（果树学专业论文）dna的硅藻土纯化法与脐橙番茄红素β环化酶基因筛选及上游序列分析.pdf

塑望_ 大堂堡：! ：兰竺堡兰! ! ! 塑堡型! ! 些鲨：! 堕堡至型塾茎! 竺些堕苎型堕堡丝：! ：塑翌! 竺! ! 英文缩写 b p c 1 、a b d n a e b e d t a e p d f p l 。c h p l c k b 上c p c r p l a c e r n a r p m s d s t s s 英文全称 缩略词表 a b b r e v i a t i o n s b a s ep a i r d e g r e ec e l s i u s c e t y l t r i e t h y la m m o n i u mb r o m i d e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d e t b i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d t h ee u k a r y o t i cp r o m o l e rd a t a b a s e f a s tp r o t e i nl i q u i dc h r o m a t o g ia p h y g r a m h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y k i l ob a s e l y c o p e n ep c y c l a s e p o l y l n e r a s ec h a i nr e a c t i o n d a t a b a s eo fp l a n tc i s a c l i n gr e g u l a o ud n ae l e m e n t s r i b o n u c l e i ca c i d r o u n dp e rm i n u t e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t r a n s c r i p t i o ns t a r ts i t e s v 中文全称 碱基剥 摄氏度 十六烷摹三乙基溴化铵 脱氧核糖核酸 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 真核罄因启动子数掘库 快速蛋白质液相层析 克 高效液相色谱 干碱基对 番茄红素d 环化酶 聚合酶链式反应 植物d n a 顺式作用元件数据库 脱氧核糖核酸 每分钟转 十二烷基磺酸钠 转录起始位j ：i 塑坚查堂堡! ：兰竺丝兰 ! 蔓! 塑壁篓丝些鲨! 些堂塑堂竺堂! 型：些堕兰型堕丝丝! ：鲎! 型! 鲨i 摘要 论文分为三部分。第一部分为d n a 的纯化研究，先研究了硅藻土在质粒d n a 纯化上的应 用，系统研究了硅藻土各项指标对质粒d n a 纯化的影响，最后将硅藻土纯化应用于果树基因 绡d n a 提取和纯化；筛二部分为应用p c r 法从橙基因组文库筛选番茄红紊p 环化酶等位基因 2 ( l c y - b 2 ) ；第- - 1 1 分为已筛选番茄红素b 环化酶等位基因1 ( l c r - b 1 ) 的上游i 芋- i q 分析。研 究取得了以下主要结果。 1 研究表明，沉降速度为6c m m i n 、lc m m i n 和0 2 5c m m i n 的硅藻土颗粒的d n a 吸附 能力约分别为0 , 0 0 9g g m g 、o3l - t g l m g 和2 5g g m g 。沉降速度为0 2 5 一ic m m i n 的硅藻土颗粒 可应用于d n a 纯化。为吸附1g g l d n a ，以加入2 0 斗i 硅藻土悬浮液( 约含1 0 m g 硅藻土颗粒) 最为合适，回收率达7 7 ，3 1 。 2 应用改良硅藻土法纯化一长为1 4 9 5 3b p 的低拷贝质粒p l z l 4 ，所得质粒纯度达2 38 7 ， 比来纯化前提高了1l0 6 倍，经纯化的p l z l 4 质粒测序信号强、无误认碱基，而未经纯化的质 粒测序时信号弱、错误普遍存在。应用硅藻土法我们成功去除脐橙果肉，多酚含量较高的多年 生果树老叶中杂质，得到纯度和含量均较高的d n a 。获得的d n a 凝胶电泳条带清晰，无拖尾 和明显滞留。 3 根据部分番茄红素d 环化酶等位糍因2 ( l c f - b 2 ) 设计特异引物，通过特异引物与通用 引物配芹1 筛选得到了仅在文库和基因组d n a 上扩增的引物。该引物应用于文库筛选时发现， 目标噬菌体稀释铺板后，p c r 条带变弱，推洲其繁殖能力明显弱于噬菌体文库的平均值，本研 究通过多种方法优化筛选，提高目标噬菌体的繁殖能力- s a t 曰标噬菌体在筛选过程中出现 的几率，为继续筛选打下了基础。 4 将己筛选的含番茄红素p 环化酶等位基因】( l c l c b l ) 的噬菌体提取钝化后测序获得其 上游区序列，应用启动子软件和数据库分析该序列，得到其理论上的启动子结合位点r 为进一 步的研究提供理论支持。 