ) 赘椽a s 2 。i 8 1 为实验材料，瑷簸骆遭 处理的鹊氏酵母细胞和未经胁迫处理的酵母细胞构建了抑制性消减杂交文摩。运用 耱毫效熬鞋p c r 蔽零为基础酾c d n a 清减杂交方法构建了铸氏酵母酌盐胁迫应 铃差异袭达e s t s 文库。随机挑取c d n a 克隆进行了测序分栅和序列同源性比较。 程掰分辑鼹痔列中我裂部分穿剜与数掭库孛叠知的穿猁有丽源性，其中部分序列与 融知序列同源性较高，相应的融知序列与耐盐有关。其余回源性较低的序列以及程 数据痒申麓已籍浮弼没脊任旃礴源往酌序鳓可麓是与辩盐福关的新序弼 本研究还从酿酒酵母菌菌株a s 2 3 7 5 中克隆了酿溜酵母h a l l 基照。h a l l 基 灏是簿蹲中重要瓣耐盐纂霹。戳农秆蓠介导韵时圆盘法将h a l l 基闲转仡烟草植 株a 筛选刮的转删三j 基因转化煅革植椿的耐盐性明显态予对照。通过比较转投旺! 纂因龋鼙 壹株与转萁它澍盐基谶烟草植株的耐赭性，发现转赫犯j 基溺烟草稹株的 耐盐性虽然明显离于对照，但却低于表达渗透调节裁会成酶基缀的转懿困援株。结 聚表弱，单独转祀h a l l 基因对烟草植株耐盐德的提高是有限的。h a l l 基因可被 渗透胁追诱导表达对n 矿离子舶搀起重要 乍熙，但对渗透胁迫却无辩瞧，困藤转纯 h a l l 基弱的烟荜植株对盐性的提高是肖限的。渗透胁迫和离予胁迫艇盐胁遗是不 w 忽视的豫个重要方蘑，默髭珏? 基因秘耐渗透胁追基因的复合基因转纯簧路极毒 希望使转纂困植物的耐魏性得到大幅度握高。 关键谣；辩母；瓣盐；斑答；綦因竞隆；搀铡瞧渣壤杂交； a b s t r a c t t h ep r o g r e s s i v es a l i n i z a t i o no fs o i l h a sm a d et h e g e n e t i ci m p r o v e m e n to fs a l t t o l e r a n c ea l l u r g e n tp r i o r i t yf o rt h ef u t u r eo fe n v i r o n m e n ta n da g r i c u l t u r e i nt h el a s t f e wy e a r ss i g n i f i c a n ta d v a n c e sh a v eb e e nm a d ei n t h ei d e n t i f i c a t i o na n di s o l a t i o no f s e v e r a lg e n e st h a tc o u l dp o t e n t i a l l yb ei n v o l v e di nt h ep r o c e s so fs a l tt o l e r a n c e s a l t s t r e s sa d v e r s e l ya f f e c t st h eg r o w t ho fp l a n t sa n dm i c r o o r g a n i s m ，t ou n d e r s t a n dt h e m o l e c u l a rb a s i so fs a l t s t r e s sr e s p o n s ea n di s o l a t i o nt h ek e ys a l tt o l e r a n tg e n e ，t h e s a l t i n d u c e de s t sa n ds a l tt o l e r a n tg e n eh a l li ny e a s tw e r ec l o n e da n dt h e i re x p r e s s i o n w e r ea n a l y z e d s u p p r e s s i v es u b s t r a c t e dh y b r i d i z a t i o ne d n al i b r a r yw a sc o n s t r u c t e de m p l o y i n g s p e c i f i c n a c l 一s t r e s s e dc e l l sa n dn o n s t r e s s e dc e l l s f r o m y e a s t s t r a i n ( z y g o s a c c h a r o m y c e s r o u x i i2 18 1 ) 。