（微生物学专业论文）delftia+tsuruhatensis+ad9邻苯二酚23双加氧酶基因的表达和功能研究.pdf

摘要苯胺是一种危害性极大的污染物，对人体有致癌作用。利用微生物降解这类化合物受到全世界各国的重视。本实验中前期研究中，从印染厂活性污泥中分离到的一株能高效降解苯胺的丛毛单胞菌d e l f t 谊t s u r u h a t e t m i aa d 9 ，克隆了完整的苯胺降解基因簇，其中包含两个赖氨酸型调控基因和有两个编码邻苯二酚2 ，3 - - 双加氧酶( c 2 3 0 s ) 的基因( t a d c l 、t a d c 2 ) ，分别位于苯胺降解基因簇的两个操纵子上。c 2 3 0 是芳香族化合物生物降解过程中重要的一个关键酶。本研究对d e l f t i at s u r u h a t e n s i sa d 9 中苯胺降解基因簇中t a d c l 、t a d c 2 的基因序列分析及b l a s t 比对，发现在核苷酸水平上t a d c l 与t a d c 2 的同源性仅有5 5 ，对两个基因推导的氨基酸序列分析表明t a d c l 与t a d c 2 的同源性仅有5 0 4 7 。但是，预测两个酶的蛋白三维结构却惊奇的相似。首先我们测定t d e l f i i at s u r u h a t e n s i wa d 9 的对苯胺和邻苯二酚耐受性，发现a d 9 对邻苯二酚的耐受性远远低于对苯胺的耐受性。a d 9 菌株能耐受苯胺的浓度达4 5 0 0 m g n ，相比对邻苯二酚的耐受浓度低于6 0 0 m g n 。超过该浓度时，a d 9 菌株的生长完全被抑制。同时，也发现在苯胺降解初期，伴随着2 一羟粘糠酸半醛( s ) 的积累。表明t a d c l 和t a d c 2 在苯胺经苯胺双加氧酶的催化转化成邻苯二酚后，邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶对中间产物的进一步降解起到重要作用。为了分析a d 9 菌中两种邻苯二酚2 ，3 - - 双加氧酶1 柚c l 和1 m c 2 的作用，我们利用熙p c r 技术在转录水平上分析t a d c l 和t a d c 2 的表达情况，实验结果表明t a d c l 和t a d c 2 两个基因的表达分别受苯胺和邻苯二酚的诱导。在苯胺诱导物存在下，t a d c 2 的表达量明显低于t a d c l 的表达量。为了进一步分析t a d c l 和t a d c 2 编码的c 2 3 0 的功能，本研究分别克隆t a d c l 和t a d c 2 基因，并构建原核蛋白表达载体p e 【2 8 a 上，获得两个基因的表达菌株p e t c i 和p e t c 2 。对提取的t a d c l 和t a d c 2 粗酶进行了酶活测定，发现t a d c l 酶粗提液对邻苯二酚的降解速率明显高于t a d c 2 酶粗提液。从上述实验结果中，我们推测t a d c l 编码的邻苯二酚2 ，3 - - 双加氧酶在苯胺降解中起主要作用，而由t a d c 2 编码的c 2 3 0 可能在在苯胺降解过程中起着补偿机制的作用。关键词：苯胺，d e l f t i at s u r u h a t e n s i s a d 9 ，邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶，酶活测定，r t - p c r ，降解途径a b s t r a c ta n i l i n ei sar e f r a c t o r yo r g a n i cp o l l u t a n t , h a v i n gac a r c i n o g e n i ce f f e c ti nh u m a n s u s eo fm i c r o o r g a n i s mt od e g r a d et h i sk i n do f c o m p o u n d sh a sp a i da t t e n t i o ni nt h ew h o l ew o r l d o u rl a b o r a t o r yh a sp r e v i o u s l yc l o n e dc h r o m o s o m e - e n c o d e dg e n ec l u s t e rf o ra l l i l i n em e t a b o l i cp a t h w a yf r o ma l la n i l i n ed e g r a d i n gb a c t e r i u m , d e l f l i at s u r u h a t e n s l sa d o i s o l a t e df r o mt h es o i ls u r r o u n d i n ga 懈t i l ed y i n gp l a n t t h e g e n e c l u s t e r c o n s i s t s o f 2 5 0 p e nr e a d i n g f r a n i c s ( o r f s ) ，a t l e a s t l 7g e n e s i n v o l v e d i na n i l i l l ed e g r a d a t i o nf o