（森林培育专业论文）野扇花组培快繁及扦插繁殖研究.pdf

论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：多k 乙 扮7 年占月谚日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意匹t ) l l 农业大学可以用不 同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：敬彩 导师死彬 r 公7 函q 年月孑e t 却年易月1 9e t 中文捅妻 本研究为探索野扇花( s a r c o c o c c a r l l s c i f o l i as t a p f ) 组培快繁的有效途径，以野扇 花当年生叶片、腋芽和成熟胚为外植体，对野扇花的组织培养及植株再生进行了系统 研究，主要研究结果如下： 1 外植体最适宜的取材季节是春季，尤其是4 ) q 份，在这一时期取材，外植体启动 率、成愈率、成活率和生长诱导值最高，污染率、褐变率最低。 2 在本实验所选碳源中，适宜野扇花外植体生长的碳源是葡萄糖，较适浓度为3 0 g l 1 。其次为蔗糖，白糖的效果相对较差。 3 本实验所选有机附加物中，对野扇花外植体生长有较好促进作用的是水解酪蛋 白，较适浓度为4 5 0 l g l 。水解乳蛋白的效果相对较差，但二者的效果无显著差异。 4 在本实验所选培养基中，野扇花外植体在m s 培养基上能很好地生长，1 2m s 较 好，在b 5 培养基上的生长效果次之，在s h 培养基上的生长势较差。 5 腋芽丛生芽诱导培养：有利于野扇花腋芽启动诱导的培养基配方组合为： m s + 6 - b a1 0 + n a ao i + i b a0 1 + 蔗糖3 0g l 1 + c h4 5 0m g 一，诱导率达8 5 3 。 6 愈伤组织诱导：有利于野扇花叶片和胚愈伤组织诱导的培养基配方组合分别为： m s + 6 - b a0 5 + i b ao 5 + 2 ，4 - do 0 5 + 蔗糖3 0g - l 1 + c h4 5 0 唱l - 1 ，诱导率达8 0 1 ； m s + 6 - b a1 o + 2 4 - d0 1 + 蔗糖3 0g l o + c h4 5 0m g l 1 7 增殖与分化培养：有利于野扇花腋芽增殖的培养基配方组合：m s + 6 - b a1 0 + n a ao 1 + i b ao 1 + 蔗糖3 0g l 以+ c h4 5 0m g l 1 ，2 8d 后增殖系数为6 2 2 ；较有利于 野扇花叶片和胚愈伤组织增殖的培养基配方分别为：m s + 6 - b a2 0 + n a ao 5 + 2 ，4 - d o 1 + 蔗糖3 0 9 l - 1 + c h 4 5 0m g l - 1 ，m s + 6 - b a1 0 + n a a1 0 + 2 , 4 - d 0 1 + 蔗糖30 g l 。1 + c h4 5 0m g l 1 ，增值率分别达7 7 4 、6 6 7 ：有利于诱导野扇花叶片和胚愈伤 组织分化的培养基配方组合分别为：m s + 6 一b a1 0 + n a ao 5 + 蔗糖3 0g l 1 + c h4 5 0 i g l 一，分化率可达7 5 ；m s + 6 - b a1 o + n a a0 1 + 蔗糖3 0g - l + c h4 5 0m g l 一。 8 生根培养：有利于诱导野扇花丛生芽生根的培养基配方组合为：1 2m s + i b a1 0 + n a a o 1 + a c1 5 + 蔗糖1 5g - l - l ，生根率可达7 0 3 。 9 炼苗与移栽：珍珠岩、蛭石、河沙的配比为3 ：2 ：1 时，移栽成活率最高，为7 0 o 。 1 0 扦插繁殖：激素n a a 与i b a 按2 5 0m g l - 1 进行组合，对野扇花插条进行浸泡4 0 m i n 的处理，插穗的生根时间最短、长出的根最多、根最长、生根率最高。 4 关键词：野扇花；腋芽；叶片；组织培养；扦插繁殖 a b s t r a c t t h es t u d yw a sm a i n l yt op r o b ea ne f f i c i e n tw a y t h r o u g ht i s s u ec u l t u r ea n dr a p i d p r o p a g a t i o no f s a r c o c o c c ar u s c i f o l i as t a p f l e a v e s ，b u d sa n dm a t u r ee m b r y ow e r et a k e n a se x p l a n t s t h et i s s u ec u l t u r ea n dp l a n tr e g e n e r a t i o no f s a r c o c o c c ar “s c i f o l i as t a p f w