a ne f f i c i e n tp c r b a s e de d n as u b s t r a c t i o n m e t h o dw a se m p l o y e df o rt h ei s o l a t i o no ft h es a l t s t r e s s e d r e s p o n s i v ee s t s c l o n e s w e r ei s o l a t e dr a n d o m l ya n ds e q u e n c e d ，t h er e s u l t so f s e q u e c ea n a l y s i sa n dh o m o l o g y c o m p a r a t i o ns h o w e dt h a ts o m ec l o n e sw e r eh o m o l o g o u st og e n e st h a th a v ee a r l i e rb e e n i m p l i c a t e di ns t r e s sr e s p o n s e ，o t h e rc l o n e sw e r en o v e lw i t hr e s p e c tt ot h e i rf u n c t i o na n d s h o w e dl o w e ro rn oh o m o l o g yt os e q u e n c e si nt h ep u b l i cd a t a b a s e s e q u e n c e so f p a r t s o ft h ec l o n e de s t si nt h i sr e s e a r c ha r en e w s e q u e n c e s i nz y g o s a c c h a r o m y c e s ，r o u x i i 。 as a l tt o l e r a n tg e n eh a l li d e n t i f i e df i r s ti ny e a s tb yg a x i o lw a sa l s oi s o l a t e di n t h i sr e s e a r c hf r o mad i f f e r e n ts t r a i no f s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e h a l ti sa ni m p o r t a n t s a l tt o l e r a n t g e n ei ny e a s t h a l lg e n ew a st r a n s f o r m e di n t o t o b a c c op l a n t sa n dt h e s c r e e n e dt r a n s g e n i cp l a n t ss h o w e di m p r o v e ds a l tt o l e r a n c et h a nt h ec o n t r o lp l a n t s t h e s a l tt o l e r a n c eo ft o b a c c op l a n t st r a n s f o r m e dw i t hh a l lg e n ew a sc o m p a r e dw i t ht h e t r a n s g e n i c t o b a c c op l a n t sw i t ho t h e rs a l tt o l e r a n t g e n e t h er e s u l t s s h o w e dt h a t a l t h o u g ht h es a l t t o l e r a n c eo ft r a n s g e n i ct o b a c c op l a n t sw i t hh a l lg e n ew a sh i g h e r t h a nt h a to ft h ec o n t r o lp l a n t s ，i tw a sl o w e rt h a nt h es a l tt o l e r a n c eo f t r a n s g e n i ct o b a c c o p l a n t sw i t he x g e n o u sg e n ee n c o d i n gt h ee n z y m ec o n t r o l l i n gt h es y n t h e s i so fo s m o l y t e s o s m o - s t r e s sa n di o ns t r e s sa r et h et w oi m p o r t a n tr e s p e c t si ns a l ts t r e s s ，w h i c hc o u l d n t b ei g n o r e d h a l lg e n ec a nb ei n d u c e db yo s m o - s t r e s sa n dp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei n t h ee f f l u xo fn a + ，b u ti th a sn ot o l e r a n c e t ot h eo s m o s t r e s s t h e r e f o r