（法医学专业论文）大鼠肌肉挫伤后肌钙蛋白Ⅰ+mrna表达与损伤时间关系的研究.pdf

山西医科大学硕士学位论文 大鼠肌肉挫伤后肌钙蛋白im r n a 表达与损伤时间关系的研究 摘要 目的：应用实时荧光定量p c r 技术检测大鼠肌肉挫伤后骨骼肌肌钙蛋白i ( s k e l e t a l t r o p o n i nl , s t n i ) m r n a 表达，探寻其时序性表达规律，探讨s t n im r n a 表达变化应用于 损伤时间推断的可行性，旨在为法医学早期损伤时间的推断提供科学依据。 方法：选取健康成年雄性s d 大鼠6 3 只，随机分为正常对照组( 6 只) 、死后损伤组 ( 9 只) 和生前损伤组( 4 8 只) 。均实施麻醉、褪毛后，利用改进的自由落体装置，2 5 0 9 重力锤自1 5 0 c m 高度垂直自由落下，造成大鼠右后肢大腿内侧肌群挫伤。损伤后0 5 h 、l h 、 6 h 、1 2 h 、1 8 h 、2 4 h 、3 0 h 、3 6 h 八个时间点( 每个时间点6 只) 取挫伤处肌肉组织5 0 m g ， 置于液氮中保存备用；正常对照组大鼠未打击造伤；死后损伤组脱颈处死后，自由落体打 击同一部位，其余处理与实验组相同。以膜吸附技术为基础的s vt o t a lr n ai s o l a t i o ns y s t e m 提取肌肉组织中的总r n a ，逆转录合成e d n a 第一条链，梯度浓度稀释e d n a 原液分别 制作s t i l i 和参比基因的相对定量标准曲线；选取管家基因核糖体蛋白l 3 2 ( r i b o s o m a l p r o t e i nl 3 2 ，r p l 3 2 ) 为参比基因，利用s y b rg r e e ni 嵌合荧光法实时定量p c r 检测s t n i m r n a 逆转录合成e d n a 的相对表达量，分别与损伤时间进行统计学分析。 结果：( 1 ) a g i l e n t2 1 0 0 芯片生物分析仪和2 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总r n a 纯度、浓度及完整性较好，均可满足下一步实验的要求。 ( 2 ) s t n i 与参比基因r p l 3 2 扩增效率分别为1 0 3 6 和1 0 0 5 ，一致性较好，说明参 比基因选择正确；扩增曲线拐点清楚，基线平而无上扬现象，说明引物设计特异性强、反 应性能良好；s t n i 基因融解温度为8 8 0 c ，r p l 3 2 基因融解温度为8 4 0 c ，两者融解曲线均 为单一峰型，基底窄而峰高，表明并无引物二聚体等非特异性扩增产生。 ( 3 ) 大鼠骨骼肌挫伤后s t n im r n a 表达明显下调俨 d ) ，而同一个体损伤肌肉中s t n im r n a 表达与正常肌肉中s t n im r n a 表 达存在差异俨 n ) ， 而同一个体损伤肌肉中s t n im r n a 表达与正常肌肉中s t n im r n a 表达存在差异俨 d d 影， s t i l im r n a 的表达仅在损伤肌肉中发生下调，同一个体未遭受损伤部位的肌肉可以作为评 价损伤肌肉的对照。 山西医科大学硕士学位论文 ( 2 ) 大鼠肌肉挫伤后3 6 h l 内s t n im r n a 呈时序性表达下调趋势，与损伤时间有一定的关 系，其时序性变化可望作为骨骼肌早期损伤时间推断的指标之一，服务于法医学实践。 ( 3 ) 实时荧光定量p c r 技术检测分子水平的变化敏感而且准确，适合法医学研究及检 案的需要。 推断 关键词：法医病理学；肌肉挫伤；骨骼肌肌钙蛋白i ：实时荧光定量p c r ；损伤时间 l i 山西医科大学硕士学位论文 s t u d i e so nm r n a e x p r e s s i o no fs k e l e t a lt r o p o n i n ii nc o n t u s e d s k e l e t a lm u s c l eo fr a t sf o rw o u n da g ee s t i m a t i o n a b s t r ac t o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o no fs k e l e t a lt r o p o n i ni ( s t n i ) m r n ac h a n g e s i n d u c e db yc o n t u s i o ni nr a ts k e l e t a lm u s c l eu s i n gr e a lt i m ef l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v ep o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ，a i m e dt op r o v i d es o m eh e l pf o rf o