rt h ec o m p l e t em e t a b o l i s mo f a n i l i n et ot c a - c y c l ei n t e r m e d i a t e s ，n a m e dt a d q t a i a 2 b r d i c i d 2 c 2 e f g i j k l , w h i c hi n c l u d e st w op u t a t i v el y s - t y p er e g u l a t o r s ( t a d ra n df a d s )a n d t w oc a t e c h o l2 , 3 - d i o x y g e n a s e ( c 2 3 0 s ) g e n e s ( t a d c l ，t a d c 2 ) c 2 3 0 sa r et h ek e ye n z y m e si na n i l i n ed e g r a d a t i o nm e t a b o l i cp a t h w a y a n a l y s i so ft h et a dg e n ec l u s t e rs e q u e n c ei n d i c a t e dt h a tt h eg e n ec l u s t e rh a so p e r a t o r s t a d c la n dt a d c 2a r ei nt h ep o s i t i o no ff i r s ta n ds e c o n do p e r a t o ra p r o b a b l yc o n t r o l l e db yt h er e g u l a t o r st a d ra n dt a d s ，r e s p e c t i v e l y t a d c lg e n es e q u e n c eo n l ys h a r e d5 5 o fh o m o l o g yw i t h 埘讹，t h eh o m o l o g yb 吐w e e nt a d c la n dt a d c 2a tt h ea m i n oa c i dl e v e li so n l y5 0 4 7 h o w e v e r t h ep r o j e c t i n gt w o - t h r c es t n l c t u n go ft h ep r o t e i n si sv e r ys i m i l a r b 吐l i ss t u d y , w ee x a m i n e dt h ea b i f i t yo fr e s i s t a n ta n ds u r v i v a lt oa n i l i n eo rc a t e c h o li nn招“n l h m 拼堪ba d 9s l l a i n , a n df o u n dt h a ta d os l l a i nc o u l dg r o wi np r e s e n to fa n i l i n ec o n c e n t r a t i o n 啦4 ，5 0 0m g 1 ，b u tt h eg r o w t ho fa d 9s w a i nw a so b v i o u s l yl i m i t e da t6 0 0r a g 1o fc a t e c h 0 1 i na d d i t i o n ,w ef o u n dt h a t2 - h y d r o x y m u c o n i es e r n i a l d e h y d e ( h m s ) a c c u m u l a t e dd u r i n gt h ee a r l ys t a g eo fa n i l i n em e t a b o l i cp a t h w a y t h o s ep h e n o m e n as h o w e dt h a te a t e c h o l2 , 3 - d i o x y g e n a s e ( c 2 3 0 ) p l a y e dai m p o r t a n tr o l ef o rf u r t h e rd e g r a d a t i o n t oa n a l y z et h ee f f e c to fc 2 3 0 s ( t a d c la n dt a d c 2 ) o na n i l i n ed e g r a d a t i o ni na d 9s t r a i n ，w od e t e r m i n e dt h ee x p r e s s i o no ft a d c la n dt a d c 2a lt h e 仃j m s c r i p 石l e v e lb yr t - p c ra s s a y t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tt a d c la n dt a d c 2w e 衅i n d u c e dt oe x p r e s sb ya n i l i n ea n dc a t e c h o lr e s p e c t i v e l