（动物学专业论文）生长抑素mrna表达的影响因素及与记忆的关系.pdf

abs tract s o m a t o s t a t i n i s a n e u r o p e p t i d e w id e l y d i s t r i b u t i n g i n b r a i n . ma n y s t u d i e s i n d i c a t e t h a t s o m a t o s t a t i n i n v o l v e l e a r n i n g a n d m e m o ry f u n c t i o n , i t m i g h t s t r e n g t h e n m e m o ry a n d r e s i s t a m n e s i a . s o c l a r i f y i n g t h e f a c t o r s o f i n fl u e n c i n g s o m a t o s t a t in m e t a b o l i s m in b r a i n a n d n e u r o n h a s i m p o r t a n t s i g n i f i c e n c e i n r e g u l a t i n g s o m a t o s t a t i n m e t a b o l i s m , e v e n l e a r n i n g a n d m e m o ry f u n c t i o n . t h e e f f e c t s o f z i n c o n t h e s s g e n e t r a n s c r i p t i o n a n d t h e v a r i a t i o n o f s s g e n e t r a n s c r i p t i o n i n d i f f e r e n t a g e a n i m a l s w e r e s t u d i e d i n t h e p r e s e n t t h e s i s . i .t h e z i n c d e f i c i e n t r a t m o d e l e s t a b l i s h e d b y o u r l a b w a s u s e d . i t i n c lu d e s t h r e e g r o u p s : t h e g r o u p o f z i n c d e f i c i e n c y , f e d z i n c d e f i c i e n t f e e d ; t h e g r o u p o f c o n t r o l , f e d n o r m a l f e e d c o n t a i n i n g e n o u g h z i n c , g i v i n g t h e s a m e q u a n t it y t o t h e g r o u p o f z i n c d e f i c i e n c y ; t h e g r o u p o f z i n c d e f i c i e n c y a n d r e p l e n i s h e d , f i r s t f e d z i n c d e f i c i e n t f e e d , t h e n n o r m a l f e e d c o n t a i n i n g e n o u g h z i n c , g i v i n g t h e s a m e q u a n t i t y t o t h e g r o u p o f z i n c d e f i c i e n c y . t h e c h a n g e s o f s s g e n e t r a n s c r i p t i o n i n t h e s e t h r e e g r o u p s o f r a t s w e r e d e t e r m i n e d b y d o t b l o tt i n g w i t h r a d i o a c t i v e l a b e l e d p r o b e . t h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e s s g e n e t r a n s c r i p t i o n i n c e r e b r a l c o rt e x o f t h e f i r s t g r o u p d e s c e n d e d , w h e r e a s z i n c s u p p l e m e n t i n g r e v e r s e d t h e a b o v e c h a n g e . 