（分析化学专业论文）扫描电化学显微术结合微反应器的单细胞分析.pdf

山东大学预 ：学位论文 中文摘要 本论文j l 分两部分：1 微反应器的构建、表征及结合扫描电化学显微术 ( s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y ，s e c m ) 的应用；l i 扫描电化学显微术 结合微反应器定量测定人单个中性粒细胞中的过氧化物酶( p o ) 。 第一部分我们制作了一种适于s e c m 现场电化学检测用的微反应器，并用 该微反应器对辣根过氧化物酶( h r p ) 活性进行了测定。首先在表面平整的有机 玻璃上构建一个微池，将h r p 及其底物h 2 q 和h 2 0 2 用自制微量加样器加入到 微池中孵育，然后在微池口上方推片浇筑多孔硝酸纤维素膜，从而制得微反应器。 将带有h r p 和底物h 2 q 、h 2 0 2 的微反应器放入含p b s 、h 2 q 、h 2 0 2 的电解池中， 甫径2 0u m 的a u 下作电极作为s e c m 的探头插入上述电解池的溶液中，并逼近 纠微反应器，亿微反应器二力。j j 拙。通过检测扩敞出微反应器的酶催化反应的产 物b q 的还原电流而测定h r p 的量。我们对电极电位，底物的浓度，电化学检 测的重现性，孵育时自j 和微池直径及深度等几种因素进行了研究，确定了h r p 检测的最佳实验条件为：p h7 4 的p b s 缓冲溶液；h 2 q 的浓度为2 0 0 x 1 旷m o l l ， h 2 0 2 的浓度为2 0 0 x 1 旷t o o l l ；探头电位为一0 3v ( v s a g a g c i ) ：孵育2 0m i n ； 电极为直径2 0 “m 的金圆盘电极；微池直径为2 0 0l a m 、深度为5 5 0 岬。在最佳 实验条件下，h r p 的线性检测范围在7 5 0 x 1 0 。9u 一5 6 3 x 1 0 。7u 之间，检测限可 达到3 7 1 0 母u 。同以往方法相比，本方法中待测酶在溶液中处于游离状态，可 以最大限度保持其活性。并且本实验中采用孵育和推片浇膜的措施，大大提高了 竹i j 父嗷j f l ：。 j 外，此方法i - 没仃瓴的 ：扰和f 乜极破污染的情况。 第二部分我们利用微反应器对中性粒细胞提取液及单个中性粒细胞中的过 氧化物酶( p o ) 进行了测定。为使细胞溶膜更方便，细胞先用d i g 穿孔，然后 用自制细胞加样器将单个细胞加入到微池内，通过冻融法溶膜，再用自制微量加 样器加入1 5n l 的含2 0 0 1 0 0m o l f l 。h 2 q 与2 0 0 1 0 刁m o l l h 2 0 2 的p b s 缓冲溶 液，用封口膜封口并避光孵育2 0m i n 。，硝酸纤维素浇膜之后，置于电解池中进 行s e c m 线性扫描。基于s e c m 扫描曲线上b q 产生的峰电流的大小，利用工 山东人学硕十学位论文 作曲线法进行p o 活性的定量测定。 关键词：扫描电化学显微镜，微反应器，单细胞分析，过氧化物脯 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h i st h e s i sc o n s i s t so ft w op a r t s ：i m i c r o r e a c t o rf a b r i c a t i o na n de n z y m ea s s a y c o m b i n i n gm i c r o r e a c t o rw i t hs c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y ( s e c m ) i i q u a n t i t a t i v e l yd e t e r m i n a t i o no fp e r o x i d a s e ( p o ) i ns i n g l eh u m a nn e u t r o p h i l su s i n g m i c r o r e a c t o rc o u p l e dw i t hs e c m i nc h a p t e ro n eo ft h i st h e s i s ，am i c r o r e a c t o rs u i t a b l ef o rs e c mw a sf a b r i c a t e d a n dh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) i ns o l u t i o nw a sd e t e c t e dw i t ht h em i c r o r e a c t o r f i r s to fa l l ，am i c r o e e l lw a sp u n c h e do nap l e x i g l a sp l a t eo f - 2m i l lt h i c h n e s su s i n ga d r i l l ，t h e nt h eh r pa n dh