（分析化学专业论文）磁性金属复合纳米粒子的合成及生物传感器的研制.pdf

桂林工学院硕士学位论文 要 功能化磁性纳米粒子在生物化学、临床医学等诸多领域有广阔的应用前景。本文主要 工作是在f c 3 0 4 纳米粒子上包覆一层纳米级贵金属，合成具有生物相容性和超顺磁性的磁 性金、磁性银、磁性铂复合纳米粒子，再通过不同的固定化方法将酶分子固定在磁性复合 粒子上，用于制备一系列高灵敏度的新型酶生物传感器。 利用共沉淀法合成纳米f e 3 0 4 颗粒，将半胱氨酸吸附到纳米f e 3 0 4 微粒表面，使其磁 性粒子巯基化。借助半胱氨酸的巯基( s h ) 对纳米金的强烈吸附，使纳米金自组装到磁性颗 粒上，得到组装型磁性金复合纳米粒子。再通过静电吸附作用自组装辣根过氧化酶( h r p ) ， 合成了f e a 0 4 c y s a u h r p 复合粒子，最后通过磁力将其修饰到固体石蜡碳糊电极表面，制 得新型过氧化氢生物传感器。以对苯二酚作为电子媒介，用计时电流法对h 2 0 2 进行测定， 线性范围为6 0 x 1 0 击2 4 x 1 0 一m o l l ，检出限为2 5 1 0 击m o l l ，响应时间小于1 0s 。 通过自组装技术合成组装型的磁性银。通过静电吸附法固定葡萄糖氧化酶，再通过磁 力固定法将酶复合粒子固定在改装的铁芯玻碳电极表面，而制得新型的葡萄糖生物传感 器。优化了传感器试验参数，在p h7 0 的磷酸盐缓冲溶液中，以二茂铁为电子媒介体，工 作电位为0 1 7v 的较低电位下，传感器对葡萄糖有很好的电催化氧化性能，传感器对葡萄 糖的响应线性范围为5 2 1 0 缶1 6 1 0 一m o l l ，响应时间小于1 0s 。信噪比为3 时，测得 检出限为2 0 x 1 0 m o l l 。，并有较好的抗干扰性和良好的重现性。 控制一定的实验条件，利用种子生长法在f e 3 0 4 纳米粒子表面直接化学还原氯金酸， 合成了核壳结构f e 3 0 4 a u 复合粒子。在核壳结构f e a o d a u 微粒上共价交联法固定葡萄糖 氧化酶，制得磁性复合粒子f e 3 0 4 a t t g o x ，通过磁力将其固定到固体石蜡碳糊电极上，以 二茂铁为电子媒介，制得新型葡萄糖传感器。研究了该传感器的传感性能，优化了实验参 数。在p h7 0 的磷酸盐缓冲溶液中，葡萄糖浓度在5 0 x 1 0 。5 - - 2 0 x 1 0 艺m o l l 间呈良好线性 关系，响应时间小于1 0s 。 。 用化学还原法直接在f c 3 0 4 粒子表面还原氯铂酸，制得核壳结构的f e 3 0 j p t 纳米粒子。 通过共价交联法f c 3 0 4 p t 纳米粒子上固定辣根过氧化酶，最后通过磁力将其固定到铁芯碳 糊电极表面，制得新型过氧化氢传感器。在p h 7 0 的磷酸盐缓冲溶液中，0 1 5v 的工作电 位下，过氧化氢浓度在8 3 x l o 一5 0 x l o - 3m o l l 范围内成良好线性关系，相关系数为 0 9 9 8 8 ( n = 1 0 ) ，响应时间小于1 5s 。信噪比为3 时，检出限为2 0 x 1 0 。6 m o l l 。 利用磁性复合粒子固定酶制得传感器具有催化性能高、稳定性、造价低和易更新等优 点，有望得到更多的实际应用。 关键词：磁性纳米粒子，贵金属，葡萄糖氧化酶，辣根过氧化酶，生物传感器 桂林工学院硕士学位论文 a b s t r a c t as e r i e so fm a g n e t i cc o m p o s i t en a n o p a r t i c l e s ，i n c l u d i n gf e 3 0 脚，f e 3 0 d a g , f e 3 0 4 p t ， w h i c hh a v eg o o db i o c o m p a t i b i l i t ya n ds u p e r p a r a m a g n e t i s m w e r e rf a b r i c a t e di nd i f f e r e n t m e t h o d s a n das e r i e so fb i o s e n s o rw i t hh i 9 1 ls e n s i t i v i t ya n dg o o ds t a b i l i t yw e r ef a b r i c a t e db a s e d t h e s em a g n e t i cp a r t i c l e si m m o b i l i z e dw i t hd i f f e r e n te n z y m e s n a n o f e 3 0 4p a r t i c l e sw e r ep r e p a r e db yc h e m i c a lc o p r e c i p i t a t i o nm e t h o d ，t h e nn a n o - a u p a r t i c l e sw e r ea s s e m b l e do n t om e r c a p t o - m o d i f i e dm a g n e t i t e ( f e 3 