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青岛科技大学研究生学位论文 几种血红蛋白修饰电极的制备与电化学行为研究 摘要 血红蛋( h e m o g l o b i n ，h b ) 是一种血红素蛋白质，是研究氧化还原蛋白质直接 电子传递的理想分子。由于氧化还原蛋白质与裸电极很难发生直接电子传递，不 同类型的膜修饰电极可以加快电子传递速率。最近几年，纳米粒子由于其独特的 物理化学性能而被广泛应用于蛋白质膜修饰电极。室温离子液体由于具有以下特 殊性质，如高的导电性、良好的化学和热稳定性、宽的电化学窗口和良好的生物 相容性而受到电化学工作者的青睐。本论文结合室温离子液体和纳米材料的特性 制备了几种血红蛋白修饰电极，并研究了血红蛋白的电化学和电催化行为。论文 主要包括以下内容： 1 开展了h b 在离子液体修饰碳糊电极( c i l e ) 上的直接电化学行为研究。通过 将碳粉与室温离子液体1 丁基3 一甲基咪唑六氟磷酸盐( b m i m p f 6 ) 均匀混合制备了 离子液体修饰碳糊电极( c i l e ) 。以上述c i l e 为基底电极，以壳聚糖( c t s ) 、n a t i o n 、 纳米z n o 、多壁碳纳米管( m w c n t ) 等为成膜材料，采用层层涂布法制备了不同类 型的h b 修饰电极如n a t i o n n a n o z n o h b c i l e 、c t s h b m w c n t c i l e 。采用扫描 电子显微镜( s e m ) 、紫外可见吸收光谱、傅立叶变换红外光谱和电化学法对修饰 电极的性质进行了研究和表征。考察了h b 在不同修饰膜电极上的直接电化学和电 催化行为。实验结果表明，h b 在不同的修饰膜内基本保持了其生物活性，循环伏 安扫描出现一对准可逆的氧化还原峰，对h b 的直接电化学行为进行了研究，求解 了相关的电化学参数。进一步研究了该修饰电极对三氯乙酸( t c a ) 的电催化性质， 实验结果表明所制备的l i b 修饰电极表现出良好的电催化性能。 2 开展了h b 在离子液体1 乙基一3 甲基咪唑四氟硼酸盐( e m i m b f 4 ) 、 m w c n t 修饰的碳糊混合电极中的直接电化学行为研究。将血红蛋白、e m i m b f 4 、 m w c n t 以及石墨粉均匀混合，并在表面涂布n a t i o n 得到血红蛋白碳糊修饰电 极( n a f i o n h b c p e ) 、血红蛋白离子液体碳糊修饰电极( n a t i o n h b i l c p e ) 、血红 蛋白碳纳米管一碳糊修饰电极( n a t i o n h b m w c n t - c p e ) 。采用电化学方法和扫描 电子显微镜( s e m ) 对混合在碳糊修饰电极中的血红蛋i 圭t ( h b ) 的性质进行了研究， 实现了h b 在碳糊修饰电极中的直接电化学，并根据实验数据求解了相关的电化 学参数。进一步研究了三氯乙酸( t c a ) 、h 2 0 2 等小分子在修饰电极上的电催化行 几种血红蛋白修饰电极的制备与电化学行为研究 为。 关键词：室温离子液体，血红蛋白，碳纳米管，电催化，直接电化学，三氯乙 酸，h 2 0 2 。 青岛科技大学研究生学位论文 f a b r i c a t i o na n de l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so f s e v e r a lh e m o g l o b i nm o d i f i e d e l e c t r o d e s a bs t r a c t h e m o g l o b i n ( h b ) i so n ek i n do fh e m ep r o t e i n ，w h i c hc a nb eu s e da sm o d e l m o l e c u l ef o rt h ei n v e s t i g a t i o nt h ed i r e c te l e c t r o nt r a n s f e ro fr e d o xp r o t e i n s d u et ot h e d i f f i c u l t yo fd i r e c te l e c t r o nt r a n s f e ro fr e d o xp r o t e i n sw i t ht h eb a r ew o r k i n ge l e c t r o d e ， d i f f e r e n tk i n d so ff i l mm o d i f i e de l e c t r o d e sw e r ed e v i s e dt oa c c e l e r a t et h ee l e c t r o n t r a n s f e rr a t e i nr e c e n ty e a r s ，n a n o m a t e r i a l sh a db e e nw i d e l yu