z q 、h 2 0 2w a si n j e c t e dw i t hs e l f - m a d em i c r o i n j e c t o ra n d l a s t l y ac e l l u l o s en i t r a t ef i l mw a sc o v e r e do nt h em i c r o c e l lt of a b r i c a t et h e m i c r o r e a c t o r t h eh r p a c t i v i t yw a sd e t e r m i n e db yd e t e c t i n gt h ep r o d u c tb qd i f f u s e d f r o mt h em i c r o r e a c t o r s e v e r a lf a c t o r si n c l u d i n gd e t e c t i o np o t e n t i a l ，c o n c e n t r a t i o no f h 2 qa n dh 2 0 2 ，r e p r o d u c i b i l i t yo fd e t e c t i o n ，t h et i m eo fi n c u b a t i o na n dt h ed i a m e t e r a n dd e p t ho fm i c r o c e l lw e r ei n v e s t i g a t e da n dd i s c u s s e d t h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n s w e r es u i t a b l ef o rd e t e r m i n a t i o n ：p h y s i o l o g i c a lb u f f e r e ds a l i n e ( p b s ，p h7 4 ) ； c o n c e n t r a t i o no fh 2 qa n dh 2 0 2 ，2 0 0 x 1 0 。m o l l ；d e t e c t i o np o t e n t i a l ，- 0 3v ( v s a g a g c l ) ；i n c u b a t i o nt i m e ，2 0r a i n ；d e p t h ，5 5 0l a ma n dd i a m e t e r , 2 0 0p m o ft h e m i c r o c e l l u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n so ft h ee x p e r i m e n t ，t h el i m i to fd e t e c t i o no f t h em e t h o dw a s3 7 x 1 0 - 9ua n dt h el i n e a rs c o p ew a sb e t w e e n7 5 0 x 1 0 - 9u - - 5 6 3 x 1 0 - 7 u c o m p a r e dw i t ho t h e rm e t h o d s ，t h es e n s i t i v i t yh a db e e ni m p r o v e db e c a u s eh r p i s f r e ei ns o l u t i o na n dt h em e t h o do fi n c u b a t i o na n df l a t t i n gt h ec e l l u l o s en i t r a t es o l u t i o n w i t hag l a s ss l i d ew a sa d o p t e d i nc h a p t e rt w o ，am e t h o df o rd e t e c t i n gp oo fs i n g l eh u m a nn e u t r o p h i l sw i t h m i c r o r e a c t o rb ys e c mw a sd e v e l o p e d i nt h i sm e t h o d ，f i r s t l y , as i n g l ec e l lp e r f o r a t e d b yd i g i t o n i nw a sm a n i p u l a t e dt ot h em i e r o c e l l ，a n dl y s e du s i n gaf r e e z e t h a w i n g t e c h n i q u e t h e np h y s i o l o g i c a lb u f f e rs a l i n ec o n t a i n i n g2 0 0 x 1 0 + 3m o v lh 2 qa n d i v 山东人学硕l 学位论文 2 0 0 x 1 0 dm o l lh 2 0 2a