r e n s i ce s t i m a t i o no fw o u n d a g e m e t h o d s ：at o t a lo f6 3s p r a g u e - d a w l e ym a l er a t s ，a r o u n d10t o12w e e k so l d ，w e i g h i n g b e t w e e n2 8 0a n d3 0 0g ，w e r eu s e di nt h i ss t u d y a l lp r o c e d u r e sw e r ea p p r o v e db yt h ea n i m a l c e n t e ro fs h a n x im e d i c a lu n i v e r s i t y t h er a t sw e r ed i v i d e di n t o3p a r t s ：at o t a lo f6 3 s p r a g u e d a w l e y r a t sw e r ed i v i d e di n t oc o n t r o lg r o u p ( n 2 6 ) a n d0 5 ，1 ，6 ，12 ，18 ，2 4 ，3 0a n d3 6 h ( n = 6 ) c o n t u s i o ng r o u p s ，a n da n o t h e r9r a t sw e r ed i v i d e di n t o0 5 ，1 ，a n d6 hg r o u p sw h i c h r e c e i v e dc o n t u s i o ni n j u r ya f t e rd e a t h a f t e rt h er a t sw e r ea n e s t h e t i z e dw i t he t h y l e t h e ra n dt h e r i g h tp o s t e r i o rl i m bw a ss h a v e d ，ad e p i l a t o r ya g e n t ( s e l f - m a d e ) w a sa p p l i e dt or e m o v er e s i d u a l l 洫s u b s e q u e n t l y , t h er a t sw e r ef i x e d ，a n da2 5 0 9c o u n t e r p o i s ew a sr a i s e da n da l l o w e d t of a l l f r e e l y15 0 c mt h r o u g hac l e a rl u c i t eg u i d et u b eo n t ot h ef i g h tp o s t e r i o rl i m bo fr a t s t h es a m p l e s w e r ee x t r a c t e dr e s p e c t i v e l ya n ds t o r e di nl i q u i dn i t r o g e n t o t a lr n aw e r ei s o l a t e df r o ms k e l e t a l m u s c l eo ft h r e eg r o u p s ，a n dr e v e r s et r a n s e r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nw a sc o n d u c t e dt o s y n t h e s i z et h e1 - s ts t r a n de d n a t h e ns t a n d a r dc r r v e sw e r em a d ef o rs t n ia n dh o u s ek e e p i n g g e n e ( r p l 3 2 ) 、v i me d n a w i t ht h eu s eo fs e q u e n c e - s p e c i f i cp r i m e r s ，t h ee x p r e s s i o nl e v e lo f s t n im r n aw a ss t u d i e db ys y b rg r e e nir e a lt i m ep c r r e s u l t s ：( 1 ) t h ep u r i t y 、c o n c e n t r a t i o na n di n t e g r i t yo ft o t a lr n a w e r ee v a l u a t e db ya g i l e n t 210 0b i o a n a l y z e ra n d2 f o r m a l d e h y d e - d e n a t u r i n ga g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s