s e di nf a b r i c a t i n gt h e p r o t e i nf i l mm o d i f i e de l e c t r o d e sf o rt h e i ru n u s u a lp h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s r o o mt e m p e r a t u r ei o n i cl i q u i d s ( r t i l s ) h a v ea t t r a c t e dt h ei n t e r e s t so fe l e c t r o c h e m i s t f o rt h e i rs p e c i f i cp r o p e r t i e s ，s u c ha sr e l a t i v e l yh i 曲i o n i cc o n d u c t i v i t y , g o o dc h e m i c a l a n dt h e r m a ls t a b i l i t y , w i d ee l e c t r o c h e m i c a lw i n d o w sa n dg o o db i o c o m p a t i b i l i t y i nt h i s t h e s i s ，w ep r e p a r e ds e v e r a lh bm o d i f i e de l e c t r o d e sb a s e do nr o o mt e m p e r a t u r ei o n i c l i q u i d s ( r t i l s ) a n du n i q u ep r o p e r t i e s o f n a n o p a r t i c l e s t o i n v e s t i g a t e t h e e l e c t r o c h e m i s t r ya n de l e c t r o c a t a l y s i so fl i b t h et h e s i sc a n b es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 t h ec a r b o ni o n i cl i q u i de l e c t r o d e ( c i l e ) w a sp r e p a r e df o ri n v e s t i g a t i o nt h e d i r e c te l e c t r o c h e m i s t r yo fh b t h ec i l ew a sc o n s t r u c t e db ym i x i n gg r a p h i t ep o w d e r a n d1 - b u t y l 3 m e t h y l i m i d a z o l i u mh e x a f l u o r o p h a t e ( b m i m p f 6 ) t h o r o u g h l y h bw a s i m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo fc i l ew i t hn a f t o na n dn a n o z n of i l mo rc h i t o s a na n d m u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s ( m w c n t ) f i l mb ys t e p b y s t e pm e t h o d i nt h e s e m o d i f i e df i l m s ，t h ec h a r a c t e r i s t i c so fh bw e r ei n v e s t i g a t e db ys c a ne l e c t r o n m i c r o s c o p y ( s e m ) ，u v - v i ss p e c t r u m ，f t - i ra n de l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d s t h er e s u l t s s h o w e dt h a th br e t a i n e di t sn a t i v es t r u c t u r ei nt h e s ef i l m s ap a i ro fw e l l - d e f i n e d q u a s i r e v e r s i b l e r e d o x p e a k o fh e m e f e ( i i i ) f e ( i i ) c o u p l ea p p e a r e d t h e i i i 几种血红蛋白修饰电极的制备与电化学行为研究 e l e c t r o c h e m i c a lp a r a m e t e r s o fh bi n t h ec o m p o s i t ef i l mw e r ef u r t h e r c a r e f u l l y c a l c u l a t e d t h eh bm o d i f i e de l e c t r o d es h o w e de x c e l l e n te l e c t r o c a t a l y t i cb e h a v i o r st o t h er e d u c t i o no ft r i c h l o r o a c e t i ca c i d ( t c a ) 。 