st h es u b s t r a t e so f t h ee n z y m e c a t a l y z e dr e a c t i o nw a si n j e c t e d i n t ot h em i e r o c e l la n di n c u b a t e d2 0m i n a n dt h e nat h i nc e l l u l o s en i t r a t ef i l mw a s c o v e r e do i lt h em i c r o c e l la sb e f o r e l a s t l y , t h ep oa c t i v i t y i nas i n g l ec e l lw a s d e t e r m i n e db ys e c m k e y w o r d s ：s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s c o p y , m i c r o r e a c t o r , s i n g l ec e l l a n a l y s i s ，p e r o x i d a s e 山东大学硕i ：学位论文 符号与缩写 1 ，4 苯醌， 扩散系数 毛地黄皂苷 探久i i l 化 葡萄瓣氰化酶 辣根过氧化物酶 对苯二酚，氢醌 基底的电流 探头上的电流 稳态极限电流 探头的校正电流( = 州打。) 校正距离( = d 亿d ，探头与基底的距离：a 探头的半径) f t 迎炽反应的f 乜了转移数 化，l ! h 水 过氧化物酶 扫描电化学显微镜 扫描探针。显微镜 扫描隧道显微镜 超微电极 微全分析系统 q 曙 弧肿投 一 搭d 阿m m | 堇膦 殴。魄止喊脚呈：趣打斤l 。朐一洲洲一脚 原创性声明 术人郑熏声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 、 ：进 j ：研究所墩 1 1r j 。, 果。除文，i 一已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作i j j 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 逸毫德 i l 4 期： 2 鲤! ：主星 关于学位论文使用授权的声明 本人完令了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交沦文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权f l j 东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存沦丈和汀编木学位论文。 ( f y 密论义在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：塑：妄焦导师签名：丝堕堡日期：_ 2 煎：三：鸷 山东大学硕t 乒位论文 前言 l 扫描电化学显微镜及其特点 作为现代仪器分析手段的重要分支之一，电分析化学技术只有灵敏度商，选 择性好、响应时m 短和方法简单等优点。自从二十世纪7 0 年代未超微i 【l 极出现 以后，超微电极( u l t r a m i c r o e l e c t r o d e s ，u m e s ) 在电化学研究方面的优势越来越 明显。在研究细胞时，超微电极可以放簧在细胞附近或插入细胞内进行检测，具 有选择性和化学功能。b a r d 【1 - 3 】等人借鉴了扫描隧道显微镜( s c a n n i n gt u n n e l m i c r o s c o p e ，s t m ) 的技术原理，结合超微电极在电化学研究中的优势，于上世 纪8 0 年代米提出和发展了一种新型的扫描探针显微镜( s c a n n i n gp r o b e m i c r o s c o p e ，s p m ) 技术一一扫描电化学显微术( s c a n n i n ge l e c t r o c h e m i c a l m i c r o s c o p e ，s e c m ) 。它的工作原理是通过测量在基底上方扫描的超微电极 ( u m e ) 上产生的电流变化，进而反映基底的形貌及性质的不同。其分辨率介 于普通光学显微镜和扣挑隧道显微镜之间。同其它s p m 相比，s e c m 的特点之 一是能够检测局部微区的电化学现象，弥补了其它s p m 不能直接提供电化学信 息的不足。 2 实验装置及s e c m 探头 常规的s e c m 装霄如图l 所示，主要由电化学部分( 电解池、探头、基底、 参比电极，辅助电极和双恒电位仪) ，用来精确控制探头位置的压电驱动器以 及用来控制操作、获取和分析数掘的计算机( 包括接口) 三部分组成。用作 探头的有u m e 和微、纳米管等，把探头固定在出三维马达控制的爬行器上， 使探头在基底上方沿x 、y 、z 轴各方向精确移动，精度可以达到纳米级。基 底固定在电解池的底部，可以是各种材料的电极，也可以足固定有生物物质 或细胞的绝缘基底。