y u n d e rt h ep r e s e n to f i l i n ei n d u c e r , t h ee x p r e s s i o no ft a d c lw a so b v i o u s l yh i g h e rt h a nt h a to ft a d c l t of u r t h e ru n d e r s t a n dt h ef u n c t i o no fc 2 3 0 se = r l c o d g db yt a d c l ，w ea m p l i f i e dt h ei n t a c tt a d c la n dt a d c 2g e n e s ，a n dc o n s t r u c t e di n t ot h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r ( p e t 2 8 a ) ，r e s u l t i n gt h et r a n s f o r m a m s ，n a m e dp e t c la n dp e t c 2 r e s p e c t i v e l y t h ea n a l y s i so fe n z y m ea c t i v i t i e sf r o mt h ee x t r a c t i o no fp e t e la n dp e t e 2s h o w e d t h a t t h er a t e o f c a t e c h o l d e g r a d a t i o n c a t a l y z e d b y t a d c l w a gs i g n i f i c a n th i g h e r t h a n t h a to ft a d c 2 t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt a d c le n c o d e dc a t e c h o l2 , 3 - d i o x y g e n a s ep l a y e dam a j o rr o l ei nt h ep r o c e s so fa n i l i n ed e g r a d a t i o n k e yw o r d s ：a n i l i n e , d e l f t i at s u r u h a t e n m sa d 9 ，c a t e c h o l2 ，3 - - d i o x y g e n a s e , e l l z y n l ea c t i v i t ya s s a y ,r t - p c r 。d e g r a d a t i o np a t h w a y缩略词第一章引言近些年来，随着生产力水平的提高，工业的发展，工业废水所造成的环境污染越来越成为人们所关注的焦点问题。在这些污染物中，芳香族化合物占了很大的比例。芳香族化合物在自然界广泛存在，仅次于葡萄糖残基，苯环是自然界中分布最广的化学单元。目前，芳香族化合物：苯，甲苯、乙苯、二甲苯、苯乙烯正以每年百万吨的数量被制造出来，这些化合物广泛的用于燃料和工业溶剂，而且它们和多环芳香化合物、氯代联苯是生产医药、农药、塑料聚合物、炸药和其它日用品的最初原料( 孙艳，钱世钧2 0 0 1 ) 。具有苯环结构的化合物是一类难降解的有机物，并且具有相当大的毒性和致癌，致突变作用。人工合成的芳香族化合物在利用时不可避免的泄漏到环境中，造成严重的环境污染，尽管人们已经认识到了问题的严重性，这一问题仍星上升的趋势。自然界中，存在着许多具有降解芳香族化合物能力的细菌，这些细菌可以以这类化合物作为唯一碳源生长，并将芳香族化合物完全降解为水和c 0 2 。微生物降解环境污染物由于投资少、占地小又不需特殊设备而成为最有前途的治理环境污染的方法。目前世界各国的科学家们都致力于降解芳香族化合物微生物的研究，已经从工业废水及污染士壤中分离得到了多种此类微生物。本实验室也于2 0 0 2 年从南方一印染厂污染土壤种分离得到了一株稳定高效的苯胺降解菌z ) e g 铽at s u r u h a t e n s i sa d 9 。( 梁泉峰，林敏2 0 0 5 )在芳香族化合物降解过程中，邻苯二酚是一个重要的中间产物。邻苯二酚的降解是通过邻苯二酚双加氧酶催化的。1 1 苯胺降解微生物的研究进展1 1 1 苯胺特性苯胺，俗名阿林尼油，外观为无色或浅黄色透明油状液体，具有强烈的刺激性气味，有毒，分子式c 6 i - i _ 7 n 。苯胺是重要的有机化工原料之一，由其制得的化工产品和中间体有3 0 0 多种，广泛应用于染料、医药、炸药、香料、橡胶硫化促进剂、药品等行业，尤其是可作为聚氨酯产品主要原料m d i 的原料苯胺对生物具有毒性作用，引起中枢神经系统、心血管系统以及其它脏器的损害，而且苯胺类化合物还具有致癌作用( 司航，1 9 9 5 ) 。1 1 2 苯胺微生物降解的特点目前国内外对苯胺类污染物的处理方法中，微生物降解相对于现有的物理化学处理系统而言，具有投舞少、速度快、消耗低、效率高、成本低、反应条件温和以及无二次污染等显著优点。微生物降解处理方法具有很大的发展潜力。但是微生物降解苯胺与降解其它芳香族化合物相比较，仍然属于难于降解的一类。芳香族化合物生物降解性与其化学组成、结构有密切关系，氨基和硝基的引入增加了降解的难度。