t h et e s tr e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h et 0 t a lr n as u i t a b l ef o rt h ed o w n s t r e a me x p e r i m e n ta p p l i c a t i o n s ( 2 ) a ss h o w ni n t h es t a n d a r dc u r v e ，t h ea m p l i f i c a t i o ne f f i c i e n c yo ft h et w og e n e sw a s 10 3 6 a n d10 0 5 ，r e s p e c t i v e l y t h ei n f l e c t i o np o i n t sa n db a s e l i n eo fa m p l i f i c a t i o np l o t sw e r e d i s t i n c ta n de v e n n e s sr e s p e c t i v e l y ；t h ed i s s o c i a t i o nc u 吖c so ft h et w og e n e ss h o w e ds i g n a lc u s p s ， a n dt h ed i s s o c i a t i o nt e m p e r a t u r e sw e r e8 8 0 ca n d8 4 0 c ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t sc o u l db e e x p l a i n e db yt h a tt h e r ew e r en oo t h e rp c rp r o d u c t i o n sb e s i d e so u rt a r g e tg e n e sa n d t h e r ew a sn o p r i m e rd i m m e r ( 3 ) o u rr e s u l t sn o r m a l i z e db yr i b o s o m a lp r o t e i nl 3 2 ( r p l 3 2 ) s h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o n l e v e l so fs t n im r n a d o w n r e g u l a t e d7 8 1 7 ( p o 0 5 ) ，4 1 5 8 ( p o 0 5 ) a n d3 2 。1 3 ( p o 0 5 ) a f t e r c o n t u s i o nw h e nn o r m a l i z e dt ol 擅l 3 2e x p r e s s i o n i i i 一坐堕垦翌查兰堡主兰垡堡苎 ( 4 ) a l t h o u g hn oc h a n g ei nt h ee x p r e s s i o nl e v e l so fs t n im r n aw a so b s e r v e db e t w e e nt h e n o r m a ls k e l e t a lm u s c l ea n dt h ec o n t r o l ，as i g n i f i c a n td e c r e a s ei nt h ee x p r e s s i o nl e v e l so fs t n i m r n ai nt h ei n j u r e ds k e l e t a lm u s c l ew a sn o t e dw h e nc o m p a r e dw i t ht h o s ei nt h ec o n t r o la n d n o r m a ls k e l e t a lm u s c l e 俨 0 0 5 ) ( 5 ) t h ee x p r e s s i o nl e v e l so fs t n im r n ai nt h en o r m a la n dc o n t u s e ds k e l e t a lm u s e l eo f p o s t m o r t e mr a t sw e r ea b o u t7 0 o ft h a ti nt h ec o n t r o lg r o u p ( p o ，0 5 ) ，a n dn os i g n i f i c a n t c h a n g e si nt h ee x p r e s s i o nl e v e l so fs t n im r n ai nt h ep o s t m o r t e mc o n t u s i o ng r o u pw e r en o t e d a m o n gd i f f e r