（植物营养学专业论文）细胞壁在植物耐铝和铝毒害机制中的作用.pdf

摘要 摘要 铝毒是酸性土壤上限制作物产量的关键因子之一。虽然有机酸分泌是公认的 铝排斥机制，但越来越多的证据表明细胞壁在植物耐铝性上起重要作用。铝毒害 的最初反应是抑制植物根系伸长，但其作用机制还不明确。本文首先研究了细胞 壁在荞麦抗铝毒上的作用；在研究有机酸与细胞壁相互作用的基础上，提出了有 机酸解铝毒的新的作用机制；为了进一步明确铝抑制根系伸长机理，利用果胶单 克隆抗体，研究了铝处理对玉米根尖果胶分布和细胞壁属性的影响；最后还利用 拟南芥根尖细胞特异报告基因，研究了铝处理对根尖不同组织细胞的影响。得到 以下主要结果： 1 细胞壁在荞麦耐铝性上的作用 通过对4 种耐铝性不同的荞麦品种的研究发现，其耐铝性的差异是与外部排 斥机理相关，但机酸分泌不能完全解释这一差异。进一步研究发现在无铝条件下， 耐性品种根尖果胶含量低于敏感品种，而铝处理提高所有品种的果胶含量，且根 尖果胶含量与铝含量呈显著的线性关系。利用果胶单克隆抗体，发现耐性品种 i a n g x i 具有较少的低度甲酯化果胶和较多的高度甲酯化果胶，且耐性品种 ji a n g x i 果胶甲酯酶活性低于敏感品种s h a n x i 。在水稻中也有类似的现象，说明 无论能否进行有机酸分泌，细胞壁果胶甲酯化程度均与耐铝性有关。细胞壁吸附 铝的动力学研究表明，敏感品种细胞壁能吸附更多的铝，且铝与之结合更加紧密。 以上结果表明荞麦幼苗耐铝性是与根尖细胞壁果胶含量，果胶甲酯酶活性、果胶 甲酯化程度及细胞壁对铝的吸附能力有关。 2 有机酸分泌能保护细胞壁与铝结合位点 铝诱导植物根尖有机酸分泌被认为是最重要的耐铝机制之一。一般认为，根 尖分泌的有机酸通过螯合根际土壤溶液中的铝而发挥其耐铝作用，然而对于根系 分泌的有机酸是否足够清除植物根系周围介质中的铝还存在争议。小麦、决明和 荞麦根尖铝处理后分别分泌苹果酸、柠檬酸和草酸。本文中，在相对根系伸长抑 制率在3 5 的条件下，小麦、决明和荞麦的铝处理浓度分别为10 、2 0 和50 “m ， 而此时它们有机酸分泌量分别为1 5 、2 0 和2 1 f l l l l 0 1c m 2 1 2h 。当加入外源有 机酸来减缓铝毒时，要想达到相同的解毒效果，苹果酸和草酸的加入量分别是柠 摘要 檬酸的8 倍和2 倍。按照此比例计算，苹果酸：柠檬酸：草酸的比例应为4 ：1 ： 5 ，这与实际分泌量有很大的差异。因此，单从有机酸与铝螯合角度不能解释其 在解铝毒上的差异，我们认为有机酸还有其他解铝毒机制存在。用l m m 苹果酸、 柠檬酸和草酸预处理细胞壁后，均能显著降低其对铝的吸附量，且三种有机酸之 间没有差异。这些结果表明，分泌的有机酸能通过减少细胞壁与铝的结合位点而 起到耐铝作用。 3 果胶半乳聚糖分布紊乱与铝抑制玉米根系伸长相关 铝毒害的最初反应是抑制植物根系伸长，然而其作用机制还不明确。本文中 我们运用果胶单克隆抗体( j i m 5 和j i m 7 ) ，研究铝处理对细胞壁果胶多糖的影响。 在无铝条件下，j i m 5 定位的果胶多糖同聚半乳糖( h g ) 在整个细胞壁都有分布， 但是在胞间隙分布最多。而j i m 7 定位的h g 均匀地分布在整个细胞壁周围。5 0um a l 处理3 , , i x 时后，玉米根系伸长被抑制了10 ，此时只有胞间隙有荧光显示。当 根系伸长抑制率在5 0 的情况下，这两种抗体都只在胞间隙有表达，荧光强度变 弱，而且不均匀分布。用l a 处理达到相同的根系伸长抑制率后，果胶抗体的分布 也有类似的变化。说明h g 的这种分布变化与根系伸长抑制具有很好的相关性。用 柠檬酸洗脱根尖吸附的铝后，果胶抗体的这种分布形式不受影响。因此，我们认 为铝诱导引起的h g 分布紊乱是铝抑制根系伸长的机理之一。 4 铝对拟南芥根尖特异报告基因表达的影响 根系生长受到抑制是铝毒的原初响应，但对铝毒对根尖不同细胞的影响尚没 有报道。本研究中我们利用拟南芥不同根尖细胞和生长素报告基因，以其说明铝 对根尖不同细胞及生长素分布的影响。g a l 4 - g f p 增强子捕获株系j3 4 1 1 能在根 冠柱细胞和侧根冠特异表达，铝处理后发现其在根冠柱细胞的表达降低，侧根冠 表达不受影响，说明根冠柱细胞的功能受到损害，这很好地解释了铝毒时主根生 长明显受阻，但侧根数量增多的现象。铝处理对q c 2 5 的表达没有影响，说明静 止中心功能保持正常，根尖细胞仍能正常分化，说明抑制细胞分裂不是铝毒的主 要原因。铝处理改变d r 5 - g u s 在根尖的表达，d r 5 是生长素的报告基因，说明铝 处理能影响根尖生长素的分布。 i v 关键词：铝毒耐铝机制细胞壁有机酸果胶抗体报告基因 摘要 a b s t r a c t a l u m i n u m ( a 1 ) t o x i c i t yi so n e o ft h em o s ts i g n i f i c a n tf a c t o r sl i m i t i n gp l a n tg r o w t ha n d c r o pp r o d u c t i o ni na c i ds o i l s a l t h o u g ha i - i n d u c e do r g a n i ca c i da n i o n ss e c r e t i o nh a s b e e np r o v e na so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tm e c h a n i s m so fa ir e s i s t a n c e ，i nr e c e n ty e a r s ， e v i d e n c es u p p o r t i n gt h eh y p o t h e s i st h