关键词：d n a 纯化 硅藻土p c r 筛选番茄红素0 环化酶基因基因组文库启动子序 列分析 v 兰塑：! ! 兰型! 竖些堡兰 ! ! ! 竺壁鉴土丝些鲨：! 壁堡至苎丝鲞! 墅些墅茎堕! ! 垄丝! ：塑! 型坌堑 第一章文献综述 1d n a 提取与纯化 d n a 是生物体中遗传信息的原初载体，提取d n a 是进行很多分子生物学实验的基础。尽 管随着分子生物学发展这项技术f j 臻成熟，但对于些特殊材料，如质粒d n a 中的低拷贝质 粒、富含多糖和多酚的多年生植物材利常规法提取的d n a 质量仍然无法满足基本的分子实 验要求。因此，针对分子生物学实验中d n a 提取存在的实际问题，寻求经济简便，d n a 提取 质量高的d n a 提取法无疑将极大提高分子生物学工作者的实验效率，减少时刚消耗，具有重 要意义。 分子克隆中经常涉及到的d n a 包括质粒d n a 和基因组d n a ，噬菌体d n a ，叶绿体d n a ， 线粒体d n a 和大分子量d n a 等。基因组d n a 存在于细胞核内，它与蛋白质起构成染色体。 基因组d n a 为链状，比较长。提取是易受到剪切而断裂。质粒d n a ，分子生物学实验所使用 的质粒一般均为细菌质粒，细菌质粒是存在于细胞质中，独立于染色体可以自主复制的遗传成 分a 已知绝大多数质粒都是环形双链d n a 组成的。质粒d n a 可以持续稳定地处于染色体外的 游离状态，也可能在一定条件下被可逆性整合到寄主染色体上，随染色体复制而复制，并通过 细胞分裂传递到后代。线粒体d n a 和叶绿体d n a 与质粒d n a 非常相似，也是核外的遗传物 质可以稳定遗传。其提取方法一般以大量收集线粒体、叶绿体步骤最为主要。 d n a 提取后纯度往往达不到要求，特别是一些低拷贝的质粒和难提取的植物组织，因此纯 化d n a 成为分子生物学实验的一步不可缺，p 的操作。 1 1 氯化铯密度梯度离心法 在细胞裂解及d n a 分离过程中，大相对分子质量的细菌染色体d n a 容易发生断裂形成相 应的线形片段，而质粒d n a 则由于其分子量较小、结构紧密，仍能保持完整状态。氯化铯，e t b r 密度梯度离心法就是利用这种原理，将含有演化乙锭( e t b r ) 的氯化铯( c s c l ) 溶液加到大肠 木t 菌裂解液中，e b 分子便会通过嵌入作用而结合到d n a 链 ：，导致双螺旋结构发生解旋反应。 线性的或丌环的d n a 分子，因其具有游离的术端而易于解旋，故可结合大量的e b 分子。而 像质粒这样的共价闭合环状的d n a 分子，由于没有游离的末端，只能发生有限的解旋反应， 结构便限制了e b 分子的结合数量，因此染色体d n a 片段要比质粒d n a 结合更多的e b 分子。 塑竖查堂 塑三! = 兰些论文d n a 的髓藻十纯化法与脐橙番茄红素i i 环化酶赫闭f 带选致j 一游序列分析 在d n a e b 复合物中，结合的e b 分子越多，其密度越低。因此，在e b 达到饱和浓度的条件 下，质粒d n a 就要比线性的染色体d n a 片段具有更高的密度。通过氯化铯密度梯度离心之后， 它们就会被平衡在不同的位置，从而达到纯化质粒d n a 的目的( s a m b r o o k 等，t 9 9 5 ) 。 1 2 液相色谱层析法( f p l c 或h p l c ) 液相色谱层折法是近年来一种快速、高效的纯化d n a 技术，无论是p c r 反应产物中的混 杂d n a 还是已经用其它方法纯化过的d n a ，都可用液相色谱层析技术获得较高纯度的d n a 。 液相色谱层析仪( f p l c 或h p l c ) 的普通柱子都可用来纯化d n a ，其基本步骤如下：a 用适当 的缓冲液平衡所用的层析柱，将柱子连接到液相色谱仪上。b 把d n a 样品打进加样器l 辛，启动 仪器，将d n a 样品打进柱中。c 分i i i i i 如下三种洗液沈脱柱：含0 6mn a c l 的t e ( p h76 ) 3 m l ；t e ( p h7 6 ) 3 m i ；含0 1m n a c i 的t f ( p h7 6 ) 3 m l 。d 收集主峰洗脱液，加入 等体积苯酚：氯仿抽提1 次，收集水相。e 加入2 倍体积异丙醇以沉淀r n af 用小体积的t e ( p h7 , 6 ) 溶解d n a 沉淀。( 关红梅等，1 9 9 8 ) 】3 高盐沉淀法 去除植物d n a 中多糖近年国外有一些的相关报道，d e l l a p o r l a ( 1 9 8 3 ) 等认为，加入高浓 度的k a c 有利于除去多糖，f a n g ( 1 9 9 2 ) 认为在1 0 2 5 m o l l n a c i 的高盐t e 中，用无水乙 醇沉淀d n a 能除去多糖。m o i l e r ( 1 9 9 2 ) 等报道，在s d s 和c t a b2 种去污剂存在时，将提 取缓冲液中的n a c i 浓度提高至l4m o l l 可除去多糖。p o r e b s k i ( 1 9 9 7 ) 等在沉淀粗提d n ah j ， 将n a c i 的浓度提高至25m o l l ，以除去多糖。