（分析化学专业论文）荧光探针在头发表面分析中的应用.pdf

摘要 摘要 环境中许多物理或化学因素可破坏头发角蛋白的主要构成成分胱氨酸，使其结构中 二硫键发生断裂转变为含巯基的半胱氨酸。本文采用对巯基敏感的荧光探针4 一氯- 7 一 硝基苯并恶二唑( n b d c 1 ) 与头发表皮的蛋白质巯基相结合而产生荧光的方法，来表征受 损头发中的巯基。采用超景深显微镜和荧光显微镜直接观察n b d c 1 在头发表面的吸附 与分布，并对n b d c l 吸附过程进行考察。在此基础上，采用荧光光谱法对头发表面半 胱氨酸进行荧光光谱分析并对反应的影响因素作探讨。此外，研究了罗丹明b 和亚甲基 兰两种荧光探针在头发表面的吸附情况。主要结论如下： ( 1 ) 与对照发样相比较，冷烫发样横断面产生高亮度的荧光环，表明n b d c 1 分子 是沿着表皮鳞片边缘和细胞膜复合体( c m c ) 区域浸入头发内部的。 ( 2 )以激发波长h x 4 2 0 m 对头发作荧光光谱扫描，结果经n b d c l 处理的冷烫发 样荧光光谱图出现一强发射峰h m 5 1 5n m 。说明n b d c 1 能特异性地与头发产生的巯基 结合。 ( 3 ) 通过研究反应体系p h 值、温度及时间等条件对n b d c 1 与头发巯基反应的影 响，发现p h4 5 、反应温度4 0 、时间5 0 分钟为最佳的反应条件。 ( 4 ) 罗丹明b 和亚甲基兰两种荧光剂在头发表面的吸附量随着荧光剂浓度的增大 而增大，直到达到吸附平衡。 关键词：头发；半胱氨酸；n b d c l ；荧光光谱法；吸附动力学 a b s 廿? a c t a b s t r a c t m a l l yp l y s i c 甜o rc h e m i c a lf a c t o r sc a i la 妇e c tt 1 1 ec y s t i l l ec o m p o n e n t si i lt l l ek e r a t i i lo f h u 加a i lh a i r ，w h i c hl e a d st 0t 量1 er a p t u r eo fd i s u i f i d eb o n d si nc y s t i n ea i l df o m sc y s t e i n e 谢t l l m e r c 印t og r o u p t h i sp a p e r 印p l i e saf l u o r e s c e n c e n ta g e n t 一7 - c m o r 0 4 一i l i t l o b e i l z o - 2 - o x a - l ，3 一d i a z o l e ( n b d c 1 ) 2 l sap r o b et 0a n a l y s i sc y s t e i n eo nh a i rt h e r e b yt oa s s e s st h ee x t e m o fl l a i rd 锄a g e ab j g m ys e n s i t i v eo p t i c a lm i c r o s c o p ya n dan u o r e s c e n tm i c r o s c o p y 、r c e m p l o y e dt 0o b s e r v e 让l ea d s o p t i o na i l dd i s t r i b u t i o no fn b d c lo n t 0h a i rs u r ：f a c e t h e a d s o r p t i o n1 【i n e t i c so fn b d c lo nh a i rs u r ：f a c ew 弱s t u d i e d b a s eo nt h es c u d i e sa b o v e ，t l l e f a c t o r sa f r e c t i n gt h er e a c t i o nb e t 、e e nn b d c 1a 工1 dc y s t e i r l eo