0 4 ) n a n o p a r t i c l e ss u r f a c e t h r o u g hc o v a l e n tl i n k a g eb e t w e e nn a n o - a ua n dt h i o lg r o u p h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) w e r e a d s o r b e do nt h em a g n e t i cn a n o a up a r t i c l e sa n df e 3 0 d c y s t e i n e a u h r pm a g n e t i cb i o - p a r t i c l e s w e r eo b t a i n e d an o v e la m p e r o m e t r i cb i o s e n s o rw a sd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fh 2 0 2 b a s e di m m o b i l i z i n gt h ef e 3 0 d c y s t e i n e a u r r pb i o p a r t i c u l a t e so nt h es u r f a c eo fa ni m n c o r e s o l i dp a r a f f i nc a r b o np a s t ee l e c t r o d eb ym a g n e t i cf o r c e h y d r o g e np e r o x i d ew a sd e t e c t e dw i t h t h ea i do fh y d r o q u i n o n em e d i a t o rt ot r a n s f e re l e c t r o n sb e t w e e nt h ee l e c t r o d ea n dh r p v a r i o u s e x p e r i m e n t a lv a r i a b l e ss u c ha sm e d i a t o rc o n c e n t r a t i o n ，p ha n dt h et e m p e r a t u r eo fb a c k g r o u n d e l e c t r o l y t e ，a n dt h ea p p l i e dp o t e n t i a lw e r ee x p l o r e df o ro p t i m u ma n a l y t i c a lp e r f o r m a n c eo ft h e e n z y m ee l e c t r o d e t h eb i o s e n s o rh a daf a s tr e s p o n s eo fl e s st h a n1 0sw i t hl i n e a rr a n g eo f 6 0 x 1 0 钆2 4 x 1 0 3 m o l la n dt h ed e t e c t i o nl i m i to f 2 5 x 1 0 。6 m o l la tas i g n a l t o n o i s er a t i oo f 3 n o t i c e a b l y , t h eb i o s e n s o rw a se a s yt of a b r i c a t e da n dr e n e w e d , b e c a u s et h eb i o s p e c i e sw e r e i m m o b i l i z e db ya r te x t e r n a lm a g n e t i cf i e l d b a s et h es e l f - a s s e m b l e dm e t h o d ，f e 3 0 d e y s t e i n e a gc o m p o s i t en a n o p a r t i c l e sw e r e f a b r i c a t e d t h e n g l u c o s eo x i d e s ew a si m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo fm a g n e t i cc o m p o s i t e p a r t i c l e sb ya b s o r p t i o nm e t h o d aan o v e lg l u c o s eb i o s e n s o rw a sm a d eb a s e di m m o b i l i z i n gt h e f e 3 0 d c ，y s t e i n e a g g o xb i o - p a r t i c u l a t e sw i t ht h ea s s i s to fam a g n e t t h ep e r f o r m