2 t h ed i r e c t e l e c t r o c h e m i s t r y o fh b i nt h e 1 - e t h y l 一3 一m e t h y l i m i d a z o l i u m t e t r a f l u o r o b o r a t e ( e m i m b f 4 ) o rm w c n t m o d i f i e dc p ew a sc a r e f u l l ys t u d i e d b y m i x i n gh bw i t hg r a p h i t ep o w d e r , m w c n ta n dp a r a f f i no re m i m b f 4t o g e t h e rw i t ha n a t i o nf i l ma p p l i e do nt h ee l e c t r o d es u r f a c ea st h ep r o t e c t i v ea n di m m o b i l i z a t i o nl a y e r , n a f i o n h b - i l c p ea n dn a f i o n h b - m w c n t - c p ew e r ep r e p a r e da n df u r t h e rs t u d i e d b y e l e c t r o c h e m i c a lm e t h o da n d s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( s e m ) d i r e c t e l e c t r o c h e m i s t r yo fh bi nt h ec a r b o np a s t eb i o e l e c t r o d ew a ss u c c e s s f u l l ya c h i e v e d i n p h7 0p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n ( p b s ) ，ap a i ro fq u a s i r e v e r s i b l er e d o xp e a k sw a s a p p e a r e da n dt h ee l e c t r o c h e m i c a lp a r a m e t e r sw e r ef u r t h u rc a l c u l a t e d t h eh bm o d i f i e d e l e c t r o d ea l s os h o w e dg o o de l e c t r o c a t a l y t i c a b i l i t yt ot h er e d u c t i o no ft c aa n d h y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) k e yw o r d s ：r o o mt e m p e r a t u r ei o m cl i q u i d s ，h e m o g l o b i n ，c a r b o nn a n o t u b e s ， e l e c t r o c a t a l y s i s ，d i r e c te l e l c t r o c h e m i s t r y , t r i c h l o r o a c e t i ca c i d ，h 2 0 2 i v 青岛科技大学研究生学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 本人答名：程瑚气 签字醐：年月日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人离校后发表或使用学位 论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛科技大学。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。 不保密口。 