2 . s s g e n e w a s t r a n s f e r r e d t o l a - n - 5 a n d n a m e d l a - n - 5 - 2 . t h e y w e r e c u l t u r e d i n c u l t u r e m e d i u m s e p a r a t e l y a d d i n g z i n c ( l m g / l z n s 0 4 -7 h 2 0 ) a n d n o z i n c , t h e n s s g e n e t r a n s c r i p t i o n i n t h e m w e r e d e t e r m i n e d b y d o t b l o tt i n g w i t h d i g - l a b e l e d p r o b e . t h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t s s g e n e t r a n s c r i p t i o n i n c e l l s c u l t u r e d i n r i c h z i n c m e d i u m i s h i g h e r t h a n t h a t i n c e l l s c u l t u r e d i n n o r ma l me d i u m. 3 .t w o g r o u p s o f r a t s ( 2 y e a r s o l d a n d 2 m o n t h s o l d ) a n d t h r e e g r o u p s o f m i c e ( 7 ,6 , 5 w e e k s o l d ) w e r e u s e d i n t h e e x p e r i m e n t s . t h e l e a r n i n g a n d m e m o ry f u n c t i o n w a s e x a m in e d w i t h s t e p t h r o u g h t e s t . a n d s o m a t o s t a t i n g e n e e x p r e s s i o n o f b r a i n a r e a s i n d i f f e r e n t a g e r a t s a n d m i c e w a s d e t e r m i n e d b y d o t b l o tt i n g w i t h d i g - l a b e l e d p r o b e . t h e r e s u lt s s h o w e d t h a t l e a r n i n g a n d m e m o ry f u n c t i o n o f t h e a g e d r a t s i s l o w e r t h a n t h a t o f y o u n g r a t s , m e a n w h i l e t h e i r l e v e l o f s s m r n a i n c e r e b r a l c o rt e x a n d h i p p o c a m p u s a l s o l o w e r t h a n t h a t o f y o u n g r a t s . wh e r e a s t h e l e a rn i n g a n d m e m o ry f u n c t i o n s o f t h r e e g r o u p s o f s i m i l a r a g e m i c e a n d t h e i r b r a i n s s m r n a l e v e l s h a d n o s i g n i f i c e n t d i f f e r e n c e s . t h e a b o v e r e s u l t s s u g g e s t : 1 . z i n c m i g h t i n fl u e n c e s o m a t o s t a t i n g e n e e x p r e s s i o n o f c e r e b r a l c o rt e x i n r a t s a n d c u l t u r e d c e l l s 2 .t h e d e c r e a s e o f l e a r n i n g a n d m e m o ry f u n c t i o n in a g e d a n i m a l c o r r e l a t e s w i t h s s g e n e t r a n s c r i p t i o n k e y w o r d s : z i n c a g e d s o m a t o s t a t i n me m o r y n e u r o n 月 ij 生长抑素 ( s o m a t o s t a t i n , s s ) 言 是一种具有广泛生理功能的神经活性肤。