nh a i rs u r f a c ew e r ei i e s t i g a t e d w i t h 戗1 em e t l l o do fn u o r e s c e n c es p e c 伽】m a l s ot 1 1 ea b s o r p t i o no frh o d 锄i n eba 工l d m e t h y l e n eb l u eo nh a l i r 、e r es t i l d i e d t h em a i nr e s u l t sa 】旧s 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4 ) t h ea b s o r p t i o n 锄o u n to f 鼬l o d 觚l i l l eba i l dm e t l l y l e n eb l u eo nh a i r 血c r e 2 u s e da s 也e i n c r e a s s eo f l ec o n c e n ：臼? a t i o no fn u o r e s c e n c ea g e n t k e y w o r d s ：h a i r ； c y s t e i n c ；n b d c l ；f l u o r e s c e n ts p e c 臼o s c o p y ；a d s o 印t i o nl ( i 1 1 e t i c s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是拳人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：互牡导师签名： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 头发是人体重要的皮肤附属组织，不仅具有一定的生理功能，而且有美化人体的重 要作用。由于美发之需要，有相当一部分人选择了烫发。比起别的蛋白质，毛发蛋白质是 比较不活泼。但毛发对沸水、酸、碱、氧化剂与还原剂比较敏感。在一定条件下，这些 因素会损伤毛发。从头发的化学组成和化学键角度来说，其中最为明显的改变是表皮二 硫键的断裂，一但被破坏任何化学或物理的方法都不能使其恢复到原来的构成。 1 1 头发的结构和化学组成 头发的主要成分为角蛋白( 约占8 0 以上) ，它是由毛干和毛囊二部分组成。毛干可分 为毛小皮( c u t i c l e ) ，皮质( c o r t e x ) 和髓质( m e d u l l a ) 三层。毛小皮为毛干的最外层，由3 层7 层毛小皮细胞围绕着毛干，每个毛小皮细胞的厚度为0 5 岬1 o 岬，长约4 5 岬，毛小 皮层的总厚度约3 陋5 陋，毛小皮细胞的结构又可分为上表皮，外表皮和内表皮，其 中上表皮和外表皮内含有丰富的高硫蛋白，能抵御外界物理和化学因素的影响。皮质紧 密地围绕着髓质周围。皮质细胞的直径约为2 岬3 岬，皮质细胞由许多粗纤维，细纤维 和原纤维组成。原纤维的直径仅2 l o 刁岫是由2 股3 股0 【螺旋的角蛋白组成；由许多原 纤维形成直径为8 1 0 3 岬的细纤维；再由许多细纤维构成粗纤维【l 】。上述这些纤维均被 包埋在由高硫蛋白组成的细胞基质中并组成非常紧密的纤维束，其角蛋白的组成中，低 硫蛋白占6 0 ，高硫蛋白占4 0 。皮质细胞的基质中含有色素颗粒，色素颗粒的多少决 定着头发的颜色。髓质位于毛干的中心，由2 层3 层多角形角化细胞成。除髓质细胞的 角蛋白结构为d 折叠以外，毛小皮和皮质细胞的角蛋白结构均为0 【螺旋，如图1 1 所示。 上奏皮 原纤 角蛋白 图卜1 头发的结构 f i g 1 1h a i rs t r u c t u r e 近年来的研究发现，除头发外有一层非极性脂质复盖以外，头发中还含有内部脂质， 江南大学硕士学位论文 它主要位于毛小皮细胞之间以及毛小皮与皮质细胞之间的细胞间隙中，称为细胞膜络合 物( c e l l i i l e mb r a l l ec o m p l e x ，简称c m c ) 【2 j 。