单个取代基芳香化合物降解性由易变难的顺序是：苯酚一苯甲酸一甲苯一苯一苯胺一硝基苯目前将芳香化合物按生物降解的速率分为五类：第一类启动期短，降解速度快，属于这一类降解类型的化合物有：苯酚，邻苯二酚、苯甲酸、邻苯二甲酸、甲苯。第二类启动期短，降解速度较快，中国农业科学院硕十学位论文第一章引言属于这一类降类型的化合物有：间苯二甲酸、对苯二甲酸、苯、间二甲苯和对二甲苯。第三类启动期长，降解速度快，属于这一类降解类型的化合物有：乙基苯、苯胺，邻苯二甲酸和三甲苯。第四类起动期较短。降解速度慢，属于这一类降解类型的化合物有；邻、间和对硝基苯酚、对羟基苯磺酸、硝基苯。第五类，起动期长，降解速度较慢，其中最为典型的是邻苯二胺和间硝基苯胺。综上所述，苯胺在芳香族化合物的生物降解中，属于较为难降解和降解启动时间长的一类( 王思菊等，1 9 9 5 ) 。因此，寻找和构建高效，快速降解苯胺的菌株，成为生物降解苯胺研究的关键因素之一。1 i 3 苯胺降解细菌基于上述原因，世界各国政府和科学家十分重视对苯胺降解微生物资源的开发和利用，已经从长期受污染的十壤或活性污泥中分离鉴定出藻类，真菌，多种细菌等苯胺降解微生物，显示出该类生物的多样性( 表i 1 ) 。囊i i 苯胺障解微生物的多样性t a b l e1 - 1d i v e r s i t yo f a n i l i n e - d e g r a d i n gm i c r o o r g a n i s m s研究者及参考文献降解菌株刘志培等，1 9 9 9 ：2 0 0 2h y u n g - y e e l 配山| 1 9 e f 础2 0 0 0剐n ，t e t a 1 9 9 7 ；1 9 9 8 a ；t 9 9 8 ba o k i k “以1 9 8 4 a ；1 9 8 4 bk i 札s 1 一a l l 9 9 7 ；1 9 9 8 ；1 9 9 9 ；2 0 0 1 ：2 0 0 2a o l d i c a l l 9 8 3d 删g 盯a 2 0 0 1韦海潮等1 9 9 8a o k i 。k ，k o d a m a , “a 1 9 9 7b o o n ，n e t a 2 0 0 0 ；2 0 0 1d e l f l i aa c i d o v o r a n * a n 3嗜酸性丛毛单胞菌a n 3 菌株p s e u d o m o n a a k i假单孢菌k l 菌株a c i n e c t o b a c t e r c a l c o a c e t i c u a乙酸钙夺动杆菌d e l f t i aa c i d o v o r a n sh y 9 9p s e u d o m o n a s p u a d au c c 2 2恶臭假单胞菌u c 2 2 菌株a c n e c t o b a c t c r s p y a a不动杆菌y a a 菌株f r a t e u r a8 p e c i e l ；a n a - 1 8弗拉特氏菌a n a - 1 8 菌株a c i n e t o b a c t e r t w o f 靠i k 2 4鲁氏不动杆菌k 2 4 菌株r h o d o c o c c u s e r y t h r o p o l i s a n - 1 3红串红球菌a n - 1 3 菌株f u s a r i u ms p 镰刀霉o c h r o b a c t r u m a n 抽r o p i人苍白杆菌p s e u d o m o n a ss p e d e sa w 一2假单胞菌a w - 2 菌株ct e s t o s t e r o n l l 2 n 础黼榭j c a 2 8n 珊i 如阳，豺jb n 3 1 d a c l d o v o r 挑fl m e l 柚dz 14 c i 加 口，堪b 8 c2中同农业科学院硕十学位论文第一章引言本实验室从印染厂活性污泥中分离到的一株新的苯胺降解菌株d e l f l i at s u r u h a t e n s i sa d 9 该菌具有降解速率快和耐受苯胺浓度高等明显的优势，具备良好的应用和理论研究价值( 梁泉峰，林敏2 0 0 5 ) 。1 2 苯胺降解途径的研究进展众所周知，微生物在物质循环包括有机污染物降解中起到不可取代的重要作用。至今已从环境中分离到许多不同种属的芳香化合物降解微生物，并对降解微生物的重要生化、遗传和生理学特点以及降解代谢途径开展了大量富有成效的研究( d e o1 9 9 4 。d i a z2 0 0 1 。g i b s o n2 0 0 2 。m i s h r a2 0 0 1 ，p i e p e r2 0 0 1 ，r e i n e k e1 9 9 8 ) 。上述提到了许多苯胺降解菌已经被分离，从一些菌株的克隆到了苯胺降解相关基因，对苯胺代谢途径有了较明确的了解。1 2 1 苯胺降解基因簇的克隆迄今世界上只有少数4 5 个苯胺双加氧酶基因簇得到真正克隆并注释：p s e u d o m o n a sp u t i d au c c 2 2 砌遘因簇( t d n q t a i a 2 b r c i c 2 f g j i e k l ) ( f u k u m o i l1 9 9 7 ) ，a c i n e t o b a c t e rs p y a an 碰基因簇( a t d a i a 2 a 3 a 4 a s r s b c d e f g h ) ( t o s h i k i1 9 9 7 ) ，f r a t e u r as p e c i e sa n a - 1 8t d n 基因簇( t d nq t a l a 2 b r o r f 7 ) ( m u r a k a m ie t a l1 9 9 8 。