a tt h er o o tc e l lw a l lp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei na i d e t o x i f i c a t i o ni sa c c u m u l a t i n g a li n h i b i t st h er o o te l o n g a t i o nw i t h i nf e wh o u r s ，b u t t h em e c h a n i s mo fa i i n d u c e di n h i b i t i o no fr o o tg r o w t hi ss t i l ln o tw e l lu n d e r s t o o d i n t h ep r e s e n ts t u d y , w ei n v e s t i g a t e dt h er o l eo fc e l lw a l lp e c t i cp o l y s a c c h a r i d e si n e x c l u d i n ga 1f r o mb u c k w h e a tr o o ta p e x w ec o m p a r e dt h eo r g a n i ca c i da n i o n s s e c r e t i o ni nb u c k w h e a t ，w h e a ta n dc a s s i at o r al ，a n dan e wa ir e s i s t a n tm e c h a n i s m w a sp r o p o s e dt h a to r g a n i ca c i da n i o n sp r o t e c t e dc e l lw a l lf r o ma l u m i n u mb i n d i n g t o i n v e s t i g a t et h em e c h a n i s mo fa 1i n h i b i t i o nr o o te l o n g a t i o n ，w eu s ep e c t i nm o n o c l o n a l a n t i b o d i e st os t u d yt h ee f f e c to fa lt r e a t m e n to np e c t i nd i s t r i b u t i o na n dc e l lw a l l p r o p e r t yo fm a i z er o o t f i n a l l yw ee x a m i n e dt h ee x p r e s s i o np a t t e r n so fd i f f e r e n t r e p o r t e rg e n e si nt h ea r a b i d o p s i sr o o tt i pu n d e ra 1s t r e s s t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 r o l eo fc e l lw a l if o ra lr e s i s t a n c ei nb u c k w h e a t f o u rb u c k w h e a tc u l t i v a r sd i f f e r e n ti na ir e s i s t a n c ew e r es e l e c t e di n t h i ss t u d y t h ea i c o n t e n t si nr o o ta p i c e so fa i - r e s i s t a n tc u l t i v a r sw e r el o w e rt h a nt h a ti na 1 - s e n s i t i v e c u l t i v a r s ，s ot h ee x c l u s i o nm e c h a n i s mw a si n v o l v e dh e r e p gt r e a t m e n t ，w h i c hi sa n o r g a n i ca c i di n h i b i t o r , i n c r e a s e dt h ea ic o n t e n t si nr o o ta p i c e so fa l lc u l t i v a r s ，b u tt h e s e n s i t i v ec u l t i v a ri n c r e a s e dm o r e ，s u g g e s t e dt h a to r g a n i ca c i d ss e c r e t i o nc a nn o tf u l l y e x p l a i nt h ed i f f e r e n ta it o l e r a n c e a l t h o u g ha lt r e a t m e n ti n c r e a s e dp e c t i nc o n t e n ti n r o o ta p i c e so fa l lc u l t i v a r s ，i tw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e ri na 1 一r e s i s t a n tc v j i a n g x it h a ni n o t h e rt h r e ec u l t i v a r s i r r e s p e c t i v e o f w i t ho rw i t h o