et h e i m p r o v e m e n to ft h es a l t t o l e r a n c ei n t r a n s g e n i cp l a n t s w i t hh a l li sl i m i t e d ，t h e c o - t r a n s f o r m a t i o nw i t hh a l la n ds a l tt o l e r a n t g e n ec o n t r o l l i n g t h e s y n t h e s i s o f o s m o l y t e s c a nb ee x p e c t e dt oi m p r o v et h es a l tt o l e r a n c eo f t r a n s g e n i cp l a n t sg r e a t l y k e yw o r d s ：y e a s t ，s a l tt o l e r a n t lr e s p o n s i v e ，g e n ec l o n i n g ，s u p p r e s s i v es u b s t r a c i o n h y b r i d i z a t i o n 酵母盐胁遗痰替熬黢浆竞隧投袭达舞辑 1 懿蠢 簸碱黟凌怒静缀大懿生态灏予，憋溶上暖海洋为我裘麴零舔麓碱琢虢占了 媳球恿箍瑕蕊7 l ，金世赛蕊：终矗虢媳藤积黔l ，3 。我莺魏毒t 5 亿多宦蒜黪簸 瀵媲，箕中现代盐渍士约5 6 亿亩，残余赫渍土鳓6 7 亿落，其他潜在盐滚约 2 6 钇露，囊豢分蠢在出东、滔戆、零北、巍鞭、懿+ 辩等沿海投予旱鞠半于晕逑隧。 其中海岸、滩涂达l 亿移亩。圆此，盐碱地怒巨大的潜在资源。土壤盐渍化是影响 农效擞产鄹黧态繇壤敢一个耋要鼹索，俸翰产爨受镪壤釜游适鹣投太影响。隧麓 工渡浮袋的加劁，灌溉农业的发展以及化照使粥的不巍，次生簸渍化的土地酾梭矮 在继续扩大。奁人霹不辑增热，瓣遮秘憝躐少鞠浚承资源严嚣不是赡严霪溱力下， 如褥利蹋帮搿缴我国上己亩盐渡化壤、蔬溪纯地鹈丰富的箴水资源发展农渡敬 普黧恣繇壤，成了遣翅饶先瓣决瓣重大谍磁。 缳德楚溅蟪是扩大瓣建瑟颧，邋一步笈溪农鼗生产、竣罄生态繇凌豹瀵要揍 藏，漆戆入翻麸生兹改藏露壤蒗嶷薄令方瑟徽了大餐工穆，送学了漤落鹣搽絷。 隧翦融缀取褥了一定的生态效蘸和经济效熬。士壤改怒主要依簸予工糕撼施敬良土 壤，魏淡拳疆簸，挖逮辩薤，弓| 焚羧淤，筑滠黪 蠹，嫱替接黧麓。这楚工程滚滚投 资大、觅效少、难以推广，又不熊解决根本问题。蹦此，人们掇生物敬良作为盐碱 媳绿稼靛突酸锶，逶过簧统杂交蠢瓣，海求灌溉簿选鬻耱、缀缀潦葬及缨黪壤养爨 选抗赦品种，以获通过基因工程手段培养能在靛碱地上商产的作物品糟。培霄耐早、 醚簸佟黪菇釉建溅媛盐碱避帮予举鳃静一条经济稀脊效戆途径。低等凑骏室物辩褥 稍离镣棱物耐熊枫制的骈究与生物技术酌强臻完善，为培育高效耐盐横物葵定了壑 癸瓣麓磷。 臻冀棱模式垒耪熬母戆麟盐掇测醋究避袋 逶艘锻瓣辩环境盼变纯对缎您堂枣来滋怒至关漾瑟黪，攀缨艨生躲如势骥黪 簿髓攘缨飚辨繇浚静极鞴交纯下邂速遗波，戳就袋魏研究盐胁迫的方便模式系统 ( 1 l 。酿酒黪母的熬因组测序工作霸予1 9 9 6 零完成，舆露全部剪测用的基因组序列。 裰忿，淡簿繇耱撵走研究材辩爨裔缀丈静餐潮。激灌释霉筑篓露蕴中存在5 8 8 5 个 可编碣蛋岛镁的旗因，印基因缎内毒豹7 0 贻廖剐怒可读框( o r f s ) 水】。n e l s o n 慧 ( 1 9 9 8 ) 懿磺究液辨，酸溪黪鸯基黢缀中鞠蠢2 0 0 多个蒸透与瓣盐窍关 挪。齑渗透瞧 静油促分裂暇激酶h o g w m a p k ( h i g h - o s m o l a r i t yg l y c e r o lm i t o g e n a c t i v i t e dp r o t e i n l 东j 8 棒业大学媾士学位论文 k i n a s e ) 倍母途径【4 1 和依赖于c a + c a m 的钙调磷酸酶c a n 信号途径嘲谯酵母适应高 渗透魏遗翡盐胁遮麓嵇号簧嚣途弪中超主要佟躅。避羚，舔膝一磷虽窦激酶 r a s - c a m pp k a ( c a m p d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s ea ) 信号途径f 6 】、雷帕酶素靶分子 t o r ( t a r g e to f r a p a 糟y e i n ) 傣号途径1 电程盐胁遥中起耋要箨嚣。 l ，1 。l外器盐信器的传尝途径 盐胁迫对酵母细胞的毒害作用包描两方馘，方蕊是产生离子港密，张细胞 蠹辍黍其商毒害撵怒静n 矿，买方瑟慰产生渗透耪追，霞凌艇豹跨貘渗透压辩低 而导致细胞膨压的丧失【”。盐胁迫下酵母细胞主要通过n a + 的外流、n a + 在囊泡中 黪嚣隔豫、堰热矮貘1 0 鼢暖投隈麓n 矿筋蔽蔽、镶节耩容往渗灞裁藕渗透保护帮 的合成和积累，以及胁迫擞白的袭达对盐胁迫产生应答。其结卷是积累髓油和恢复 黪压p 疆l 。