爬行器及固定电解池的载物台都放置于一个稳固的平台 上，以减小震动所引起的噪音和误差。通过双恒l 乜位仪可控制探头和基底的 电位。计算机通过位置控制器来控制x y z 三维爬行器在基底上方移动。与此 同时，由电化学分析仪测定探头上的信号变化而得到基底的三维图像。 山东人学硕仁学位论文 a 幽ls e c m 仪器装置示意图 a ，技胃方桩示意i 射；b ，爬行器示意图 b 其中s e c m 的探头足一个相当重要的组成部分。s e c m 在扫描基底成像 时，它的分辨牢人小就足e 探灭的人小决定的；而il ，s i c mj i ：头利料的不 同也影响其检测物质的不同。s e c m 的探头一般来说为被绝缘层包围的超微 圆盘电极( u m d e ) ，常为贵金属或碳纤维【4 ，5 】，半径在微米或亚微米级。制作时 把清洗过的微电极丝放入除氧毛细玻璃管内，两端加热封口，然后打磨至电极部 分露出，由粗到细用抛光布依次抛光至探针尖端为平面，再小心地把绝缘层打磨 成锥形【6 】，以在实验中获得尽可能小的探针一基底b j 距( d ) 【7 】。也少量涉及到 半球面电极。而锥形的电极尖端因探针电流不随探针一基底间距( d ) 而变化， - 投 1 4 少他川1 4 8 l 。阢? i ；l ! ( m 技术及u m e 技术的发腱，s e c m 所应用的探头 j 下向着小型化、多样化迈进。由于s e c m 的分辨率从原理上说主要是由其探头 大小决定的，因此s e c m 探头的小型化更为迫切。自从1 9 9 2 年b a r d 小组【9 】提 出了s e c m 锥形纳米探头的制作方法以来，科学家们发明的制作s e c m 纳米 级探头的方法多种多样【l o 1 3 】。其中制作探头的材料包括碳纤维，铂等，探 头直径更是从儿个纳米到几百个纳米不等。s e c m 探头的小型化为其检测业微 米级甚至纳米级样品提供了可能，而它的多样化则极大的拓展了s e c m 的研 究领域。1 9 9 5 年，b a r d 等人【1 4 】研制出一种新型玻璃微管探针。它利用电子 在两种互不相溶的电解质溶液界面的迁移进行检测。近年来，科学家们又研究出 2 山东大学硕f j 学位论文 亚纳升体积的s e c m 微电解池【1 5 】，而且对于超微电极的研究也从平板电极和 半球体电极【1 6 】发展到了超微圆环电极【1 7 】及环盘电极【1 8 。s e c m 采用化 学修饰电极和生物传感器探头也是多有报道【1 9 】。另外，很多非电化学活性 的物质也通过不同的s e c m 探头进行了检测，如c l 。选择性微电极已作为探头 榆测在电化学转换导电高分子时的c l 。流馒【2 0 】和会属腐蚀时的c l 。浓度分布 l 钭l ! i j 。f 啦川刈i i 仃选j fr j 的微p f i 探头l 三测譬了钢、铝腐蚀时的表面p h 值 以及还原水、酶催化水解尿素和用酵母对葡萄糖新陈代谢的区域p h 分布图 【2 2 】。由金属锑制成的探头比较特别，它既可以作为伏安式也可作为电位式的 探头，这主要是因为锑对p h 敏感f 2 2 ，同时可还原氧。l i u 等【2 3 】采用锑 电极测定了单个哺乳动物细胞的氧化还原活性( 伏安响应) 和酸碱活性( 电 位响应) 形貌图。 3s e c m 工作模式 s e c m 是以r u 化学原耶为坫础，贝彳以下两个优点：( 1 ) 能够用于反应机 肌的圳究和探测界i f i i 现象；( 2 ) 分辨率商，在微水级和纳米级范围内，传质 速度快，可以在稳态条件下研究快速反应过程。s e c m 可以以多种模式进行实 验，如反馈模式、产生，收集模式、穿透模式、离子转移反馈模式、平衡扰动 模式、电位测定。 本论文实验过程中均采用产生，收集模式，它是一种常用于定量分析的模 式。产生收集模式是指s e c m 的一个工作电极产生的物质被第二个工作电极 收集到的一种工作模式( 见图2 ) 。它又分为二类；( 1 ) 基底产生，探头收集模 式( s g t c 模式) ，( 2 ) 探头产生，基底收集模式( t g s c 模式) 。对于后一种 模式，由于探头的直径远小于基底的直径，因此对探头产生的稳定物质基底 f 门收求效串接近1 0 0 。这种杉! j 衄川小太广泛，- t 要用于研究溶液中的均相 反应1 2 4 2 8 j 。s g r c 梭足延川比较j 。泛的收桀模式如同3 - a 所示，在壁 底某一位置上有氧化态的物质( o ) 产生，而在其它位黄则没有，此时在探头 上恒定一个能使氧化态的物质( o ) 被还原成还原态物质( r ) 的电位，当探 头在离活性点较远的位霄扫描时，探头上检测到的电流是很小的；当探头扫 描到活性点上方时，产生的氧化态物质( o ) 就可以在探头上被还原生成还原 l j 东入学伸! i 学仃沦史 态物质( r ) ，此时探头上的电流就会相应的增大( 如图3 b ) 。通过这一原理 就可以检测基底性质及形貌的变化。这种模式通常被用来测定基底上产生或 消耗的物质的流量和浓度分布图。它不同于反馈模式和t g s c 模式那样整个 氧化还原过程只能局限于探头和基底之h j 的一层很薄的溶液层之间，而足探 头在基底产生的一个很厚的扩散层中进行测定。