它主 要以1 4 月 太 的形式存在， 另外还有s s , 4 . s s 2 8 . s s 2 。 和s s 2 s 等形式。 在机体组织内， 胰腺、胃肠道粘膜以及神经组织都有生长抑素的分布。在中枢神经系统主要分布 于下丘脑、大脑皮层、海马等组织，这些组织均与大脑的高级功能密切相关，提 示生长抑素可能参与大脑的高级功能。 有资料表明， 生长抑素对学习记 忆功能具有积极的调控作用， 如脑室内注射生 长抑素或其类似物明显改善大鼠 的主动回避行为e l l . v e c s e i 等则报道大鼠 在被动回 避反应训练后， 立即给以电惊厥休克造成逆行性遗忘， 而后脑室内注射 s s 能明显 增加被动回避的潜伏期，如果电惊厥休克之后隔不同时间注射 s s ，其抗遗忘的作 用逐渐降低。 在跳台和穿梭箱模型实验中， 观察到脑室内注射s s 可显著抑制大鼠 主动逃避反应的消退， 进一步说明s s 在信息的储存和巩固中起重要作用。另据报 道， 利用s s 的 耗竭剂一半脐胺 ( c y s t e a m in e , c y s ) 及其类似物耗竭大脑中的生长 抑素 ， 则 使大鼠 记 忆明 显 受 损 12 1 ; 脑 室 或 皮 下 注 入c y s ， 明 显 阻 碍大 鼠 被 动 回 避 反 应记忆、易化主动回避反应的消退，并且其新皮层、海马、 下丘脑的s s 含量均明 显减少， 可见中枢神经系统内源性s s的减少可导致动物获取和保持信息的功能减 弱甚至丧失2 1 ;大鼠 脑室注射s s 则可以 减轻由 半胧胺等引 起的i 己 忆缺陷。 由于生长抑素在学习记忆功能中的重要作用，因此阐明脑组织以及神经细胞 生长抑素代谢的影响因子以及正常生理状态下生长抑素的代谢规律，已为广大学 者所关注。 我们以 前的实验发现缺锌使大鼠 脑组织生长抑素的含量明显降 低3 1 ， 但 究竟锌怎样影响生长抑素的代谢尚不清楚。另有资料表明衰老过程中学习记忆功 能的衰退与生长抑素基因的表达有关，如 s o n n t a g发现在老龄动物下丘脑中 s s m r n a水平明显降低，但 s s的分泌却增加;而 ma r t i n o l i 和 c o l o n n a则有不同 的认识， 认为老龄动物s s 基因表达降低不明显叫 ， 显然衰老与生长抑素代谢的关 系尚未定论，因此尚有必要就这一问题进一步研究。 因此我们设计了本研究，主要就锌对生长抑素基因转录的影响和衰老过程中 生长抑素基因转录水平的变化进行探讨。这无疑对儿童智力的提高、脑的营养保 健以及人口老龄化所引起的越来越多的认知障碍性问题的解决，具有一定的理论 意义和潜在的应用价值。 文献综述 一、有关学习记忆的研究现状 学习和记忆是大脑的高级功能之一，它们是两个有联系的神经过程。学习是 指人和动物依赖于经验改变自身行为以适应环境的神经活动过程。可分为非联合 型学习和联合型学习，前者是一种简单的学习形式，在刺激和反应之间不形成明 确的联系;后者包括经典条件反射和操作式条件反射。i己 忆则是把学习到的信息 储存和读出的神经活动过程。可分为反射性记忆和陈述性记忆，两种类型可能有 不同的神经通路参与。人们通过设计各种各样的实验方法，从行为学，电生理， 脑成象，组织化学及分子生物学的角度试图对这一复杂过程进行分析。 目 前，国内外关于学习记忆神经机制的研究报道， 主要集中于以下三个方面: 1 . 神经组织学机制从神经组织学角度看，学习记忆的机制迄今尚未完全定 论。有人认为学习和记忆功能需要整个脑的参与;另一种意见则认为，i 己 忆在脑 内有固定的加工和储存部位。目前认为与学习记忆功能有密切联系的脑内结构主 要有大脑皮层联合区、海马以 及邻近结构、丘 脑、下丘脑等s 。 它们可形成两个 与记 忆有 关的 神 经回 路: 一是内 侧 边 缘回 路， 即p a p e z 环路 6 1 : 由 大 脑内 侧面的 隔 区开始，经扣带回、海马回、海马、弯隆、下丘脑乳头体、乳头丘脑束、丘脑前 核、扣带回，另一条是以杏仁核为主体的基底外侧边缘环路:额叶眶部皮质、前 额皮质、杏仁核、丘脑背内侧核、额叶眶部皮质。 2 神经生理学机制从神经生理学角度看， 有关学习记忆机制的研究最引人关 注的就是长时程突触可塑性研究，包括长时程突触后电位增强 ( l o n g - t e r m p o t e n t i a t i o n l t p ) 和长时 程突触后电 位压抑 ( l o n g - t e r m d e p r e s s i o n l t d ) 。早在 1 9 4 9 ， 著名心理学家 h e b b 就提出了 神经突触可塑性是影响学习和记 忆等行为的 神经学基础的假说。1 9 7 3 年， b l i s s 等人在家兔海马区诱导出l t p 现象。 l 丁 p自一 发现便引起了人们的极大兴趣。由于这种突触可塑性增强可长时间保持，且具有 联合性和特异性，现在人们认为 l t p 是学习记 忆的突触可塑性模式，与学习记忆 有密切联系。其诱发率差异与动物智力水平呈显著正相关。