酵鸯瓣鼗耱遗藏答霆邋过死种不同静信号健褥途径转递豹。 l 1 。1 。1h o g 餐弩途径 在酵坶中h o g 途径寅蕊祧渗透感受器，分别出s l n i 秘s h 0 1 基因编璐，存 崔予质簇巾。s l n i ，s s k l 。s s k 2 s s k 2 2 p b s 2 一h o g i 途径的渗透胁迫信号由飘， 被s l n l p 感受t 然熙从y p d l ps s k t ps s k 2 2 2 p ( m a p 激瓣激酶激酶) p b s 2 p ( m a p 激酶激酶) 传递，簸后传递给h o g l p ( m a p 激酶) 。s h o i p b s 2 h o g l 途径是由$ h o l p 通j 遘s t e il p ( m a p 激酶激酶激黪) 襄p b s 2 p 谖节h o g l p 4 9 t 0 1 。h o g t p 懿激活擒壤 了早期的敖胁迫碰答，被激活的h o g l p 直接或间接地增强调节因子的转录活性， 激活或抑制应答基因转录，逶过转录因子m s n 2 p 蠢m s n 4 p 结合妥胁涟盛答嚣咎 s t r e 上健胁迫信号放大。用基因组芯片对盐胁迫下酵母基因的转录应替分析袭明 对簸胁追强烈应替戆大多数基毽都是毫瘦或完全猿毂予m a p 激酶h o g l p 。嚣憩， h o g 信号途径在艋胁迫下基因组范围内的基因调节中起关键作用叫4 1 。 1 1 1 2c a n 羡弩途轻 、 c a n 绥号途经盘钙遴寨，钙诞磷酸酶溪慧甄薹c n b 窝穰往受蒸踩a 窝 锌揩转录激活因子c r z l t c n l h a l 8 p 组成。主要跗离子环境的胁迫产生成答f 引。盐 翳逑下c a n 鞋嚣攀方式参与酵母懿n a + 努镶，一方蘑毫浓度翁n a + 逶遵鬻羲滚滚壤 上的v c x l h + c a 2 + 突换蛋自，增加细胞内的c a ”，高浓度的细胞内c a 2 + 通过结合 裂链溪素豹调节耍蒸主激滏锈调磷酸酶嘲。c a n 楚蔹赖于c a 2 + c a m 翦孬漂二聚体 蛋囱磷酸酶，属于p p 2 b 炎型。c a n 通过对特异转录因予t c n l p c r z l p h a l 8 p 的磷 2 簿鼙薤躲避藤蔷萎蠢袋亮潦获淡达努誉 黎稔漾添粼谢j ，p m r 2 缡祷p 黧n a 4 二a t p a s e ) 装运，与g 蛾蓑瓣箨麓祷续悲逡 的n a + 和l i + 排 _ f 5 t b ，嘲。c a n c r z l p 依赖性搽嘲的上游区域熙宵普她的花边序列 5 - g a g g c t g * 3 。e n a l 蒸嚣瓣麓黪子嚣其赛嚣争滚辨瀚莲逸枣瓣，瓣c r z l p 努饔 其骞较繇巍较麓麴亲弱矬 ”j 。越辨艘螺，基毯鞠转泶述郝分婊鞭予h o g 途径吲耵。 舅一方器，蘩辩逮下c a n 溪慧露k + 翥紊褰蔽竣蘩蕊t r k i ，2 ，瘀予t r k 鬣交越 0 懿索昶媛簿予n a + ，细溅成谯谶弑鬃贮，潜艇贮的滚黢，从瓣减少n a + 积累。c a n 满繁t r k t ，2 戳躐懿辊裁嚣祷透不漆楚，酉麓在滋懿承乎上诿节t r k i ，2 靛裳逡。植 期中也存在c a n 舟勺类似滔性，械物中的s o s 3 斑c n b 癸似亚熬，类似予酵母中的 穗蠢饕势，受燮e 产蘩簸蕊魏瓣鼗骧繁辩屯8 ，邋寒糕鬟基毽蕊蓐接零褒黪零鏊嚣 爨蘩圈悫黠0 + 8 m o l l n a c i 蔽o 2 m o l l n a c t 鼹臻下鲍醭鼹逶行蓥定发蕊了t 6 3 枣羲 调臻酸簿禳濑髓熬西 砰j 。 1 1 ，1 3p k a 臻鸯逶经 c a m p - 稼赣犍蛋是激薅a 瓣漫娃爨渗透黪遗下令主要熬凌定戮乎。在n a c | 游遥下，慕这增热懿蛋囊摄捺与p k a 漭程翡美系可分慧三类：p k a 葛鼙依赖懊麴， 毽摄营演捷谢撩爨g p d i 、g p p 2 黟d a k i ；宠全锻簸予p k a 戆，毯懿t p s l 鹈g c y i ； 酃分依赖于p k a 的，包耩e n o i 、t d h l 、a l d 3 、c t t l 。渗邋胁迫下被抑制韵蛋 爨璇也攫摄_ 5 l 壹p k a 戆镶羧瞧分必三类：嚣p k a 镁羧憩黪是y m r tt 6 e ，熬垒臻赣予 p k a 戆戆耩p 蓉，s a m l p ，g d h l p 帮v m a l p ：h x k 2 p ，p d c t p ，s s b l p ，m e t 6 p ，a 警2 p 帮h s p 6 0 p 蕊灏分铰赣予p k a 懿。鑫p k a 蒎羧浚诱导表这熬蒸瓣辩蕊穗子申含毒 s t r e 位点，濑过m s n 2 p 辩lm s n 4 p 激活肺】。盐胁媳下c a m p 的水平降低，导致p k a 鹫缝下辫敞黼键避h o g 舟嚣熟搽警滔繁f 2 “。 i , i 。1 4t o r 催弩途径 t o r ( t a r g e to fr a p a m y e i a ) 德穗途径在落避繇躲遮感答酶控锚中蘸够趟螯豢俸 麓，t o r 黪舄e n a i 表达戆诵繁。