e r e s y s t e m a t i c a l l ys t u d i e d t h em a i nr e s u l t sa sb e l o w ： 1 t h eb e s ts e a s o no f t a k i n ge x p l a n t so ns a r c o c o c c ar “s c i f o l i as t a p fi si ns p r i n g ，t h e s t a r t i n gr a t e ，t h er a t eo f f o r m i n gc a l l u s ，s u r v i v i n gr a t ea n dg r o w t hi n d u c e m e n tr a t e a l et h eh i g h e s t ；t h eb r o w n i n gr a t ea n dc o n t a m i n a t e dr a t ea r et h el o w e s t ，e s p e c i a l l yi na p a l o f s p r i n g ， 2 s u c r o s e c o s ec o u l dr a t h e rp r o m o t et h eg r o w t ho f e x p l a n t si ns a r c o c o c c ar u s c i f o l i a s t a p f , e s p e c i a l l y3 0g l 一，t h ee f f e c to f s u c r o s ei n d u c e m e n tt a k e ss e c o n dp l a c e ，a n dw h i t e s u g a ri sc o m p a r a t i v e l yl o w e ri nt h i se x p e r i m e n t 3 c hc o u l dr a t h e rp r o m o t et h eg r o w t ho f e x p l a n t si ns a r c o c o c c ar u s c i f o l i as t a p f , e s p e c i a l l y4 5 0m g l 一，t h ee f f e c to f l h t a k e ss e c o n dp l a c e , b u td i f f e r e n c eo f t h e mi sn o t m a r k e di nt h i se x p e r i m e n t 4 e x p l a n t si ns a t c o c o c c ar u s c i f o l i as t a p f c o u l dr a t h e rg r o w t hi nm sc u l t u r e m e d i u m ；t h eg r o w t hi n d u c e m e n ti n1 2 m sc u l t u r em e d i u mt a k e ss e c o n dp l a c e ，a n dt h a ti n b sc u l t u r em e d i u mt a k e st h i r dp l a c e ，a n ds hc u l t u r em e d i u mt a k e st h el o w e s t 5 i n d u c e m e n ta n dc u l t i v a t i o no f b u d s ：t h eo p t i o n a lc u l t u r em e d i u mc o m b i n a t i o nf o r s t a r ta n di n d u c e m e n to f b u d si ns a r c o c o c c ar u s c i f o l i as t a p f w a s ：m s + 6 - b a1 0 + n a a o ，i + i b a0 0 5 + s u c r o s e3 0g l 1 + c h4 5 0 唱l 1 t h ei n d u c e m e n tr a t ew a s8 5 3 6 c a l l u si n d u c t i o nf r o ml e a v e sa n dm a t u r ee m b r y o ：t h eo p t i o n a lc u l t u r em e d i u m c o m b i n a t i o nf o rc a l l u s e si n d u c e m e n tf r o ml e a v e sa n dm a t u r ee m b r y o si ns a r c o c o c c a r u s c i f o l i as t a p f r e s p e c t i v e l yw e r e ：m s + 6 - b a1 0 + i b ao 5 + 2 , 4 - d0 1 + s u c r o s e3 0 g - l 1 + c h4 5 0m g l 1 ，t h ei n d u c t i o n r a t ec o u l db eu pt o8 0 1 ；m s + 6 - b a1 0 + 2 ，4 一d o 1 + s u c r o s e3 0g l 1 + c h4 5 0m g l 1 。 