所有这些报道都是利用在高盐缓冲条件下，在乙 醇或异丙醇中d n a 优先沉淀的性质，达到d n a 与多糖分离的目的，但对于多糖含量过高的材 剁，总有部分多糖随d n a 沉淀而造成污染( 刘月学等，2 0 0 5 ) 。 1 4 乙醚抽提法 程运江等( 2 0 0 1 ) 认为先用乙醚和n a c i 将大部分多糖除去，再沉淀d n a 便可大大提高去 除多糖的效率。他们认为用此方法列衰老叶片( 如：红桔+ 积壳的体细胞杂种和批把的老叶) 进行d n a 的分离，也能获得高质量的d n a ：油菜等作物用此方法进行d n a 提取也能有效降 低多糖的污染。本研究曾尝试过此法，认为陔方法l 、1 于d n a 含量低的样品并不适用。 晰江人学坝f j 学位论史d n a 的砖藻十纯化法脐槛番拍红素b 环化前摧筛选及 游序列分析 1 5 试剂盒纯化法 试剂盒技术的应用为分子生物学工作者提供了极大的帮助，常用的试剂盒有p c r 片段回收 试剂盒，凝胶回收试剂盒，d n a 纯化试剂盒、质粒提取和基因组d n a 提取试剂盒等。生产厂 家较多，相对著名的有s a n g o n ，t a k a r a ，上海基康，宝生物，博亚、赛百盛等公司。产品一般 均为柱式，材料咀g l a s sm i l k ( s i l i c a ) 、离予交换树脂居多。这些试剂盒原理普遍为一定缓冲液 存在下，用s i l i c a 、离子交换树脂膜等利料特异结合d n a ，通过乙醇等洗涤剂清洗去除杂质后， 用低黼溶剂洗脱下d n a 。试剂盒的成本不高，但由于试剂盒厂家普遍封锁信息，所以试剂盒产 品一般价格不低，大概为3 一。1 0 元爪，进口试剂盒则价格更高。同时，在实际研究中，我们发 现试剂盒回收率没有其说明书上所述的高，且重复性往往也不理想，所得d n a 有时仍不能满 足测序对d n a 质量的要求。对于经常进行分子生物学实验的研究者柬说，获得种更加简便 便宜的纯化d n a 方法更符合研究者的实际要求。 1 6 硅藻土纯化法 硅藻土、硅珠、磁珠、玻璃奶( g l a s sm i l k ) 、硅石粉具有相同成分一二氧化硅。硅石粉f 吸 附d n a 的纯化方法最初由b o o m 等提出，并从人的血液和尿液中得到高质景的d n a 。h o a 等 1 9 9 3 年将这种方法改进后从化石材利中提取d n a 。也得到了高质量的d n a 样品。植物细胞由 于具有细胞壁，生命活动过程中通常会产生各种次生代谢产物。因此与动物组织有很大差别。 这也影吓o j n 植物d n a 的提取。特别是剥所谓“顽固性”的植物材料。二氧化硅吸附的纯化方法 具有简单、快速、方便等特点。 陔提取方法的基木原理利用了在高浓度离液剂( c h a o t r o p i ca g e n t ) 如s c n ，c 1 0 4 ，】等存 在的条件下核酸具有与s i 0 2 颗粒结合并能在较高温度下被低盐浓度溶液洗脱的特性。硅藻土 中s i l i c a ( s i o x ) 极细颗粒在高离液剂存在有很大的表面能，亦具有较大负电性，在低盐溶液内 结合大量水分予，d n a 同样结合大量水分子，彼此在低盐溶液里相互排斥：高离液剂存在时， 高离液剂能夺取硅藻土中s i l i c a ( s i o x ) 极细颗粒表面和d n a 表面结合的水分子。高离液剂夺 取水分子使两者带有高负电性，溶液中有限的阳离子会在两者之间形成阳离子桥。这种结合稳 定也是可逆的，当溶液中重新处于低盐状态下，硅藻土中s i l i c a ( s i o x ) 极细颗粒会和d n a 脱 离。d n a 与硅藻土结合后，硅藻土中s i l i c a ( s i o x ) 极细颗粒很好的保护d n a 免受酶的降解 和其他剪切。作为离液剂异硫氰酸胍( g u s c n ) 和盐酸胍等除了具有这种特性外，还是种溶解 浙江火学坝f j 学位论义d n a 的柞藻。卜纯化法0 脐橙嚣茄红索b 环化酶幕筛选搜i ：游j g - y r j 分析 性蛋白质变性剂能增加蛋白质的非极性，提高其在水中的溶解度。有效地将蛋白质从s i 0 2 - 核 酸复合物中洗脱出来。自v o g e l s t e i n 等( 1 9 7 9 ) 发明应用玻璃粉或硅石粉纯化d n a 以来，这一 方法得到了持续不断的改进和应用。目前多数方法应用硅石粉为d n a 的吸附介质但也有研 究发现硅藻土也同样有效。 某些种果树含有极高的多糖、多酚杂质，普通纯化方法应用于这些组织，提取的d n a 往 往效果很差，呈冻胶状或在提取过程被多弼) 氧化呈褐色，难溶于t e 等缓冲液，凝胶电泳时点 样孔滞留严重；无法进行基本的后续分子生物学操作。以前的研究者通过多种途径纯化d n a ， 使得d n a 质量有了很大程度的提高，已经成功从多种多年生组织中提取得到高质量的d n a ， 这些方法包括多次氯仿抽提、高盐沉淀、区室法等去除多酚和多糖。但这些方法仍然存在着提 取咧闻长、操作繁杂、d n a 纯度仍然较低、成本较高等缺点。 2 柑桔番茄红素b 环化酶基因的研究进展 充分成熟的相桔果实中主要呈色色素是类胡萝b 素。