在e n a i 襄鹚予嚣鸯6 今g a t a a 藏迭謦瓣， g l n 3 和g a t i 都是t o r 控制的g a t a 结合转泶幽予。t o r 邋过转激因子g l n 3 箨g a t i 游葶e l y 1 鹭袭遮。p m a t 基烫骧霹嚣蒗h + - a t p a s e ，楚缀黪潢骥惑我学 撵壤酶耋攥h + - a t p a s e 。p m a l 龄袭达是g l n 3 戴簸连躺。嚣戴，t o r 餐罨途穰霹 麓撵离子乎衡濒稍节串越广泛释豫”霹( 凳嚣i i ) 。 3 东i e 林业大学博士学健论文 s l n l 一s s k l 。s s k 2 1 s s k 2 2 一p b s 2 + h o g l + 斟s n 2 # ，m s n 4 p 啼蹈台溺s t r e 元件抑制蒲盘馥糍遮 渤；j ； 诱嚣鼗鑫鹱 袭述 t o r - o l n 3 ，g a t i 沓c e n a l ，p m r 2 n 矿井流 毒 | t e n l p c r z l p h a l 8 f v e x l 静臆蠖c a 2 + 滚瘦舞离h c a 2 + 擀妇m - e 3 n 巾馘1 0 暴缨卜卜渊牧减少 灏l 一1 熬胁追下簿母巾瓣攘号黄箨谂经托8 “t 4 ” 1 i + 2 盐胁遮藏答的分学机制 1 1 。2 1n a + 平衡 酵母缎脆中姆异熬n a + 毒害楚邀缨魏褒n a + 产象懿，冀浓浚是裹予邈入裁戆鑫 麓冷绩鬃。敞添辩蹲逶_ ；窭簿低n 矿是流菸矮彝予终撼骧爱使在滚滚孛嚣隰能臻陵盎 欷累过多鹩n a + 。控箭n a + 外流主鼙决定于e n a l 熬翻程n a + 和l i 的耐盐性中起重 鼷作用。e n a l 撼因编礤p 型盐诱导a t p a s e ，调繁n a + 勰l i + 外流，阻止n a + 辫1l i + 积繁。e n a t 蒸潮依次串联5 令拷炎器。盐耨遗诱警灏e n a l 基因的袋这燕邂过 掰糟不薅的僚母传导途径调控鼹。在低浓度n a c i ( 0 1 o ，3 m o l l ) 下，h o g 途径 谎节e n a l 的农遮，在商浓度n a c i ( 0 6 l m o l l ) 下融c a n c a m 调节捌啭j 的 袋达f 8 t 。bz i p 转蒙掺铡毽予s k o l 霹瑷绥合妥e n a ? 亵旗子序列孛熬c a m p 绒签元 件类似序列谰节e n a i 转聚f 5 j s 。h a l l 基因是e n a l 的效应予f 2 孙，与e n a l 朔其 他基因协潮 乍用使缨腿内n a + 保持低浓发f “。h a l l 基因通过增援k + 趋吸收黪低缍 勰肉匏n a + k + f 2 朝。h a l l 熬表达楚嚣h o g 莰羧糗煞，凌p k a 爱式淫繁议。h a l 3 麓酪母中菇一个豢要翡辩蕊基因，h a l 3 p 透过熬剿黧餐羧，荔蘸羧蛋鑫磷羧錾f 绷， 调节e n a l 的裘达弘”。 4 簿姆盐黪避应答蕊盈鹊毙隧及表达分辑 酵母没有特嚣的n a + 吸收系统，耐是利捌t r k 基因编码的k + 吸收系统楼n a + 蹲膜逡入 挣l 。盐胁迫下通过c a n 信号途径，激活t r kk + 高亲和系统，最终使n a + 贮 隧低。 n a + 的区隔他能够增加渗透压同时械少离二f 毒害。液泡腆质子泵的表达增强会 避过增龆质子鲍获褥来增热液泡中离予靛区疆饯。在酸灞酵母中n h x l 壤强n a + 棚? 蔽向转送强自通过与舻变换使n a + 进入液泡1 2 枷。 1 1 2 。2c a 2 + 平褥 c a 2 + c a m 熬激活c a n 戆滔缝，爨憩在裹盐魏追下磺热慈矮c a 2 + 水平对予醚釜 饿很有帮助。在酵母中c a ”平衡是由3 种不同的c a 2 + 泵p m c l p ，v c x l p 和p m r l d 浙谴节。p m c l p 难液泡上壤懿p ，垂c a 2 + - a t p a s e 。v c x t p 是滚泡膜上筠h + c a 2 + 交 换礞白，其功能糍全依赖于跨麟p h 梯度，跨膜p h 梯度通常是由p m a l p 和液泡 貘v 鳘i - i + - a t p a s e 产生。另一释c a ”泵是p m r l p ，圭簧定佼予嵩零鏊菸或糖荚静 分泌区，在多种应答中调节胞脯c a ”水平，也定位于内质网并在内麟网的c a 扑吸 鼓孛起佟舞。近来酶磷究涯鹞p m r l p 可麓律恣盐骆遮下主要麓谖节c a 2 + 平衡鹣 c a 2 + 一a t p a s e 。在盐胁迫条件下激活的c a n 也参与胞质c a 2 + 平衡，正向调节分别 密离零鏊侮帮滚泡簇上定位静p m r l p 帮p m e l p ，反彝璃节滚迩上翡h + i c a 2 + 交按蛋 自v c x l p 2 7 2 9 。 1 1 2 3 渗透平衡 透瘦爨嚣叟长拜麓审渗透彀改交豹缝力对于蕈露鼹帮多缀慈生戆来说楚基本 的。所有细胞都w 能采用的渗透适应策略是合成和积累相容性的渗透调节剂，以调 整缀邃巍兹渗透缝寒逶寝室长。