7 p r o l i f e r a t i n ga n dd i f f e r e n t i a t i n gc u l t i v a t i o n ：t h eo p t i o n a lc u l t u r em e d i u m c o m b i n a t i o n f o r b u d s p r o l i f e r a t i o n w a s ：m s + 6 - b a1 0 + n a a o 1 + i b a o 1 + s u c r o s e3 0 g - l l + c h4 5 0m g l 一，p r o l i f e r a t i o ni n d e xw a s 6 2 2a f t e ri n o c u l a t i n g2 8d a y ；t h eo p t i o n f l c u l t u r em e d i u mc o m b i n a t i o nf o rl e a f a n de m b r y oc a l l u s e sp r o l i f e r a t i o nr e s p e c t i v e l yw e r e ： m s + 6 b a2 0 + n a a0 5 + 2 ，4 d0 1 + s u c r o s e3 0g l - 1 刊：h4 5 0m g l 一，m s + 6 - b a1 0 5 + n a a 】0 + 2 4 do 1 + s b c r o s e30g l - i + c h4 5 0m g l a n dt h ep r o l i f e r a t i o nr a t ec o u l d b eu pt o7 7 4 6 6 7 ；t h eo p t i o n a lc u l t u r em e d i u mc o m b i n a t i o nf o rl e a v e sc a l l u s e s d i f f e r e n t i a t i o nw a s ：m s + 6 一b a1 o + n a ao 5 + s u c r o s e3 0g l - i + c h4 5 0m g l t h e d i f f e r e n t i a t i o nr a t ec o u l db eu pt o7 5 ：t h eo p t i o n a lc u l t u r em e d i u mc o m b i n a t i o nf o r m a t u r ee m b r y od i f f e r e n t i a t i o ni ns a r c o c o c c or u s c i f o l i as t a p f w a s ：m s + 6 - b a1 o + n a a o 1s u c r o s e3 0g - l 。1 + c h4 5 0n a g l 1 8 r o o t i n gc u l t u r e ：t h eo p t i o n a lc u l t u r em e d i u mc o m b i n a t i o nf o ri n d u c i n gb u d sr o o t i n g i n s a r c o c o c c ar u s c i f o l i a s t a p f w a s ：1 2 m s + i b a1 0 + n a a 0 1 + a c1 5 + s u c r o s e1 5 g l 。，t h er o o t i n gr a t ec o u l db eu pt o7 0 3 9 t r a n s p l a n t i n g ：p l a n f l e t sw e r et r a n s f e r r e d t ot h em e d i u mw i t i lr a t i oo f 3 ：2 ：1o f v e r m i c u l i t ea n dr u b ym i c aa n ds a n d s ，t h es u r v i v a lr a t ew a su pt o7 0 o 10 c u t t i n gp r o p a g a t i o n ：c u t t i n g sw o u l dr o o ti nt h es h