a n c eo ft h e s e n s o rw a ss t u d i e db yc y c l i cv o l t a m m e t r i ca n dc h r o n o a m p e r o m e t r i ct e c h n i q u e s i np b so f p h 7 0 ， w i t ht h ep r e s e n c eo ft h em e d i a t o ro ff e r r o c e n ef e r r o c e n e ，a tt h el o wa p p l i e dp o t e n t i a lo fo 17 v ， t h eb i o s e n s o re x h i b i t e dah i 曲e l e c t r o c a t a l y t i co x i d a t i o np r o p e r t yf o rg l u c o s e ，a n dt h er e s p o n s e t i m ew a sl e s st h a nl o s w i t hl i n e a rr a n g eo f 5 2 x 1 0 6 1 6 x 1 0 3 m o l l ，a n dt h ed e t e c t i o nl i m i to f 2 0 xl0 旬m o l la tas i g n a l t o n o i s er a t i oo f3 t h eb i o s e n s o rh a sag o o ds e l e c t i v i t ya n d r e p r o d u c i b i l i t y , e s p e c i a l l y , i tw a se a s i l yt or e n e wb e c a u s et h ee n z y m ep a r t i c l e sh a sag o o d m a g n e t i s m m a g n e t i cf e 3 0 曲c o m p o s i t en a n o p a r t i c l e sw i t hc o r e - - s h e l ls t r u c t u r ew a ss y n t h e s i z e di n i i 桂林工学院硕士学位论文 a d v a n c e 。t h e nc o m p o s i t em a g n e t i cp a r t i c u l a t ec o m p o s e do ff e 3 0 4 | a l l g l u c o s eo x i d e s e w a ss y n t h e s i z e d ，w h i c he x h i b i t e dg o o ds u p e r p a r a m a g n e t i s m an o v e la m p e r o m e t r i cb i o s e n s o r h a sb e e nd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fg l u c o s eb a s e df e a 0 4 a u g o xp a r t i c u l a t ea b s o r b e d o nt h ei r o n c o r es o l i dp a r a f f i nc a r b o np a s t ee l e c t r o d et h r o u g hm a g n e t t h ep e r f o r m a n c eo ft h e s e n s o rw a se v a l u a t e db yc y c l i cv o l t a m m e t r i ca n dc h r o n o a m p e r o m e t r i ct e c h n i q u e s i np b s o fp h 7 0 i nt h ep r e s e n c eo ft h em e d i a t o ro ff e r r o c e n e ，al i n e a rc a l i b r a t i o np l o tw a so b t a i n e di nt h e g l u c o s ec o n c e n t r a t i o nr a n g eb e m e e n5 0 xl0 5a n d2 o x lo m o 儿a n dt h er e s p o n s et i m et o g l u c o s ew a sl e s st h a n10s t h es e n s o re x h i b i t e dh i g hs e n s i t i v i t y ，g o o ds e l e c t i v i t ya n ds t a b i l i t y , d u et ot h ee x i s t e n c eo fn a n o m e t e rf e 3 0 4a n dn a n o - a