类胡萝p 素的含量及组成影响柑桔果 实的色泽，继而影响品质和商品价值。类胡萝h 素作为光合作用的辅助色素，参与光保护，清 除活性氧，还是a b a 和某些芳香物质的前体。不少类胡萝h 素可转化为维生索a 为人体利用， 多数类胡萝p 素具有清除活性氧和抗癌作用，因此相桔果实的类胡萝b 素含量及组成也影响 了其保健价值。人们直对类胡梦h 素代酣途径十分关注，但由于该代谢的复杂性，直到上 个世纪术，植物类胡萝h 素合成代谢主链上的成员及其关键酶和基因才得到阐明( 徐昌杰， 2 0 0 2 ) 。 d 一胡萝p 索和番茄红素是最早也是至今最受关注的两种类胡萝n 素，前者可在人体内转变 成维生素a ，后者是所有类胡萝h 素中抗氧化能力最强、颜色最红的，并对多种癌症的发生和 发展有抑制作用。然而，番茄红素除了在柑桔红色芽变品种中高含量存在外，在其他柑桔中均 不存在，6 一胡萝h 素也通常不是利桔的主要类胡萝h 素。多数相桔果实类胡萝h 素u , a t 黄素 类为主( 可占类胡萝h 索总量的8 0 ) 。 发生色泽变化的天然相桔突变体有不少，但较为出名的一类是导致番茄红素积累的棚桔红 色突变体。未发生突变的利桔果实中通常不能检测出番茄红素，而有些红色突变体中番茄红素 可以成为最主要的类胡萝h 素。除了番茄红素积累，红色突变体都有b 胡萝h 素的积累。常见 的积累番茄红素的利枯种类有f a s t e z 粉红葡萄柚，m a r s h 粉红葡萄柚，r u b y 红葡萄柚，b u r g u n d y 红葡萄柚，c a r a c a r a 红肉脐橙( 徐昌杰，2 0 0 0 ) 。 浙江大学侦= 1 = _ 学位论文d n a 的砖越十纯化睦j 脐橙番茄红索b 环化酶捧闻筛选投l ：游序州分析 番茄红素在l c y b 催化下转变成b 一胡萝b 素，在l c y b 和番茄红素环化酶切、同作用下转变 成d 一胡萝h 索，b 一及a 胡萝b 素是合成途径中最先生成的具坏状的类胡萝h 素。但红肉脐橙等 突变体积累番茄红素是否与该基因突变有关尚无报道。徐昌杰等( 2 0 0 2 ) 根掘植物番茄红索b 环化酶基因的保守区序列设计p c r 对甜橙基因组d n a x 噬菌体文库进行p c r 筛选( 退火温度 为5 2 。c ) 获得甜橙番茄红素d 环化酶同源基因。结合亚克隆及r a p d 结果共获得20 2 7b p 序列， 包括完整编码区，不含内含子，编码5 0 4 个氨基酸。后续研究表明甜橙中存在两个不同序列的 番茄红索b 环化酶等位基因( 徐昌杰等未发表) 。 3 启动子研究进展 完整基因包括：1 ) 转录起始区( 含有对d n a 序列转录起始凋控作用的启动予以及增强子 等。2 ) 转录起始位点( t s s ) ：3 ) 5 不译区；4 ) 翻译起始位点：5 ) 外显予、剪切位点、内含 子、剪切位点、外显子：6 ) 翻译终止位点；7 ) 3 不译区：8 ) p o l y a 信号区；9 ) 转录终位点。 3 1 转录起始位点 高等植物基因的转录起始位点通常位于翻译起始密码子( a u g 上游一4 0 - - 7 0b p 处。大多 数情况下( 9 0 ) 转录起始位点周围为嘌呤残基，l u t c k e ( 2 0 0 0 ) 等分析了6 1 种植物的翻译 启始密码的序列后指出，植物a u g 密码旁侧的序列较为保守，常为a a c a a u g g c 转录起始 位点发生变化或缺失就会影响转录，但也有学者认为该位点不足以成为转录的必须信号。 一般情况下，真核生物只要满足以下基本条件即可完成转录：转录能力较强的启动子，这 些启动子可以不含增强子，但启动子必须能与r n a 酶正确结合。转录模板( 转录起始点( + 1 ) 一 终止点) ( t e m p l a t e ) ，转录模板一般及编码区。r n a 聚合酶i l ( r n ap o li i ) ，负责真核生物 蛋白编码基因的转录( 产物m r n a ) ，有7 1 0 个亚基， 最大亚基的羧基术端结构域( c t d ) 具有7 个氨基酸( t y r s e t - p r o t h r s e r p r o s e t ) 的重复序列，其中有多个磷酸化位点c7 1 1 d 磷酸 化对调控基因转录有重要作用。普通转录因子( g t f s ) ，r n a 聚合酶i i 的普通转录因子( t f i i ) 包括t f i i d ，t f l i b ，t f i i f ，t f i i e ，t f i i h ，【f | i a 等( 王颖等，2 0 0 3 ) 。 浙江 学删斗学位论义d n a 的辟攥十纯化法ij 脐橙蒋描红豢自捌，化酶糍川筛选发j + 游序刮分析 岗i 翼核生物届动于 3 2 启动子组成 启动子包括核心启动子和启动子上游近侧序列： 1 、核心启动子是决定转录起始位置的关键序列，也是普通转录因子t f i i d 的结合位点。 包括：t a t a 盒( t a t ab o x ) ，起始子( i n i t i a t o r ，l n r ) 。2 、上游启动子元件( u p s t r e a mp r o m o t e r e l e m e n l ，u p e ) 如c a a t 盒和g c 盒。 