o r t e s tt i m e ，t h e q u a n t i t yo f r o o t s w a st h em o s t ，t h el e n g t ho f r o o tw a st h el o n g e s t , a n dt h er o o t i n gr a t ew a st h eh i g h e s tw h e n c u t t i n g sw e f et r e a t e d 嘶1 1 1n a a + i b aw i m 2 5 ，0r a g - l 1d i p p i n g4 0r a i n ： k e yw o r d s ：s o r c o c o c c ar u s c i f o l i as t a p f ；b u d ；l e a f ；t i s s u ec u l t u r e ；c u t t i n g p r o p a g a t i o n 6 1 日i j 吾 野扇花( s a r c o c o c c ar u s c i f o l i as t a p f ) ，别名清香桂，为黄杨科( b u x a c e a e ) 野扇 花属( s a r c o c o c c a ) 植物，以根和果实入药，味苦性寒。根能理气止痛，祛风活络， 用于治疗急、慢性胃炎，胃溃疡，风湿关节痛，跌打损伤。果能补血养肝，治疗头晕、 心悸、视力减退。 目前国内外对野扇花属植物研究较少，对该属植物的开发利用程度还处于原始状 态。从现有资料来看，对该属植物的研究主要集中在其活性成分的分子结构鉴定、分 类方面o “o ，在对该属植物的资源保护、繁殖方式方面尚未涉及。 组织培养快速繁殖是近年来生物技术在林业生产应用中的常用手段，具有不受地 域、时间限制等优点。为了充分开发利用野扇花这一宝贵的资源，采用快速、高效的 繁殖方式来解决野扇花的种质资源保护问题已迫在眉睫。旨在以开展野扇花繁殖问题 为目的的系统研究，能为野扇花在植物化学成分方面的进一步研究提供细胞培养所急 需的愈伤组织和种苗，具有重要的理论和实践意义。 2 文献综述 2 1 野扇花生物学特征 野扇花为常绿灌木，高1 3m ，单叶互生、全缘、革质、具柄、三出脉、无托叶， 叶狭披针形，长3 5c m ，宽1 5 2 5e m ，顶端渐尖，基部渐狭，无毛，叶柄长1 1 5e m 。 花白色，小，无花瓣，整齐，雌雄同株，花序腋生密集穗状，长l 1 5e l n ，具苞片。 雄花：小苞片2 ，卵形，长约2 m i l l ，萼片4 ，阔卵形，长约3 m m ，雄蕊4 ，长约6 i b m ： 雌花：小苞片多枚，卵形，长1 5 3m m ，萼片6 ，近卵形。雌雄萼片均为二轮，复瓦 状排列。雌蕊3 心皮组成，雌花通常比雄花大，单生，具柄。花药2 室，大，花丝 多少扁阔，无柄，纵裂。子房上位，2 3 室，花柱短，2 0 枚，接近，不分枝，具多 少向下延伸的柱头，宿存，子房每室2 枚并生、悬垂的倒生胚珠，种脊背生，脊向 背缝线。果实为室背开裂的蒴果，肉质，直径约8m i l l ，红色或紫红色，有种子1 - 2 颗，种子黑而发亮，具种阜，胚乳肉质，胚直立，有扁薄的子叶。野扇花主要分布在 云南、四川、贵州等地，广西、湖南、湖北、陕西、甘肃等地区也有分布，喜生于沟 边灌丛中，阔叶林下，山谷边，石灰岩山坡。现为我国濒危植物之一o 5 1 。 2 2 野扇花属植物的利用价值 2 2 1 野扇花属植物的药理价值 野扇花属植物大部分为较有名的药用植物，该属植物中的野扇花( s a r c o c o c c a 7 h o o k e r i a n a ) 、k 柄野扇花( s 1 0 n g i p e t i o l a t a ) 、东方野扇花( s o r i e n t a l i s ) 、大叶野 扇花( s v a g a n a s ) 和清香桂( s r u s c i f o l i a ) 含帑体生物碱供药用，具有较高的生理活 性作用，具祛风除湿、理气止痛、清热解毒之功，民间常用于治疗癌症，在临床上具 有巨大的开发前景。 野扇花属中所含生物碱全部为孕甾烷类衍生物型的甾体生物碱，如从s s a l i g n a 中分离得到s a l i g n e n a m i d e sa 、b ，e p i - p a c h y s a n d r i n ea ，s a r c o n i d i n e ：从大叶清香桂 ( s v a g a n s ) “1 中分离到大叶清香桂碱a - d ( s a r c o v a g i n e sa 、b 、c 、d ) ；从黄杨科 清香桂属植物中分离得到清香桂碱a l ，b ，d 等”。它们都具有抗菌活性。 甾体生物碱是目前广泛运用于临床的一类重要药物，具有抗炎、抗肿瘤、抗生育 等方面的生物活性。从天然产物中寻找高效低毒的甾体生物碱直接运用于临床或作为 新药合成的研究，更是得到世界卫生组织和各国学者的重视。 