本人签名： 翟强芍 刷隘字劲“辛 签字日期： 年月日 签字日期：年月日 青岛科技大学研究生学位论文 第一章文献综述 1 1 血红蛋白概述 氧化还原蛋白质是一类具有氧化还原性质的蛋白质，可以接受或给出电子， 在其氧化态与还原态之间转换，在氧化还原蛋白质中，有相当一部分蛋白质属于 血红素蛋白质。血红素蛋白质是一类含有血红素辅基的蛋白质，血红素( h e m e ) f l q 原卟啉和中心铁原子组成，原卟啉环中间的f e 为+ 2 价或+ 3 价，使其可以以氧化 态或还原态的形式存在，从而使其具有电化学活性，其结构如图1 1 所示f l 】。常 见的血红素蛋白质有血红蛋白( h b ) 、肌红蛋白( m b ) 、过氧化物酶( h r p ) 、细胞色 素c ( c y tc ) 等。本文以h b 为模型物质，研究了氧化还原蛋白质的直接电化学与 电催化行为。 图1 - 1 血红素的结构 f i g 1 - 1c h e m i c a ls t r u c t u r eo fh e m e 血红蛋t 刍( h e m o g l o b i n ，h b ) 是存在于红细胞中的一种血红素蛋白质，在脊椎 动物的血液中担负着储存和运输0 2 的重要任务1 2 j ，h b 由4 个亚基( 聚合肽链) 组成，其相对分子量约为6 45 0 0d a ，每一个肽链含有一个能贮藏和转移0 2 的血 红素，血红素的中心铁原子能与氧分子可逆地结合，因此每分子h b 可运输四分 子的0 2 。四条肽链结合的血红素相互排列紧密，形成直径约为5 5a ，近似球形 的分子。血红素附近有2 个组氨酸基，它们的咪唑基恰好位于血红素卟啉平面的 两侧，在距离血红素平面较近的一个咪唑基与血红素的中心铁原子形成一含配位 键，由于直径较大而不能落入卟啉平面。当0 2 分子与h b 中的o c 亚基结合后，直 径变小，因而可以全部嵌入卟啉平面，并使铁原子与组氨酸间连接键的距离发生 几种血红蛋白修饰电极的制备与电化学行为研究 改变，从而引起一系列连接键的变化，并使相邻的c 亚基结构易与氧分子结合。 在相邻的0 【亚基与氧分子结合后，引起其余亚基发生变构，从而使得其余亚基也 易与氧分子结合，最终使得整个h b 分子变成氧合血红蛋白的构像。血红蛋白的 这种“变构现象，是调节其功能活动的极有效地方式。 1 2 蛋白质直接电化学的研究意义 。 大多数的生命活动过程都与电子传递密切相关，因此，从某种意义上来说， 研究生命过程的本质就是研究生物体内的电子传递过程【3 】。蛋白质广泛存在于各 种生物组织中、是生物细胞中最重要的组成物质，也是生命活动的物质基础，生 命活动几乎都是通过蛋白质实现的。氧化还原蛋白质在电极表面的电子传输可以 看成是生物体内的电子传输过程的简单模拟，因而，采用电化学方法研究氧化还 原蛋白质的电子传输过程，对于了解生命体内的物质和能量转换、了解生物分子 的结构和各种物理化学性质、探索其在生命体内的生理作用及作用机制、开发新 型第三代生物传感器和生物燃料电池等均具有重要的理论和实际意义。 氧化还原蛋白质直接电化学的研究由来己久，最早可以追溯到1 9 7 7 年，h i l l t 4 l 将c y tc 放在金电极和锡搀杂的氧化铟电极表面，经循环伏安扫描获得了准可逆 的循环伏安曲线。事实上，氧化还原蛋白质的直接电化学在裸电极上很难实现， 其氧化还原电化学反应一般是不可逆的，这主要是由于：( 1 ) 氧化还原蛋白质的分 子很大且结构复杂，大多数蛋白质的氧化还原中心都深埋在多肽链内部不易暴 露，所以不易暴露在电极表面并发生电子转移；( 2 ) 氧化还原蛋白质结构比较复杂 且其表面电荷分布不均，其活性中心不处于分子的中心位置；( 3 ) 氧化还原蛋白质 存在不稳定性，在电极表面容易发生变形或变性，变形或变性后的蛋白质通常会 表现出不可逆的电化学行为；( 4 ) 直接电子传输的机理也非常复杂，常常与蛋白质 在电极表面的构象和定位等很多因素有关，而蛋白质在电极表面的取向往往不利 于其电活性基团与电极之间的电子交换；( 5 ) 蛋白质的分子结构较大，溶液中的浓 度一般较低，而且溶液中的蛋白质分子很难直接固定到电极表面，电化学信号容 易被残余电流和充电电流干扰，导致氧化还原峰电流较小，一般不易得到氧化还 原蛋白质的电化学信号。为了实现氧化还原蛋白质与电极之间有效的直接电子传 递，化学工作者进行了大量的实验研究，例如寻找不同的电子传递媒介体【5 】、特 殊的电极材料【6 】以及电极反应的促进剂【_ 7 】等，这些工作使人们对氧化还原蛋白质 与电极之间的电子传递机制有了较深的理解。其中，表面膜技术是一种比较有效 的方法，该方法是通过将氧化还原蛋白质掺杂在一个类似于生物膜双层的微环境 中，为氧化还原蛋白质分子提供一个类似于其生物膜的微环境，有效地加快氧化 还原蛋白质分子与电极之间化学可逆的、直接的电子传递过程，因而不需要加入 2 青岛科技大学研究生学位论文 任何电子传递媒介体就可以实现氧化还原蛋白质分子与电极之间的电子传递过 程。这为研究氧化还原蛋白质的直接电化学提供了一个非常有力的平台，也为开 发与研制第三代生物传感器提供了新思路【8 1 。通常用于实现氧化还原蛋白质直接 电化学的薄膜有聚合物薄膜t 9 1 、溶胶凝胶薄剧1 0 l 、层层组装薄膜【】、无机纳米材 料薄膜【1 2 】等，这些修饰在电极表面的薄膜通常能够为氧化还原蛋白质保持其生物 活性和实现与电极之间的直接电子传递提供一个非常有利的微环境。 