c m c 的脂质分布占整个毛干纤维的5 7 ，是头 发的主要结构脂质，占头发质量分数的5 7 ，在毛小皮和皮质细胞之间的c m c 的厚 度约为2 8n m 。c m c 脂质与蛋自质结合形成脂蛋白，能围绕头发形成一个连续的网状结 构，起到对毛小皮细胞之间，毛小皮与皮质细胞之间的粘合作用。c m c 脂质与人表皮角 质层脂质类同，其主要组分为：c e r a m i d e s ，胆固醇硫酸酯，胆固醇，脂肪醇和游离脂肪 酸 1 】o 从头发形态学角度来说，一根完整的成形的头发包括三到四个组织部分，头发的表 面是一层薄的保护层，由扁平的薄片状细胞似鱼鳞重叠交盖，称为毛表皮。毛表皮的薄 片细胞厚0 5 阻，长约4 5 6 0 岬，其中5 岫暴露于头发表面。表皮层围绕着毛皮质， 毛皮质是头发的重量的主要组成部分，它由纺锤状细胞沿头发的轴排列而成。头发的皮 层细胞含有纤维状蛋白质。粗的头发通常含有一个疏松多孔的部分，称为毛髓质，位于 头发的中心。头发的第四个组织部分是细胞膜复合体( c m c ) ，其功能是在细胞之间起连 接作用，同时也是其它非蛋白物质扩散至头发的重要通道【2 】。头发表皮对决定头发的物 理性质起着关键的作用，而纤维内部皮质的作用较小【1 】。 毛表皮由外而内主要有四层：外表皮层、外角质层a 层、外角质层b 层和内角质层， 其结构如图1 1 所示。外表皮层位于毛表皮的最外面，厚约5 7 衄，外表皮层的最外面 是是一层由脂肪酸酯的混合物构成的类酯，也称f 层。f 层主要成分是由1 8 甲基二十碳 烯酸，f 一层之下则是含有亲水基团的蛋白质层。脂肪酸和蛋白质以酯键和硫酯键结合。 类脂的存在使纤维表面呈疏水性质【2 】。 头发主要是由不溶性的角质蛋白 所组成，角蛋白是由氨基酸组成的多 肽链【3 】。角质蛋白含有色氨酸、胱氨酸、 谷氨酸等1 8 种氨基酸1 4 】。 头发结构的稳定性是多肽链之间 各种作用力所决定。这些作用力包括： 盐键、氢键、二硫键、范德华力、共 价多肽和酯键。 ( 1 ) 氢键( c = o n h ) 氨基和邻近的羧基之间的结合可 形成氢键。虽然氢键是一种微弱的相互 ， 霸勰 图卜2 头发毛表皮结构示意图 f i g 1 2t h ef i 证u r eo fh a i rc u t i c l es t r u c t u r e 作用，但由于一条多肽链中可存在的氢键数目很多，所以它们也是多肽结构上一个重要 的稳定因素。 ( 2 ) 盐键( 一n h 3 十o o c 一) 亦称离子键。在多肽链的侧链间存在许多氨基( 带正电) 和羧基( 带负电) ，相互之间 因静电吸引而成键，即离子键。在p h = 4 5 5 5 的范围内( 等电点) ，两者的结合力最大。 头发角蛋白强度的3 5 与盐键有关。这种键很易被酸和碱破坏。 2 第一章绪论 p 加f ：? 吲3 rr h r ，善h冬h 。占h 2。占h 2 h r 1 c hc h c h c h 2 c h lii 叠o 。h 粕0 = c r 2 卞h宁h c h 2 s 焉h 2 f h 图卜3 头发中的键合结构 f t g 。 1 3t h eb o n d i n gs t r u c t u r e 王nh a i r 1 2 头发损伤的一般表征方法 在头发的形态学研究方面，於勤等人 6 7 】利用扫描电子显微镜( s e m ) 定性地揭示了头 发中毛小皮受损前后的表面形态学变化。研究发现：不同类型的损伤对头发表面造成的 影响是不同的。而随着头发损伤程度的增加，头发的表面孔隙增加，鳞片层厚度减少。 於勤等人还发现：随着头发损伤程度的增加，头发末端分叉情况会加剧。 从头发的化学组成和化学键角度来说，一般对损伤最为敏感的氨基酸是色氨酸、胱 氨酸和酪氨酸。其中最为明显的改变是二硫键的断裂，表现为胱氨酸含量的降低哺】。因 此可以通过蛋白质含量分析【9 】、氨基酸含量分析【1 0 1 、黑色素分析 1 1 1 2 】以及可以测定二硫 键断裂程度的汞溴红着色法【l 引、铜吸附法等方法来表征头发的损伤【l 引，也可通过检测十 八甲基二十碳烯酸( 简称1 8 砸a ) 的含量完成对头发损伤的检测【l j 。 