uw h i c hm a i n t a i nt h ee n z y m a t i ca c t i v i t yo f g l u c o s eo x i d a s e ，a n dt h es e n s o rw a se a s yt or e n e wb yr e m o v a l o ft h em a g n e t am e t h o do fp r e p a r a t i o no ff e 3 0 4 p tc o r e - s h e l ls t r u c t u r em a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw a s d e v e l o p e db yc h e m i c a lc h e m i c a lr e d u c t i o n ，t h a tk b h 4 w a su s e dt od e o x i d i z e 旷i o n sw h i c h w e r ea d s o r b e do nt h es u r f a c eo ff e 3 0 4p a r t i c l e si na d v a n c e h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ew a s i m m o b i l i z e do nt h ef e 3 0 4 p tp a r t i c l eu s i n gc o v a l e n c e - e r o s s l i n k i n gm e t h o d ，a n df e 3 0 4 f t h r f p a r t i c l ew a so b t a i n e d t h e nan o v e lh y d r o g e np e r o x i d es e n s o rw a s f a b r i c a t e db yi m m o b i l i z i n g f e 3 0 4 p t h r pp a r t i c l e so n ai r o n c o r ec l e a n e dc a r b o np a s t e e l e c t r o d et h r o u g hm a g n e t i c f o r c e t h e p e r f o r m a n c e o ft h es e n s o rw a s s t u d i e d b yc y c l i c v o l t a m m e t r i ca n d c h r o n o a m p e r o m e t r i ct e c h n i q u e s i np b so fp h 7 0 ，w i t hh y d r o q u i n o n ei ni t a st h em e d i a t o r , t h e a p p l i e dp o t e n t i a lo f o 15 v ，t h er e s u l t e db i o s e n s o r e x h i b i t e df a s ta m p e r o m e t r i cr e s p o n s e ( w i t h i n 1 5s ) t oh 2 0 2 ，t h el i n e a rr e s p o n s et oh y d r o g e np e r o x i d er a n g e df r o m8 3 l 矿t o5 0 x 1 0 - 3w a s o b t a i n e d t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tw a so 9 9 8 8 ( n = 1o ) n l ed e t e c t i o nl i m i to ft h eb i o s e n s o rw a s 2 o x10 - 6m o l l t h es e l e c t i v i t y ，s t a b i l i t ya n dr e p e a t a b i l i t yo ft h eb i o s e n s o rw e r ea l s oe v a l u a t e d t h es e n s o rw a se a s yt of a b r i c a t ea n dr e n e w k e y w o r d s ：m a 匦e t i cn a n o p a r t i c l e s ，n o b l em e t a l ，g l u c o s eo x i d a s e ，h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ， b i o s e n s o r i i i 桂林工学院硕士学位论文 研究生学位论文独创性声明和版权使用授权说明 独创性声明 本人声明：所呈交的论文是我个人在李建平教授指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得桂林工学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 对论文的完成提供过帮助的有关人员已在论文中作了明确的说明并致以了谢意。 