u ta it r e a t m e n t s a ic o n t e n t si nr o o ts e c t i o n sw e r ep o s i t i v e l yc o r r e l a t e dt ot h ep e c t i nc o n t e n t l o c a l i z a t i o no fp e c t i nb yi m m u n o f l u o r e s e n c er e v e a l e dt h a ta i s e n s i t i v ec v s h a n x i h a dah i g h e rp r o p o r t i o no fl o w m e t h y l a t e dp e c t i na n dal o w e rp r o p o r t i o n o f h i g h - m e t h y l a t e dp e c t i nt h a na i r e s i s t a n tc v j i a n g x i t h ep m ea c t i v i t yw a s l o w e ri n j i a n g x it h a ns h a n x i w ef o u n dt h es a m ep h e n o m e n o ni nr i c e ，i n d i c a t e dt h a tw h e t h e r v 摘要 o r g a n i ca c i dw a ss e c r e t e dt h ed e g r e eo fp e c t i nm e t h y l a t i o ni sr e l a t e dt oa ir e s i s t a n c e t h ek i n e t i c ss t u d yw i t hr o o tc e l lw a l le x t r a c t e df r o m0 - 5m ms e c t i o ns h o w e dt h a tt h e t o t a la m o u n to fa ia d s o r b e dw a s h i g h e ra n dt h ed e s o r p t i o nr a t ew a sl o w e ri ns h a n x i t h a ni n j i a n g x i a l lt h ea b o v er e s u l t ss a t i s f a c t o r i l ye x p l a i nt h ed i f f e r e n c e i na i r e s i s t a n c eb e t w e e nt h e s et w oc u l t i v a r s ，w h i c hc o u l dn o tb ee x p l a i n e db yo x a l a t e s e c r e t i o n t h u sw ec o n c l u d e dt h a tc e l lw a l lp e c t i nc o n t e n t ，p m ea c t i v i t y , p e c t i n d e m e t h y l a t i o n ，c e l lw a l lb i n d i n gc a p a c i t yt oa ic o n t r i b u t et oa ir e s i s t a n c e i n b u c k w h e a t 2 o r g a n i ca c i dp r o t e c tc e l lw a l lf r o mb i n d i n ga l a l u m i n u m - i n d u c e ds e c r e t i o no fo r g a n i ca c i d sf r o mt h er o o ta p e xh a sb e e n d e m o n s t r a t e dt ob eo n em a j o ra lr e s i s t a n c em e c h a n i s mi np l a n t s h o w e v e r ，w h e t h e r t h eo r g a n i ca c i dc o n c e n t r a t i o ni sh i 。g he n o u g ht od e t o x i f ya li nt h eg r o w t hm e d i u mi s f r e q u e n t l yq u e s t i o n e d t h eg e n o t y p e so fa 1 一r e s i s t a n tw h e a t c a s s i at o r ala n d b u c k w h e a ts e c r e t em a l a t e ，c i t r a t ea n do x a l a t e ，r e s p e c t i v e l y i nt h ep r e s e n ts t u d yw e f o u n dt h a ta ta3 5 i n h i b i t i o no fr o o te l o n g a t i o n ，t h ea ia c t i v i t i e si nt h es o l u t i o nw e r e 1 0 ，2 0 ，a n d5 0l amw i t ht h ec o r r e s p o n d i n ga tt h er a t e so f1 5 ，2 0a n d2 1n m o l c m 2 p e r1 2h ，r e s p