目 前认为l t p 是由n - 甲 基一 d 一 天门 冬氨酸 ( n m d a ) 受体依赖的突触传递效能的持续性增强$ 1 3 .神经生化学机制学习记 忆过程受递质和神经肤的调节是早己有定论的。 其 作用途径是通过影响神经细胞的兴奋性，或通过影响各结构间的信息传导，从而 影响学习i 己 忆过程。中枢神经系统有许多种递质都与学习记忆有关，如大量的动 物和人的研究证据表明，中枢胆碱能系统是学习记忆的重要机制。有资料表明， 大鼠 通过训练获得记 忆后， 皮层和海马乙 酞 胆碱和胆碱转移酶升高 9 1 ; 而拟胆 碱能 药 物则能改善学习记 忆功能 10 , 1 1 ， 反之， 抗胆碱能药物则损坏学习记 忆功能。 如阿 托品中毒可影响近期记忆。另外氨基酸类神经递质也与学习记忆有关。有资料表 明， 谷氨酸、 天冬氨酸和n 一 甲 基一 d 一 天冬氨酸均可选择性与递质受点结合1 1 2 1激活 n m d a -r ， 使钙通道开放， 钙离子内流增加， 调节着兴奋性突触的传递和发育过 程中的突触可塑性， 参与学习和记 忆的形成 1 3 1 。 抑制性氨基酸神经递质y 一 氨基丁 酸 ( y - a m i n o b u t y r i c a c id g a b a ) 受 体阻 断 剂 可 导 致大鼠 海马 长时 程 增强 抑 制， 空间学习能力受损，提示g a b a与学习记 忆的关系。此外，据报道，单胺类神经 递质 1 4 ) 及一氧化氮1 5 也与学习记 忆有关。除神经递质外， 还有许多种神经活性肤 与 学习记 忆有密切关系。 如下丘 脑神经 肤 1 6 , 1 7 1 、 垂 体后叶 神经 肚 1 和 s s 2 9 ，其次为 s s 的生理功能及作用机制 抑制激素的分泌 6 、， ，1 主要有生长激素 ( g h) 、促甲状腺激素 ( t s h )等。s s不影响激素的合成， 仅影响激素的释放。s s抑制腺垂体g h的基础分泌，注射 s s抗血清可提高大鼠 g h的基础水平并加强紧张性刺激引起的g h释放。另外，s s还可抑制运动、胰 岛素、 低血糖、精氨酸、 戊巴比妥钠和l 一 多巴等多种刺激引起的g h释放。s s 抑 制 t r h( 促甲状腺激素释放激素)引起的t s h和 f s h( 卵泡刺激素)的释放，对 高钾、 茶碱引起的t s h释放以及夜间t s h水平升高也有抑制作用， 还可降低肢端 肥大症病人血浆中p r l( 催乳素)的水平。 其次， 还可以 抑制 胰岛素 (2 4 1胰高 血糖素、胃 泌素 等激素的 分泌。 如 可抑制 胰岛 素和胰高血糖素的基础分泌、胃 泌素的基础分泌及饮食诱发的分泌2 5 1 2 )抑制消化液的分泌 如s s 可完全抑制由 五肤胃 泌素及蛋白 陈引 起的胃 酸及胃 蛋白 酶的分泌2 6 1 。 另 外还可抑制唾液淀粉酶，胰腺的碳酸氢盐，胰酶，内因子及组织胺等的分泌。 3 )抑制消化道及有关器官的运动 抑制胃 蠕动引 起的胃 排空【2 6 1 ， 胆囊收缩及o d d i 氏 括约肌收缩。 4 )抑制消化道的吸收功能 抑制葡萄糖、 木糖、 氨基酸、 甘油三酸酷、离子 ( 如c a t )的吸收、肾小管 对水的吸收， 刺激兔小肠对n a c l 的吸收2 3 1 5 )抑制神经系统的活动 抑制神经元自发性电活动，增强对鸦片受体的拮抗作用，在小鼠身上引起行 为改变， 抑制肠肌层神经元激动， 抑制电 刺激引 起的乙酞胆碱释放等2 3 1 6 )对学习记忆有调节作用，关于这点在下面详细叙述。 7 )其它 1 抑制血小板的聚集斑，减少内 脏血管的血流量。 2 抑制左旋多巴、 精氨酸、 吗啡、 氯丙啧、 异丙肾上腺素、巴比 妥、 c a m p . 前列腺素 e 2 、儿茶酚胺。 3 使激素g i p 、血管活性肠肤 ( v i p ) 、红细胞生成素分泌下降。 4 能延长戊巴比 妥的睡眠时间，降 低巴比妥的 l d 5 0 ， 延长麻醉时间， 缩短 士的宁的致惊厥作用， 增加抗抑郁药、 抗焦虑药的效果，以及镇静、降体 温等多种神经调节作用。 5 s s 可预防链左霉素对大鼠 胰岛b细胞的损伤。 6 s s对氧自由 基引 起的胃 粘膜细胞损伤有直接保护作用， 通过提高胃 粘膜 清除自 由 基的 能 力 而实 现其 脂 质过 氧 化 作 用 (27 .2 8 1 7 s s 可抑制e g f . g n r h( 促性腺激素释放激素) 刺激的h c g分泌及h c g b 一m r n a水平。 8 s s对热刺激信息和伤害性化学刺激信息的传递起重要作用2 9 o 9 s s 可通过提高细胞清除自由 基能力预防c c l ; 及黄嗓吟氧化酶 ( x - x o ) 引起的肝细胞损伤3 0 1 3 、生长抑素对学习记忆的调节作用 s s 不仅是一种内分泌激素，而且还具有神经递质和神经调质的作用。有文献 报道， s s 对中枢神经系统的活动具有普遍的抑制作用。目 前已确认，s s阳性神经 元与学习记忆密切相关。许多研究资料表明，神经活性肤生长抑素对学习记忆功 能具有积极的调控作用，有利于记忆的强化，具有抗遗忘作用，是记 忆的物质基 础之一13 1 1 有资料表明 脑室内 注射s s 或其类似物可明显改善大鼠的主动回避行为3 2 1 。 