2 0 0 3 ；s h u i c h i r o2 0 0 3 ) 和d e l f t i aa c i d o v o r a n ss p o r f m 基因簇( o r f t a b c d e f g h ) ) ( u r a t a2 0 0 4 ) ( 图1 一1 ) 。这些降解基因簇均位于质粒上，都含有l y s r t y p e调控基因。每个基困簇中前几个基因( 6 8 个) 位于同一操纵子上，包括编码多组分的苯胺双加氧酶的5 个基因以及调控基因。可见这些苯胺降解基因在遗传组织结构上具有极高的相似性。这种相同的基因组成表明上述苯胺降解基因可能来源于同一祖先( f u k u m o r i ，f e t d 1 9 9 ；m u r a k a m i 。se t a l l 9 9 7 ；v u j i i ，t e t a ，1 9 9 8 ；m u r a k a m i ，se t a 2 0 0 3 ) 。本研究室从污染环境中分离到一株能高效降解苯胺的细菌菌株d 班妇t s u r u h a t e n s i sa d 9 。最高能耐受4 5 0 0 i n g ，l 的苯胺以及在1 8 小时内完全降解起始浓度为l o o o m g 1 的苯胺。并从该菌基因组d n a 中克隆到完整的苯胺降解基因簇t a d q t a l a 2 b r d i c i d 2 c 2 e f g i j k l ( 图1 2 ) ，为首次报道染色体编码的完整的苯胺降解基因簇( l i a n g2 0 0 5 ) ，报道中其余得到的完整的苯胺降解基因簇均位于质粒中。其苯胺降解基因紧密连锁成簇，两侧由转座酶基因( i s l 0 7 1 ) 序列环绕，具有典型的基因岛( g e n e i s l a n d ) 特征。序列比对分析表明该基因簇与只p u t i d a u c c 2 2 的苯胺降解基因簇t d n在序列和遗传组织上有很高的同源性，认为f 叫基因簇是比t d n 基因簇更古老的基因型( l i a n g2 ( x ) 5 ) 3叶i 嗣农q p 科学院硕卜学伊论文第章引吉围1 - 1 不同菌种中的苯胺双加氧酶基因f i g u r e l la n i l i n e o x y g e l t a s c g e n e s f r o m d i f f e r e n ts p e c i e sp s e u d o m o n a sp u t i d au c c 2 21 9 9 7 年f u k u m o r ia c i n e t o b a c t e rs p y a a19 9 7 年t o s h i k if u j i i图i 一2 不同菌种中的苯胺降解基因簇f i g 1 1a n i l i n e d e g r a d a t i o n g e n e c l u s t e r s f r o m d i f f e r e n ts p e c i e s4中国农业科学院硕卜学位论文第一章引言1 2 2 苯胺降解代谢途径b a c h o f e r 等1 9 7 5 年证明了在诺卡氏菌通过加双氧反应形成邻苯二酚。b a c h o f e r , r1 9 7 5 年第一次提出苯胺降解的邻位裂解( 0 r t h o ) 一开环途径。b a c h o f e rr ，1 9 7 5 和l o i d lm ，1 9 9 0 i 正明了苯胺降解途径中邻苯二酚1 ，2 双加氧酶催化邻位裂解开环。h e i m , v1 9 7 9 第一次提出苯胺降解的间位裂解( m e t a ) 一开环途径。a o k ik 等人1 9 9 0 证明苯胺降解间位裂解途径的邻苯二酚2 ，3 双加氧酶作用。大多芳香族化合物的生物降解过程中，均生成称之为中心代谢中间产物一邻苯二酚，微生物在好氧条件下，降解途径的第一步是苯胺氧化成邻苯二酚( 图1 - 3 ) 。而邻苯二酚降解可以通过两种代谢途径，即邻位( o r t h o ) 和问位( m a a ) 代谢途径，分别由邻苯二酚l ，2 双加氧酶或邻苯二酚2 。3 双加氧酶催化。当苯胺通过邻位代谢途径时，在两个羟基之间切割邻苯二酚，再经多步反应产生三羧酸循环的中间代谢物琥珀酸和乙酰辅酶a 。当苯胺通过间位代谢途径时，在其中一个羟基的旁侧切割儿茶酚，最后产生丙酮酸和乙醛。假单胞菌属的某些菌株可以通过间位代谢途径降解苯胺。诺卡氏菌通过双加氧酶反应将苯胺转化为邻苯二酚，进而既可以通过邻位代谢途径也可以通过间位代谢途径降解邻苯二酚。m e y e r s 等人1 9 9 2 年还对苯胺降解酶进行了基因定位，发现假单胞菌的邻苯二酚2 。3 双加氧酶的基因可能定位于质粒上。