e c t i v e l y ，f o rt h ea b o v et h r e ep l a n ts p e c i e s w h e ne x o g e n o u so r g a n i c a c i d sw e r ea d d e dt oa m e l i o r a t ea 1t o x i c i t y ，t w o f o l da n de i g h t f o l dh i g h e ro x a l a t ea n d m a l a t ec o n c e n t r a t i o n sw e r er e q u i r e dt op r o d u c et h ee q u a le f f e c tb yc i t r a t e b a s e do n t h i sc a l c u l a t i o n ，t h em o u n t so fm a l a t e ，c i t r a t e ，a n do x a l a t ee x u d a t i o ns h o u l db ei nt h i s p r o p o r t i o n4 ：1 ：5 ，i ti sd i f f e r e n tb e t w e e nt h er e a le x u d a t i o na n dt h e o r e t i cs e c r e t i o n s o w e p r o p o s et h a tt h e r ea r eo t h e rr o l e so fo r g a n i ca c i d si na ir e s i s t a n c e a f t e rt h er o o t a p i c a lc e l lw a l l sw e r ei s o l a t e da n dp r e i n c u b a t e di n1m mm a l a t e ，o x a l a t eo rc i t r a t e s o l u t i o no v e r n i g h t ，t h et o t a la m o u n to f a ia d s o r b e dt ot h ec e l lw a l l sa l ld e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l yt oas i m i l a rl e v e l ，i m p l y i n gt h a tt h e s eo r g a n i ca c i d so w na ne q u a la b i l i t y t op r o t e c tt h ec e l lw a l l sf r o mb i n d i n ga 1 t h e s ef i n d i n g ss u g g e s tt h a tp r o t e c t i o no fc e l l w a l l sf r o mb i n d i n ga 1b yo r g a n i ca c i d sm a yc o n t r i b u t es i g n i f i c a n t l yt oa 1r e s i s t a n c e v i 摘要 3 p e r t u r b e dd i s t r i b u t i o no fh ge p i t o p e si si n v o l v e di nt h ea i - i n d u c e dr o o t g r o w t hi n h i b i t i o ni nm a i z e a ii n h i b i t sr o o te l o n g a i o nw i t h i nf e wh o u r s ，b u tt h em e c h a n i s mi ss t i l ln o tw e l lk n o w n h e r ew eu s ep e c t i nm o n o c l o n a la n t i b o d i e s ( j i m 5 ，j i m 7 ) t oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to ra l t r e a t m e n to np e c t i np o l y s a c c h a r i d ei nm a i z er o o t i nt h ea b s e n c eo fa i ，j i m 5e p i t o p e w a s p r e s e n ta r o u n dt h ec e l lw a l lw i t hh i g h e rf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ya tc e l lc o r n e r s l i n i n gt h ei n t e r c e l l u l a rs p a c e s ，a n dj i m 7e p i t o p ew a sp r e s e n tt h r o u g h o u tt h ec e l lw a l l h o w e v e r ，a3ht r e a t m e n tw i t h5 0 z ma ip r o d u c e d1 0 r o o tg r o w t hi n h i b i t i o ni nb o t h c u l t i v a r sa n dc a u s e dt h ed i s a p p e a r a n c eo ff l u o r e s c e n c