s g t g 模式的缺陷：若探头 是电流型电极，探头上发生的电极反应消耗了基底产生的物质。这会使基底 的扩散层发生明显的扰动。另外，移动探头会引起基底扩散层的搅动和收集 效率( i t i s ，i s 是基底的电流) 的降低。 r ro rr _ _ 3 _ 止 i ! i2 产生收集模式 w 竺 a x ( p m ) b 酗3s e c m 的收集模式示意图 a ：s g t c 模式原理示意图；b ：s g t c 模式所得检测图形 4s e c m 在生物方面的应用 s e c m 最初被用于电十发与电解质问界面的研究，包括探洲表面形貌图【2 9 】， 对材料进行微加工【3 0 】，进行电化学动力学研究 3 1 3 9 。此外s e c m 还被月j 于 4 山东大学硕士学位论文 电化学现象如腐蚀的研究中【3 9 4 1 。d i 于s e c m 主要足在溶液巾进行工作并提 供所需信息的，所以对生物体系外部环境的破坏可以尽量的降低，因此用s e c m 对生物体系进行测最和成像有着很大的优势。随着s e c m 应用的不断拓展，目前 s i ：( 、m 九帆n q 究【4 2 5 5j 、细胞的研究【2 3 ，5 6 7 h 、抗原抗体复合物【7 2 7 8 】和 d n a 的检测【7 9 8 2 1 等生物领域得到广泛应用。在这里我们着重介绍一下用 s e c m 对生物体系的测量和成像。 4 1 酶的研究 s e c m 对于酶的研究有其独特的优势，既可定量测定酶反应的动力学常数， 又能直接得到酶催化活性分布的形貌图等。在酶的研究中产生收集模式应用 很多，因为有些酶的动力学反应太慢，无法用反馈模式来进行研究s e c m 不 仅被用作检测电活性点的工具，能提供准确定量的理论，还可以作为模拟和 分丰j ，传感器阳列f 川勿洒r i ：的一i ：具。 p i e r c e 等【4 2 】用反馈模式研究了微米厚度的孔层中的葡萄糖氧化酶 ( g o x ) 催化1 3 - d 葡萄糖氧化为d 葡萄糖内酯的反应。溶液中的还原型介质 在探头上发生氧化反应产生氧化型介质，此反应受扩散控制。只要有足量的 葡萄糖存在，此氧化型介质就会在固定于基底表面的g o x 催化下与葡萄糖反 应生成还原型介质和d 葡萄糖内酯。此时酶与介质问的动力学为零级反应。 按此机理求得了几种介质存在下的表观异相反应速率常数。他们又用类似的 反馈模式研究了聚碳酸酯膜孔中固定的g o x 和鼠肝脏线粒体膜上的n a d h 细胞色素c 还原酶【4 3 】。z h o u 等 4 4 】用两种方法把辣根过氧化物酶( h r p ) 网定在绝缘肛底卜：( 1 ) i i r p 与聚物发生交联反应而共同f ；i i | 定在玻璃片上， ( 2 ) 川榭l d 的j g 聚物蚓定亲和素。这两种方法固定后，在共聚物的上方覆盖 有微扎的聚碳酸酯膜。用第- - f l , 方法固定后可以直接测定微孔处的h r p 。而 用第二种方法固定后再加入生物素化的h r p ，利用生物素和亲和素的特异性 反应，把h r p 固定在绝缘基底上。该方法在直径约7p m 的区域内可以检测 到大约7 1 0 5 个h r p 分子 研究表明，s e c m 可以用束制作和分析表面上微米酶点的构造，这有可 能用在生物传感器的小型化设计中。w i t t s t o c k 和s c h u h m a n n 【5 0 】设计了一种 山东大学顾f ：学位论文 可以用s e c m 在金电极上固定微米级的g o x 点的方法。他们把s e c m 的探头 逼近到自组装有十二烷基硫醇的大面积金电极的上方，把探头作为对电极， 大面积金电极为工作电极，在1 2 到+ 1 2v ( v s s c e ) 扫二圈循环伏安。这样， 探头下方的十二烷基硫醇就会从金电极表面脱附 5 1 】。c y s t a m m i n i u m d i h y d r o c h l o r i d e 就会吸附在裸露a u 电极表面上。再通过希夫碱反应连上g o x ， 即可得到固定的微米级的g o x 点，最终用铂探头s g t c 模式测定了基底产生 的h 2 0 2 。另一种构造酶点微型图案的方法是通过改变局部化学环境，在微米 或、l f 微米水f 上改，史酶的活性，如s h i k u 等【5 2 】报道了使固定的心肌黄酶局 部失活的文章。把铂探头靠近酶基底，在探头上加一个很讵的电位，溶液中 的氯化物和溴化物就会在探头上发生氧化反应分别生成c 1 2 和b r 2 ，它们再与 水反应生成h c i o 和h b r o ，当h c i o 和h b r o 扩散到酶基底上时就会使心肌 黄酶失活，随探头走过的轨迹在酶层上产生一条失活的酶线( “m 级) 。 前面所提到的酶都是氧化还原酶( 如g o x ，h r p 等) ，s e c m 是通过测定 其电活性反应物及或产物来实现对酶活性的测定的。实际上，s e c m 还可以 用来研究非氧化还原酶的活性。h o r r o c k s 和m i r k i n 4 5 】用电位型探头测定了 固定在金微圆盘电极基底上的非氧化还原酶一尿素酶的活性及其与基底所加 i 乜化之m 的川火忆。