时 i m 幽nq ：= o hh _ h o a n i l ka c i d圈i - - 3 芳香化合物生物降解成邻苯二酚是降解途径中的关键第一步f i g 1 3b i o c o n v e r s i o n o f m o n m t i c c o m p o u n d s i n t oc a t e c h o l i s t h e f i r s t k e ys t e ps c h n e l l s 等1 9 8 5 年报道，在厌氧条件下苯胺脱硫杆菌( d e s u l f ob a c t e r i u m a n i l i n o 首先使苯胺羧基化形成对氨基苯甲酸，然后进行还原脱氨作用。不同微生物降解苯胺的途径不同，表明苯胺微生物降解代谢的多样性。另外需要特别指出的5囟是，上述苯胺的降解代谢途径的研究都是通过测定细胞中所含的酶类来确定的，建立分子基础上的苯胺代谢途径仍鲜有报道。1 3 邻苯二酚双加氧酶的研究进展微生物可以降解芳香族化合物，根据微生物对氧的需求可分为好氧降解和厌氧降解。好氧降解以分子氧作为最终电子受体，而厌氧降解以除氧以外的物质如硝酸盐、硫酸盐、二氧化碳或铁等作为最终电子受体目前普遍认为单环芳烃和一些多环芳烃的降解途径一般是先生成中间产物，这些中间产物再降解为c 0 2 和h 2 0 ，从而进行有氧降解。需氧细菌中，邻苯二酚降解途径是由苯环转变为中心代谢物的主要途径，细菌可以通过间位裂解( m e t a ) ( 州i i ，t 甜讲1 9 9 ；z c y 既, j甜以1 9 8 5 ；l a t o r l 。j ，1 9 8 4 ；a o k i ，k 甜a l l 9 9 0 ；m e c l u r e , n ce la 1 1 9 8 6 ；k o n o p k a , a 甜a l l 9 8 9 ；f u c h s ，ke t a l l 9 9 1 ) 和邻位裂解( o r t h o ) ( a o k i ，k 甜a 1 9 8 4 ；m u r a k a m i ，se t a l 2 0 0 3 ；瞄i n ，s i 甜a l l 9 9 7 ；b o o n ，ne t a l2 0 0 0 ) 两种途径降解邻苯二酚( 如图i 一4 ) 。邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶是典型的间位氧化开环酶。也称作外二元醇双加氧酶，它催化邻苯二酚的间位裂解途径；邻苯二酚1 ，2 - - 双加氧酶是典型的邻位氧化开环酶，又称为内二元醇双加氧酶，它催化的是邻苯二酚的邻位裂解途径。它们的功能之所以不同，是由其活性中心的不同结构决定的。1 3 1 邻苯二酚1 ，2 - - 双加氧酶邻苯二酚1 刍双加氧酶属于内二元醇双加氧酶，它催化邻苯二酚转化为顺，顺粘糠酸，目前已在_ j 4 c i n e c t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u s ，p s e u d o m o n a ss p ，a c i n e t o b a c t e rl w o f f i i ，f r a t e u r i a ，a r t h r o b a c t e rs p 、( m e t ac l e a v a g e )m e t a p y r o c a t e c h a s eh o 介oc hc o o 一4 h y d r o x y - 2 - _ k e t o v a l e r a t el 、a c e t a l de b y d ep y r u v a t ehh( o n h oc i e a v a g e )h c = 妣8 。吣皂c o o c i s ，c i s - m u c o n a t ef o r ma t em u c o n o l a c t o r e毋一乇8 u c c i n a t o|c o o c o o l2 - k e t o a d l p a t ee n o l l a c t o n e2 - k e t o a d i p a t ea c e t y l圈1 4 芳香族化合物降解途径中邻苯二酚降解的邻位和问位途径f i g 1 - 4c a t e c b o li i x t a - = l do f m 0 - c l e a v a g ep a t h w a yi na r o m a t i cc o m l a o u n dd e 掣| d 撕6a l c a l i g e n e s 、b u r k h o l d e r i as p 、e h o d o c o c c l 口及s t r e p t c n y c e $ s e t o n i i 等菌株中克隆到邻苯二酚1 ，2 一双加氧酶基因( p a t e l ，r ne t a t l 9 7 6 ；n e i d l c , e l e t a t l 9 8 6 ) ，并纯化得到该酶。它可分为l 型和型两套邻苯二酚1 2 双加氧酶基因。型基因( c a t 2g e n e c l u s t e r ) 主要出现在氯代芳香族化合物的降解途径中，而i 型基因( c a t lg e n ec l u s t e r ) 几乎对氯代邻苯二酚没有降解能力( h a r a y a m a , s ，1 9 9 2 ) 已报道t a c i n e t o b a c t e r 蝴ik 2 4 、f r a t e u r i as p e c i e s a n a - 1 8 及b u r k h o l d e r i as p t h 2 中克隆到两套邻苯二酚l 玉双加氧酶基因，其结构组成比较见图1 - - 5 所示。