ei nm i d d l el a m e l l ao fb o t h e p i t o p e s p r o l o n g e da it r e a t m e n t ( 2 4h ) w i t h5 0 r o o tg r o w t hi n h i b i t i o ni nb 7 3 ，a n a i - s e n s i t i v ec u l t i v a r ，r e s u l t e di nf a i n ta n di r r e g u l a rd i s t r i b u t i o no fb o t he p i t o p e s a ta 5 0 a i i n d u c e dr o o tg r o w t hi n h i b i t i o ni nn o n g d a 3 1 3 8 ( 1 0 0 z ma i ，9h ) ，a n a 1 - r e s i s t a n tc u l t i v a r ，t h ed i s t r i b u t i o no fh ge p i t o p e sw a sa l s or e s t r i c t e dt ot h el i n i n g o fi n t e r c e l l u l a rs p a c e s a l t e r e dd i s t r i b u t i o no fb o t he p i t o p e sw a sa l s oo b s e r v e dw h e n e x p o s u r eo fr o o t st o5 0 z ml a c l 3f o r2 4h ，w h i c hr e s u l t e di n4 0 o fr o o tg r o w t h i n h i b i t i o n c h a n g e si nh gd i s t r i b u t i o na n dr o o tg r o w t hi n h i b i t i o nw e r eh i g h l y c o r r e l a t e d w a s h i n gb yc i t r a t et or e m o v eo f ft h em o s t a ii nt h er o o tt i ph a d n oe f f e c t o nt h eh gd i s t r i b u t i o n t h e s er e s u l t si n d i c a t i n gt h a ta i i n d u c e dp e r t u r b e dd i s t r i b u t i o n o fh ge p i t o p e si sp o s s i b l yi n v o l v e di nt h ea i - i n d u c e dr o o tg r o w t hi n h i b i t i o ni nm a i z e 4 a ie f f e c tt h ee x p r e s s i o no fr e p o r t e rg e n e si na r a b i d o p s i sr o o tt i p s a 1s t r e s si n h i b i t sr o o te l o n g a t i o n ，b u tw h a tp a r t so fc e l l si n t h er o o ta p e xa r e i n f l u e n c e da n dw h e t h e ra u x i nd i s t r i b u t i o ni sa f f e c t e da r es t i l lu n c l e a r h e r ew et e s t e d t h ee f f e c to fa is t r e s so nt h ee x p r e s s i o no fd i f f e r e n tc e l la n da u x i nr e p o r t e rg e n e s t h e e n h a n c e rt r a pl i n ej 3 4 11 ，i nw h i c hg f pi se x p r e s s e di nt h ec o l u m e l l aa n dl a t e r a lr o o t c a p ，e x p o s u r et oa 1d e c r e a s e dt h eg f pe x p r e s s i o ni nt h ec o l u m e l l ac e l l s ，b u th a dn o e f f e c ti nt h el a t e r a lr o o tc a p ，i m p l y i n gt h a tt h ef u n c t i o no fc o l u m e l l ac e l l sh a db e e n d a m a g e d ，t h i sc a ns a t i s f a c t o r ye x p l a i nt h a tu n d e r a is t r e s s g e n e r a l l yr o o tg r o w t ho f p r i m a r yr o o t si si n h i b i t e dw h i l et h eg r o w t ho fl a t e r a lr o o t si se n h a n c e d t oi n v e s t i g a t e t h ei m p a c to fa lt r e a t m e n to nt h