他1 f j ) l jn i i 。离f 选择l 乜 及米测定僧：化尿素水解产生的 n h 4 + 研究发现，当会基底电极的电位在o 一0 4v ( v s a g a g c l ) 扫描时， 尿素酶发生可逆性的失活。这种失活复活的现象是酶的四级结构随电场和界 面离子成份改变而发生变化的结果。 近几年来，s e c m 对酶的研究进一步深入。g f i s p h r 等 5 3 采用一种新型 微型分配器在金表面制成了微米尺寸的酶网。用分子自组装和交联聚合法固定 酶，分别得到了单分子层和多分子层的酶层。并用交联聚合法制备多酶偶联结构 的酶网，如双酶偶联( g o x 和过氧化氢酶) 和三酶偶联( a 葡萄糖苷酶、变旋酶 和g o x ) 。上述酶相互交叉形成的酶网可以用s e c m 的产生收集模式通过测定 酶反应产，- 的h 2 0 2 来进行农征。溶液中的简萄糖和氧气在g o x 单分子层的催化 下生成葡萄糖内酯和h 2 0 2 ，因此在g o x 的位置探头的电流增加。2 0 0 4 年z h a o 等提出了一乖| ，提高灵敏度和分辨率的s e c m 检测方式【5 4 】，它结合了反馈与收 集两种模式的优点。他们利用这种新的检测模式检测了半乳塘苷酶( g a l ) 和葡 6 山东大学硕士学位论文 萄糖脱氢酶( g d h ) 多酶体系。g a l 和g d h 被固定在顺磁性磁珠中，溶液中对 氢j i l 尿毗i 帕半乳船( p a p g ) 在g a l 作用下产生对氨基苯酚( p a p ) ，后者又被 氧化为对一醌业胺( p q i ) 。p q i 是g d h 的一种有效辅助因子【5 5 】，它扩散至极 微小的酶点在d 葡萄糖存在的情况下被固定的g d h 重新转变为p a p ( 图4b ) ， 然后p a p 重新扩散至超微电极从而完成反馈循环。这样超微电极的电流来自两 部分：一是p a p g 经g a l 作用产生的p a p 的氧化( g c 模式) ；二是探头还原产 生的p o i 经g d h 作用( f b 模式) 所产生的p a p 的氧化。该模式下由于反馈产 生的p a p 使得探头电流较传统的收集模式下的电流有明显增加( 图5 ) ，反馈所 产生的信号放大效应仅仅发生在g d h 所处位置的部分区域。 恻w 图4 结合收集模式与反馈模式g a l g d h 多酶体系检测原理图 备 a ) 无葡萄糖情况下传统收集模式检测g a l ；b ) 有葡萄糖情况下信号增大 2 0 x g j m - - - - - - - 一 图5 通过多酶体系微点中心的s e e m 线性扫描曲线 a ，传统收欠卡萸式，无简曲船存企；b ，收集模式与反馈模式相结合，有葡萄搪存在 他 “ a l汕 i f i 东人学颂i 。学付论艾 4 2 细胞的研究 s e c m 开发的初期，人们就在不断尝试将其应用拓展到生物领域。继b a r d 小组 5 6 ，5 7 】首次用反馈模式做出了草和l i g u s t r u ms i n e n s i s 叶子表面的形貌 图以及用收集模式测定了e l o d e a 叶片上光合作用产生的氧气和气孔释放氧气 分布图之后，细胞的形态和性质逐渐成为s e c m 研究的热门课题之一。s e c m 用于研究单细胞有其独特的优势：( 1 ) 对细胞的形态及活性无太大影响，可 以实现细胞活体测定；( 2 ) 只对有电活性的物质有响应，选择性好；( 3 ) 可 测定跨膜电荷传递的速度，进而研究细胞内的氧化还原活性。 近十年，m a t s u e 小组和m i r k i n 小组围绕单细胞做了一系列的工作。m a t s u e 小组测定了c n 对活的人体癌细胞( s w - 4 8 0 ) 呼吸活性的影响【5 8 】。用双微 圆盘电极通过同时测定两种电活性物质一k 4 f e ( c n ) 6 和0 2 ，同时得到了原生质 细胞的形貌图和光合作用产生0 2 的s e c m 图【5 9 。研制了一种固定有细胞的 生物微芯片，研究了两种抗生索一安比西林和链霉素对大肠杆菌活性的影响 f 6 0 1 。测定了单个牛胚胎在培养状态下各个分裂阶段氧的消耗速度 6 1 。还研 制种有阵列微孔的硅片，把二种癌细胞一k 5 6 2 ，抗阿霉素k 5 6 2 用胶原固定 在微孔中。用s e c m 在微i l 上方扫描，测定细胞团的呼吸活性以及抗癌物质 对细胞活性的影响【6 2 】。m i r k i n 小组利用溶液中不同种类的氧化还原介质在 细胞膜上与活细胞内的氧化还原物质有可能进行电子交换的原理，用s e c m 探测了单个哺乳动物细胞【2 3 ，6 4 】的氧化还原活性和酸碱活性( 见图6 ) 及具 有双层膜的紫色光合作用菌( p u r p l ep h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ) 的氧化还原活性 6 5 】。并且进一步研究了哺乳动物细胞中电荷转移反应的机理【6 6 ，提出了根 据氧化还原活性区分正常细胞和癌细胞的新思路【6 7 】。他们所采用的是在 s e c m 探头上产生还原型氧化型介质，这些介质有可能进入细胞并在其内部 再被氧化还原，这个过f 7 就会被探头收集，产，上电流的增加( 正反馈) 。