1 3 蛋白质在不同膜修饰电极上的电化学 ：黟一凇渊王h - - - 一 利用涂布、共价键合、吸附或l a n g m u i r - b l o d g e t 膜转移等方法将某些双链的 表面活性剂引入基底表面，通过自组装作用，在电极表面形成一层有序排列的双 分子层自组装薄膜，这种双分子层的结构类似于生物细胞膜中类脂所组成的双分 子层，因而又被称为模拟生物膜【1 5 】。表面活性剂具有独特的类生物结构和生物相 容性，可以有效的促进氧化还原蛋白质与电极之间的电子转移，这就使得本来在 裸电极上很难实现的蛋白质的直接电子转移在表面活性剂膜修饰电极上得以实 几种血红蛋白修饰电极的制备与电化学行为研究 现，为电化学模拟氧化还原蛋白质的生物功能提供了有利条件。因此，氧化还原 蛋白质在表面活性剂膜修饰电极上的直接电化学研究，将为氧化还原蛋白质在真 实生命体系中的电子传递的研究提供一个模型，对于认识生命体内的酶的催化机 理和电子转移机制以及某些重要生命物质在生命体内的代谢过程都有重要意义， 同时也为研制与开发第三代生物传感器提供了一种新思路。 目前制备蛋白质表面活性剂膜修饰电极的方法主要有两种：( 1 ) 将氧化还原 蛋白质与表面活性剂均匀混合，并涂布在电极表面，在室温下晾干即可得到。研 究表明所选基底电极以棱面裂解石墨、铂、金等电极稳定性最好；( 2 ) 将含有表面 活性剂的氯仿溶液蘸涂在电极表面，待氯仿溶液挥发后，得到表面活性剂膜修饰 电极，将该修饰电极放入含有氧化还原蛋白质的溶液中进行吸附。早在1 9 9 3 年， r u s l i n g 等【1 6 】就报道了在涂布于热解石墨( p g ) 电极上的双十二烷基二甲基溴化铵 ( d d a b ) 多双层表面活性剂薄膜中的肌红蛋白( m b ) 能表现出准可逆的循环伏安 ( c v ) 电化学行为，首次将氧化还原蛋白质的直接电化学行为的研究与表面活性剂 膜结合起来。实验结果表明，在d d a b 薄膜的微环境中，m b 与电极之间的电子 转移速率比溶液中的m b 在裸电极上的电子转移速率快很多。此后，有不少关于 各种氧化还原蛋白质在不同类型的多层模拟生物膜电极上的直接电化学的报道。 例如，r u s l i n g 等探讨了血红蛋白( h b ) 【1 7 】和细胞色素p 4 5 0 ( c y tp 4 5 0 ) t 博j 分别在 d d a b 薄膜修饰电极上的直接电化学行为，也获得了m b 在双十六烷基磷酸酯 ( d h p ) 薄膜电极上可逆的电化学响应信号【捌。b i a n c o 等 2 0 - 2 2 研究了细胞色素c ， c 3 ，c 5 5 3 等蛋白质分别在磷脂酰胆碱( p c ) 胆固醇和d d a b 多双层薄膜修饰电极中 的直接电化学。k o n g 等【2 3 】报道了辣根过氧化物酶( h r p ) 在d d a b 薄膜电极上的 可逆电化学行为。胡乃非f 2 4 】探讨了h b 在双十四酰磷脂酰胆碱( d m v c ) 模拟生物膜 电极上的可逆循环伏安行为。 ， 研究表明，多种氧化还原蛋白质在不同类型的模拟生物膜修饰电极中均可发 生较快电子传递，如血红蛋白、肌红蛋白、过氧化氢氧化酶1 2 5 乏6 】、辣根过氧化物 酶( h i 心) 、细胞色素cf 2 7 】等，并表现出良好的可逆性和较强的电催化行为【2 譬2 9 l ， 因此，氧化还原蛋白质在模拟生物膜中可以保持其原有的生物活性，这对于研究 氧化还原蛋白质在生命体内的作用机制具有重大意义。 1 3 2 双层类脂膜修饰电极 双层类脂膜( b l m ) 是由类脂分子通过超分子自组装而构成，易于形成和控制， 其厚度【3 0 l 与天然的生物膜相近，通常在5 1 0n m ，在膜的两侧可以建立不同的物 理场，同时双层类脂膜所围成的空间可以作为反应器。由于成膜的类脂分子处于 液晶态，它与l a n g r n u i r - b l o d g e t t 膜和其它膜体系不同之处主要在于：具有流动性 4 青岛科技大学研究生学位论文 和自我封闭性，抵抗一定程度破裂的特点；制作简单，膜的成分能够合理地控制； 能明显降低背景噪声，并能阻止亲水性电活性物质到达传感膜发生副反应；使配 体受体相互作用的同时又能保持其生物活性：稳定性好，有实用价值，且适合于 现场的谱学研究。所以，近年来双层类脂膜的研究发展迅速，尤其是基于固体材 料支撑的双层类脂膜，在镶嵌有关主体物质后用于生物传感器的开发研究，从特 异性、灵敏度、生物相容性等方面都有很大的优越性。 固体载体支撑的混合双层类脂膜二般是先在金基底上自组装一层烷基硫醇 ( 或者含有特定端基如- n h 2 、c o o h 的巯基化合物) ，再以此自组装硫醇单层膜为 基底构建双层类脂膜。构建固体载体支撑的混合双层类脂膜的主要方法有：l b 技术、涂层膜技术、泡囊融合技术和涂层膜冷冻技术等。各种固体载体支撑的双 层类脂膜由于具有高度有序、良好稳定性的特点1 3 1 1 ，因此可用作仿生膜，模拟氧 化还原蛋白质的生物代谢过程1 3 2 1 。