外周血单核细胞的分离以及培养.doc

1、 牛外周血单核细胞的分离1、 采血袋采集200ml血液2、 首先在15ml离心管加3ml分离液（室温）3、 轻轻的将3ml全血加到3ml分离液中4、 400g室温离心30min5、 离心后，吸取白膜层（0.5cm）转移到新的离心管6、 加10ml的PBS或是培养基，进行混匀（枪轻轻吹打）7、 250g室温离心10min8、 加5ml的PBS或是培养基，进行混匀（枪轻轻吹打）9、 250g室温离心10min10、 重复8、9，加0.5ml培养液悬浮，2、 磁珠分选11、 将分离得到的 PBMCs 进行细胞计数。12、 离心细胞悬液，300g，10 分钟。吸去上清。13、 将细胞沉淀用 buffer（含 0.5BSA 的 PBS）悬浮，按每 107个细胞加 80L buffer 和20L 抗 CD14 磁珠，充分混匀，2-8孵育 15 分钟。14、 300g，10 分钟。吸去上清。用 500L buffer 重悬细胞。15、 将柱子放在磁珠分离器上，吸取细胞悬液加到柱子中，用 500L buffer 清洗三遍柱子。16、 待清洗三遍后，将柱子从磁珠分选器上取下来，加入 1mL buffer，用助推器快速推动柱子中的洗脱 buffer，收集单核细胞，计数。17、 单核细胞 300g 离心，10 分钟，用含 10的胎牛血清、100U/mL 青链霉素、PH7.2-7.4 的 1640（IMDM） 全培养液调整细胞浓度为按 1106单核细胞铺入 10cm培养皿，375%CO2温箱中培养。3、 磁珠分选注意事项1、柱容量：1107 磁性标记细胞可上达2108细胞总量。 注意：当分选的细胞比淋巴细胞大时，柱容量需减少。2、建议白细胞样本大小：在1062108细胞总量中有104107标记细胞3、典型富集率：50fold至1000fold,取决于磁性标记的活力和特性，达到10000fold富集量就可以分装两柱。4、柱流动停止，不要干涸5、Void容积:60ul.贮液器容积3.5ml6、PBS典型的流量包含0.5%BSA：0.35-0.5ml/min。7、MS柱不可重复使用。MS柱的准备：1、准备用buffer漂洗的MS柱：取500ul degassde buffer 到柱的上部，并使buffer流过全柱。MS 柱流动停止，不要干涸。2、弃掉废液更换收集管。此时的MS 柱可用于磁珠分选。注意：装满之后快速使用，避免温度升高产生气泡。用buffer装满柱的时间取决于贮存环境，温度和湿度。因此，时间可能从几秒到变到几分钟。这个时间并不影响分选质量。用MS柱进行磁珠分选：在进行下一步之前要等到柱子的贮液器是空的。1、 在500ul的degassed buffer中重悬上达108的细胞总量。注意：细胞数目增加，按比例增加buffer体积。当新鲜抗凝血剂的血液或白膜层一起作用时，分选之前用buffer稀释为1：2。除去团块使细胞通过预分选过滤器。2、 将分选的细胞放至准备好的MS 柱上，收集流动的未被标记的细胞。3、 用3500ul的degassed buffer清洗MS 柱。收集未标记的细胞使其与步骤2获得的结合。注意：执行清洗步骤，柱子储液器一旦空了就要添加buffer4、 从分选器上取下MS柱，更换新的收集管5、 吸取1ml buffer至MS柱，快速驱赶片段伴有磁性