此过 程随氧化还原介质的种类、浓度及细胞的种类而变化。另外h e n g s t e n b e r g 【6 8 】 研制了一种利用剪力传感器控制探头和基底之间高度的s e c m 。用这种方法得 到了神经细胞株p c i 2 的s e c m 图。并把探头固定在细胞上方，记录了加入 k + 后所产生的胞吐过程。l i e b e t r a u 【6 9 】用负反馈模式测定了p c i 2 的形貌图， 并选用合适的氧化还原介质及不同类型的探头实时监测了p c i 2 细咆形态的 8 变化。b a r d 小组研究了甲萘醌浸入酵母细胞后与酵母细胞内的谷光甘肽反应， 产生了氧化型产物，利用p t 电极( 直径2 5 岬) 探头测定了该氧化型产物的 还原电流【7 1 。w i p f 小组 7 0 】利用两种工作模式( 恒电流模式和恒阻抗模 式) 研究了神经细胞，发现恒电流模式等距离细胞成像可以获得很高的分辨 率，而恒阻抗模式不需要额外加入介质，可以直接在细胞培养液中成像总 体上说，现在用s e c m 来研究细胞主要采用二种方法：( 1 ) 加入可逆型氧化 还原介质利用反馈模式得到细胞的形貌图；( 2 ) 通过测定细胞产生或消耗的 氧气利用收集模式来进行研究。 c o t ： o t i pd i s p l a c e m e n t p m 图6 探头在细胞上方的扫描曲线 4 3 抗原抗体复合物和d n a 的检测 绝大多数生物键合反应和d n a 蛋白质相互作用都不能产生可以检测的电 化学信号。为了要用s e c m 对它们进行检测，必须先用标记技术使之标记产 生氧化还原信号的物质，再用探头来检测。s h i k u 等【7 3 ，7 4 】用与酶联免疫吸 9 山东大学硕 学位论文 附法类似的方法得到了抗体一抗原一酶标抗体这样的央心化合物。用这种方 法测定了癌胚抗原，绒膜促性腺激素和胚盘促黄体激素。z h a n g 等f 7 2 通过 在水平基底f ：构筑可拆卸的微反应池的方法进行酶免疫反应，测定了乳腺癌 相关抗原c a l 5 3 。w a n g 等【8 0 ，8 l 】曾利用银增强及鸟嘌呤氧化在电极上产生 的正反馈，检测了d n a 微陈列中d n a 的杂交反应，并得到了最低每个点3 0 a m o l 的检测限。另外，b a r d 小组【7 9 ，8 2 】用信号灵敏度 2 5 0u r a g ，中国医药集l 毋上海化 学试剂公司) ，氢醌( h 2 q ，分析纯，中国医药( 集团) 上海化学试剂公司) ，苯 醌( b q ，化学纯，北京芳草医药化脚开制公司) ，过氧化氢( 含量3 0 ，分析 纯，江苏徐州试剂二厂) ，磷酸氢：二钠( n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ，分析纯，汕头市化学 试剂厂) ，磷酸二氢钠( n a h 2 p 0 4 2 1 1 2 0 ，分析纯，西安化学试剂厂) ，氯化钾( 分 析纯，北京双环化学试剂厂) ，苯酚f 分析纯，莱阳经济技术开发区精细化工厂) ， ! 烯i 钛苯酚( 9 9 n e wj e r s e y ，l i s a ) ，厶二酣独丁醚( 化学纯，北_ ! 化工厂) ， f p 醇( 分析纯，天津市广成化学试刺有限公司) ，氨水( 分析纯，济南i l 隍 旗第 ：化1 ：j 一) ，无水乙醇( 分析纯，1 i 洳振兴化工一厂) ，胶棉液( 5 f i l l j 胺纤维索 的乙醇乙醚溶液，化学纯，上海烫会材料厂) ，固化银胶( f h s 2 0 3 型，广东省电 子元件工程技术研究开发中心) ，5 0 2 胶( 山东禹王实业有限公司禹城化工厂) ， ! i c 7 0 4 胶粘剂( 江苏无锡市锡光有机硅材料厂) ，弹性石英毛细管( 外径3 7 5l a m ， 内径2 5i t m ，河北永年光导纤维厂) ，直径2 0g m 金丝( h d 2 型，纯度 9 9 9 9 ， 贺利氏招远贵金属材料有限公司) ，塑料培养皿( c e l lp l a s t i cd i s h e s ，4 0m i n x 9 山东人学顺l7 他论文 m m ，b b i ，c a n a d a ) ，p a r a f i l m 封口膜( p a r a f i l m ，u s a ) 。 1 0 0 x 1 0 2m o l l k 3 f e ( c n ) 6 和o 5 0 0m o l lk c i 溶液：称取o 1 6 5g k j f e ( c n ) 6 和i 8 6gk c i ，用水溶解，定容奄5 0m l ，避光保存。 1 0 0m o l l 过氧化氢溶液：移取用k m n 0 4 法标定过的浓度为约3 0 h 2 0 2 溶液1 0 3 0t t l ，用水稀释至1 0m l 。低浓度h 2 0 2 溶液现用现配。 o 1 0 0 m o l l 氡醌溶液：称取o 1 1 0g 钮醌，用水溶解，定容至1 0 m l ，避光 f 1 1 打。 5 0 0 x 1 0 。