因此，根据已有基因序列研究发现，真核生物强启动子区序列的一般特征为：a 、t a l a 盒 或者1 n r 序列。真核生物启动子在2 5 一3 5 存在t a t a 盒，t a t a 盒是第一个被确定的r n a 聚合酶i i 的启动予元件，也是一些反式作用因子与d na 相互作用的位点之一。植物启动子 t a t a 盒是位于转录起点上游的一段富合a t 碱基对的序列，与动物启动子略有不同，其共通保 守序列为5 。t3 7 c 4 2 a3 r c 47 t9 6 a 。7 t9 0 a 9 4 t5 3 a9 5 t6 a7 lg 4 l3 。m 盯a 框依靠与转录因子tf i i d 的识别结合而发挥功能，介导决定r n a 聚合酶】i 起始转录的位点，以及介导前转录复台物的 形成并启始转录：t a t a 框足绝大多数植物启动子正确启动转录所必需的；不合t 姐a 框的基因 的精确转录受起始因子( i n i t i a t o r ，l n r ) 介导。i n r 元件并无一个十分严格的同源顺序，其中最 为关键的核昔酸是处于+ 1 的a 和+ 3 的t 。如果5 一a n t - 3 ( n 为任意核苷酸) 的两n + 4 到+ 5 和 1 到一5 为嘧啶，则成为强的i n r 。i n r 在功能上与1 a 1 _ a 框类似，常常通过与t fi i d 的结合决定 转录起始点的位置起始转录，并能介导上游至少一部分激活因予的调控作用，与t a t a 框不同， 1n l 元件与转录起点重合。b 、特有上游序列植物特有上游序列：如c a c g t g3 、般上游序 列：如c a a t 盒，g c 盒( g u s m a r o l i 等，2 0 0 2 ) 。c 、组成性启动子的增强子( 吴乃虎，2 0 0 1 ) 。 一般上游启动子元件在真核基因启动子中普遍存在c a a l 盒和g c 盒两种元件，它们或者 同时存在，或者只存在其中之一，有时还是多拷贝的。但并非所有的真核基因的启动子都存在 着一般上游元件，例如在植物细胞中就几乎不存在c a a t 盒。 浙江火学坝l 学位论文d n a 的硅藻t 纯化法与脐橙番茄红素b 环化酶器吲筛选及f i 游序列分析 第二章硅藻土纯化d n a 法的改进及其应用 植物表达载体的构建是植物转基因研究的必要环节，在应用于转基因研究之前，植物表达载 体的正确性需要得到鉴定。鉴定表达载体正确与否的常用方法有p c r 、酶切和测序。p c r 鉴定 最简便，但载体上重复序列( 如p b l l 2 1 有两处n o s 终止子序列) 的存在有时对鉴定带来麻烦， 另外偶而发生的不是在预期的酶切位点的连接不能被有效发现；酶切鉴定在实际操作中经常遇到 难以切开或酶切结果难以解释等问题；测序是最可靠也是最有说服力的鉴定方法，商业化的测序 服务使得一周内即可对植物表达载体的正误作出判断。 对于克隆于p u c 或p b s 等高拷贝质粒中的插入片段，商业化测序具有接近1 0 0 的成功率， 而植物表达载体的测序成功率往往较低，有时测序公司需要多次优化调整方能获得结果，但所得 的测序图谱仍然不够理想，测序错误普遍存在。究其原因，是因为植物表达载体大多属于低拷贝 质粒，质粒样品d n a 的纯度远低于高拷贝质粒d n a 。因而，出研究者向测序公司提供经纯化 的质粒样品较为理想。 商业化测序公司在质粒提取和纯化过程中通常也应用了各种来源的质粒提取和纯化试剂盒， 这表明这些试剂盒仍不足以实现低拷贝质粒的有效纯化。而且，在实际应用经历中，我们发现不 同批次的试剂盒纯化效果的不一致性c ! 王十分常见。因而，建立一种稳定的可重复的适于低拷贝质 粒纯化的方法十分必要。 同时，用胍赫( 盐酸胍或异硫氰酸胍) 取代n a l 也比较普遍，可避免了n a l 试剂久9 p 变色及 p h 升高导致的低i 亘i 收率问题。然而，先前的方法均没有就石主藻二匕等吸附介质的用量、| 耍j l 恢率以 及纯化效果等进行定量的描述，因而也就在一定程度上导致了纯化效果和回收奎的低重复性，影 响了方法的推广应用。 本研究对以往方法中的吸附介质用量进行了优化，建立了种回收率较高、纯化效果显著、 操作简便、重复性好的质粒纯化方法，并用此方法对一低拷贝质粒迸行了纯化并用于测序，获得 了十分理想的结果。本研究还对该方法在基因组d n a 纯化上的应用进行了试验。 堂i 坚叁堂 研。j 堂竺堡芝d n a 的硅藻十纯化法1 _ 脐橙番茄红索b 环化酶幕吲筛选发卜游序州分析 i 材料与方法 1 1 材料与试剂 i i 1 质粒与菌株、基因组d n a 提取材料 所应用的质粒p l z l 4 是一种基于p b l l 2 1 的植物表达栽体，长1 49 5 3b p ，是一种低拷贝质 粒。所应用的大肠杆菌菌株为t g l 。 利桔、葡萄、梨、香榧老叶( 均取自浙江大学华家池校区果园) ，红肉脐橙幼果( 取自浙江 黄岩柑桔所实验场) 。 1 1 2 硅藻土的制各 称取ig 硅藻土( c e l i t e5 4 5 ，f l u k a ) t 用5m l 蒸馏水悬浮并轻轻倒入已装有4 5m l 蒸馏水的 f n c o n e 管中t4 分钟后回收悬浊液，悬浊液再经1 3 0 0 9 离心- o 5 分钟，弃上清液。