我实验室也于2 0 0 3 年在分离得到的苯胺降解菌a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u sp h e a - 2 也是通过由c 1 2 0 催化的邻位裂解对苯酚进行降解的。c 1 2 0 q a 含有一个”辅基，大多数细菌中的c 1 2 0有不同的a ，b 亚基，另外还有一些则为单一肽链。b u r k h o l d e r i as p t h 2 是一株能够降解2 一氯苯甲酸( 2 c b ) 并经过邻苯二酚代谢途径的细菌。w e s t e r nb l o t 表明当t h 2 菌株只利用苯甲酸作为碳源时，邻苯二酚1 互双加氧酶c a t a l 和c a t a 2 都可以检测到；当t h 2 菌株只利用2 c b 或顺，顺粘糠酸作为碳源时，只能检测至0 c a t a 2 的活性。但是，当失活c a t 2 基因簇时，这时可以检测到c a t a l 的活性。研究表明，c a r l 基因簇和c a t 2 基因簇的调控因子对诱导物的不同识别导致了c a t a l 或者c a t a 2 的形成，c a t a l 的诱导物是苯甲酸而不是2 c b ，c a t a 2 诱导物是顺，顺粘糠酸或者中间代谢物。尽管c a t 2 基因簇对于在2 c b 生长的t h 2 菌株不是必需的，但是可以确定两套邻苯二酚双加氧酶基因簇对于菌株的生长及化合物的分解代谢都是有益的( s u z u k i ke ta 2 0 0 2 ) 。 1 w o f f k 2 4 a 矗)扁_ 招胁p a n a - 1 8 ( c 馨n )j l w m f f k “_ 妨胫_ 妇妇仲a n a 1 8 ( a 盘)c 2日砌一唯础鳓一c 藿鼗涵銎隧渤眦墨孓叫衙紫一纠滋移童蕃图圈别工垣工z 西胁如一刖触p 路洲喹蟊翟霞潞琵荔琵加棚r e e r y t h r o p o l i 。si c 啪p榨f 骞囫缓涵瀑卜田l - 5c a t g o n e d u g i c r 的结构比较f r a k 矧d a e t a l2 0 0 1 )f i g 1 - 5c o m p a r i s o n o f o r g a n i z a t i o n s o f c a t g e n t c l u s t e r7口一一中国农业科学院硕十学位论史第一章引言只p u t i d a 的蓬因簇的转录调控已有详细报道。c a t r 属于l y s r - q ，p e 调控蛋白转录调控蛋白家族。转录调控基因c a t r 位于c a t b c 操纵元的上游，通过c a t r 与c a t r c a t b c 启动子内调控区域的结合对c a t b c 进行转录调控。研究表明，邻苯二酚l ，2 - 双加氧酶( c 1 2 0 ) ，顺，顺粘糠酸内酯酶( c a t b编码) ，粘糠酸内酯异构酶( f c 编码) 由一个共同的诱导物顺，顺一枯糠酸所诱导，无论顺，顺一粘糠酸存在与否，c a t r 都可以结合到启动子内调控区域，但只有在诱导物的存在下才可以激活c a t b c 的表达( o r n s t o n , l n ，1 9 6 6 ；r o t h m e l ，r k e t a 1 9 9 0 ；r o t h n z l , r k e t a 1 9 9 1 ：p a r s e k , m re t以1 9 9 2 1 。1 3 2 邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶邻苯二酚2 ，3 - 双加氧酶属于外二元醇双加氧酶，它催化邻苯二酚转化为2 一羟基己二烯半醛酸( 2 - - 羟一粘康酸半醛) 目前在a c h r o m o b a c t e r x y l o s o x i d a n s ，a z o t o b a c t e r v i n e l a n d i i 、a l c a l i g e n e se u t r o p h u s ，p s e u d o m o n a s p u t i d a ，p s e u d o m o n a ss p ，a l c a l i g e n e ss p ，c o m a m o n a ss p 、r h o d o c o c c u $r h o d o c h r o u s 及b a c i l l u st h e r m o l e o v o r a n s 等菌株中克隆到邻苯二酚2 ，3 - 双加氧酶基因( c h a t f i e l d1 9 8 6 k e i l1 9 9 0 ) 。c 2 3 0 也属于一种金属蛋白，在金属离子参与的条件下，才具有活性。目前发现3 种不同类别的c 2 3 0 ，它们分别含有f e ”，m n 2 + ，m g “活性中心( 季朝能2 0 0 0 ) 。1 3 3 邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶结构根据研究得出，邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶是由四个相同亚基构成的四聚体。每个亚基是由c端结构域和n 端结构域两个结构域构成的。每个结构域是由两个结构相同的陬b p b 模体结合组成邮桶状结构。