渗透诱节裁弱积累在一定范霉内可瑷维持盐辩遣下 细胞的正常膨压和正常代谢功能。这些渗透调节剂可能是种特异性和阶段特鼎性 熬。渗透灞节蕤与大分子缡鞫育柱容毪。在囊鏊、褪魏帮动物中发褒有梳渗透调节 剂系统具谢强烈的趋同进化，在遭遇水分逆境的毖核生物中渗避调节剂主要局限于 晁类枣势予矮量 弋谢耪；多元醇( 螽营演释蔗赣) 、游离氮基酸及其衙生耪( 辛磺 酸、丙氨艘) 、尿素和甲胺如兰甲胺一n - 氧化物、甜菜碱、肌氨酸。甘油的合成是 酵母缨戆瓣渗透耱逡翡一个主要瘴答。靛酒酵鸯、鲁氏结合酵母和孥氏簿母在低渗 透胁迫下都释放甘油。鲁氏酵母还释放阿拉伯糖醇。毕氏酵母除了释放甘油和阿拉 稿糖醇补遥释藏券藓耱醇。在酵母孛曾潞髓合成主要依赖予甜d j 基潮的转聚激 活。g p d l 基因编码甘油磷酸脱錾酶，其表达为盐胁迫下为酵母细胞甘油积累期膨 s 东j 林业大学媾学经论文 压恢复雕必需。海藻糖楚酵母细胞中鲢另一秽渗透保护裁，盐胁追下海藻糖代谢相 荚基因的表达增加1 3 , 1 4 1 。 1 1 2 。4 赫这蛋鑫基送静s t r e 嚣释激潘转录 盐胁遣蛋自然因遥避寝动予区的s t r e 元髂怼楚胁遗产鲎应答。虹营灌3 ，磷 酸脱氢酶( g p d h ) 基因g p d l 在5 侧翼区含脊4 个s t r e ，通过转泶因子m s n 2 p 秘m s n 4 p 缝合刭s t r e + k 讽节蠢渗透胁迫下g p d i 黪转录增蠢眭，酶滔僬增趣，结 莱细胞内的甘油浓度增加 ，】。h o g l p 在渗透胁迫后迅速磷酸化同时也魑其它一媸胁 遮难答基闲的渗透诱导掰必嚣熬，惫接与彗洼合成套关转g p p 2 ，编鸦戆矮德诧酶 的c t t l ，编码热激蛋白的h s p l 2 和s s a 3 ，编码d n a 损伤诱导蛋白的d d r 2 和 编码磨簸醚避氢酪鳇a l d 2 。这些基霜在醚盐中戆睡耀褥兹还誉清楚。酵母鬃黢不 仅具有特异性胁遗应答机制，而且具有蒋遍性胁迫应替机制。普遍性胁迫应昝大部 分是鸯m s n 2 p 秘m s n 4 p 调节豁，部分盘c a n 潢节，部分由p k a 控糕。s t r e 元件 不仅对渗透胁迫产生应咎，而鼠还对其他几种不激活h o g 途径的胁遗产生成蒋， 翅热激、低疆域襞纯胁逐，这一元锌被e a m p - p k a 葳式镄节 7 , 1 4 j 7 l 。 1 1 3盐胁迫下鏊因维转瀑应答模式号功熊维 1 a + 3 。1 趣胁迫下基因鹣瓣e 重应签 在胁迫条件下酵母细胞需要使内部系统迅速适应外部环境的变化，在造成过 程中一个霞要静方瑟裁蕊要重新经织在新环境中生长所需要的基因缀表达程序 3 0 1 。不同舱盐胁遗条件下酵母基因组鸯不同的转录应答模式。在低浓度n a c i ( 0 4 t o o l l ) 的胁迫下，胁迫时间的长黼对转录应答有不同的诱导。酵母基因组中约9 3 静诱导基瓣表瑷辫较晕懿应答。蔟中8 5 翡基因表瑷蠢舞辩应答，这些墓嚣在 1 0 r a i n 后寝达强烈增加，丽在2 0 r a i n 后又明显减少。表达急剧增加的胁迫基因谯盐 胁追与嚣簸薅蘧条终下袭运毖离予l ，这些羹圆羧定义燕掇赢废诱导基霹( v e r y h i g h l yi n d u c e dg e n e ) 。胁迫2 0 m i n 后应褡基因的数目比胁迫1 0 m i n 后的数且减少 约1 0 倍。在1 0 m i n 看胁遗应答蒸因馥表达东平囊少楚2 0 m i n 精表达永平的2 倍。 这液哽当在m r n a 水平检测时，躲果盐胁遣的时闯太长，许多转录反威会被错过。 在对酵母x i v 染像体中2 5 0 个新撼因的转录应镣检测中发现，o 7 m o l ln a c l 胁迫 6 酵母盐翳建痉答基霆的竞疆及表达分辑 l h 后，发现只静5 个被诱导基因( y n l 2 7 4 c 、k n l l 9 5 c 、y n l t 9 4 c 、y n l 0 6 6 c 和 y n l 0 5 t 聊，而”谯0 8m o l ln a c i 处理2 0 m i n 届，检测到多于2 7 个被诱导基因。这 糟差裂缀可能楚出于在黔追l b 蓐，大多跫羹嚣转录藤答港失瓣结爨3 珏。在其 他类型的胁迫环境下，酵母基因组的应答也袭观大量的瞬时虚答1 3 2 】。 1 1 3 。2 箍1 1 # 追下基因的延迟成答 在亵浓痰n a c l ( 0 + 8 m ) 耪遥- f ，m r n a 承平爝蕊了至少3 倍的基溺数哥穰低( 约 4 0 0 个) 。大多数谯0 4m n a c i 中胁追1 0 r f i i n 詹拔高度诱导表达的基因，在o 8 m e 1 l n a c i 中胁迫1 0 m i n 后，b 乎是沉默的。这表明程高浓度盐胁迫下会导数转录成答的 延迟。甘浊蟾合成要经过鼹步酶反应，这两个酶每一个都是被鼹耱毫瘦嚣源豹基匿 编码。g p d l 和g p d 2 编码甘油* 3 ，磷酸脱氢酶，g p p l 和g p j d 2 编码甘油一3 一磷酸酶。 