e n tt i m ep o i n t sa f t e ri n j u r y c o n c l u s i o n s ：( 1 ) as i g n i f i c a n td e c r e a s ei nt h ee x p r e s s i o nl e v e l so fs t n im r n ai nt h e i n j u r e ds k e l e t a lm u s c l ew a sn o t e dw h e nc o m p a r e dw i t ht h o s ei nt h ec o n t r o la n dn o 彻a 1s k e l e 伽 m u s c l e ( 尸 0 0 5 ) ，s u g g e s t i n gt h a tt h en o n - i n j u r e ds k e l e t a lm u s c l ef r o mt h es a n l ec o n t u s e dm t c o u l db eu s e da sac o n t r o lt oe v a l u a t et h ec o n t u s e dm u s c l e ( 2 ) t h et i m e - d e p e n d e n te x p r e s s i o no fs t r dm r n aa f t e rc o n t u s i o n 、析t h j n3 6 l l sw a s p o t e n t i a l l yi n d i c a t i v ef o re s t i m a t i o no fe a r l yw o u n d a g e ( 3 ) t h em e r i t so ft h er e a lt i m ef l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s u c h a si t sg o o da c c u r a c y ，s e n s i b i l i t ya n d r e p e a t a b i l i t y ，e n a b l ei ta so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tt o o l si n t h er e s e a r c ho ff o r e n s i cm e d i c i n e k e yw o r d s ：f o r e n s i cp a t h o l o g y ：m u s c l ec o n t u s i o n ；s k e l e t a lt r o p o n i ni ：r e a lt i m e f l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ：w o u n d a g ee s t i m a t i o n i v 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中任何引 用他人的成果，均己做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的 任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示致谢。 本文如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果： l 、交回学校授予的学位证书； 2 、学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报； 3 、本文按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开 道歉； 4 、本人负 论文作者签名： 实产生的法律纠纷。 日期： 学位论文版权使用授权书 年工月望日 本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山西医科 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位 仍然为山西医科大学。 ( 保密 论文作者签名： 指导教师签名： 守此规定) 吼啤年上月堑日 日期：年月日 ( 本声明的版权归山西医科大学所有，未经许可，任何单位及个人不得擅自使用) 。m 9 1 1 = 管 日u吾 损伤时间推断( w o u n da g ee s t i m a t i o n ) 是指根据损伤后组织细胞形态学变化或分子水平 变化来推测损伤形成的时间，是法医病理学研究的主要课题之一。对于暴力性伤害死亡案 件，首先要确定损伤是生前伤还是死后伤，如为生前伤，要进一步确定损伤至死亡经历时 间，即伤后存活时间( s u r v i v a lp e r i o da f t e r w o u n d i n g ) 。