c 端结构域的p 桶状结构提供了与金属离子结合的所有配位体，并组装活性中心( m a t h e w2 0 0 0 ) 。a k i l , o 等人通过构建i 2 a 家族与i 2 b 族的杂合体也证明了c 2 3 0 中c 端结构的重要性。c 端结构参与了四聚体的形成，从而使蛋白具有活性( a k i k 0 2 0 0 3 ) 。此外，在邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶大家族中，有7 个保守氨基酸残基，h i s - 1 7 6 , l e u 2 0 3 ，h i s - 2 3 2 ，i - i i s l 2 5 1 ， 1 3 , r - 2 9 3 。p r o - 2 9 7 ，g l u - 3 0 3 。在这7 个氨基酸残基中除了p r o - 2 9 7 其余阶都是金属蛋白中参与活性中心金属结合位点的氨基酸残基。其中组氨酸残基在与金属离子结合上尤其重要0 e r o n e1 9 9 6 ) 。对邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶的蛋白晶体结构进行分析得出，i - i i s - 1 7 6 ，h i s - 2 4 1 ，g l u 一3 0 3 是亚铁离子的配位体。在c 2 3 0 中，除了常温邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶，还存在着一类可以耐受高温的耐热邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶( 张炜1 9 9 8 ) 。由于酶活性质不同，蛋白结构必定有所差别。它是由嗜热脂肪芽孢杆菌分泌产生的，具有较高的热稳定性。通过电感耦合等离子体( i c p ) 分析和酶激活及抑制实验，确定它是一种含m n ”活性中心的金属酶( 季朝能2 0 0 0 ) 。由于t d c d 具有较高的热稳定性，其蛋白结构肯定也有它的特点。该酶分子同样为同源四聚体结构，每个单位由相对独立的n 端结构域( 1 - 1 5 3 位氨基酸残基) 和c 端结构域( 1 5 3 3 1 9 位氨基酸残基) 构成。每个结构域含有两个在此类酶中具有特征性的陋p p b 结构，两个结构域可根据分子内非晶体学对称轴近似叠合( 姜涛2 0 0 1 ，d a i2 0 0 1 ，c h e r t1 9 9 8 ) 但是它的p r o - 2 2 9 对热稳定性有重要贡献姜涛2 0 0 1 ) 。1 3 4 不同来源的邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶及其性质自从1 9 6 1 年首次报道了来源于恶臭假单胞菌( p s e u d o m o n a ap u t i d am r - 2 ) 的邻苯二酚2 ，3 - -8中国农业科学院硕十学位论文第一章引言双加氧酶以来，人们对该酶引起了广泛的关注。目前，人们已从不同细菌中筛选到的邻苯二酚2 ，3 - - 双加氧酶的基因( 潘自铁2 0 0 0 ) ，甚至在深海中也有分布( b m s a 2 0 0 1 ) 。( 1 ) 假单胞菌邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶最初是在假单胞菌属中发现的p p u t i d ar m - 2 中的邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶位于t o l 质粒上( h a r a y a m a1 9 8 4 ) ，由x y l e 基因编码( z u k o w a k i1 9 8 3 ) 。枷基因有9 2 1个碱基对，基因中g + c k 较高，编码的邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶由4 个相同亚基构成，每个亚基的相对分子质量为3 5 k d a ，同时酶蛋白中还有亚铁成分( b c r t i n i1 9 9 4 ) 。由h i s l 5 3 、h i s l 9 9 、h i s 2 1 4 、h i s 2 4 6 、t y r 2 5 5 和g 1 u 2 6 5 组成活性位点的核心区。其中h i s l 5 3 、h i s 2 1 4 、g l u 2 6 5 和一个丙酮分子构成一个扭曲的四面体f e ( i i ) 结合区域，抑制剂的结合对该区域的构象没有显著影响。h i s l 9 9 的眯唑基帮助卜羟基转变为酮基，t y r 2 5 5 促进2 一羟基的质子化，而h i s 2 4 6 控制底物苯环的芳香( i s h i d a2 0 0 2 ) 。f e ( ) 与六个或者五+ n o 结合，其距离分别为2 0 5 和2 0 4 ( k i 忸1 9 9 7 ，b c t i n i1 9 9 4 。k i m1 9 9 9 ) 。恶臭假单胞菌g 1 3 1 含有一种特殊的邻苯二酚2 ，3 - - 双加氧酶，它可以转化3 一氯邻苯二酚和3一甲基邻苯二酚。同其它4 种相关邻苯二酚2 ，3 - - 双加氧酶相比，只有它能大量转化3 - - 氯邻苯二酚，并且不易被甲基邻苯二酚所灭活。该酶基因所在区域也包含编码铁氧化还原蛋白、移位酶和2 一羟粘糠酸半醛脱氢酶的基因( m a t s1 9