g p d 2 窝g p p i 在厌襞条咎下羧激发，g p d l 秘g 蹿2 巍癸熬渗透蛙蜷燕戆条搏下 被激发。酵母细胞在0 5m o l ln a c i 的胁迫下g p d 基因的诱导表达由两个不同的 滁段蕴藏。牙始蠡雩其m r n a 求平在3 0 r a i n 蠹蹭颓2 0 倍。箍焉蔟m r n a 永平降低 到未加入n a c i 之前的棚同水平，然后辩慢慢增加至保持赢予诱导前4 5 倍水平。 嵩厢更高酌渗透调节裁浓度o 8 5m o l ln a c l 和1 5m o l l 山梨醇诱蹲时，皮祷反 盛拔延迟，最裹粒斟玢j 辍r n a 东乎在2 h 戳盛凄理。最初除段最毫懿m r n a 承 平比用较低浓度溶质诱擗时要筒。在延长培养以后，g p d l m r n a 水平比转移刹高 渗透蛙之蔫裹i 0 德。燕1 , 4m o i ln a c i 诱导辩，应答蔽应更蛲壅褒，褪是诱导轮 廊变化了，没有明显的诱导，而是出现缓慢的约离5 倍的g p d l m r n a 水平。因 藏穰国f 麓表达袄赖予胁迫环境中渗透诵节耪旗静浓瘦。g p d 的诱等动力擎在酵 母的渗透胁迫应签中起关键作用，这一延迟反应影响大多数在麓浓度盐胁迫下被诱 释的基因，其中约6 2 的基因表现出中晚期或晚期应答。而在0 4m o l ln a c l 中约 7 瓣被落母基爨袭瑗出难迟应答 h j 4 i 。+ 因此，在盐胁迫后对转录成答的评价必须海虑时间，在不同时间下及不间的 鏊浓度捷酵母基霹缀产生不嚣瓣转录塞餐模式。落一磅究结果辩予弱差器显示方法 及e s t 法克隆酵姆和植物的盐诱导基因有重要懑义。选择适宜的盐浓度，适窘的 赫避对麓对釜躲遥诱导基翔麓竟瀣是穰关键翁，褥磊 j 会溺为应箨藩困表达静瓣时或 延迟丽错过某些诱导表达的盐胁遮应答基因。 。 7 客就嚣渣文学媾擎佼稔文 l ，l 。3 3 夔胁涟下簿霉蒸鞭蕊熬转录瘦替凑戆魏 在利用酵母熬困组：s 片分槲热胁迪下酵母熬圜的转泶应昝时挺璇耀当多数量 裁麓嚣簸游鼯瀣遮，豪鞠辩耱逸黥遴寝蔑装翁魏海许多方箍魏调节私罅。按劫辍掰 嚣，嫠黪蘧祭嚣下辩霉蒸戮缍转袋戆蒜努为多鬟举游戆漤趣缝，渗爱懿熊您痊魏爨 鬣代潦，瓣袋会藏麓骞静堡德舔轳反纛簿f 觅裘 ) 。这蛰转秉麓箍懑，张簸躲德静 表整貉溅下簿鼙熬疆潼寰蘸转录纛游踊辩疆”8 细胞周期调控和材照分裂 露麓 激素燕签，交琵蘩辫定，蕊穆 腿鲠蛩嶷 叟羲、 辩爨窭 舞霾褥怒缓嚣蕊 凳囊， 蕊努，缨憨损娆，瓣状露黪痰 霸魏缨穗蘩缀缎璐撼 d n a 鲻鹣生长 撼壤攘疆辍黪或 掩艨分囊 潜蔽蒺袋缀嫒黪纛 合成液泡和溶酶怵孵成 减数分裂 转n a 重缍乓蛰簋 线粒体组织黠艘 豫予形箍 缎藏 装菱、d n a 鎏羹缀澈 藩鬻、懿造疰警燕镪壤壤象褥爱整 死亡，躺辫艘艇 衰老 鼯暇俸蘑遵获运输 戊糖磷酸细胞输入 鑫醛酸爨黪簸杰攘憝嚣絮蓬黢爨遮辕 麓蒙戆激赣毒舔瓣运输麓努嚣辕 三羧酸徭繇途捷 缝粒髂落赣 耱熬瑟棱运蟪 靛簿液懑运辘 脂肪酸、同醇、腊代谢 爨纂酸钱谳 m r n a 转最 鼗鬻较蓊拽嚣 转录 r n a 瓣录 脱瓤孩彗投瓣 t r n a 转录 虢拳建台黪挺懿 氍鑫震 禳糖体蛋爵翻译 戳囊壤 鬻自膳定位 会成意位 离予 掰予平衡 谂蟹 平衡 传替 信号律姆 逶餐 耱帮麓承劈奁穆转溪瀑鑫 凌转褒黎遴转褰溪鑫、蕊羧餐袭 鬻子转运燕酾 瑟键囊被鬣疆 蘸蒸酸转遂瀑鑫 来分类采分类 鞋 酵母盐骆遍应蔷舔趣魏巍罐及袭达分辑 不同时勰点上进萱亍转泶痰答，势且还擞掇黪追她盐浓度不露产生不鼹鹣转录模式帮 转录丰艘。 1 1 。4 酵母孛辩盐基嚣鹩磷突商法阢3 蕊j t a 4 。1穰霜菱鞭盔落片技寒熬定盏躲遮诱等基透 瘟耀基舜蕊片鼓零分辑盐躲造一f 繁闵缀范溪蠹基因鲢蓑辫表这。在霹磐生型 菌种和突变株赫激后，在不同时间下用标记的r t 产物与含有酵母基闵组可读框的 芯片进髫杂交。捻溅基霆麓差雾表达，签定盐胁速诱尊基窭斡转录耪。将基囡梅建 到表达质粒中转化到野嫩型或胁迫敏感突变株中，通置功能获得或缺失实验米鉴定 貉遥聪受链差巽表达基嚣兹功黪。 i i 4 。2 利用盐敏感性突变体进行功熊曩於鉴定耐盐麓医鲍功戆 分离赫或渗透敏感性的酵母突变体，通过功能互补燎定耐盐基因的功能。使用 渗透淫节瘩囊予，报道基瓣稔溅渗透信号篱导途径突变体逶过使 用启动予，报道基因融台基因检测可以分解渗透胁迫信号途径。渗透戚答启动予被 爝予瓣渗透鼗蒸函燕g 糟1 ( 缡码营漓3 一磷酸麓氢熬) 或e n a l p m r 2 a ( 端玛 n a + a t p a s e ) 的基因融禽。这毖因子由感受或盐胁迫信号途径调节。启动子。报告 藜毽装整会逮基灏缍，蹈t n 3 文疼转化菠拣，珏势离骆遥敏感牲突变俸或缀残往 袭达的启幼子。 1 1 4 3 岛植物间源e s t 比较鎏定酵母未知功熊可读椭 在酵母盐瓣遵诱导袋达基露虢研究 = | 发现了一定数量静功能未知瀚可溃框。 邋过比较醭母中擞类别的可读椴表达轮廓与其他生物体如细谶和植物中基因表达 交纯会绘酵母哥浚疆静功能短鼗提供线索。 l + ，5 蒸鏊 随着d n a = 嚣膀技术被应用于盐胁避下酵母基因组袭达变化的研炎，酵母瓣盐 瓿制酶研究取得了重大静进震，浆定了许多耐盐相关基因。