伤后存活时间的推断，对于划定嫌 疑人的范围、推测嫌疑人的意图、重建案件过程及判断死亡方式至关重要，能为案件侦破 和审理提供科学的法医学司法鉴定证据。生活机体遭受暴力作用后生存较长时间死亡者， 根据肉眼及组织学的变化易于确立生前伤的诊断，但在创口缺乏形成典型组织学生活反应 所必需的时间时，就显得无能为力了，加上死后早期阶段的一定时间内组织细胞和器官尚 能产生超生反应，就使短存活期损伤和一些复杂情况下案例的损伤性质鉴别变得更加困 难。因此，早期或濒死期损伤时间推断既是法医病理学的主要任务，也是法医病理学的难 点之一。 对于早期损伤时间推断，目前大多数国内、外法医学者借助于一些生物学因子如炎性 介质及反应蛋白等的检测，且研究主要集中在脑组织损伤、心脏损伤及皮肤损伤，其中对 于实验动物皮肤切创损伤时间推断的文献报道较多 1 - 9 1 ，主要有：( 1 ) 细胞因子，如i l 2 、 i l 4 、i l 6 、i l 8 、i l l 0 、g m c s f 、i f n l 、t n f a 等。( 2 ) 趋化因子，m c p - l 、m c p 2 。 ( 3 ) 黏附分子，如e 2 选择素、i c a m 1 、v c a m 1 。( 4 ) 炎症介质，如组织胺、5 一羟色胺、 白三烯b 4 等。 ( 5 ) 细胞凋亡调节因子，如c a s p a s e 3 、6 、7 、8 ，b c l - 2 与b e c l i n l 等。( 6 ) 单核巨噬细胞，t l r 2 和t l r 4 。( 7 ) 酶类，如m a p k 、j n k n o s ，f a k 等。实验表明 上述指标在炎症的发生发展、清除损伤、坏死的皮肤组织和入侵的病原体并重建损伤组织 中起着重要作用，且损伤后随时间呈一定规律性表达。但是由于受到个体差异、损伤程度 以及损伤部位不同等众多原因的影响，加之各实验室使用的动物模型、实验仪器、方法不 同，目前难以形成统一的标准，应用到实际检案中尚有一段艰辛漫长的过程。 肌肉挫伤是法医学实践中很常见的一类损伤，在损伤类型中占绝大多数，且经常伴随 其他损伤方式存在。与皮肤相比，骨骼肌，特别是深层骨骼肌具有所处环境相对稳定、对 缺血缺氧有一定的耐受性、不易受到外部污染、自溶较慢等条件，加之含量大、分布广、 少患病、易取材等优势，可作为损伤时间推断研究的良好检材。但有关于肌肉损伤时间推 断的法医学研究却少见报道【1 0 1 ，目前利用骨骼肌的变化推断死亡时间有一定的研究【l l 1 2 】， 如利用死后大鼠腓肠肌内糖原含量变化推断死亡时间，利用应用傅立叶变换红外光谱 ( f t i r ) 分析大鼠死后骨骼肌随死亡时间推移的化学降解过程推断死亡时间。 m r n a 通常被认为由于外界环境中广泛存在的r n a 酶会使m r n a 在体外或死后迅速 发生降解，然而近年来国内外学者对以上提到的细胞因子m r n a 进行了研究，发现其中某 些细胞因子m r n a 的表达随损伤时间规律性变化，而死后伤则无明显变化；死后短期 ( 3 6 9 6 h ) 内未发现有急剧的r n r n a 降解，直至死后一周组织中仍可检出靶m r n a 【l 卜巧j ， 说明上述物质r n r n a 的表达对于损伤后存活时间短或濒死期的损伤鉴定有一定的意义，而 山西医科大学硕士学位论文 有无基因水平的表达则是区别生前伤和死后伤的标志性特征。 目前损伤时间推断的研究主要采用免疫组织化学、w e s t e r nb l o t 、原位杂交、逆转录聚 合酶链式反应( r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，r t - p c r ) 等方法定性定 量探讨损伤后一些蛋白质及其m r n a 的表达与时间变化的规律性。二十世纪九十年代中期 发展起来的实时荧光定量p c r 技术( r e a lt i m ef l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v ep o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ，r e a lt i m ep c r ) 是指在p c r 反应体系中加入荧光物质，并通过实时检测系统对 p c r 反应进程中的荧光信号强度进行实时监测，最终对实验数据进行分析处理的方法。其 优点【1 6 _ 。7 】在于：( 1 ) 完全闭管操作，降低了污染。( 2 ) 可在宽广动态范围内准确定量，且 扩增和定量同步进行，克服了传统p c r 的平台效应。( 3 ) 敏感性高，操作简便，不需要在 反应结束后通过电泳操作确认扩增产物，能够简单、快速地获得实验结果。( 4 ) 避免了 电泳染色剂e b 或用于标记目的产物的放射性同位素对研究人员的伤害。r e a lt i m ep c r 以 上优势及在m r n a 定量中的高敏感性和精准性i l 引，符合法医学研究和实践要求。 综上所述，本文采用r e a lt i m ep c r 技术，建立不同时间点大鼠骨骼肌挫伤模型，研究 挫伤后肌肉组织中s t n im r n a 表达随损伤时间的变化关系，探寻其时序性表达规律，旨为 法医学早期损伤时间的推断提供科学的实验依据。 