学位论文作者( 签字) ： 签字日期： 版权使用授权说明 本人完全了解桂林工学院关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照学校要求提 交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检 索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为 目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 学位论文作者( 签字) ： 指导教师签字： 签字日期： 桂林工学院硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 新型生物材料磁性纳米复合粒子 1 1 1 磁性纳米复合材料的概念 纳米磁性材料技术早在2 0 世纪7 0 年代就被应用于共沉制造磁性液体材料，19 8 8 年，法 国巴黎大学教授研究组首先在f e c r 纳米结构的多层膜中发现了巨磁电阻效应，引起国际上 的反响。此后，美国、日本和西欧都对发展巨磁电阻材料及其在高技术中的应用投入很大 的力量，兴起纳米磁性材料的开发应用热。磁性纳米复合材料是指综合运用纳米技术和化 学修饰技术、生物偶联技术等技术手段，制造的既具有纳米磁学特性，又具有生物相容性、 表面活性等优异特性的复合材料。磁性纳米粒子一般是指颗粒尺寸在1 1 0 0n l n 范围内的 超微磁性粒子。磁性纳米复合材料具有优异的磁学性能，这主要是由于，一方面磁性纳米 复合材料在结构上与体相材料有很大差别。如常规晶体、非晶体f e 和其合金的磁结构是由 许多磁畴构成，畴间由畴壁隔开，磁化是通过畴壁运动来实现。纳米晶f e 中不存在这种畴 结构，其每个晶粒一般为一个单的铁磁畴，磁化由粒子的各向异性和粒子间的相互作用决 定。另一方面磁性纳米复合材料的基本组成单元是磁性纳米微粒，本身能表现出反常的磁 学性能，具有奇异的超顺磁性、较高的矫顽力和较低的居里温度【1 3 】。这些特性和差异给予 了科学工作者一片广阔的天地，也给临床医学、生物分离等提供了有利的技术手段。 1 1 2 磁性纳米粒子的特殊性质 磁性纳米粒子之所以能引起了人们广泛的关注，这是因为当物质的尺寸减小到纳米范 围时，具有表面效应，小尺寸效应，量子效应，宏观量子隧道效应等几种特性，由此导致 了纳米粒子的光、磁、电、热、力以及化学活性等性质与本体物质有显著差异。而以f e ， c o ，n i 等金属元素为基体元素形成的纳米尺寸微粒还具有奇异的超顺磁性等特性，如纳米 f e ，f e 2 0 3 ，f e 3 0 4 ，f e p t 等。 表面效应是指，随着纳米粒子的粒径变小，纳米粒子的表面原子与总原子之比急剧增 大，粒子的比表面积、表面能及表面张力也随着增加的效应。 小尺寸效应是指当超微粒子的尺寸与光波波长、德布罗意波长以及超导态的相于波长 长度或透射深度等物理尺寸相当或更小时，晶体周期性的边界条件将被破坏，非晶态纳米粒 子的颗粒表面层附近原子密度减小，产生出的特殊性质。 量子效应是指当粒子尺寸下降到某一值时，金属费米能级附近的电子能级由准连续变 桂林工学院硕士学位论文 为离散的现象，纳米半导体微粒存在不连续的被占据的最高分子轨道能级和未被占据的最 低分子轨道能级，同时能带也会变宽的特殊性质。 超顺磁性是指当磁性粒子的粒径小于某一l 临界尺寸后，在有外加磁场存在时，表现出 较强的磁性。但当外磁场撤消时，无剩磁，不再表现出磁性。 1 1 3 磁性纳米复合粒子的结构和分类 磁性纳米复合粒子多为核壳式的纳米级微球。根据不同的应用方式，磁性纳米微球可 有三种结构形式：核壳结构，即由磁性材料组成核部，其他无机或有机材料作为壳层； 壳核结构，即将无机或有机材料作为核部，外面包裹磁性材料；壳核壳结构，即最 外层和核部为无机或有机材料，中间层为磁性材料。这三种结构中，第一种是以磁性材料 为核部，可以在其包覆层连接所需携带的药物、抗体等；第二种和第三种结构则是以无机 或有机材料为核部，可在核部结合对生物体内环境较敏感的药物等，避免其在到达靶部位 前与生物环境发生反应，而降低疗效或对其他细胞、组织、器官产生毒副作用。纳米磁性 材料大致可分为3 大类：一是纳米颗粒，二是纳米微晶，三是纳米结构材料【4 】。 1 2 核壳结构磁性纳米制备方法 核壳结构磁性纳米粒子一般不能通过一步反应直接形成，一般都是在合成磁性纳米粒 子之后再进行包覆形成性能稳定的具有特殊功能的复合粒子。生物医用核壳结构磁性纳米 粒主要是以磁性粒子作为内核，如图1 1 所示。图l ( a ) 为典型的核壳结构磁性纳米粒，外壳 材料为二氧化硅、金、银等贵金属或荧光半导体等功能化材料；图1 1 ( b ) 是介孔二氧化硅磁 性纳米粒，有望发展为可控释放靶向药物载体；图1 1 ( c ) 和( d ) 的壳层材料为功能纳米金或荧 光量子点；此外还有二氧化硅同时包裹纳米磁性粒子和量子点的多内核结构等。