由于双层类脂膜具有生物相容性，可以提供嵌 入各种生物组分( 受体、蛋白质、膜组织片段、甚至整个分子) 的天然环境，能将 生物分子嵌入其中并保持生物活性。将h r p 固定于盐桥支撑的双层类脂膜中，可 以获得- h r p 的直接电化学及其对h 2 0 2 的电催化还原行为1 3 习；将c y tc 固定在双 层类脂膜中，可与金电极发生直接电子传递，并能氧化溶液中的c y tc 3 4 j 。h i a n i k 等 3 5 , 3 6 把抗生素蛋白葡萄糖氧化酶固定到生物素化双层类脂膜上，利用安培法研 究了葡萄糖氧化酶对葡萄糖的氧化行为，并测定了几个重要的酶反应动力学常 数。董等【3 7 l 将卵磷脂和h b 的混合液修饰到热解石墨电极表面，得到了h b 在该 膜中的直接电化学行为，实验结果表明h b 在该膜中表现出典型的薄层电化学行 为，式电位在p h 为3 5 7 0 的范围内与p h 成线性关系，且对h 2 0 2 表现出较好的 电催化还原行为，可以用于构建无媒介体的h 2 0 2 传感器。 1 3 3 溶胶凝胶膜修饰电极 溶胶凝胶方法的特点是以用液体化学试剂( 或将粉状试剂溶于溶剂中) 或溶胶 为原料，而不是采用传统的粉状物质。反应物在液相下均匀混合并发生反应，反 应生成物是稳定的溶胶体系，经放置定时间转变为凝胶，其中含有大量的液相 物质。由于生物分子的识别部位往往暴露在表面，而在水溶液中，它的侧链只通 过氢键和偶极力与溶剂分子相互作用，因而可呈现出最大的活性。溶胶凝胶固定 法就可以为网络中的生物分子提供一个溶液的微环境，因为网络结构中含有大量 的孔隙水。与其它固定方法相比，溶胶凝胶包埋法具有以下优点：它可适用于任 何种类的生物组分；可以较好的保持蛋白质表面微结构的整体性和方向均一性， 从而对组分的活性和稳定性的损伤较小；膜不易开裂，使得生物分子能保持较高 的活性、较长的寿命和较好的稳定性。 几种血红蛋白修饰电极的制备与电化学行为研究 。 溶胶凝胶技术在电分析化学中的应用主要体现在以下两个方面：抗体( 原) 、 酶、电活性分子与细胞在电极表面的固定；制备电化学生物传感器。迄今为止， 基于溶胶凝胶技术制备的电化学生物传感器主要有两种类型：一种是导电生物陶 瓷复合材料电极，即使用含酶等生物组分的凝胶复合材料作为主体制成修饰电 极，另一种是凝胶膜修饰电极，它是在基体电极表面覆盖一层含酶等生物组分的 凝胶膜。 目前，利用溶胶凝胶过程制备电化学生物传感器方法如下：在室温条件下将 生物组分与所需的溶胶混合均匀，然后将形成的混合液涂布到载体表面，在适当 温度下进行凝胶化过程，得到一种多孔结构网络状的干凝胶，由此可将生物分子 固定其中。利用溶胶凝胶技术制备的电化学生物传感器一般具有较好的电化学响 应，这是由于凝胶材料具有多孔性结构，底物分子能够方便的穿过凝胶孔隙与酶 接触。在制备溶胶凝胶型电化学生物传感器过程中，通常选择甲醇、四甲氧基硅 烷( t m o s ) 分别为共溶剂和前驱体对生物分子进行包埋。在t m o s 水解制备溶胶 时，常用盐酸作为催化剂来加快水解反应的进行，这主要是因为t m o s 与水反应 是惰性的，而酸催化可以加速反应的进行。然而，生物分子在高酸度的条件下不 利于保持原有的生物活性，因此，需要先调节溶胶与缓冲溶液混合液的酸度，再 与生物分子混合并在凝胶形成过程中将其固定。这样既可以控制凝胶化的速度也 可以防止生物活性物质的失活。c h e n 和l i u 3 s 研究了在无醇条件下溶胶凝胶的形 成过程，并利用该溶胶凝胶成功固定了一系列生物分子，如血红蛋白、细胞色素 c ，过氧化氢酶和肌红蛋白等，且保持了它们原有的生物活性。另外，硅酸钠在 无醇体系制备溶胶凝胶时常用作前驱体，固定在该溶胶凝胶内的氧化还原蛋白 质分子能保持很好的生物活性。贾建波等【3 9 】将h r p 固定于自组装有金纳米粒子 的三维溶胶凝胶网络中，制得的生物传感器具有较高的灵敏度及较好的稳定性。 鞠烷先等【4 0 】采用气相沉积方法在玻碳电极表面得到二氧化钛凝胶膜，并将h r p 包埋于电极表面，制成电流型h 2 0 2 生物传感器。 1 3 4 纳米粒子膜修饰电极 纳米粒子一般是指尺寸在1 1 0n m 之间的超细微粒，制备方法主要有固相法、 液相法和气相法三大类。由于其具有体积较小、比表面大、表面反应活性高、表 面活性中心多、催化效率高、吸附能力强等优异性质，纳米粒子表现出独特的力 学、光学、电学、磁学、热学、化学活性和异相催化等特性，使其成为表面纳米 材料工程和功能纳米结构制备的理想对象。纳米粒子在固体表面的二维和三维的 有序组装，可制备多种复合纳米电子和光学传感器件，对于提高氧化还原蛋白质 或酶等生物分子在固体表面上的稳定性、生物活性、促进氧化还原蛋白质的直接 6 青岛科技大学研究生学位论文 电子传递能力及蛋白质或酶与底物间的电子传递具有重要作用，因此得到物理 学、材料学、电化学、生物电化学和分析化学工作者的广泛关注。 常用于固定和促进氧化还原蛋白质直接电子传递的纳米粒子有：金胶纳米粒 子、银纳米粒子、二氧化锆纳米粒子、碳纳米管等。 