早 在1 9 8 3 年， v e c s e i 等报道大鼠 在被动回避反应训练后，立即给以电 惊厥休克造成 逆行性遗忘，而后脑室内注射s s能明显增加被动回避的潜伏期。 如果电惊厥休克 之后隔不同时间注射 s s ，其抗遗忘的作用逐渐降低，提示脑室注射 s s对记忆巩 固过程的作用比对再现过程更为显著。在跳台和穿梭箱模型实验中，观察到脑室 内注射 s s可显著抑制大鼠主动逃避反应的消退，进一步说明 s s在信息的储存和 巩固中起重要作用，它有易化学习记忆的效应。但对动物的迷宫空间辨别学习和 转换学习却无明显影响， 说明s s 可能只是选择性地易化某些模型的学习记忆行为。 半肤胺 ( c y s t e a m i n e , c y s ) 是 s s的耗竭剂。 使用半肤胺或其类似物耗竭大 脑中的s s ，可使大鼠记 忆明显受损。脑室或皮下注入c y s ，大鼠 被动回避反应记 忆明显受到阻碍，并易化主动回避反应的消退d l ， 其新皮层、 海马、下丘脑的 s s 含量均明显减少， 可见中枢内源性 s s的减少可导致动物获取和保持信息的功能减 弱甚至丧失t2 1 。 大鼠 脑室注射s s 则可以 减轻由 半肤胺等引 起的i 己 忆缺陷。 另外s s 可抑制大鼠海马、脑干内的g a b a，通过g a b a共同影响海马l t p( 突触传递效 应长时间增强)和突触部位信息的储存和传递，进而调控学习和记忆，早老型痴 呆症与前脑范围内s s 减少呈正相关性。 综上所述， s s 对学习记忆有易化作用，内源性 s s 耗竭后使学习i己 忆受阻碍， 而加入外源性 s s能逆转该现象; 脑内生长抑素含量减少可导致一些痴呆症的认知 和智力障碍，由此表明，s s参与了条件性反应的形成和信息的储存，在学习i己 忆 过程中发挥着重要的作用。 三、锌与脑功能的关系 锌是机体重要的营养素，具有重要的生理功能，提供适当的锌是保证正常生 长发育，尤其是脑发育必不可少的。对它的研究多年来一直是营养学研究中最为 活跃的课题之一。早在 1 9 3 4年t o d d等就阐明:锌为生命所必需的元素。适量的 锌会直接或间接的影响细胞代谢的各个方面:国际统一命名的酶中有 2 0 0多个属 8 锌金属酶，是有丝分裂和蛋白质合成所必需的;是生物膜脂蛋白的组成部分，它 们影响膜的腺嗓吟环化酶、鸟嚓吟环化酶、 n a - k 十 a t p酶、c a mp的功能，参与 膜受体功能调节和神经递质的释放、兴奋传递过程。正常神经细胞的发育也必须 有锌的参与，缺锌会造成多方面的发育停滞:包括骨骼、肝脏、辜丸、肌肉、胸 腺、脾和淋巴系统，尤其对脑发育和功能的影响最大。 1 .锌影响行为的原因 锌可影响脑的组织结构。有资料表明，母鼠缺锌可使胎鼠大脑变小，脑d n a 降低，脑细胞数量减少，严重缺锌可使子代大脑先天性畸形;另外，锌缺乏鼠小 脑小，海马突触小泡明显减少3 5 1 ; 缺锌使生长大鼠 海马 c a 3 区有髓神经纤维的髓 鞘结构发生明显形 态改 变， 补锌后， 可见明 显改 善 (3 6 1 。 还有， 缺锌使脑的g o / g期 细 胞增多， 而s + g 2 / m期 细胞降 低， 意即 细胞 增殖指数降 低 3 7 1 。 体 外实 验发 现， 锌对海马神经元的生长发育具有促进作用，能使其神经突起生长，突起数增多， 神经元的存活数和神经元胞体的直径和面积增加1 3 8 1 。 对豚鼠的实验则表明，缺锌 使豚鼠 的 神经肌肉 接头损害3 9 1 。 而 对沙土鼠 的 实验发现， 提前 皮下注射锌制剂， 可使暂时性大脑缺血的海马的 神经细胞损伤和细胞死亡减少4 0 1 锌可影响脑的化学组成及一些生化物质的含量与结构功能。 首先， 影响脑中其 他功能矿物元素含量4 1 1 。 第二， 锌影响脑中酶和功能蛋白的合成和结构。 有资料 指出， 锌对脑中乙 醇脱氢酶、 谷氨酸脱氢酶、 碱性 磷酸酶、 c u z n - s o d酶 4 2 1 、 谷 氨酸脱 梭酶 ( 调节g a b a的 平 衡) 4 3 1 . 2 , 3 。 一 环 磷酸核 普水解酶、 l 一 谷氨酸 脱 水酶4 4 1 、一氧化氮合成酶 ( n o s ) 4 5 的活性有明显影响。同时缺锌鼠 的脑细胞微 管装配受损14 6 1 ，另外锌对脑中的一些功能蛋白 有积极的调节作用。第三，锌可影 响脑中神经递质的含量及其与受体的结合。第四，影响脑中阿片肤及其受体的相 互作用。第五，锌影响脑中核酸的合成及基因的转录。尽管动物出生后神经元数 目己恒定，但此时缺锌仍可影响核酸的合成，使神经细胞发育和胶质细胞增殖受 阻，以 及神经髓鞘发育障碍5 3 ,7 0 1 。 有资料表明， 缺锌使大鼠 脑中d n a和r n a合 成减少4 7 1 ; 另外， 锌可作为酶的活性中 心组成部分参与基因表达， 如r n a聚合酶 i 、1 1 、川为含锌金属酶，分别为合成r r n a , t r n a和m r n a所必需。锌指蛋白 是真核生物细胞中最普遍存在的一 类d n a结合蛋白 7 1 1 ，能选择性地与核酸结合， 参与基因表达和调控。