2 山西医科大学硕士学位论文 1 材料 材料与方法 1 1 动物 健康成年清洁级s d ( s p r a g u e - d a w l e y ) 雄性大鼠，体质量2 8 0 3 0 0 9 ，由山西医科大 学实验动物中心提供。 1 2 主要试剂 试剂名称生产厂商 s vt o t a lr n ai s o l a t i o ns y s t e m r n a i s op l u s p r i m e s c r i 胛t - p c rk i t ( p e r f e c tr e a lt i m e ) s y b r p r e m i xe xt a qt m 2 0 0 b p d n al a d d e rm a r k e r r i b o n u c l e a s ei n h i b i t o r n u c l e a s e f r e ew a t e r 6 x l o a d i n gb u f f e r 10 x l o a d i n gb u f f e r r n a s ea w a y 西 甘油( g l y c e r 0 1 ) t r i s 硼酸( b o r i ca c i d ) 丙磺酸钠盐( m o p s ，s o d i u ms a l t ) 溴酚兰( b r o m o p h e r o lb l u e ) 二甲苯青( x y l e n ec y a n o lf f ) 去离子甲酰胺( f o r m a m i d ed e i o n i z e d ) d e p c e d t a a g a r o s e 1 x t eb u f f e r 9 5 乙醇 无水乙醇 乙醚 甲醛溶液 p r o m e g a 俐( a r a t a k a r a t 2 出a r a 嘲( a r a 瑚( a r a t a k a r a t a k a r a t a k a r a s i g m a b b i b b i b b i b b i b b i b b i b b i b b i b b i b b i 上海生工 北京化工 北京化工 北京化工 北京化工 3 山西医科大学硕士学位论文 1 3 主要实验仪器 仪器名称生产厂商 p c r 扩增仪 m x 3 0 0 5 p 实时荧光定量分析仪 a g i l e n t210 0 芯片生物分析仪 微量可调移液器 m i l l i q 超纯水制备系统 精密天平 紫外分光光度计u l t r o s p e c4 3 0 0 p r o 紫外凝胶图像分析系统 高速冷冻离心机2 1 6 p k 型 电泳槽d y c p 3 1 d 型 电泳仪电源d y y - 7 c 型 水浴恒温器t h z 8 2 型 水浴恒温振荡器 生物超净工作台 超低温冰箱 压力蒸汽灭菌器 p h 计p h s j 4 a b i o m e t r s t r a t a g e n e a g i l e n t e p p e n d o r f m i l l i p o r e o h a u s a m e r s h a mb i o s e i e n c e b e c k m a n s i g m a 北京六一仪器厂 北京六一仪器厂 华普达教学仪器有限公司 华普达教学仪器有限公司 苏州市苏信净化设备厂 中国海尔 宁波镇海医疗器械厂 上海精密仪器科学仪器有限公司 2 方法 2 1 大鼠肌肉挫伤模型制备 2 1 1 实验动物及分组 健康成年清洁级s p r a g u e d a w l e y 雄性大鼠6 3 只，体质量2 8 0 - - - 3 0 0 9 ，随机分成3 组， 包括： ( 1 ) 生前损伤组：依照挫伤后存活时间的不同，分为o 5 h 、1 h 、6 h 、1 2 h 、1 8 h 、 2 4 h 、3 0 h 、3 6 h 八个亚组，每个亚组6 只。( 2 ) 正常对照组：6 只，相同处理后不实施打 击，处死后即刻取材。( 3 ) 死后损伤组：每个时间点3 只，处死后o 5 h 实施打击，并在 打击后即刻、l h 、6h 三个时间点取材。动物实验遵守国际实验动物保护原则( u s 1 9 8 5 ) 。 2 1 2 动物模型制作 经口鼻乙醚麻醉大鼠，选取大鼠右后肢大腿内侧肌群作为挫伤着力点，用本室自制的 褪毛剂( 配方附后) 褪净着力点附近的鼠毛，仰卧位固定于鼠板上，并用纱布垫将右后肢 垫起，以防止其悬空并充分暴露打击区域。参照王晶等【1 9 2 1 1 改良的自由落体装置进行如下 打击操作：固定大鼠双侧小腿跟部以防目标肌群发生偏移；用带线的重力锤确保p v c 管( 口 径4 0 m m ) 垂直于打击平面，重力锤( 2 5 0 9 ，直径3 3 r a m ) 置于1 5 0 c m 的高度，自p v c 管 4 山西医科大学硕士学位论文 中自由落下导致目标肌群挫伤( 解剖证实损伤率达1 0 0 ) 。 