m o l lb q - 称耿b q5 4 0m g ，加水溶解，定容于1 0m l ，超卢 溶解，避光保存 生理捕水( p h y s i o l o g i c a lb u f f e r e ds a l i n e ，p b s ，p h7 4 含0 ，1 5m o l ln a c i ， 7 6 x 1 0 。m o l ln a 2 h p 0 4 ，2 a x l 矿m o l l l 。n a h 2 p 0 4 ) ：称取n a c i1 7 0 g ， n a e h p 0 4 。1 2 1 1 2 00 5 1 6g ，n a h 2 p 0 4 2 h z o0 ，0 8 7g 溶于水中，然后定容至2 0 0 m l ，。 现用现配 电极绝缘液的配制：称取0 0 1 7 0g 苯肋。0 0 3 7 0g2 - 烯丙基苯酚和0 0 5 3 3g 乙二聍独丁醚，加入3 m l l ：1 甲醇和水的混合溶液，用浓氨水调p h = 9 0 。 6 2 5l j m l ，h r p ：称收2 5 0m gh r p ( i , q 住 2 5 0u r a g ) ，用水溶解，定容伍 1 0m l 。低浓艘溶液用缓冲溶液稀释。 成膜液：将等体积的胶棉液与无水乙酣混匀，置于5m l 离心管中密封储存。 铬酸沈液：将1 2 0g 重铬酸钾溶于l o o t ) m l 水中，在搅拌的情况下缓慢加入 2 0 0 m l 浓h 2 s 0 4 。 除注明外，所用其它试剂均为分析纯，溶液均用亚沸蒸馏水( 蒸馏水经亚沸 蒸馏后的水) 配制。溶液均保存于4o c ，i 避免生物物质的污染。 应该注意的是，酶本身就是蛋白质，仍：俘或使用不当就会使酶失活或变质， 同时也要采取措施以防i ：外源性的污染。刚此在整个实验过程中，要进行必要的 火胁分狄擞f 1 以将微小物的 染程度减1 - i 量小。 1 2 3 实验方法 1 2 3 i 金电极( 探头) 的制作 会i 【l 极的；制作方法如下：将直径2 0p n l 的会丝( 纯度兰9 9 9 9 ) 在丙酮中浸 i | j4 、人学帧i 学位论史 泡i i j 沈约lr a i n ，川镊j 二收，放ni 净的翻纸l 炼十。川r - 术j 斤切成约0 5c m 的小段。把一根k 约5c m 的机制麓( 直径5 0 0p m ) 川细砂纸引肼光毙，除占表 面的氧化层，然后1 j e 相i 锕丝的一端触取适量银导r n 胶，用银胶把金丝札到孝l 臼】丝 上。将会丝一端州f ：放胃咆极，然析将其罱于2 1 0o c 炽衔巾加热3 0m i n ，令银 胶踟化。加热结束后，在铜丝与仑缝的接界处涂上h c 7 0 4 胶札刺，以酗红绝缘 过程中银导电胶或铜丝与绝缘溶激接触，室温固化2 4h 。将固化盘的l 【l 极在一：次 水一i ，超卢清沈5 m i n ，| i ； 二f ：后胃入f “做绝缘液中，在a u l 【l 极与p t 刈l u 极i 1 ) j l l4 0 v 的直流电压( 如图l - 2 所示) ，2 0r a i n 后将电极从绝缘液中取出。置于1 5 0o c 烘 箱c l l 烘3 0r a i n ，从而伍电极表面形i 此一层致密的绝缘联，使电极完个绝缘。 l 乜 圾他川州，将i 【l 擞m 卜似蒯定n f f 鹏”。l ：使金丝蚍近坡j 1 ，川r 术川力：，盒丝 垂直的力向迅速切f ，在显微镜下脱察，金丝被切平。制作好的l 【i 极纠i 陶示意图 如图l - 3 。 金电极 幽1 - 2 缸电极绝缘示意l i ( 1 租铜丝a u 丝 h c 7 0 4 胶袖刺 ! i1 - 3 仑i u 极结构示意幽 i 山东人学腴i t 旺论文 1 2 3 2 微池制作 用钻头( 直径1 0 0 i t m ，1 5 0 t a m ，3 0 0 p m ) 在厚度约2 m m ，长、宽备约2c m 的有机玻璃板 二打孔，制成微池( 如图1 - 4 所示) 。打孑l 时要求钻头伸出部分哽 塔f 的m 以胁j 丁j 钻头颤动而j j l l 宽微池孔i 。打孔结爪后依次用w 2 0 、w 5 的碳 化硼粉末抛光打磨平整。将其进行超声清沈5r a i n ，洗去有机玻璃板表面与微池 中的粉末、灰尘。用铬酸沈液浸泡有机玻璃扳3 0m i n ，然后分别用自来水与去离 子水充分沈涤，晾干备用。通过显微镜观察，制成的微池的直径在1 3 0p m 3 5 0 p m ，其深度通过s e c m 渐进曲线来确定。j 体做法足：先将带有微池的f 机破 璃板放入s e c m 电解池中，在s e c m 电解池中加入1 0 0 1 0 。2m o l lk 3 f e ( c n ) 6 和o 5 0 0m o l lk c i 溶液，溶液没过有机玻璃扳。将电极的电位恒定于0v ，设定 直径2 0p m 的a u 电极沿z 轴向基底( 确机玻璃板) 逼近，当电流降为极限f 乜 流的约8 0 , h l l 极停止移动，记录此过程的i 【l 极渐进曲线( 图1 5a ) ，此时对j ： 径2 0 肚ma u 电极，它j 载玻片的距离约勾2 0p m 。我们采用图1 - 6 示u 的玎 法将电极移动到微池的i f 上方。具体操作：将电极沿x 轴( 即直线1 ) 扫描喇， 在池口上方电极测得的