目前认为存在于神经细胞受体中的锌指蛋白调控着神经细 胞的基因表达，对神经细胞的发育和功能调节有重要意义。锌作为锌指蛋白的组 成成分， 可以 通过锌指蛋白 对基因的表达起调节作用4 8 。 近年来在人脑中发现一 种含锌的类金属硫蛋白，即生长抑制因子，可防止神经细胞过早死亡。在老年性 痴呆患者中，该因子水平的明显降低，可能与锌缺乏有关5 3 1 。第六， 锌影响脑细 胞第二信使，环磷酸腺普 ( c a mp ) 和环磷酸鸟昔 ( c g mp ) 是细胞内的第二信使， 对信号传递起着重要的作用4 9 1 2 .缺锌对学习记忆的影响: 锌与学习记 忆的关系近年来已引 起一定的关注。 锌在脑中的分布是不均一的， 据对神经组织全容量分析， 边缘系统、皮质部、 扣带回、 齿回和海马中含量较多， 其中尤以 海马结构和大脑皮层含量最高3 3 1 ，如啮齿类动物海马锌含量可高达 1 3 3 微克/ 克干重3 4 1 ，而海马和大脑皮层与行为功能密切相关，因此锌在脑中的这种分 布说明其在调节功能方面的重要作用。它影响脑内许多神经递质的释放。大量动 物实验和临床资料说明锌与智力水平有密切关系。有研究表明，在行为方面缺锌 大鼠表现为活动减少、觅食动机和摄食量也减少5 2 1 ;对缺锌大鼠 进行水迷宫和条 件反射测验，其学习能力显著低于对照组，条件性回避行为的百分率，缺锌组大 鼠习得率曲 线上升趋势明显较对照组缓慢5 1 1 。 适量的补充锌有助于 提高成年和老 年大鼠的学习记忆能力，摄入锌过量导致幼鼠脑、海马超微结构改变，学习i 己 忆 能力减退5 0 1 。 缺锌可以 影响人脑的功能。 机体严重缺锌时的明显特征就是出 现种 种异常行为，以及健忘、记忆力减退等15 3 1 。儿童锌缺乏时常会出现厌食，味觉减 退甚至发生异食癖，以后逐渐出现生长缓慢、身材矮小、生殖器官发育落后、免 疫功能差等许多症状， 。 肺心病5 5 1 、肾病综合征5 6 1 、 尿毒症 5 7 1 等患者多伴血锌水 平的降低，其烦躁、忧郁、健忘、记忆力减退等症状，给予补锌治疗后有不同程 度地好转5 8 ,5 9 1 。 缺锌可促发神经原纤维的紊乱， 在a l z h e i m e r 型老年性痴呆的发病 中占重要地位，给予锌剂可有较好的治疗效果。国内的研究也表明轻度智力低下 儿童血清锌和过氧化物歧化酶活性明显低于正 常儿童6 0 1 。在孕期和哺乳期缺锌妇 女，其子女成年后的智力将受到影响，缺锌发生越早，对学习i 己 忆功能的危害就 越大;年长儿和成人缺锌可促进神经细胞的退化，甚至引起损伤，从而影响其学 习 记 忆 活 动 (6 11 3 .锌对学习记忆能力的影响机制 1 )缺锌引起的神经病理改变缺锌可引起海马 c v 3区锥体细胞突触小泡减 少， 也可能损害神经纤维的微丝、 微管结构， 破坏突触后膜的结构完整性8 1详细 机理尚不清楚。 2 )锌对神经递质的影响影响学习记 忆能力的神经肤加压素 ( a v p )在缺锌 大 鼠 体内 合 成明 显 下 降 13 1 . s l e v in j 丁 等 用l - 3 h g lu 和l - 3 h a s p 标记 观 察 发 现 锌 能调 节神经元受体 对兴奋性神经递质( g l u 和a s p ) 的 亲 和力， 其实 验中 缺锌动 物 行为学改变可能就与受体亲和力发生改变有关，锌的作用相当于海马兴奋性突触 的一种强抑制剂， 维持神经递质正 常功能18 ,6 2 1 3 )锌对海马的影响海马是学习记 忆活动的重要核团，参与认知i己 忆功能和 情绪反应。 对不同 发育期大鼠 脑的8 个区域含锌量的测定表明海马含锌量最高 5 2 1 海马锌是贮存在神经末梢的突触中，调节突触功能，锌含量的高低与学习记 忆功 能 呈明 显正 相关 f 5 1 1据 报道， 胎龄为1 6 - 2 4 . 2 5 3 2 和责干3 2 周 的丁 常fl ip l l .n. ni _ 额、顶和枕叶，以及海马、小脑、脑干、延髓等组织中锌含量随胎龄增长而迅速 增加。在海马中锌的蓄积尤其明显，大于3 2周胎龄时为 1 6 2 4 周的5 倍，提示 海马中 锌含量在学习记 忆中的地位1 6 3 ) . l t p目前 被公认为学习记忆的突触可塑性 模式， 动物的学习记忆能力的优劣与其海马区l t p 效应呈显著正相关3 5 ,6 4 1 。 锌在诱 发海马区突触电 位中具有重要作用6 6 1 。 海马缺锌可影响神经元之间信息传递的突 触功能。有资料显示正常大鼠up诱发率可达 1 0 0 %，而缺锌大鼠l t p诱发率几 乎为零16 5 1 ，内源性锌的释放能诱发海马锥体细胞中自发的去极化突触电位，使海 马苔状纤维发出兴奋性冲动。 各种原因引起的血清锌水平下降均可使海马锌降低， 从而影响海马区的电活动，影响神经信息的传导，整合和储存，可能是缺锌影响 学习记忆功能的神经生理学基础5 3 ) s o u t h a m等人发现中 枢神经系统中有n m d a受体一 n o - c g m p 通路6 7 1 : 从突触 前部位释放的兴奋性氨基酸结合到后膜的n 一 甲基一 d 一 天门冬氨酸 ( n md a ) 受体或 其它受体上，引起后膜去极化，产生钙离子内流，钙与钙调蛋白结合后激活一氧 化氮合成酶 ( n o s ) ，催化l 一 精氨酸氧化产生一氧化氮 ( n o ) , n o自由扩散通过 细胞膜， 激活邻近突触前和突触后的可溶性鸟普酸环化酶， 产生c g mp ， 再由c g mp 调节细胞的功能。 