eq u i e tc e n t e r , w ee x a m i n e dt h ee x p r e s s i o no fa q c s p e c i f i cp r o m o t e rq c 2 5i n t h er o o tt i p ，w ef o u n dt h a tt h eg u s a c t i v i t yh a dn o v i i 摘要 d i f f e r e n c ew i t ho rw i t h o u ta 1t r e a t m e n t ，i n d i c a t i n gt h a ta 1h a dn oi n f l u e n c eo nq u i e t c e n t e rc e l l s ，w h i c hi si na c c o r d a n c ew i t ht h es u g g e s t i o nt h a ta 1m a i n l ya f f e c t sc e l l e l o n g a t i o nb u tn o tc e l ld i v i s i o n a it r e a t m e n tc a nc h a n g et h ee x p r e s s i o np a t t e r no f d r 5 - g u sw h i c hi sa na u x i n - r e s p o n s eg e n ei nt h ea r a b i d o p s i sr o o tt i p s ，i n d i c a t e dt h a t a it r e a t m e n tc h a n g e dt h ed i s t r i b u t i o no fa u x i n k e yw o r d s ：a 1t o x i c i t y , a 1r e s i s t a n c em e c h a i s m ，c e l lw a l l ，o r g a n i ca c i d ， p e c t i na n t i b o d y , r e p o r t e rg e n e v 1 1 i 目录 图表目录 第二章 图2 1 果胶网络结构，包括共价键( a ) 连接和离子键( b 、c ) 连接一2 0 图2 2 果胶甲脂酶的作用原理一一2 1 图2 3 果胶甲酯酶( p m e ) 的作用模式2 3 表2 1 植物果胶抗体种类一2 3 图2 4 果胶抗体与果胶多糖结合示意图2 4 图2 5 细胞壁结构图一- 2 6 第三章 图3 1 铝处理对荞麦根伸长的影响3 9 图3 2 荞麦根尖铝含量- 4 0 表3 1 荞麦地上部和地下部铝含量一- 4 0 表3 2 荞麦根尖。一5 r m 根段铝含量和细胞壁铝含量4 l 图3 3 荞麦根尖果胶含量一4 2 图3 4 不同根段果胶含量( a ) 和铝含量( b ) 4 2 图3 5 荞麦根尖细胞壁p m e 活性一一4 3 图3 6 果胶含量和铝含量的关系一4 4 图3 7ji m 5 和ji m 7 在两个荞麦品种( ji a n g x i 和s h a n xi ) 中的定位一4 4 图3 8 j i m 5 和j i m 7 在两个水稻品种( z h e f u 8 0 2 和n ip p o n b a r e ) 中的定位 4 5 图3 9 荞麦根尖细胞壁对铝吸附( a ) 和解析( b ) 动力学一4 6 第四章 图4 1 不同铝浓度对荞麦、小麦和决明根伸长的影响一5 7 图4 2 在3 5 根伸长抑制率情况下，荞麦、小麦和决明的有机酸分泌量5 8 图4 3 草酸、苹果酸和柠檬酸在改善荞麦、小麦和决明铝毒上的作用一5 8 图4 4 不同有机酸预处理对细胞壁铝吸附( a ，b ，c ) 和解析( d ，e ，f ) 的影响 一一一一一一一一5 9 第五章 图5 1b 73 和n o n g d a 3 13 8 的相对根伸长量一一7 2 图5 2ji n 5 和ji m 7 在b 7 3 根尖的荧光定位一一一7 4 图5 3j i m 5 和j i m 7 在n o n g d a 3 l3 8 根尖的荧光定位一一7 5 图5 4n o n g d a3 13 8 的相对根伸长量和j i m 5 、j i m 7 的荧光定位一一7 6 图5 5l a 处理对n o n g d a 3 13 8 根尖j i m 5 和j i m 7 分布的影响一一7 6 图5 6n o n g d a 3 13 8 根尖苏木精染色和j i m 7 荧光定位一一7 7 第六章 图6 1d r 5 根尖苏木精年口e v a n sb l u e 染色一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一8 6 图6 2d r 5 根尖g u s 染色一一一一一一一一一一一一8 6 图6 30 c 2 5 根尖苏木精和e v a n sb lu e 染色一一一一一一一一一一一一一一一一一一一8 7 图6 4q c 2 5 根尖g u s 染色一一一一8 7 目录 图6 5j 3 4 1 1 苏木精和e v a n sb l u e 染色 图6 6 j 3 4 1 1 在根尖的表达一一一 x l v - - - 8 8 - - - 8 8 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝耋三盘堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示i 身 意。 