金胶纳米粒子具有较高的比表面积，同时金胶纳米粒子的存在给蛋白质分子 更自由的取向，为蛋白质的直接电子传递构筑更适合的方式，使其电活性中心更 靠近导电的电极表面，从而加快其电子传递速率且不需要任何电子传递媒介体或 促进剂，因而为制备无试剂生物传感器如h 2 0 2 或其它生物分子的传感器提供了 新途径。陈洪渊等】将h r p 固定在不同尺寸的金胶纳米粒子表面，观察到了h r p 分子的直接电子传递反应，研究结果表明蛋白质在小尺寸的金胶纳米粒子上的吸 附量比在大尺寸的金胶纳米粒子上的吸附量更大，因而具有更好的电催化行为。 鞠烷先等将葡萄糖氧化酶【4 2 l 、细胞色素c 1 4 3 l 吸附在金胶修饰电极表面，或将辣根 过氧化物酶【4 4 1 、血红蛋白【4 5 1 、肌红蛋白f 4 6 】包埋在金胶修饰碳糊中实现了蛋白质的 固定化，实现了氧化还原蛋白质的直接电子传递，研究表明将金胶纳米粒子混入 碳糊，可使碳糊电极的充电电流降低5 倍左右。胡乃非等【47 】将不同尺寸的金纳米 粒子与肌红蛋白采用层层组装法制备薄膜修饰电极，电化学表征结果表明，金纳 米粒子的粒径越小，电极的电阻越小，肌红蛋白对0 2 和h 2 0 2 的催化活性越高。 纳米金属氧化物在生物传感器领域的研制与开发方面也具有很大的应用潜 力。d u r r a n t 小组【4 8 ，4 9 】首次引入纳米多孔二氧化钛( t i 0 2 ) 用于固定h b 和细胞色素 c ，详细研究了氧化还原蛋白质表面电荷、溶液离子强度和溶液p h 值等因素对氧 化还原蛋白质在纳米多孔t i 0 2 上吸附量的影响。胡乃非等1 5 0 j 研究了m b 、h b 与 h r p 三种氧化还原蛋白质在纳米四氧化三铁( f e 3 0 4 ) 薄膜电极上的直接电化学行 为，研究结果表明f e 3 0 4 纳米粒子薄膜为氧化还原蛋白质与电极间的直接电子传 递提供了一个适宜的微环境，并使其很好的实现了直接电化学行为，同时，该修 饰电极对三氯乙酸、亚硝酸盐和过氧化氢均表现出良好的电催化还原性质。鞠烷 先等【5 l 】将直径约为3 5n i n 的二氧化锆( z r 0 2 ) 分子均匀分散在二甲基亚砜( d m s o ) 溶剂中并与血红蛋白溶液均匀混合，然后将此混合液体滴在已抛光的热解石墨电 极表面固定血红蛋白分子，研究了血红蛋白在z r 0 2 纳米粒子修饰热解石墨电极上 的直接电化学行为。 碳纳米管( c n t ) 是以碳原子s p 2 杂化为主，混有s p 3 杂化所构筑成的理想结 构，可看成是片状石墨稀片卷成的圆筒，这种结构使其具有石墨的许多优良特征， 如耐热、传热、耐腐蚀和导电性好、强度高、自润滑性和生物体相容性等一系列 综合性能，为低维纳米结构在电化学和生物传感器方面的应用开辟了崭新的方 向。l i 等【5 2 】报道了c t yc 在s w c n t s 修饰的玻碳电极上的直接电化学，实验表 7 几种血红蛋白修饰电极的制备与电化学行为研究 明细胞色素c 在该修饰电极上呈现了较好的可逆电化学响应并对h 2 0 2 有良好的 电催化行为。s u n 等【5 3 】用n a t i o n 为固定材料将血红蛋白( h b ) 固定到碳纳米管修饰 一 电极表面，实现了h b 的有效固定，详细研究了l i b 在该修饰电极上的直接电化学 和电催化行为。 1 3 5d n a 膜修饰电极 d n a 的结构分为一级结构和空间结构，一级结构是由数量极其庞大的四种脱 氧核苷酸( ，脱氧腺嘌呤核苷酸、脱氧鸟嘌呤核苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸和脱氧胸腺 嘧啶核苷酸) 通过3 t ，5 磷酸二酯键链接起来的直线形或环形多聚体。空间结构又 分为二级结构和三级结构，d n a 的二级结构就是它的双螺旋结构，二级结构的破 坏称为变性，它的稳定因素主要有3 个方面：( 1 ) 互补碱基对之间的氢键。虽然氢 键是一个非常弱的键，但由于d n a 中氢键数量很多，所以氢键是比较重要的因 素。佗) 碱基堆积力。是一条链上相邻两个平行碱基环间的相互作用，这是来自芳 香族碱基兀电子之间的相互作用，是维持d n a 双螺旋结构稳定的主要因素。( 3 ) 离子键。磷酸残基上的负电荷与介质中的阳离子之间形成静电作用，有利于双螺 旋的稳定。氧化还原蛋白质和核酸同存于线粒体内，是构成细胞内原生质的主要 成分，是生命的物质基础，研究d n a 和蛋白质的作用机理对于理解生物呼吸链 能量转换、揭示蛋白质在细胞中的结构和功能具有重要意义。 用电化学方法研究氧化还原蛋白质的电子传递机理及催化底物的反应过程， 不仅能方便地获得蛋白质氧化还原反应中的物理参数，而且可以模拟氧化还原蛋 白质的电子传递机理，为构筑电化学生物传感器提供坚实的理论基础。然而由于 氧化还原蛋白质在裸电极表面强烈吸附而导致变性及杂质分子在电极表面的吸 附阻碍了电子的传递，因此，选择利用d n a 膜修饰电极，不仅能为氧化还原蛋 白质保持原始构象提供所需的微环境，而且能减小阻碍电子传递因素的影响，在 氧化还原蛋白质与电极之间建立电子传递通道，加速电子传递进程，同时能够研 究d n a 和氧化还原蛋白质之间的相互作用机理。c h e n 等【5 4 】用d n a 将c y tc 固 定在玻碳电极表面，研究表明c y tc 与d n a 的相互作用使得c y tc 更易发生电子 转移，并对n i - 1 2 0 h 、n 2 i - h 和s 0 3 2 - 等小分子表现出很好的电催化行为。