内源性锌能阻滞海马神经元n md a受体介导的兴奋性突触后电 位，增加 n md a受体激活的离子通道而激活 n md a受体，诱发和维持 l p t 。国 内也有学者报道4 5 缺锌大鼠 脑内n o s 活性及。 g m p 水平明显低于对饲组和自 由 喂 养组，并抑制 n md a受体一 n o - c g mp通路。目 前认为 n md a受体一 n o - c g mp 通 路是缺锌影响学习记忆的重要机制之一。但另有实验证明缺锌大鼠的海马及大脑 皮层 n o含量增加，并认为 n o在海马作为实触后逆信使，对 l t p的产生，对学 习记 忆功能及突触的可塑性等有重要作用6 8 1 四、年龄与学习记忆及生长抑素的关系 许多 研究表明，成年人记 忆随年龄的增长而有所减退7 1 ,7 2 1 ，不同的记 忆活动 随增龄发生的变化不同。认知作业成绩和认知速度是用以评价认知功能年龄差异 的两项重要指标。有研究表明，与注意、符号鉴别、图形加工和学习记忆等信息 加工活动有关的认知作业成绩随年老而明显降低;但与符号操作、概念推理及抽 象思维 等活 动有关的 认知作业成绩并 不随年老而明 显降 低田 。 另 外有大量 研究 报 告，认知作业速度随年老普遍降低，但老年人经学习训练认知作业速度可明显提 高，且中枢信息加工过程速度的提高可能大于外周感觉一 运动速度的提高。文化教 育因素及相关的脑力劳动发杂程度对认知速度年老衰减过程有明显影响，提示脑 的积极活动对于延缓脑的衰老有重要作用7 4 ,7 5 。 工作记忆是一种对信息进行暂时性的加工和储存的系统和能力，对于学习、 记忆、推理、思维及语言 理解等复杂认知任务起重要作用。目前国外关于工作记 忆老化的 研究很活跃。 s a l t h o u s e 和b a b c o c k 7 6 . s a l t h o u s e 7 7 1 . f i s k和w a r r 11 8 1 等均 报告工作记 忆与年龄呈负相关7 9 1据报道， 增龄对一记 忆功能的影响与所给予的学 习任务和所需要的信息处理水平有关。对大鼠操作行为的研究表明，大鼠的长时 记忆随年龄增长有不同的变化。1 0月龄鼠能很快回忆起先前学习过的所有操作行 为程序， 而1 9 月龄老年鼠只能回忆起相对简单的操作行为程序， 对较为复杂的程 序则容易遗忘8 0 1 有关生长抑素分泌的 年龄变化一直有争议， s o n n t a g 发现在老龄动物下丘脑中 s s m r n a水平明显减低， 但s s的分泌却增加; 而ma rt i n o l i 和c o l o n n a 认为s s 基 因 表达降低不明显4 1据报道， 鸡的下丘 脑中s s 神经元数量在发育后期明显 减少， s s 神经元合成肤的能力逐渐降低。随着大鼠的衰老及认知功能逐渐降低，其脑区 生长抑素的基因表达均明显降低18 1 ,8 2 1 。原位杂交观察到老年大鼠 额颗皮层的 s s m r n a水平较年轻鼠明显降低。 原因之一可能就是s s 对g h的反馈敏感性降低。 在青年和成年大鼠中，g h可通过反馈刺激s s基因表达调节自己的分泌，而给老 龄大鼠 注射g h后几乎不能改变下丘脑中s s m r n a的水平8 3 1 五、有关细胞培养及基因转染 动物细胞培养是指离散的动物或细胞在体外人工条件下的生长增殖过程8 4 1 在此过程中，细胞不再形成组织。由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便 于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化以及 遗传物质的表达调控等高难领域的既便利又有效的新方法s s l据可考证的资 料记 载， wil h e l m r o u x 是第一个进行动物组织培养实验的人， 他于1 8 8 5 年将鸡胚髓板 放置于温热水中使之维持存活了数天。1 9 0 7 年r o s s h a r r i s o n 将蛙胚神经管区的一 片组织植入蛙的淋巴液凝块中，使这片组织不但存活了几个星期，而且从培养的 细胞中长出了轴突。从而证明了动物组织 ( 细胞)在离体条件下培养是完全可行 的。在此基础上，1 9 1 2 年 c a r r e l 则更加丰富和完善了此项技术，他将无菌操作技 术引入动物细胞培养，在没有使用抗菌素的条件下使鸡胚心脏细胞在人工培养条 件下生存了3 4 年，先后传代 3 4 0 0 次。 细胞培养可分为原代培养和传代培养两大类。细胞从组织中分离，在体外生 长至传代之前可视为原代培养。制备原代培养物第一步是无菌解剖组织，用机械 或酶化技术分散细胞。 组织可以 简单 碎成l m m ， 的小块。 这些小块依靠本身的 粘性 涂抹在平皿或用凝固的血浆使之贴附，细胞从碎片成长出来，而后使用或传代。 