另外，也有人采用润湿性来表征头发的损伤。早在1 9 世纪8 0 年代，y k k a m a c h 等人 江南大学硕士学位论文 【1 5 ，1 6 j 就开始研究头发与水的润湿性质，并试图以此来衡量环境等外在因素对头发的损伤 程度。他们认为头发的皮质细胞是亲水的，而表皮细胞由于脂质的存在是疏水的。清洗、 梳理、日光以及各种以美发为目的的化学处理( 如漂白、卷发等) ，都容易造成表面亲水 基团的增加。近年来的资料也表明，固液接触角能十分灵敏地反映固体表面o 5i u l l 深度 地化学性质【1 刀，通过测量纤维表面的润湿性，不仅可以表征头发损伤的影响，而且可以 考察表面活性剂、聚合物、硅油等头发调理剂对头发的调理作用l l 配。 近年来，随着科学技术和检测手段的发展，一些新的方法被应用于头发损伤的表征， 原子力显微镜( a f m ) 和头发的诱导化学发光( i c l h ) 方法技术也为头发损伤的研究提供 了新的技术手段。n c e n td u p r e s 等人【2 1 j 使用a f m 无触点式检测模型，对欧洲棕色无损 发其表面极性与纳米级润湿性间的相关性进行研究；s t e p h e nd 等人【2 2 】使用a f m 对环境 因素对头发表皮形态学的影响进行了研究。b e n 砌等人【2 3 j 贝0 通过自行创建的i c l h 方法， 检测了u v 对头发所造成的损伤，研究发现自由基和活性氧会对活细胞造成伤害，u v 诱 导产生的光子( 化学发光) 与头发的受损程度相关，此外，电烫和漂白处理后头发的受损 情况也与发束的光子发射相关。 1 3 固体材料表面分析的一般方法 1 3 1 固体表面结构分析的种类 电子束和离子能与表面发生相互作用，低能电子和离子具有1 2 衄的穿透深度， 对表面变化很敏感。因此许多能谱技术，如俄歇电子能谱、x 射线光电子能谱、二次离 子质谱、电子能量损失光谱和低能电子衍射等技术都能用于表面研究，但这些方法所给 出的信息一般是原子水平的，而且往往需要真空条件，与现场情况有一定的差别1 2 4 乃j 。 光子的穿透深度较大，且表面光学的方法有分辨率高，对固一固、固一液和固一气 界面有普适性等优点。因此一些光谱方法，如荧光光谱法，椭圆偏振法、红外光谱和拉 曼光谱、光声和光热光谱，等技术均能用于表面研究。 ( 1 ) 椭圆偏振显微实时成像分析技术旨在实时获取纳米尺度结构的表面或界面信息 和纪录快速动力学过程的测量和显示技术。该技术不仅能够大面积精确显示超薄膜的厚 度分布，而且能够用于生物分子表面的吸附以及分子间的相互作用过程的实时观察。呈 像椭圆仪可以实时检测在生物体外不同固体表面的物质吸收程度，它能够在免标记的情 形下侦测在蛋白质结合过程中薄膜的厚度。 ( 2 ) 红外光谱技术已发展成为界面结构研究中十分普遍和行之有效的方法。吸附分 子的红外光谱可以给出表面吸附物种的结构信息，并可得到在反应条件下吸附物种结构 的信息。现在红外光谱在催化剂表面吸附物种和催化剂表征方面得到广泛应用。 ( 3 ) 拉曼光谱方法。分子的振动有些出现在红外光谱，有些出现在拉曼光谱。因此 拉曼光谱可以获得不出现红外光谱的信息。红外光谱技术不适用于水溶液，拉曼光谱不 受水的干扰。自从采用激光光源特别是表面增强技术的出现，由于表面增强拉曼光谱有 很高的灵敏度，能检测吸附在金属表面的单分子层和亚单分子层的分子，又能给出表面 分子的结构信息，因此表面增强拉曼光谱被认为是一种很好的表面研究技术。 4 第一章绪论 ( 4 ) 光声光谱是本世纪七十年代初期重新兴起的高灵敏度光谱分析新技术。它适用 于透明、不透明，甚至强散射样品在紫外，可见，红外光区的光热性质研究，已在物理、 化学、工程材料、生物、医学等领域得到广泛的应用。光声光谱( 简称p a s ) 是一种光热 吸收光谱，当用一束调制后的( 或脉冲的) 单色光照射样品时，样品吸收以后，以无辐射 弛豫方式将吸收的光能部分或全部地转换成热，样品受热体积膨胀，产生以光源为中心 向外扩展的压力波，用置于其中的声传感器便可接收到光声信号。用波长扫描方法得到 样品的光声图谱可做定性分析。