离心所得的 颗粒用等体积蒸馏水悬浮，经高压灭菌后4 保存备用。 1 1 3 试剂 盐酸胍为上海生工生物工程有限公司产品， ；l d n a 为t a k a r a 产品，其他试剂均为国产分 析纯试剂。 1 2 方法 1 2 j 细菌的培养和质粒的提取 按照分子克隆手册培养和碱法提取质粒d n a 。 1 2 2 基因组d n a 的提取 取o 5 克老叶片和幼果果肉，加入液氮研磨成粉术，加入4 m l 高赫清洗缓冲液，剧烈混匀后 1 5 1 0 ，0 0 0 r p m 离心5r a i n ( 若多糖含量较高重复此步骤，直至上清液不在粘滞) ；6 5 预热c t a b 抽提液；去上清，加入预热c t a b 抽提液中，另每m lc t a b 抽提液加入2 0 “i0 一巯基乙醇，用搅 拌器剧烈混匀，6 5 保温1h ；每隔1 0r a i n 混匀一次；1 小时后加入等体积氯仿异戊醇，颠倒混 匀后i5 ，1 0 ，0 0 0r p m ，5m i n ：移出上层水相加入1 1 1 0j 拳积c t a b n a c i ，用等体积氯仿异戊 浙江大学倾卜学位论文d n a 的硅藻十纯化法，脐橙谮茄红索b 环化酶摧陲l 筛选驶j 。游序列分析 醇抽提，4 ，7 l o ，0 0 0r p m ，5m i n 离心：移出上层水相，用酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 抽 提，颠倒混匀，离心；用等体积氯仿异戊醇抽提，离心；移出上层水相，加入2 3 体积异丙醇， 于一2 0 。c 放簧1 0m i n ，离心收集沉淀；用高盐t e 缓冲液溶解沉淀，离心去除不能溶解的杂质， 上清液移出，合并，加入1 1 0 体积n a a c 及2 3 体积异丙醇，混匀，此时会出现絮状沉淀，钩出 此沉淀，在7 0 g 醇中漂沈，晾干，溶于含r n a s e 的t e ，处理1h r 后冻于2 0 。c 。 1 2 3d n a 的定量 质粒d n a 样品与已知含量的k d n a 在l 琼脂糖凝胶上电泳；用不同方法提取的基因组 d n a 在同张琼脂糖凝胶上电泳，拍摄电泳照片，电泳图片用b a n d s c a n 45 0 软件进行定量。 1 2 4d n a 纯化标准方案 在d n a 样品中加入适量硅藻土悬浮液( 根据电泳定量结果，每微克质粒加入2 0u i 硅藻土 悬浮液) ，混匀；加入3 倍于d n a 样品及硅藻土悬浮液总体积的6m o l l 盐酸胍或异硫氰酸胍( 含 5 0 m m o l l t r i s ，2 0 m m o l l e d t a ，p h7 0 8 0 ) ，馄匀，冰上放置1 5 m i n ，每分钟混匀1 次( 轻 弹多下促使充分悬浮) ；】2 0 0 0r m ij 3 离心5 r a i n ，吸弃上清液，沉淀用7 0 乙醇悬浮：重复此步 骤；1 2 0 0 0r m i n 离心5r a i n ，充分吸弃上清液，沉淀于3 7 干燥1 0r a i n ；加入经7 0 预热的1 0 0 川r i e 7 0 保温1 0r a i n ，每分钟混匀1 次( 轻弹多下促使充分悬浮) ，1 2 0 0 0r p m 离心5r a i n ： 小心吸取上清液至新管，重复步骤，将两次上清液合并，于1 2 0 0 0r p n l 离心5r a i n ，小心吸取上 清液至新管；加入1 1 0 体积3 m o l l n a a c ( p h5 , 2 ) 和等体积异丙醇，混匀，置室温1 0 r a i n 后 一t ：- 1 2 0 0 0r p m 离心5r a i n ，弃上清液，沉淀用7 0 乙醇漂洗后于3 7 充分= | = 燥：溶于适量体积 的t e ，如用于回收率比较，则恢复至纯化前的体积。 1 2 5 确定硅藻土的最佳用量 取6 个】5m l 离心管，每管加入1g gxd n a ( 2 0 1 ) ，分别加入1 、2 、5 、1 0 、2 0 和5 0u l 硅藻土，用蒸馏水补充至总体积7 0 l ，随后按d n a 纯化标准方案步骤进行，最后d n a 溶于2 0 t e ，取5u l 电泳检测，并以5 川未经纯化的x d n a 为刘照。 1 2 6d n a 纯度的定义以及纯化倍数的计算 分别应用电泳法( 1 2 2 ) 和分光光度计测定a 2 6 0 法对d n a 的浓度进行定量，在本研究中 浙江人学坝卜学位论文d n a 的酢藻_ 十纯化法。j 脐橙番茄红豢0 环化酶糕筛选敬f 。游序列分析 质粒的纯度定义为电泳法定量结果与a 2 6 0 法定量结果的比值，纯化倍数= 纯化后的纯度纯化前 的纯度。 1 2 7 测序 质粒d n a 测序由上海生工生物工程有限公司完成。 1 2 8 p c r 检测 以纯化以后的果肉基因d n a 和广橙叶片基因组d n a 为模板p c r 。 2 结果 2 1 硅藻土最佳用量 研究表明，硅藻土的合适用量对于d n a 的回收斗分重要，过多过少地使用均不利于回收。 