药理研究表明该属植物所含甾体生物碱具有增加冠状动脉血流量的作用，用于冠 心病及冠心病引起的心绞痛。由于野扇花属植物所含生物碱全部为孕甾烷类衍生型的 甾体生物碱，最早从野扇花属植物得到，主要有清香桂碱( s a r e o r u e i n i n e ) a ，a l ，b ， d 等，其中清香桂碱a 是野扇花属植物中含量最高的一个生物碱，约占地上部分干重 的0 1 ，清香桂碱d 的量较微。本属植物主要含甾体生物碱，除此之外还有部分多酚 类、脂肪油类成分阳”。 2 2 2 野扇花属植物的生态价值和观赏价值 野扇花属植物除具有较高的药理价值外，还具有极高的生态价值观赏价值，该属 植物萌芽力强，耐修剪、耐荫，较耐寒、耐旱，不耐涝，喜温暖气候，在湿润庇荫下 生长得枝茂叶繁，要求疏松肥沃的沙质壤土，耐碱性较强，即使在山地、河边、溪旁 及溪流的石隙中间同样能生长良好，病虫害少。大多枝叶茂密而浓绿，经冬不凋，观 赏价值较高，宜于庭园做绿篱及花坛边缘种植，也可在草坪孤植、丛植及路边列植、 点缀山石；适宜盆栽，作为盆景的材料用于室内绿化。该属植物生长缓慢，材质坚实 细腻，可用于做雕刻、美工及各种工艺品嘲。 2 3 愈伤组织、营养条件、激素水平及胚培养研究现状 2 3 1 愈伤组织研究现状 迄今，用植物组织培养技术进行离体快繁和生产次生代谢产物( 尤其是药物) 已 发展成为植物组织培养在生产应用中的两大主流“”。离体快繁主要用于一些“名、优、 特、新、奇”作物品种的繁殖，可不受地区、气候的影响，比常规方法快。为获得大 8 量的再生苗或次生代谢产物，愈伤组织的快速增殖是一个重要静提，而愈伤组织的增 殖主要受外植体本身、培养基和培养环境的调控。因此研究植物愈伤组织诱导、继代 等的最佳激素浓度、最适培养基、不同激素浓度配比等具有重要意义。 在组织培养中，愈伤组织和胚状体的形成是能否培育出新植株的关键一步，胚性 愈伤组织比非胚性愈伤组织具有更强的生长能力、胚胎发生能力和相对较高的同工酶 活性，而形成胚状体再分化出植株比形成愈伤组织再形成植株更容易。近年来，人们 不仅研究再生植株的培育，还重点研究愈伤组织的一些特性，较多的是利用愈伤组织 鉴别植物抗性和进行次生代谢产物的生产“。 针对生物反应器的限制，目前比较理想的是试图建立高产的植物细胞悬浮培养体 系。其中c c a ( c o m p a c tc a l l u sa g g r e g a t e s ) 的诱导具有优势“”，首先是生长速度快， 在形态和生理特征上都已经表现出了一定程度的分化，往往表现出积累较多的次生代 谢产物，其次是易从外植体直接诱导或愈伤组织状态调控，而且在培养过程中，工艺 问题也容易解决，比植物细胞自生固定化技术和器官培养更有应用与开发价值。 2 3 2 营养条件研究现状 在植物组织培养中，外植体的品种、遗传基因型、不同取材部位、不同发育时期、 培养基类型、培养条件、外植体内源激素的种类和配比等因素都不同程度影响着实验 研究的结果，因此，植物组织培养的偶然性较大，重复性差，虽然可以抽象出一些结 论，但规律性不强o ”。周维燕将影响植物离体培养的外因分为植物细胞的营养条件和 环境条件，其中离体培养过程中，培养基营养条件常被作为主要影响因素来考虑。营 养条件包括无机盐混合物类、有机物类、植物激素类、天然复合物类“。 在众多的实验中，m s 、b 5 、n 6 培养基是最常用的三种培养基“ 在组织培养中， m s 培养基对保证组织生长所需要的矿物质和加速愈伤组织的生长有利，培养基中的 有机物含量高，是一种适用性广的培养基。b s 培养基是g a m b o r g 为植物愈伤组织培养 和细胞悬浮设计的低无机盐浓度培养基。s h 培养基和b 5 培养基一样，是低无机盐浓 度的培养基，k n 0 3 与b 5 相同，但含有较多的有机物。 有机成分( o r g a n i cc o m p o u n d ) 是指植物生长时所必需的有机碳、氢、氮等物， 主要有糖、维生素、肌醇、氨基酸等。碳源是细胞生长的能量来源和构成细胞骨架的 重要成分，植物细胞培养一般采用蔗糖、果糖、葡萄糖为碳源。糖的种类和用量不仅 影响培养细胞生长速度和生长量，而且影响其代谢水平、次生代谢物合成、以及细胞 的形态和发生，是影响植物组织培养成功与否的关键之一，通常用量为1 - 5 “删。 近年来，其它糖类对植物组织培养的效应，引起了广泛关注，许多文献报道蔗糖并不 9 定是最佳碳源，不同植物对不同糖类的反映不完全相同，目静已有单糖( 葡萄糖) 、 二糖( 果糖、蔗糖) 、三糖、多糖( 白糖) 以及未经纯化的混合糖类近5 0 种在植物组 织培养中被实验用作碳源或者渗压剂1 。许多研究认为，水解酪蛋白( c h ) 和水解 乳蛋白( l h ) 均有利于愈伤组织生长，浓度约为4 5 0 m g l o 2 4 。 2 3 3 激素研究现状 在植物组织培养中，不同种类的生长素的作用强弱顺序为2 ，4 d n a a i b a i a a ；细胞分裂素的作用强弱顺序为z t 6 b a k t “”。离体培养条件下，对多数植 物种，适宜的生长素浓度范围为2 5m g l 1 ，而细胞分裂素常用的浓度范围是0 5 2 m g l 1 。