原代培养物也可产生分散的组织，如用胰蛋白酶或胶原酶消化组织块，使细胞悬 浮，细胞悬浮液下沉后，贴壁扩散于玻璃基质或塑料基质表面，这种原代培养选 择性更高。单层细胞培养物用胰蛋白酶消化，分散成单个细胞，然后稀释接种于 新的培养容器称为传代。传代培养最大的优点在于提供大量的能长期使用的稳定 细胞材料。 为了能在细胞水平和分子水平深入研究生长发育过程中神经细胞的形态、生 理、药理及生化代谢，各国科学家已由过去的神经组织培养转移到神经细胞的分 散培养， 例如电 位活动8 6 1 、 酶的代谢8 7 1 、生长分化8 8 1 、 突触形成8 9 1 、以 及神经生 长因子9 0 的作用等研究都较普遍地建立在神经细胞分散培养的方法上。神经细胞 的原代培养被认为比那些在体外多次传代的神经细胞株更能代表体内的神经细胞 的正常发育状态8 8 ,9 1 1 目 前， 外源基因导入真核细胞的方法较多9 2 1 ， 如重组d n a病毒感染法、 显微 注射法、电穿孔法、 d e a e - 葡聚糖转染法、脂质体转染法和磷酸钙转染法等。 重组 d n a病毒感染法中病毒 d n a的序列有时会影响外源基因的表达，所插 入的 外源基因大小有一定的限制，不能 超过8 k b ，并且具有潜在的危险性9 3 1 电穿孔法和显微注射法需要昂贵的仪器， 且后者导入 d n a时只能一个细胞一 个细胞的注射，不适合大量细胞的 基因导入9 4 1 d e a e - 葡聚糖转染技术只对少数细胞系转染效率高，且对细胞有毒性作用。 磷酸钙转染法和脂质体转染法操作简单，不需要昂贵的仪器设备可大批量转 染，对细胞无毒性。所以，这两种方法均适合实验室进行细胞内基因导入的研究。 磷酸钙转染法是g r a h a m等人于 1 9 7 3 年建立的，此后该法作为常规方法用于 多种细胞的基因转染，可获得短暂或长期表达。但据报道，此法影响参数较多， 制备具有高效转染目的的基因共沉物较困难，需要熟练掌握操作技术和严格控制 溶液的p h ， 且对质粒d n a的 质量要求极高， 质粒溶液中 不能含有杂蛋白 及r n a . 脂质体转染法是w e i n s t e i n 等人于1 9 8 4 年开始采用的 9 5 1 。 最初转染时采用逆 相蒸 发技术 制备包装d n a的 脂质体， 现己 发展成为商品 化的l i p o f e c t i n 试剂。 虽 然l i p o f e c t i n 试剂较贵， 但转染效率相对较高，且操作步骤简单易行， 容易掌握。 脂质体作为基因载体，在基因工程和基因治疗中被广泛应用。早期都是将核酸分 子包埋在脂质体水相中，其包埋效率和转染效率都较低。阳离子脂质体的发现， 克服了传统包埋核酸脂质体的缺点， 不仅运载核酸的效率达 1 0 0 yo， 而且转染效率 显著提高。阳离子脂质体是通过表面正电荷与带负电荷d n a或r n a结合，并保 护 所结 合的 核酸分子不被酶 解9 6 1 g 4 1 8 是细胞基因转染过程中常用的选择抗生素。当作用于普通细胞时，由于 细胞不含抗 g 4 1 8的抗性基因，因而会中毒死亡;相反，当转染质粒中携带的抗 g 4 1 8的抗性基因n e o r基因表达时，则细胞获得对 g 4 1 8的抗性而不死亡，从而 区别出基因是否已转染成功 实 验 研 究 第一部分 生长抑素r n a 探针的制备和检测 碱基互补的两条核酸链可以通过a t ( u ) , g c碱基配对形成稳定的结构，利 用这种性质定性或定量测定组织及细胞中某种蛋白质或多肤 m r n a是一种很有效 方法。而特异性的杂交探针则是分子杂交有效进行并能检测的必要工具。我们为 了测定神经组织或细胞中生长抑素m r n a ，特制备了生长抑素m r n a互补链 ( 用 放射性同 位素 2 p 或地高辛标记)作为r n a探针，并对该探针进行了 检测。 1 . 材料与方法 l . 1材 料. 与 i 式剂 1 . 1 . 1 材料 质 粒p g e m - 3 : 含 有 外 源片 段s s - d n a 。 由l in k o p o m g s u n iv e r s it y ( s w e d e n ) h a n s - j u r g m o n s t e i n 博士惠赠。其结构如下图所示: h i n d i 渐s s 一 d n a 图1 、 含有s s - d n a的质粒p g e m - 3 结构示意图 宿主菌j m 1 0 8 :由南开大学生命科学院微生物系任改新教授惠赠。 细胞总r n a : 来自 成年大鼠大脑皮层，大鼠 购于天津药物研究院。 1 . 1 .2 主要试剂及配制方法 l b培养基:在 9 5 0 m 1 蒸馏水中加入 : 胰蛋白 月 东l o g 酵母提取物5 g n a c l l o g 完全溶 解后， 用5 m o l / l n a o h调节p h 值至7 . 0 ， 定容至1 0 0 0 m 1 , 高 压蒸气灭 菌2 0 m i n a 总讨论 学习记忆是大脑的高级功能，对其神经机制己经在神经解剖学、神经生理学 及神经生化学等各个方面进行了广泛的研究。已有资料表明，生长抑素对学