常用的制 备方法主要有溶胶凝胶法【5 埘、微乳液法 g q o 】、自组装技术 im 2 】、种子生长法 1 3 - 1 6 】和超声化 学法。 豢一 ( a ) ( b )( c ) ( d ) 图1 i 核壳结构磁性纳米粒示意图 f i 9 1 1s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no fs h e l l c o r em a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s 2 桂林工学院硕士学位论文 溶胶一凝胶是无机初始粒子( 金属盐或有机金属分子) 经过各种反应，最后形成一个三维 分子网络的过程，此法多用于制备磁性二氧化硅复合微粒。 微乳液是两种互不相溶液体在表面活性剂作用下形成的热力学稳定的、各向同性、外 观透明或半透明、粒径1 1 0 0n l n 的分散体系，一般由有机溶剂、水溶液、活性剂、助表 面活性剂4 组分组成。通常采用反相微乳液，即油包水型( w o ) 制备纳米粒。微乳液法广 泛用于制备纯纳米粒子以及核壳结构复合纳米粒，通常分为两步：( 1 ) 调节各组分用量，形 成稳定的微乳体系：( 2 ) j j l 入新组分或混合不同反应组分微乳液，引发反应，得到核壳结构 纳米粒。 自组装技术是通过分子与基材之间的化学键或静电作用形成有序的分子组装体系。该 方法设计灵活，操作简单，能在超分子水平控制壳层的组成结构和厚度，已成为当前化学、 物理学、材料学和生物学交叉领域一个令人瞩目的技术，在组装各种不同功能的复合纳米 粒方面具有广阔的应用前景。 种子生长法是以纳米磁性粒子作为种子，加入金属离子溶液和还原剂，通过控制沉积， 使a u 、a g 在磁性粒子表面异相成核生长，从而形成金( 银) 磁性粒子结构纳米粒。成功与否 的关键取决于溶液中新粒子的形成( 通过还原a u 3 + ) 与a u 3 + 还原在种子表面的相对速率，只 有当后者速率比前者大很多时，种子才会生长，同时消耗新产生的金核，即均相成核与异 相成核的相互竞争。 超声化学法是近些年发展起来的一种制备纳米粒子的新技术，超声波对化学反应起 作用的主要原因在于超声波所产生的超声波汽化泡”，它形成局部的高温、高压环境和具 有强烈冲击力的微射流。超声波空化作用与传统搅拌技术相比，更容易实现介质均匀混合， 消除局部浓度不均，提高反应速度，促进新相的形成，而且对团聚还可以起到剪切作用， 有利于微小颗粒的形成。超声波技术的应用对体系的性质没有特殊的要求，只要有传输能 量的液体介质即可，对各种反应介质都有很强的通用性。2 0 0 3 年，l i 等【1 7 】利用超声化学的 方法合成了具有核壳结构的f e c o 磁性复合纳米粒子，s i v a k u m a r 等f 1 8 】在2 0 0 4 年用超声化 学的方法合成了l a f e 0 3 纳米晶，n i k i t e n k o 等【1 9 】通过超声化学的方法制备t f e f e 3 c 纳米 晶粒子。2 0 0 7 年，吴伟等【2 0 】通过超声化学法成功地制备了核壳结构的磁性f e 3 0 d a u 复合 纳米粒子，复合粒子粒径在3 0n n a 左右，室温下磁化强度可达6 3e m u g 。其制备过程如图 1 2 所示。 林工学院硕士学位论文 茹喇睨t 一 。0 9 t f e 3 0 i 兰s m h 姻i i 魄l ”9 f e 毒o a u 图1 2 磁性纳米粒子的制备原理示意图 f i 9 1 2 i l l u s t r a t i o no f t h ec h e m i s t r yi n v o l v e di nt h es y n t h e s i so f t h ef e 3 0 4 a un a n o p a r t i c l e s 1 3 磁性纳米粒子在生物医学领域中的应用 具有生物相容性和一定生物医学功能的磁性纳米生物材料具有小尺寸效应、良好的磁 导向性、生物相容性、生物降解性和活性功能基团等特点，由于磁性生物纳米材料的生物 活性、亲和性或反应活性，可结合各种功能分子如酶、抗体、细胞、d n a 或r n a 等，因 而在在靶向药物、控制释放、酶的固定化、免疫测定、d n a 和细胞的分离与分类等领域有 广泛的应用【2 l 】。 1 3 1 靶向药物载体 利用磁性纳米颗粒制造靶向输送医疗药物，是目前医药学研究的热点。具有磁导向性 的药物载体微球可以靶向定位于作用对象，从而增强疗效、减少副作用。通常的靶向药物 载体微球是运用了载体对机体各组织或病变部位亲和力的不同，或将单克隆抗体与载体结 合，使药物能够转运到特定的治疗部位。在外加磁场的作用下，磁靶向性的药物载体微球 可以更方便地把载体定向到靶部位。w i d d e r 2 2 l 等首先提出了磁靶向药物传递系统的概念， 并开展了载药磁性微粒的研究。研究表明载药磁性微粒具有高效、低毒、高滞留性的优点。 但由于制备的微粒为l 3 岫，可引起血栓样血管栓塞，甚至导致实验动物死亡。纳米级的 磁性微球可以解决这个问题。磁性纳米颗粒的粒径比毛细血管通路还小1 2 个数量级，用 其作为定向载体，通过磁性导向系统控制，可将药物靶向输送到病变部位释放，以增强疗 效。