最佳用量是每微克d n a 样品中加入2 0u l 磕藻土悬浮液，此时回收率达7 7 3 1 。硅藻土悬浮液 用量为i o 利5 0 时的回收率分别为6 5 9 7 和6 3 4 8 ( 图2 1 ) 。 l234567 图2 1 礴澡十州颦对d n a 同收的影响 纯化前：2 7 ：分圳麻h 1 、2 、5 、1 0 、2 0 神15 0 叫砖藻十悬浮液。 2 2p l z l 4 质粒纯化的回收率和纯化倍数 应用所建立的d n a 纯化标准方案，剥碱法提取的p l z l 4 质粒进行了纯化，并对纯化前后的 质粒纯度进行了计算。纯化后质粒电泳结果如图2 所示表明质粮得到了有效回收，经过b a n d s c a n 分析表明，回收率达7 6 2 。另外，通过纯化有效地去除质粒样品中的小分子r n a ( 图2 2 ) 。 浙江人学坝卜学位论立d n a 的娃麒1 i 纯化泣o 脐橙需茄红素b 环化酶水川筛选发游序，l 分析 质粒样品中不可避免地含有杂质，有些杂质会造成a 2 6 0 吸收，从而使得通过a 2 6 0 计算的d n a 含量大大超出通过电泳法计算的含量，超出程度越大，表明d n a 纯度越低。p l z l 4 质粒纯化前 的纯度为19 8 ，远低于用相同方法提取所得的p u t l 9 质粒的纯度( 1 7 6 0 ) 。经过纯化，p l z l 4 质粒样品的纯度上升至2 3 8 7 ，比纯化前提高了1 1 0 6 倍。 2345 图2 2 砖藻十法对p l z l 4 质粒d n a 的纯化 1 ：纯化前：2 5 ：地化；彳。 2 3 质粒纯化对测序结果的影响 对未经纯化( 指未经本研究纯化，但测序公司的质粒制备过程中包括了常规纯化步骤) 和经 过纯化的质粒进行测序，获得了截然不同质量的测序结果( 图2 _ 3 ) 。经过与已知序列对比分析， 在所选区域中，经纯化的质粒的测序结果与预计结果完全一致，而未经纯化的质粒的测序结果中 普遍存在不能判断碱基、碱基判断出错以及碱基数判断失误等错误( 表2 1 ) 。表明未经本研究纯 化的质粒不宜测序，也表明经过硅藻土纯化的质粒达到了测序要求。 浙江火学硕七学位论文d n a 的砩藻十纯化珐吲脐橙番茄红豢8 王1 、化酶撼悸筛选及f 游序列分析 l i 。：。：。；：。，。：。，。，。翟，。、。：。； 碰躺肿晰：，飚搿州帅m 舭8 蚓23 朱经纯化和经过纯化的质粒洲序剧谱 】i i ：未经纯化的质粒洲序剀谱：i i ，i v ：经纯化的赝粒测序幽谱。 2 塑堡查兰塑! ：堂垡堡兰 ! 型! 塑堡竖丝些鲨：! ! 堕堂鱼堂塾蔓里兰兰塑堕曼堕堑型垡生坚堂壁翌堕羔l 表2l术经纯化的p l z l 4 质粒在测序时发生的筹错 发生差错的碱 在图谱中的位 对应的正确碱 在图谱中的位 差错类型 基 置基 置 n1 ( 2 8 一) a i i ( 3 4 ) 未能判断碱基 n ir 5 2 1 a 1 i ( 5 8 ) 未能判断碱基 n i ( 5 3 1 g i i ( 5 9 ) 未能判断碱基 n 1 ( 7 3 1 a i i ( 7 9 ) 未能判断碱基 n i i i ( 4 2 1 ) a v ( 4 2 6 ) 未能判断碱基 n1 1 ( 4 7 3 ) a 1 v ( 4 7 8 ) 未能判断碱基 n 1 1 ( 4 7 8 ) a i v ( 4 8 3 ) 未能判断碱基 n i i i ( 4 8 2 ) a i v ( 4 9 7 ) 未能判断碱基 al(61、t l i ( 6 7 ) 碱基判断出错 a a a a c c i ( 5 6 5 8 ) i l l ( 4 1 4 ) 1 1 i ( 4 6 2 ) t t t t g l l 侣l 一8 3 ) 碱基判断出错 1 v ( 4 1 9 ) 碱基判断出错 l v ( 4 6 7 ) 碱基判断出错 g g gi ( 2 3 2 5 ) g gi i ( 3 0 3 1 1 碱基数判断出错 一一一 + 山现在图3i 的2 8 何，其余以此类推。 2 4 应用硅藻土法纯化基因d n a 高盐清洗可以去除多糖，经过高盐清沈后的果肉d n a 纯度有了一定的提高r 但浓度急剧下 降，特别对于些成熟期果肉浓度下降更为严重。对于部分品种的老叶，葡萄、柑桔的叶片经普 通c t a b 法难以获得较高浓度的d n a ，电泳可见点样孔滞留严重( 数据未列出) ，而梨叶片合有 极多的多糖和多酚物质，采摘的老叶片冰上很快褐变，常规c t a b 法提取的梨d n a 呈粘滞状， 凝胶电泳时由于d n a 所含多糖过高，无法进入胶内。经过高盐清洗多次后梨d n a 仍然无法进 入胶孔见图2 4 a 第l 列。 经过硅藻土纯化后，凝胶电泳发现可以很好的去除杂质，不需r n a a s e 消化及可以去除r n a ， 含多糖和酚类最高的梨老叶片d n a 也成功进入胶内，点样孔滞留明显减少，纯度有了很大提高 ( 9 i l 图2 4a 第2 、4 列) 。 浙江人学坝。