庞代文等 人利用d n a 膜修饰电极，研究了d n a 与氧化还原蛋白质之间的相互作用。他们 将d n a 修饰到金电极和碳电极表面，形成稳定的薄膜，详细研究了d n a 与c y t c 的相互作用机理及其对c y tc 的测定，探讨了c y tc 的生物电催化性质【5 ”6 j 。 y a n g 等【5 7 】利用循环伏安扫描将c y tc 固定到d n a 修饰的玻碳电极表面，并研究 了c y tc 在d n a 膜中的直接电化学行为。用d n a 将h r p 固定于石墨电极表面， 加快h r p 与电极之间的直接电子传递速度，用于对h 2 0 2 的检测【5 引。k w o n 等p 州 8 青岛科技大学研究生学位论文 将d n a 和f i b 利用层层涂布法修饰到金电极表面制备了d n a h b 生物传感器， 并详细研究了f i b 的直接电化学行为，实验结果表明该生物传感器对h 2 0 2 表现出 优良的电催化还原性能。 1 3 6 离子液体膜修饰电极 室温离子液体( r o o mt e m p e r a t u r ei o n i cl i q u i d s ，r t i l s ) 是指在室温或接近室温 条件下为液体，且由阴、阳离子组成的有机类化合物，简称离子液体，一般可 以分为以下三种类型：a 1 c 1 3 型、非舢c 1 3 型和其它功能化离子液体。当前研究 的离子液体的阳离子基本上有4 类( 见表1 1 ) ：烷基季铵离子 n r d + ；烷基季膦 离子p r 4 + ；烷基取代的咪唑离子；烷基取代的吡啶离子。烷基取代的咪唑阳离 子型室温离子液体具有较强的稳定性，也是目前研究最多的；其阴离子还有亲水、 憎水之别，常见的阴离子有卤素离子、含f ，p ，s 的离子等，目前应用最广的烷 基取代的咪唑阳离子型室温离子液体有：四氟硼酸盐、六氟磷酸盐和三氟甲烷硫 酸盐等。 阳离子阴离子 p 轧 n 艮+ 酸性：f o 啦q 】f 国q 4 】池氆】m q l o 】。 日r 中性：q 警 碱性： b f d 【甄】f 甄1 【c f 3 晒 c m h 凹a ；】 表1 - 1 离子液体正负离子组成表 t a b l el - it h ec a t i o na n da n i o no fi o n i cl i q u i d 室温离子液体作为一类新型的非水介质，与其它常见的固体或液体物质相 比，离子液体具有独特的物理化学性质，如无毒、稳定性好、极低的蒸汽压、 不易燃、导电性好、较宽的电化学窗口以及溶解多种有机无机材料的能力等， 因而室温离子液体又被誉为绿色溶剂。 离子液体由于具有导电率高、电化学窗口宽、挥发性小、溶解性好、酸碱性 可调等特点，使其在电化学和电分析化学领域中具有较明显的优点，这为研究氧 化还原蛋白质的直接电化学和制备生物传感方面提供了新的方向。具体表现在以 下几个方面：( 1 ) 蛋白质在离子液体支持电解质中的电化学行为。c o m p t o n 6 0 】于 2 0 0 2 年首次报导了有关氧化还原蛋白质在离子液体中的电化学行为方面的研究 9 几种血红蛋白修饰电极的制备与电化学行为研究 工作，他们将氯化血红素通过吡啶或者n 一甲基咪唑固定到金电极表面，研究了酶 电极分别在1 丁基3 甲基咪唑六氟磷酸盐( b m i m p f 6 ) 和1 一辛基一3 甲基咪唑六氟 磷酸盐( o m i m p f 6 ) 两种离子液体中的电化学行为，研究发现氯化血红素能够在 两种离子液体中发生准可逆的单电子氧化还原过程，其氧化还原标准电位会因使 用的配体碱性的不同或者离子液体极性的不同而有一定差异。庞代文【6 l 】利用琼脂 糖和二甲基甲酰胺的复合膜将血红素蛋白质成功固定在玻碳电极表面，研究了该 修饰电极分别在疏水性离子液体 b m i m p f 6 和亲水性离子液体1 丁基3 甲基咪 唑四氟硼酸盐( b m i m b f 4 ) 媒介中的直接电化学行为以及在疏水性离子液体媒介 中对t - b u o o h 和三氯乙酸的电催化行为。随后c o m p t o n l 6 2 又研究了通过巯基链 烷酸巯基乙醇吸附到金电极表面的细胞色素c 分别在纯的 b m i m p f 6 和1 - 丁基 3 甲基咪唑三氟甲基磺酸盐( b m i m 】 ( c f 3 s 0 3 ) 2 n 】) 离子液体中的直接电化学行 为，实验结果表明该修饰电极在离子液体中最初观察到的氧化还原峰会随着浸泡 时间的延长而逐渐消失；然而，当将该修饰电极从离子液体中取出放入p b s 缓冲 溶液中浸泡几分钟后，又能重新观察到c y tc 的氧化还原峰。( 2 ) 蛋白质在离子 液体修饰电极上的电化学行为。由于离子液体导电率高、粘度大，可以代替传统 液体石蜡作为粘合剂制备离子液体修饰电极，以该修饰电极为基底电极进行蛋白 质的电化学行为研究。m a l e k i t 6 3 】等人最初以正辛基吡啶六氟磷酸盐( o p p f 6 ) 为粘合 剂制备了高性能的碳糊组合电极，有效地提高了各种有机无机电活性物质