2 1 3 取材 损伤后大鼠每笼一鼠并给予专用饲料及蒸馏水饲养，保持垫料清洁及空气通畅，置于 可控环境中( 2 0 士2 0 c ) 。大鼠存活至预定时间后腹腔注射致死量戊巴比妥钠处死，打击区 域常规手术消毒后，无菌手术剪剪开皮肤及浅层肌肉，暴露深层损伤肌群，进行取材操作： ( 1 ) 生前损伤组于损伤最明显处取材。( 2 ) 为了比较生前损伤组正常肌肉( n o r m a l ) 与损伤肌肉中s t n im r n a 的表达水平，选取1 8 h 亚组大鼠左后肢同一部位取材。( 3 ) 死 后损伤组双后肢取材。 2 2s d 大鼠肌肉组织中总r n a 的提取 以膜吸附技术为基础的s vt o t a lr n a 提取系统操作步骤如下： ( 1 ) 用液氮预冷研钵，然后将组织放入研钵中进行研磨。整个过程中应不断的加入 液氮，研磨至极细粉末状( 肉眼无明显颗粒，研磨时不再产生明显的摩擦感) 后，倒入灭 菌的n u c l e a s e f r e ee p 管中。 ( 2 ) 加入2 2 5 i t lr l a ( r n al y s i sb u f f e r ) ，颠倒混匀，2 3 。c , - , 2 6 0 c 水浴数分钟，待裂解 液组织混合物呈清亮透明状、肉眼无明显固形物即表示裂解充分。 ( 3 ) 在e p 管中加入3 5 0 肛1r d a ( r n a d i l u t i o nb u f f e r ) ，颠倒混匀3 4 次后，7 0 0 c 水 浴变性3 m i n ( 时间可以稍加延长，但一般不能超过5r a i n ) 。 ( 4 ) 离心1 5 m i n 。用移液器小心吸取上清( 约4 0 0 1 a 1 ) 至新e p 管中，切忌吸取到沉 淀。 ( 5 ) 加入9 5 乙醇2 0 0 p 1 后用移液器吹打3 - - 4 次，室温静置2 m i n 后，将混合液全部 移至s c a ( s p i nc o l u m na s s e m b l i s e ) 中，离心l m i n 。 ( 6 ) 弃去收集管中的洗脱液，加入6 0 0 p 1r w a ( r n a w a s hs o l u t i o n ) ，离心l m i n 。 ( 7 ) 现配d n a s em i x 4 0 t ly e l l o wc o r eb u f f e r ，5 i - t l m n c l 2 和5 p ld n a s ei ( 顺序不能 颠倒) 加入s c a 中，尽量加到其吸附膜上，室温孵育15 r a i n 。 ( 8 ) 加入2 0 0 1 a l d s a ( d n a s es t o ps o l u t i o n ) ，室温静置3 r a i n 后离心l m i n ，弃去收集管 中废液。 ( 9 ) 加入6 0 0 p 1r w a ( r n a w a s hs o l u t i o n ) ，离心l m i n ，弃去废液，再加入2 5 0 1 x lr w a 离心2 m i n ，取出s c a 置于新的e p 管中。 ( 1 0 ) 加入1 0 0 1 a ln u c l e a s e f r e ew a t e r ，离心1 r a i n ，洗脱得到r n a 溶液。标记好后迅 速冰上放置以进行下一步检测。 甚玉所有离心操作均在1 4 0 0 0 x g 、4 0 c 条件下进行，室温静置在2 3 0 c 3 0 0 c 条件下。 2 3 总r n a 的评价与鉴定 2 3 1 用紫外分光光度计对总r n a 进行浓度检测 每个样本取4 1 a l 总r n a 溶入到9 6 t l1 t eb u f f e r 中( 稀释2 5 倍) ，以1 0 0 “11 t eb u f f e r 作为空白对照。 r n a 抽提效率有很强的组织特异性，不同组织中r n a 的丰度和r n a 提取的难易程 度共同决定了该种组织的r n a 得率。一般来说，可通过分光光度计测定r n a 溶液在2 6 0 n m 处的吸光值来计算r n a 的含量。r n a 溶液在2 6 0 、3 2 0 、2 3 0 、2 8 0 n m 下的吸光度分别代 表了核酸、溶液浑浊度、杂质浓度和蛋白等有机物的吸收值。用标准样品测得在波长2 6 0 n m 处，1 9 9 m lr n a 钠盐吸光度为0 0 2 5 ( 光程为i c m ) ，即o d 2 6 0 = 1 时，样品r n a 浓度为 4 0 i r t g m l 。通常分光光度计o d 2 6 0 的读数要介于0 1 5 1 0 之间才是可靠的。因此r n a 提 取结束后，要根据大概产量稀释到适当浓度范围，再用分光光度计检测。按以下公式计算 总r n a 浓度： 总r n a 浓度( i t g m 1 ) = o d 2 6 0 x 稀释倍数x 4 0 i - t g m l 2 3 2 用紫外分光光度计对总r n a 进行纯度检测 通过o d 2 6 0 o d 2 8 0 来检测r n a 纯度，o d 2 6 0 o d 2 3 0 作为参考值。 