1 学位论文d n a 的硅藻十纯化注与脐橙番茄红案1 3 环化酶持刊筛选及卜游序列讣析 ab 幽2 4 砘藻十纯化c t a b 法提取的d n a a 梨、柑桔老叶c t a b 法提取的d n a 与经过砖藻十纯化后比较，第1 列为kd n am a r k e r ，4 0 n g ，2 ，4 列为 c t a b 法提取的梨、柑桔老n f 基冈纲d n a ，3 ，5 列为经过砘蕊十纯化后的相同材判。b 纯化后的红肉脐橙 聚肉d n a 紫外吸收定量结果高出电泳定量结果越多，在一定程度上反映d n a 越不纯。分光光度计检 测的d n a 量须结合电泳分析，分光光度计检测的d n a 量和凝胶电泳分析所得d n a 量我们定义 为纯度，详见本章讨论部分。 d n a 纯化前后分光光度计检测的浓度相差较大( 1 0 2 0 倍) ，电泳检测表明二者的量相差并 非如此( 2 - 3 倍) ，醴明经硅藻土纯化后较好的去除了d n a 样品中多余的杂质。d n a 纯度纯化 前后均相差近1 0 倍，这与纯化质粒所得结果相同。纯化后d n aa 2 6 0 a 2 8 0 的比值均接近1 8 t 而 未纯化均偏差较大( 表2 2 ) ；同时，d n a 回收率均达到3 5 以上，而般基因组d n a 回收试 剂盒回收率均难以达到此水平。 浙江大学碰l 学位论殳d n a 的雕藻七自e 化法与脐橙普茄红荣日环化酶堆h 筛选驶f 。游序列分析 表2 2 分光光皮计检；! 】1 4 普通c t a b 法和硅藻十纯化果树d n a 往：i ：c t a i 法，：石丰；蔡十法：纯度指鼯腔电泳的浓度分光光j 空计检洲敞度；同收率为纯化斤：的凝胶吧 泳浓度，纯化前的凝胶电泳浓度；得率根据凝胶浓度算得。 2 5p c r 检测脐橙果肉基因组d n a 以提取后的果肉d n a 为模板，用番茄红素p 一环化酶的一剥通用引物p l2 + p 1 9 ( 表3 2 ) 进行 p c r 反应。扩增得到的条带与以广橙幼叶d n a 为模板扩增的条带无异，如图2 | 5 。 i 芏| 2 , 5 脐桥贝肉基冈组d n a p c r 1 、2 、3 、4 ：模板为芝肉脐棒录肉摹田绷d n a ，5 ：楼板为r 攒幼n i 基闪纽d n a 6 ：模板为术经群稚卜法纯 化的粜肉d n a ，7 l ； j 性对照，8n l 2 0 0 0 m a r k e l 浙江人学颂l ! 学位论义d n a 的硅越十纯化泣ij 脐橙番茄红索口环化酶茉筛选及f ：浒序州分析 3 讨论 3 1 硅藻士的分级 硅藻土是古生物硅藻残骸的沉积物，是种多孔非晶体硅石，比较易得和便宜。在d n a 纯化中应用的硅藻土是白硅藻士，其s i 0 2 含量一般较高( 8 0 ) ，而且几乎不含有机物，使 用前不必经过酸洗。但无论是普通硅石粉还是硅藻土粉， 在使用前大多要进行分级，以去除过 粗和过细的颗粒。 颗粒大小对d n a 吸附能力有显著影响，研究表明，沉降速度为6c m m i n 、ic m m i n 和o 2 5 c m m i n 的颗粒的d n a 吸附能力约分别为0 , 0 0 9g g m g 、o3g g m g 和25g g m g 。细小颗粒具有较 大的d n a 吸附容量，然而那些通过离心不能有效沉降的过于细小的颗粒势必导致d n a 回收率 的下降以及最终d n a 样品中细微颗粒的残留。过粗颗粒因d n a 吸附能力极弱也不宜应用。因 而，本研究去除了沉降速度大于2c m m i n ( 5 0m lf a l c o n e 管中装入4 5m l 水后液面高度约为8c m ， 沉降了4 r a i n ) 的糯颗粒，并通过低速短暂离心去除过细颗粒，保证了合适的d n a 吸附能力和 回收率。研究表明，为吸附1g g ) 。d n a ， 以加入2 0 l 硅藻土悬浮液( 约合10 m g 硅藻土颗粒) 最为合适，因而硅藻土颗粒的吸附能力约为0li - t g m g 。考虑到本研究硅藻士颗粒的沉降速度大 多介于1 2c m l m i n 之间，这一结果与v o g e l s t e i n 等的结果比较相近。王柏秋等( 1 9 9 5 ) 提及的 一种吸附能力达3 45g g m g 的二氧化硅基质可能是种较细的颗粒。我们发现虫u 果舍弃沉降 速度介于l 一2c m m i n 之问的颗粒，则每克硅藻土试剂可制得的硅藻土悬浮液急剧减少。鉴于不 同厂商或不同批次生产的硅藻二l 颗粒粗细可能有所不同，也许本研究使用的硅藻土并不是最适于 d n a 纯化的品牌。另外，有些研究者不进行颗粒分级而直接使用，在这利t 情况下宜对硅藻土产 品进行d n a 吸附能力的测定，否则实验的重复性难以得到有效保证。 3 2 硅藻土的用量标准 合适的砖藻土用量是保证d n a 纯化效果和回收率的关键，这不仅需要对颗粒d n a 吸附能 力进行测定，还要求对进行纯化的d n a 进行精确定量。传统的d n a 定量是通过测定a 2 6 0 进行， 实际上这一方法很不可靠，因为d n a 样品中含有大量可导致a 2 6 0 吸收的杂质。本研究采用凝 胶电泳法对样品的d n a 含量进行定量，保证了定量的精确性和实验的重复性。 浙江火学坝士学位论文d n a 的硅蕊土纯化珐。，脐橙番茄红豢b 环化晦耩胂筛选艘j ! 蝣序列分析 3 3d n a 纯度与定量 紫外吸收定量结果高