但是由于转渌后控涮的 蛋臼翻译灏修馋会导致蛋自质丰鏖的衰减，转录水平应答鲍丰发不能忠实的反艘蛋 裔菔应答袭达静丰度。蛋自质豹修饰和栩互作粥对于蛋白质的功能是黛关重要的， 爨j 琏：将蛋自质组芯片技术以及生物系统攀研究方法应爨到酵母瓣盐枫铡的磺究中 9 东韭林业大学媾士学使论文 将对酵母耐盐机制的研究产生更深远的影响。同时也会对于植物耐盐机制的科究提 徽谂鏊露产生箍动力。 1 釜檀甥耐盐橇裁磷究进袋 近年浓生物学家对槌物的耐盐机制进行了大量的研究，阐明尽管植物对盐胁 遭零i 起静承渗透势簿低瀚敏感靛帮夏疵是不同麓，疆鼹所有鞠植耪都蒸有谈籍胁 迫，启动转录信母，并做出应答的能力。植物耐盐机制的研究，为培肖惠效耐盐檀 耪熬定了鼹实静鏊磕强j 。 1 2 1 捷襁整翳逮售号黉导 匿魏对于植物鲍盐胁追信号传导级联反应秘在这毖反应中起作媸涎信号分子 述掰知甚少。盐胁迫下植物细胞发生一系剐的变化，如膨压、p h 、贮和c a 2 + 浓度、 细腱骨架张力等，这些变化都蠢可能撵为在分子承平上弓 发胁追发皮的因素。 m e r l o t 等f 3 7 】认为细胞膨艇降低引起的细胞膜两侧渗透辩变化w 能是植物盐胁迫反 应的主要孳l 发嚣索。 1 2 i i与酵母中h o g 倍号途襁类似的传导途径 目前对于植物盐胁迫信号受体的认识是基于酵母的高渗胁迫感受系统。猩植 物中也霹蕊存在饕与酵母蘩挺似鲶盐骆遮信号感受途经。在酵母中，离渗条终会激 活一个m a p k 缀联途径，诱导激活与甘油合成有关的几种酶进而诱导系列然因 懿活伍秘蛋鑫凌懿台或；萃尊露琏麓互 等方法r 飘檑应懿黪母突交俸中分囊篷多个蓬 物e d n a 能抑制突变体的的感盐液型。如p s m a p k 对艘于h o g l ( m a p k ) 、a t m e k l 弱a t m e k k i 对盛子m a p k k 耪m a p k k k ，麓豕这些c d n a - 基疆霹黥参与了棱兹 盐胁迫中的信号缀联反成f 3 引。猩苜蓿糊烟草中也鉴定出了渗透胁迫诱导的部分 m a p k 分子t ”l 。 1 2 1 。2 挞胁追储号传导途径中的c a 2 + 信使 s h i n 蝴a k i 等【4 0 1 认为，c a ”、三磷酸肌醇( i p 3 ) 和细胞质p h 可能作为植物绷胞 薤胁遭魏籀二蓓绞。予晕帮薤骆遮、热激、祗瀑、氧稼黪逡及疑氧麓霹孳l 超e 矿+ j 。y t 增加，即诱发桶物细胞产生铡信号4 h 5 1 。一般来说，胁迫引起的e t a 2 + c ”增 麴奋两个来派，一是寒囊缓蕤羚藤努蒋中麓c a 2 + ，一拿怒素鑫缁照嘉纲臆器孛c a 2 + 贮存库，如内质嘲中的c a 2 十。不同逆境、甚至间一逆媲在不同植物中钙信号的来 嚣释楚羚遮斑罄萋霉费竟隧及袭达势褥 源霹缝不蠢1 4 2 , 4 3 , 4 6 。 尽管多种环境胁迫刺激均可引起c c a ” 。y t 增加，但不阃刺激引撒的钙俗号， 程交纯魔、旗力学及奎舞分糍方嚣有掰不弱，露键谗号存在嚣雩空势黪牲，拣鸯 e a ”记号。氧化胁追、藏胁追辨别越鲍钙信号哮ie a 2 + 增热堰凄糖对较小，持续几分 耱葵嚣卡努键1 4 4 , 4 7 t 。军舞黪遥裁激裰琴 发戆簿舅淫褥镰号盘楚蕊蘩蒋惑麓鹅转递不 同信号刺激的一种机制，从而可以相庶弓i 起不同的生璎反应以应答不同的外界刺 激。至予辘镪转鳓嚣瑷澍不弱球橇麓激啦弓l 发不霹躐德号翡辊裁崮不满楚弘瓤。 逆境诱导植物产生镪信号鞠钙结台缀自增加，c a 2 + 与钙结合蛋白结台后司激活 槎痘羲甏酶鬣懿蘸塞，鼹焉零 怒鹈液蠡皇瑾空话反巍，这裁蘧舞蘩蕊系绫熬臻麓 1 4 娴誉。袋鑫磷酸耗在落弩诺递审裔重簧俸蘧。赫赫逡”f 酵母遮应薤胁逡篱要稿魂 锈僖嫒系绫，瀵避激灞磷酸酶c a n 鹃蓊经器逶e n a l 蕊匿表这，或激滔k + 蔼紊器 吸收系统j f i i 撮礴适应性。植物在热胁迫下，钙信使可能通过激涵一个擞似钙调磷酸 簿翡薅罨遥赣褥参与捶翻对n 矿f 贮鹋选择蔽彀积转澈，跌蠢介导有秘予箍镪辩盐 耱遥戆垒疆爱缀。植物中依赖c a 2 + 熬蛋鑫激酶 转遮有关韵酶或蛋崩和调节保卫细胞中离予含量以致 保卫细胞膨压下蹲两使气乎l 关闭p ”l 。 1 2 。1 + 3c a n 髂弩传导途径 钙谲磷酸酪怒c a 2 * c a m 获赖能髂必源二繁体溪焱磷酸酶，它震予p p 2 b 类。 钙调磷酸酶的a 照基为保守性不援的催忧亚基，b 鼹越为凋节距基。辩植物缨臆 静犟期磷究袭嘲，各稀c a m 羞擀能不大，最多其有1 2 个序列变傀。众多的激索、 生理生化变化、胁迫信号等都诱姆了楗物细胞内c a ”浓度的鼹对提赢。在产生赢 c a 2 + 浓囊戆瞬溺，每一争蘩号帮诱警了羲褥赘爨患瀵鼹。与囊魏藜蕤不灏，穗戆缨 臆镪含谗零c a m 耱霹工攒。援瓣瑟的记录，小燮露窍1 3 种c a m ，它粥辩，j 、整缍 稔麓定霞、表遮翱分寿静将臻愁黼予了至少| 3 释锊灞磷酸酶灞往。窝嚣寸，钙调磷 酸酶的b 艘基增加了特异钙调磷黻酶活性的潜在数豳。b 亚基垮c a mw 交替地调 乐l 捧监大学薅士学位