动物临床实验证实，载药磁性纳米微粒具有高效、低毒、高滞留性的优点，它在治疗 结束后可以通过人体肝脏和脾脏自然排泄。目前应用磁性药物治疗的肿瘤多位于体表或离 体表较近，若治疗深部器官或组织的肿瘤，需要提高磁性微球的磁化强度，优化纳米微球 的粒径分布。 1 3 2 细胞分离 磁性纳米粒子用于分离癌细胞和正常细胞在动物、临床试验中已获成功，展现了令人 4 桂林工学院硕士学位论文 瞩目的应用前景。传统的细胞分离技术主要采用离心法，利用密度梯度原理进行分离，时 间长、效果差。1 9 8 3 年u g e l s t a d 等【2 3 j 提出用磁性微粒用于细胞分离，1 9 9 5 年w r i w a t z 等【2 4 】 首次报道了应用磁性激活细胞分选( m a g n e t i ca c t i v e dc e l ls o r t i n g ，m h c s ) 技术从恶性肿瘤患 者的外周血中分离出单个肿瘤细胞，认为该技术是较好分离靶细胞的分选方法。m a c s 技 术的原理是在磁珠表面偶联有免疫活性的抗体，直接与靶细胞的抗原分子或间接与结合在 靶细胞表面的抗体进行抗原抗体反应，在细胞表面形成“玫瑰花结 。将这些结合了磁珠 的细胞置于磁场下，通过洗涤使其与未被结合的细胞分离，从而达到分离和纯化细胞的目 的。胡振红等【2 5 】构建了能特异地与靶细胞结合并赋有磁响应性的小细胞肺癌免疫磁性微 珠，并检验其在分离微量癌细胞中的效率，结果该免疫磁性微珠能有效地从外周血单个核 细胞中分离出微量肺癌细胞，有望成为一项新的微量细胞检测方法。 1 3 3 免疫分析 免疫分析在现代生物分析技术中是一种重要的方法，它对蛋白质、抗原、抗体及细胞 的定量分析发挥着巨大的作用。在免疫检测中，经常利用一些具有特殊物理化学性质的标 记物如放射性同位素、酶、胶体金和有机荧光染料分子等对抗体( 或抗原) 进行偶联标记， 在抗体与抗原识别后，通过对标记物的定性和定量检测而达到对抗原( 或抗体) 检测的目 的。由于磁性纳米颗粒性能稳定，较易制备，可与多种分子复合使粒子表面功能化，如果 磁性颗粒表面引接具有生物活性的专一性抗体，在外加磁场的作用下，利用抗体和细胞的 特异性结合，就可以得到免疫磁性颗粒。利用它们可快速有效地进行免疫分析，具有特异 性高、分离快、重现性好等特点，同时磁性纳米颗粒具有超顺磁性，为样品的分离、富集 和提纯提供了很大方便，因而磁性纳米颗粒在免疫检测方面受到了广泛关注【2 6 1 。 程琼等【2 7 】采用化学键合法将乙肝抗体固化在自行制备的纳米磁性高分子功能微球表 面，利用免疫夹心反应原理，捕获溶液中的乙肝表面抗原和标记有辣根过氧化物酶的乙肝 第二抗体。在外加磁场的作用下，抗体抗原结合物从样品溶液中分离，在含有邻氨基苯酚 和过氧化氢的底液中，生成具有电活性的化合物3 氨基吩呃嗪，用示差脉冲伏安法进行测 定。结果令人满意。采用本方法检测血清中乙肝表面抗原，灵敏度大大高于目前临床采用 的酶联免疫吸附法。洪霞【2 8 】等，选用葡聚糖包覆超顺磁性的f e 3 0 4 纳米粒子，通过葡聚糖 表面的醛基化实现与抗体的偶联，制得t f e 3 0 d 葡聚糖抗体磁性纳米生物探针，在组装有 第二抗体和抗抗体的全层析试纸上进行的层析实验表明该探针完全适用于快速免疫检测 的需要，达到了层析免疫检测的目的。 1 3 4d n a 分离与纯化 d n a 的分离与纯化在分子生物学实际工作中起着一个重要的角色。传统的d n a 分离方 桂林工学院硕士学位论文 法，不仅需接触有毒试剂，而且步骤繁杂，费时、费力、难以自动化操作。磁性纳米微粒研 究始于2 0 世纪7 0 年代，迄今广泛用于有机固相合成和生物分子固定化的载体。磁性纳米微 粒粒径很小，比表面积大，偶联容量高，其悬浮稳定性较好，便于各种反应高效而方便地 进行。又因其具有顺磁性，在外磁场作用下，固液相的分离十分简单，可省去离心、过滤 等繁杂的操作，并可在外磁场作用下定位。磁性纳米微粒可通过共聚，表面改性，赋予其 表面多种反应性功能基，可连接各种基团或d n a 片段以达到分离的目的f 2 9 1 。b o s e 等【3 0 l 在卵 磷脂包裹的磁性微粒表面偶联亲和素，对结合有寡核苷酸的目标d n a ( p t c 4 5 ) 和非目标 d n a0 d n a ) 混合物进行分离，获得的目标d n a 纯度达1 0 0 。在磁性纳米微粒上包裹有抗 鼠i g g ，用单克隆抗d n a 结合在顺磁性纳米微粒上进行分离d n a ，载有d n a 抗d n a 复合 物的磁性纳米微粒可无需洗脱便可直接用于d n a 扩增排除了样本中的任何p c r 抑制物对 扩增的影响，提高了p c r 反应的精确性【3 。 1 3 5 对蛋白酶的吸附及固定化 生物高分子例如酶等都具有很多官能团，可以通过物理吸附、交联、共价偶合等方式 将他们固定在磁性颗粒的表面。用磁性纳米颗粒固定化酶的优点是：易于将酶与底物和产 物分离；可提高酶的生物相容性和免疫活性；能提高酶的稳定性，且操作简单、成本较低。 作为酶的固定化载体，磁性纳米粒子有利于固定化酶从反应体系中分离和回收，还可以利 用外部磁场控制磁性材料固定化酶的运动和方向，从而代替传统的机械搅拌方式，提高固 定化酶的催化效率。