对多数植物材料来说，0 2 也0m g l 1 的2 ，4 一d 是诱导愈伤组织和细胞悬浮培 养的最有效物质，同时加入0 5 2 0m g l 4 的k t 会对组织和细胞的生长有帮助”。但 2 ，4 一d 对动物和人体中枢神经有严重的损害等中毒现象，一些欧美国家己将2 ，4 d 列为 食品检验对象，许多国家都严禁以2 ，4 d 诱导的无根豆芽出售。细胞分裂素对组培 中不定芽的分化及增殖有着显著作用，不同种类的细胞分裂素对不同的材料作用差异 较大，但大多数种类以6 b a 最为有效“”据f l i c k t m 等人统计2 5 0 种植物外植体直接或 间接再生植株中，2 4 7 的双子叶植物、1 7 7 的单子叶植物和5 0 的裸子植物单独使 用b a 诱导无根苗的形成，显然b a 在不定芽诱导过程中起重要作用。 2 3 4 胚培养研究现状 2 0 世纪4 0 年代起，胚培养技术开始广泛应用于林木育种，t u k e y 汹1 进行了樱桃 胚培养，目前，胚培养已在柑橘、菠萝、葡萄、苹果和核桃及一些核果类果树上获得 成功。进行胚培养时，首先要把胚从即将退化的子房或胚珠中剥离出来，或者将胚珠 或子房整体培养。就最终对胚抢救成活及成苗率影响大小而言，所利用的组织优劣顺 序是：活体内胚 带胎座的胚珠 胚珠 退化或败育的胚。胚培养技术的应用不仅克 服了胚败育问题，还对推动育种尤其特早熟品种和缩短育种周期发挥了重要作用。 经过近7 0 年的发展，林木胚培养无论在理论上还是技术上都取得了长足发展， 极大地拓宽了育种范围，提高了育种效率。一些果树如桃、核桃、杏等早熟品种有很 高的经济价值，但其胚往往发育不完善，自然条件下不易得到有生活力的种子，胚培 养技术的应用大大改善了这一状况。据刘用生o ”统计，截止到1 9 9 2 年，运用胚培养 技术己经培育出了8 个优良桃早熟品种。c h a p a r r ojx 等将“s a n l i k e ”油桃花后5 3 d 的胚珠进行早期培养再生出植株。陈学森等嘲采用杂交和胚培养相结合的方法，选出 了果实发育期仅为5 2 d 的特早熟杏优系。 。 杂种胚早期败育一般是由于胚乳发育不正常或杂种胚与胚乳之间生理上的不协 l o 调而引起。在胚败育之前将其取出进行培养并产生杂种植物，己有很多成功的例子。 对美味猴桃( a c t i m d i ad e l i c i o s ac v h a y w a r d ) ( 6 x ) 和毛花称猴桃( a c r i a n i h a ) ( 2 x ) 杂交当代种子的胚胎学分析和胚挽救，发现在适于实生苗生长的培养基上，一些正常 种子和少数不正常种子胚的下胚轴直接形成了许多不定芽，从而诱导产生了更多的杂 种植株。 胚培养对植物进一步的离体快速繁殖、细胞悬浮培养，原生质体培养、遗传转化 以及离体种质保存等生物技术研究奠定基础。谷晓峰等1 进行了罗田甜柿开花后7 0 d 的幼胚培养，对影响因素进行正交实验，得出适宜幼胚培养的各因素的优化组合，同 时对胚培养中适宜的激素种类、胚培苗诱导生根等也进行了探讨。刘杰俊等m 1 以油楝 成熟胚为材料，对愈伤组织的诱导和保持进行了初步研究，表明成熟胚的诱导，采用 不同培养基时，激素2 , 4 d 使用的浓度也不同，最高诱导率达7 3 5 4 ；蔡汉权等d 司以 橄榄的成熟胚为外植体，研究橄榄成熟胚培养的方法、培养反应和影响因素，建立了 橄榄成熟胚离体无菌培养的有效方法，同时，获得了橄榄无菌胚苗、愈伤组织、气生 根和胚状体等4 种培养物。 2 4 组培设计方法 激素浓度和组合对组培成功的影响很大，因此，在决定激素浓度过程中，采用了 实验设计方法，如单因素实验设计、均匀设计、正交设计等，通过统计计算，更能求 出最佳的激素组合和比例“”。在参选的因素、水平数较多时，正交设计及其它较流行 的方法往往要求做较多的实验，方开泰正是为了解决多因素、多水平问题而提出了均 匀设计，均匀设计目前在组培方面的应用研究较少嘲。 多数研究者用单因素实验法进行愈伤组织诱导培养基筛选，部分研究人员用正交 实验设计，在确定最佳培养基时，均用定性指标或经验观察值。肖娅萍等采用了定 量综合指标生长诱导值来确定最佳培养基，该方法可定量比较观察，有助于经验 不足者在短时间内掌握选择培养基的方法。 2 5 野扇花属植物研究现状与不足 根据现有文献报道，野扇花属植物还处于野生状态，国内外对该属植物研究报道 较少，对该属植物资源的开发利用程度还处于原始状态。由于该属植物的果，叶，茎 均可入药，及近几年来在园林上的广泛应用，除了对野扇花属植物的活性成分的分子 结构鉴定、分类方面及药理性质进行研究外“。4 ，在对该属植物的资源保护、繁殖方 式研究方面尚未涉及，且是一个亟待解决的长期性研究课题。 从野扇花属植物的化学成分研究报道来看，该属植物的药用前景十分广阔，由于 体生物碱日的尚无法人工合成，以及玖属植物中有的植物在治疗癌症方面的独特作 用6 ，该属植物的次生代谢研究有待进一步的深入开展。 