学位论文作者签名：签字同期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘堂 有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘鲎 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签名： 签字同期： 年月 日签字f l 期：年月同 致谢 致谢 本文是在导师郑绍建教授的悉心指导下完成的，从论文选题、研究方案拟定、 结果凝练、文章润色，都凝结着导师的心血。导师活跃的学术思想、严谨求实的 治学态度、忘我的工作精神、真诚乐观、宽容豁达的人生态度永远是我学习的楷 模。在郑老师的领导下，整个研究组中形成了浓厚的学术气氛，宽松的研究环境， 鼓励相互交流与合作。在这样一个充满智慧和活力的研究集体中学习、工作和生 活，使我受益终生。在论文完成之际，特此向思师表示崇高的敬意和由衷的感谢。 在攻读博士学位的期问，得到了浙江大学环境与资源学院的各位领导，资源 科学系各位老师的关心，指导和帮助，在此向他们表示感谢。 感谢生科院仪器与技术服务平台的陈汉民老师。陈老师在激光共聚焦显微镜 实验上给予我很多指导和帮助。 感谢课题组的全体成员。特别感谢杨建立师兄在试验设计、论文写作等方面 的热情指导和帮助。感谢已经毕业的金崇伟师兄、刘强师兄、尤江峰师姐、俞雪 辉师姐、张蕾、何李生、尤广奕等同学，也感谢在读的胡益婷，周圆、孟志斌、 章月皎、陈微微、莫基号、何向东、徐晓颖、彭友祥等同学，感谢试验室的兄弟 姐妹在研究、学习和生活中给予的热忱帮助。 感谢吴愉萍、腾一波、卢玲丽、沈晔娜、张婷、石艳军、王雅莉等在学习、 生活中给予的无私帮助和支持，为我五年的求学生涯增添了很多色彩和美好回 忆。 特别感谢我的爱人张中杰，我们双方的父母及亲人们，在我多年求学路上给 予的物质和精神上的大力支持和关爱。 感谢参加本论文评阅和答辩的老师，并敬请批评指正。 李雅颖 - 0 0 九年十二月于紫金港 1 1 引言 第一章植物铝毒害机制与耐性机制 铝( a 1 ) 在地壳中含量非常丰富，其重量百分比仅次于氧和硅，也是组成土 壤无机矿物的主要元素，约占土壤总量的5 - 15 。但迄今还没有证据表明它对 生物体具有重要的或是特殊的生理功能，相反，大量研究表明，它对生物体是有 毒性的。幸运的是，通常土壤中的铝以难溶性的硅酸盐或氧化铝形式存在，对生 物无毒；只有在酸性土壤条件下( p h 5 5 ) ，部分铝以离子态释放到土壤溶液中， 并对植物产生毒害作用，其中以a l3 + 形态毒性最强( k o c h i a n ，1 9 9 5 ) 。微摩尔级 的a l 就可以在短时间内( 几分钟) 对根系的伸长产生毒害作用，进而影响根系 对养分和水分的吸收，并最终导致农作物的减产、减收。因此，铝毒被公认为是 酸性土壤上影响农作物生产的重要限制因子之一。全世界约有4 0 以上的耕地 属于酸性土壤( k o c h i a n ，19 9 5 ) ，我国南方也有1 4 个省( 自治区、直辖市) 是酸 性土壤，面积达到2 1 8 万k m 2 ，占全国土地面积的2 2 7 ( 沈仁芳等，2 0 0 8 ) 除了自然成土过程导致的土壤酸化外，由于大气污染引起的酸沉降、农业生产中 大量施用生理酸性肥料、根系阴阳离子吸收不平衡、豆科作物连续种植等都加剧 了土壤的酸化，使酸性土壤的面积和酸性程度不断增加，农业生产上的铝毒问题 也有进一步加剧的趋势! 减轻或消除铝毒的农艺措施主要包括施用石灰、施用钙镁磷肥和施用有机质 等提高土壤p h 以降低土壤溶液中铝的活性，为植物生长提供良好的环境。但是 这些措施只能解决表土的铝毒问题，对心底层的土壤很难起到作用；此外，由于 上述的自然成土过程和人为酸化过程的影响，以提高土壤p h 来降低铝的活性的 农艺措施通常是不可持续的。目前认为培育和利用耐铝的植物基因型是持续、高 效地解决酸性红壤中铝毒害的有效途径( 严小龙和张福锁，1 9 9 7 ) 。经过几十年 的研究，我们对植物铝毒害和耐性的生理、遗传和分子机制有了深入的认识也取 得了很多阶段性的成果。特别是近年来，随着分子生物学技术的突飞猛进，研究 进度不断加快，20 0 4 年日本冈山大学的m a st u m o t o 教授所领导的研究小组从小 麦根尖分离和克隆到了编码铝诱导的苹果酸分泌转运蛋白的a l m t i 基因( s a s a k i 等，2 0 0 4 ) ，三年后，美国c o m e l l 大学的k o c h i a n 教授所领导的研究小组和日 浙江人学博l j 学位论文 本冈山大学的马建锋教授所领导的研究小组分别从高梁和大麦根尖分离和 克隆到编码铝诱导的柠檬酸分泌有关的m a t e 基因( m a g a l h a e s 等，2 0 0 7 ；f u r u k a w a 等，2 0 0 7 ) 。澳大利亚c s i r o 和日本冈山大学的研究者已成功地将a l m t j 基因转 入对铝敏感的大麦品种，转基因大麦在获得了铝诱导分泌苹果酸的性状的同时， 抗铝性得到了大幅度的提高( d e l h a i z e 等，2 0 0 4 ) 。这一成功已充分表明将与抗 铝性密切相关的基因转入敏感性品种后，完全可以提高目标作物品种的抗铝性， 这让我们看到了通过转基因技术来解决酸性土壤铝毒问题的希望。 1 2 铝对植物的毒害 1 2 1 铝的结合位点 铝化学性质活泼，能与多种阴离子络合，如si o 。卜，c o ，2 、p 0 。3 。，s 0 。2 和f 。等； 也能与多种配体结合，如羧基( - c o o h ) 、羟基( - o h ) 和羰基( 一c o ) 等。因此 a l 在植物细胞上有多个作用位点( z h e n g 和y a n g ，2 0 0 5 ) 。a l 可以与细胞壁上的 果胶羧基结合( c h a n g 等，19 9 9 ；s c h m o h l 等，2 0 0 0 ；y a n g 等，20 0 8 ) ，使细胞 壁钢化，影响了细胞壁的组装和延展；与细胞膜上的