o d 2 6 0 o d 2 8 0 在1 9 2 1 之间，可以认为r n a 的纯度较好： o d 2 6 0 o d 2 8 0 值小于1 8 ，则表明蛋白质杂质较多： o d 2 6 0 o d 2 8 0 值大于2 2 ，则表明r n a 已经降解； o d 2 6 0 o d 2 8 0 值小于2 0 ，则表明r n a 溶液有异硫氰酸胍和p 巯基乙醇残留。 2 3 3 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总r n a 的完整性 1 甲醛变性琼脂糖凝胶配制方法如下( 2 胶) ：加3 0 9 高质量的琼脂糖到8 0m ld e p c 水中，煮沸直至完全溶解，再加入适量的d e p c 水定容至9 3 m l 。溶液冷却至6 0 0 c 左右后， 加入3 0m li o x m o p sb u f f e r 和2 7m l3 7 甲醛( 在通风橱中操作) ，倒胶后于室温静置1h 。 按下列组分进行总r n a 的变性反应： 2 加样前将胶在1x m o p sb u f f e r 中1 0v e r a 条件下预电泳1 0 r a i n 。 3 混匀电泳槽中的1 x m o p sb u f f e r ( 电泳液) ，1 0v e r a ( 恒压) 条件下电泳至溴酚 蓝迁移至胶的2 3 左右位置，电泳过程中应每隔3 0 m i n 混匀电泳槽中的电泳液一次。 4 电泳结束后，将凝胶在d e p c 处理水中浸泡1 5 r a i n ，除去凝胶中的甲醛。 5 使用d e p c 处理水制备的e b ( 5i x g m 1 ) 溶液染色2 3r a i n 。用d e p c 处理水脱色 3 0 m i n ，再换水脱色3 0 r a i n 后成像观察。 毖甲醛凝胶使用e b 染色比较麻烦，即使r n a 样品染上了明显的条带也会带来较 高的背景。因此，凝胶在染色剂中的浸泡时间应小于5 r a i n ，以降低背景。 2 3 4 用a g i l e n t2 1 0 0 芯片生物分析仪对总r n a 进行质量控制 严格按照a g i l e n t2 10 0 生物芯片分析系统配套的r n a 检测c h i p 及试剂进行操作，仪 器会对每一份样品进行分析并自动输出结果，包括r n a 浓度、r r n a 比值 2 8 s 1 8 s 、r i n 6 山西医科大学硕士学位论文 ( r n ai n t e g r i t yn u m b e r ，r n a 完整性指数) 。 2 4c d n a 的合成 ( 1 ) 模板总r n a 进行6 5 0 c 水浴5 r a i n 变性后迅速冰上放置，同时按反转录试剂盒操 作说明冰上配制反应混合液如下。 荭；预先计算好反应次数，配制出各种试剂的混合液( m a s t e rm i x ：其中包括 n u c l e a s e f r e ew a t e r 、b u f f e r 、酶等) ，然后再分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂 体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂，同时也可以减少实验操作或实验之 间的误差。 表1r t - p c r 反应液成分 t a b l e1r t - p c rw a sp e r f o r m e di na10 p ir e a c t i o nm i x t u r e 试剂使用量终浓度 5 p r i m e s c r i p tb u f f e r2 1 d 1 p r i m e s c r i p t l mr te n z y m em i x l o 5 p l o l i g od tp d m e r ( 5 0 l 上m ) 0 5 1 x l2 5 p m o i r a n d o m6m e r s ( 10 0 p m ) 0 5 t d 5 0 p m o l t o t a lr n a ( 5 0 0 n g ) r n a s ef r e ed h 2 0 u pt o10 1 x l _ _ _ _ 一i _ 崖jr a n d o m6m e r s 和o l i g od tp r i m e r 同时使用，可有效地将全长m r n a 反转录成c d n a 。 ( 2 ) 反转录反应条件如下： 3 7 0 c1 5 m i n ( 反转录反应) 8 5 0 c5 s e e ( r te n z y m e 的失活反应) 反应结束后，迅速将e d n a 冰上放置2 3r a i n ，2 0 0 c 保存备用。 2 5 r e a lt i m ep c r 目的基因及参比基因扩增所用引物序列均引自g e n b a n k ，由本室研究人员通过 a u e l e l d6 软件( p r e m i e rb i o s o f li n t e r n a t i o n a l ) 进行设计优化，