从该属植物的园林应用前景来看，该属植物属耐荫性极强，具香花红果，观赏价 值较高，可广泛应用于公路，立交桥，室内等各种荫蔽环境的绿化。此外，柳叶野扇 花现为我国一濒危植物“一，其种质资源的保护还亟待进行。 3 研究目的与意义 + 目前尚未有野扇花属植物繁殖研究的报道，而近年来对野扇花属植物次生代谢产 物的研究大多从原植物中直接提取，野生资源日趋减少。因此植物资源问题限制了该 属植物的生物活性成分的提取和药理研究等，为了更充分地开发利用资源，将该属植 物潜在的野生价值转变成实际生产力，利用组织培养技术进行愈伤组织诱导和快繁成 苗对资源拓展进行新途径研究成为了首要任务。快繁研究中，在通过外观形态指标对 愈伤组织诱导、生长、分化培养基进行筛选时，大多数研究还主要凭经验值来判断其 生长优劣，且重复次数少，这样导致实验重复性差，实验数据准确性低。 为了获得再生植株苗，本研究采用单因素实验和正交实验相结合，通过培养基营 养条件对野扇花愈伤组织诱导及植株再生的影响研究，用生长诱导值来综合评估愈伤 组织诱导及生长过程中的情况，能在短期内准确筛选出适宜培养基，且可靠性高。同 时，取野扇花1 2 年生的枝条作插穗，采用不同激素及激素组合对插穗进行处理，进 行无性繁殖研究。本研究对野扇花种质资源保护提供理论依据具有重要意义。 4 材料与方法 4 1 实验材料 于2 0 0 5 年4 月一2 0 0 7 年4 月采自四川农业大学林木遗传育种室植物园多年生植株， 该植株由雅安市郊野生状态下的植株盆载驯化2 3 年，经四川农业大学林学系教师鉴 定。 4 2 研究方法 4 2 1 材料预处理 将所取新鲜材料用洗涤剂清洗干净，在流水下冲洗2 3h 后，用吸水纸吸于材料 表面的水，放入超静工作台中，先用o i h g c i 2 加2 4 滴土温8 0 充分振荡进行表面灭 菌6 - - 8m i n ，再立即用无菌水冲洗8 次左右，最后用无菌滤纸吸干材料表面的水。将叶 片剪成约1 锄2 大的小块，叶背面接触培养基接种在培养基上；将带腋芽的茎段切成 约1 长的小段将其生物学下端直接插入培养基中约0 5 锄。每支试管接种外植体1 1 2 个进行启动培养。在1 1 月仞，将种子进行灭菌消毒后，在无菌培养皿中剥去种皮，则 得到成熟胚，将胚接种到培养基上。 ， 4 2 2 培养条件 培养基p h 值为5 8 6 0 。培养室条件为：温度2 5 士2 ，空气湿度为8 0 0 , , - - - 8 5 。采 用日光灯照明，光照时间1 2h d ，光照强度为2 0 0 0 - - - 2 5 0 0l x 。 4 2 3 技术路线 ，叶片 野扇花植株壬呻成熟胚愈伤组织一丛生芽一生根苗一试管苗一炼苗一移栽 、带腋芽的茎段一 4 3 实验设计 4 3 1 预备实验 为了筛选最佳的基本培养基，以m s 、i 2 m s 、b s 、s h 为启动培养基，研究不同 培养基对外植体愈伤组织诱导的影响，附加物为0 8 琼脂，蔗糖3 。 为了寻找野扇花适宜的取材时期，研究了春季( 3 、4 、5 月) 、夏季( 6 、7 月) 、 秋季( 9 、1 0 ) 和冬季( 1 l 、1 2 月) 外植体的启动情况，基本培养基为m s ，附加物为 0 8 琼脂，蔗糖3 。 为了筛选最适合野扇花外植体生长的碳源、有机附加物，先采用单因素实验，研 究不同碳源：白糖、蔗糖、葡萄糖( 用量分别为1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0g l - 1 ，基本 培养基为m s ，附加物为0 8 琼脂) ，有机附加物质：水解酪蛋白、水解乳蛋白( 用 量分别为1 5 0 、3 0 0 、4 5 0 、6 0 0 、7 5 0 、9 0 0 m g l - i ，基本培养基为m s ，附加物为0 8 琼 脂) ，分别对外植体生长状况的影响。 ， 4 3 2 初代培养 4 3 ，2 1 腋芽的诱导设计 接种外植体：取自4 月份的带腋芽的茎段；基本培养基：m s ；生长调节剂：n a a ， i b a ，6 - b a ；附加物：o 8 琼脂，3 0g - l 1 蔗糖，4 5 0m g l c h 。采用三因素三水平正 交实验设计( 见表4 1 ，4 2 ) ，每个处理接种外植体2 0 个，每个处理重复3 次。 4 3 2 2 叶片愈伤组织的诱导设计 接种外植体：取自4 月份的叶片；基培养基：m s ；生长调节剂：2 , 4 - d ，i b a ，6 - b a ； 附加物：o 8 琼脂，3 0g l d 蔗糖，4 5 0m g l c h 。采用三因素三水平正交实验设计( 见 表4 3 ，4 4 ) ，每个处理接种外植体2 0 个，重复3 次。 表4 i 野扇花腋芽的诱导正交实验设计因素水平表 t a b4 1l 9 ( 3 4 ) o r t h o g o n a l d e s i g no f b u d s i n d u c t i o no f s t e m s i n s a r c o c o c c a r u s c i f o l i a s t a p f 水平 旦鲞 x 1 1 6 b a ( m g l 。