磁性高分子颗粒作为酶的固定化载体还具有以下优点：固定化酶可重 复使用，降低成本：可以提高酶的稳定性，改善酶的生物相容性、免疫活性、亲疏水性； 分离及回收酶的操作简单，适合大规模连续化操作【3 2 l 。例如丁丽俐【3 3 1 等以氨基末端磁微粒 为载体，用戊二醛作交联剂，通过共价交联结合法固定化a s l 3 9 8 中性蛋白酶，制备出活 力达4 5 0 0 0u g 磁性固定化酶。朱以华【3 4 】等制备了表面富含羧基和环氧基的磁性聚苯乙烯高 分子微球以及表面含氯甲基的磁性高分子微球。环氧基化和氯甲基化的磁性微球由于其表 面的环氧基和氯甲基非常活泼，可以不需连接剂活化而直接与生物配基偶合。探讨了磁性 微球对固定化乳糖酶的影响并利用磁性微球对血管内皮生长因子核酸探针进行了纯化分 离。 1 3 6 基因治疗 2 0 世纪7 0 年代，医学领域提出“基因治疗”这一概念，即将遗传物质导入细胞或组织， 进行疾病的治疗。基因导入的方法有病毒载体和非病毒载体。病毒载体存在制各困难，装 载外源d n a 大小有限制，能诱导宿主免疫反应及潜在的致瘤性等缺点。磁性四氧化三铁生 物纳米颗粒的制作简单，直径可达1 0m n 以下，具有比表面积效应和磁效应。在纳米颗粒 6 桂林工学院硕士学位论文 的表面可吸附大量d n a 。在外加磁场的作用下，可具有靶向性，且四氧化三铁的晶体对细 胞无毒。为达到生物相容性，在磁性四氧化三铁的晶体表面可很容易地包埋生物高分子， 如多聚糖，蛋白质等形成核壳式结构。因此磁性生物纳米颗粒可成为较好的基因载体【2 。 向娟娟【3 5 1 等合成了适合快速免疫检测的葡聚糖包裹磁性四氧化三铁纳米微球并评价了其 吸d n a 能力及保护d n a 免遭核酸酶降解的能力。同时用体外基因转染来证实磁性四氧化 三铁生物纳米颗粒作为基因载体的可行性。 1 3 7 生物传感器 由于磁性纳米粒子具有独特的小尺寸效应、量子尺寸效应、表面效应、宏观量子隧道 效应、体积效应等四大基本效应，应用到生物传感器中，能有效地改善传感器的性能，显 著提高了生物传感器检测的灵敏度，缩短了生化反应的时间，提高了检测的通量。将磁性 纳米粒子结合到生物分子( 如核酸、蛋白质、肽等) 表面上时，产生的生物共轭物种由于 尺寸依赖性和维度与生物大分子类似，很适合作为活性磁共振成像、药物释放与运输的大 循环载体和组织工程的结构构架，同时又能用在分子识别和标记、d n a 传感器和生物芯 片中，因此磁性纳米粒子在核酸分析、临床诊断、靶向药物、细胞分离和酶的固定化等领 域的应用已经成为研究的热点。研究发现，利用磁性纳米粒子的这些性质并应用到生物传 感器中，可显著提高生物传感器检测的灵敏度，缩短生化反应的时间，提高检测的通量， 为生物传感器领域开辟了广阔的前景【3 6 - 3 9 1 。 i m m o m l i z 戗lp r i l i _ y 锄d 呻 - 曩i y 钾 之 幽竺塑 i i 弹 图1 3 结合磁分离技术运用化学发光免疫测定方法测定人类免疫血球蛋白g 原理图【4 0 l f i 9 1 3 s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ft h en o n c o m p e t i t i v ec ll m m u n o a s s a yb yu s i n gm a g n e t i c b e a d sa n dc o l l o i d a lg o i dl a b e l l 4 0 】 磁性纳米粒子易于磁性富集和磁性分离，给生物医学监测带来了很大的便利，如提高 工作效率、降低成本等。f a n 等4 0 1 将原始抗体固定在磁珠上，二级抗体修饰在金上，然后 7 盟盟 桂林工学院硕士学位论文 通过夹心法方式捕获目标生物分子等形成含有多抗的复合物。再化学处理氧化使得a u 变为 a l l 3 + 离子，。加入鲁米诺( l u m i n o l ，发光胺) 引发化学发光，从而运用化学发光免疫测定方 法测定人类免疫血球蛋白g ，利用这一方法可直接制作出测定人类免疫血球蛋白g 的生物传 感器，原理见图1 3 所示。 在酶传感器中，主要将磁性纳米粒子作为固定酶的载体。采用磁性纳米粒子作为酶载 体有三大优势：( 1 ) 亲水性磁性纳米粒子能够比较稳定地悬浮在水溶液中，并可在外加 磁场作用下定位于某一部位，其表面可固定各种功能分子如酶、抗体、d n a ，甚至细胞等； ( 2 ) 作为酶的固定化载体，磁性纳米粒子有利于固定化酶从反应体系中分离和回收，还 可以利用外部磁场控制磁性材料固定化酶的运动和方向，从而代替传统的机械搅拌方式， 提高固定化酶的催化效率：( 3 ) 固定化酶可重复使用，降低成本：可以提高酶的稳定性， 改善酶的生物相容性、免疫活性、亲疏水性、分离效果及酶的回收操作，适合大规模连续 化操作。研究表明，在磁性纳米粒子上固定化酶对酶的稳定性和活性不产生负面影响 4 1 - 4 3 】。 l i a n e t 4 4 等人首先合成了2 0n m 的f e 3 0 4 纳米粒子，然后对f e 3 0 4 进行氨基化，再依赖戊二醛 通过s c h i f f 碱反应，共价交联葡萄糖氧化酶。结果表明，f e 3 0 4 增加了固定化酶的稳定性， 于4 c 下保存，3 个月内其生物活性未见明显变化。应用于葡萄糖传感器，测定葡萄糖的结 果令人满意。 采用磁性纳