1 ) 】 x 2 n a a ( m g l 。jj塑! 呈垒( m g l 。) 】 l 2 o 5 1 o 0 1 o 5 o o 0 5 3 2 01 0 0 i 表4 2 野扇花腋芽的诱导正交实验设计及实施方案b ( 3 4 ) t a b4 2o r t h o g o n a ld e s i g na n di m p l e m e n t a r ys c h e m eo f b u d si n d u c t i o no f s t e m sl ( 3 ) 处理 6 - b a ( m g - l i ) n a a 堕( m 塑g l | _ 4 ) i b a ( m g - l 一 1 ) 1 0 50 1 0 2 3 4 5 6 7 8 o 5 0 5 1 o 1 o 1 o 2 o 2 o o 5 1 0 0 1 o 5 1 0 o 1 0 5 o 0 5 0 1 0 0 5 o 1 0 o 1 o 表4 3 野扇花叶片愈伤组织的诱导正交实验设计因素水平表 t a b4 3l 9 ( 3 ) o r t h o g o n a ld e s i g no f c a l l u s e si n d u c t i o no f l e a v e si ns a r c o c o c c ar u s c i f o l i as b p f 兰二玉xl6-巫ba(m亚g-l1)画x2iba墨(mg-l互4)jx312匦,4-d(mgl1) 1 0 5 0 10 21 0 0 50 0 1 32 0 1 00 0 5 表4 4 野扇花叶片愈伤组织的诱导正交实验设计及实旌方案b ( 3 “ t a b4 4o r t h o g o n a ld e s i g na n di m p l e m e n t a r ys c h e m eo f c a l l u s e si n d u c t i o no f l c a v e sb ( 3 ) 处理1 丽面广斋譬 丽矿 1 0 5 0 1，0 2 0 5 0 50 o l 3 0 51 00 0 5 41 0 0 10 0 l 5 1 00 50 0 5 6 1 0i 0 0 7 2 00 1 0 0 5 8 2 00 5 0 9 2 0 1 00 们 1 4 4 3 2 。3 成熟胚愈伤组织的诱导 。接种外植体：取自1 1 月份的成熟胚；基本培养基：m s ；生长调节剂：2 ，4 d ，6 - b a ； 附加物：0 8 琼脂，3 0 9 l 1 蔗糖，4 5 0 m g l c h 。采用二因素三水平正交实验设计( 见 表4 5 ，4 6 ) ，每个处理接种外植体3 个，每个处理重复3 次。 表4 5 野扇花成熟胚愈伤组织的诱导正交实验设计因素水平表 t a b 4 5 k ( 2 3 ) o r t h o g o n a ld e s i g no f c a l l u s e s i n d u c t i o n o f m a t u r ee m b r y o 表4 6 野扇花成熟胚愈伤组织的诱导正交实验设计及实施方案 t a b 4 6 0 r t h o g o n a l d e s i g na n d i m p l e m e n t a r ys e h e m e o f c a l l u s e s i n d u c t i o n o f m a t u r ee m b r y o 4 3 3 继代增值与分化培养 4 3 3 1 不定芽的增值培养 增殖培养材料：初代培养的腋芽：基本培养基：m s ：生长调节剂：n a a ，i b a ， 6 - b a ；附加物：0 8 琼脂，4 5 0m g l c h ，3 0g - l 4 蔗糖。采用三因素三水平正交实 验设计( 见表4 7 ，4 8 ) ，每个处理接种外植体2 0 个，每个处理重复3 次。接种后统计 新芽出现的时间、芽增值量、芽诱导率。 4 3 3 2 愈伤组织增值培养 增殖培养材料：初代培养的叶片和胚愈伤组织；基本培养基：m s ；生长调节剂： 2 , 4 - d ，i b a ，6 - b a ；附加物：o 8 琼脂，4 5 0n a g l c h ，3 0g - l o 蔗糖。采用三因素 三水平正交实验设计( 见表4 9 ，4 1 0 ) ，每处理接种3 0 块直径1 0 左右的愈伤组织， 各处理重复3 次。在接种2 0d 后分别统计各自的增殖倍数。 表4 7 腋芽不定芽增殖的正交设计因素水平表b ( 3 4 ) t a b4 7 l 9 ( r ) o r t h o g o n a l d e s i g no f b u d s p r o l i f e r a t i o no f s t e m s i n s a r c o c o c c a r u s c i f o l i a s t a p f 水平 因素 0 50 0 0 1 1 00 1 0