根据光声信号大小与物质吸光度成正比的关系进行定量 分析。p a s 在检测固体样品时，通常是将其放在含有空气并装有微音器的密闭池中，固 体样品吸收调制的( 或脉冲的) 单色光后，产生从固体吸收层到周围气体周期性的热流， 池内气体热膨胀收缩产生的压力波动可用微音器检测。 1 3 2 固体表面荧光分析法概速 固体表面荧光测定有两种方法：一种系直接测定固体物质表面的荧光；另一种系将 待测组分吸附在固体物质表面，然后进行荧光测定【2 6 】。 固体表面荧光测定有两种不同的型式，一为反射式，一为透射式。采用反射式时， 激发光源和荧光检测器同在样品的一边，一般互成4 5 0 角。紫外激发光聚集于固体表面 样品斑点上，样品发生的荧光经单色器散射后由检测器检测。采用透射式时，一般将样 品吸附在透明的薄层色谱板上，激发光源和检测器分处在样品的两边。紫外激发光经滤 光片除去可见光，聚集在样品斑点上而发可见荧光，荧光透过薄层板再经单色器色散然 后由检测器检测。在固体表面荧光测定中，待测物质吸附在固体物质的小颗粒上。入射 光进入固体物质而在颗粒的边界上发生多重反射，成为漫发射，发生的荧光也在颗粒之 间发生反射，形成了激发光和荧光两者的散射。在这样复杂的情况下，固体表面发生的 荧光强度除与照射面积和荧光物质的数量有关外，还受众多因素的影响，如散射光强度、 吸附层厚度、固体颗粒的大小、固体表面对激发光的吸收、测定的方式、观测发光信号 的角度等。 某些工作者曾对固体表面荧光建立模式以预测发光强度与吸附化合物的关系。例如， g 0 1 d m a n 提出下列方程式 r i o f l 3 l 。( ( 1 7 3 0 s x 奴)( 1 1 ) j + i o 产2 3 奴( 1 4 3 0 s x l 。( )( 1 2 ) 式中：r 为透射荧光的强度；r 为反射荧光的强度；i o 为初始激发光强度；q 为吸收 光转化为荧光的分数：k 为激发吸收光系数；s 为激发光的散射系数；x 为散射介质的厚 度。 h u r m b i s e 曾采用氧化铝和硅胶玻底色层板，以n - 己烷为流动相对荧蒽的固体表面荧 光进行研究，试验结果表明，在某些条件下，g 0 1 出1 1 a 1 1 方程式可用以预估校正曲线的线 性范围和第一个斜率的转折点。 但是，上述各种模式的建立均基于吸光系数，散射系数等因素，而未考虑到固体表 面基体于吸附物之间的相互作用及其性质与程度。近年来建立了表面敏化荧光法，在基 体表面上加上敏化剂，由于敏化剂吸收大量入射光，并将激发能量转移至荧光体，可使 5 江南大学硕士学位论文 难以检测的低浓度荧光体的荧光强度大为提高而使易被检测。 1 3 3 荧光光谱与荧光探针法 荧光光谱法是研究蛋白质分子构象的一种有效方法，它能提供包括激发光谱、发射 光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数，这些参数从各个 角度反映了分子的成键和结构情况口7 1 。通过对这些参数的测定，不但可以做一般的定量 分析，而且还可以推断蛋白质分子在各种环境下的构象变化，从而阐明蛋白质结构与功 能之间的关系【2 配引。 荧光探针技术利用蛋白质在和某些具有荧光特性的荧光剂结合，检测这些化合物在 不同蛋白质分子中量子产率、峰位及谱带的变化，就可探测蛋白质分子结合区的极性、 疏水性的大小，从而推论构象的稳定情况及变化等。该方法的最大特点是具有高度的灵 敏性和极宽的动态响应范围。荧光探针物质之所以可被用来研究蛋白质的构象，主要是 因为其具有特殊的光物理性质，如在不同极性介质中有着不同的光谱特性( 即不同的峰 值波长) ，不同的荧光量子产率和荧光寿命等【3 0 3 1 1 。 ( 1 ) 蛋白质的荧光光谱。 在蛋白质分子中，能发射荧光的氨基酸有色氨酸( 唧) 、酪氨酸( t y r ) 以及苯丙氨酸 ( p h c ) 。个别蛋白质分子含有的黄素腺嘌呤二核苷酸( f 如) 也能发射荧光 2 8 】。唧、t ”以 及p h e 由于其侧链生色基团的不同而有不同的荧光激发和发射光谱。其中砸的荧光强度 最大，研次之，p h e 最小。因为蛋白质的荧光通常在2 8 0i l i l l 或更长的波长被激发，p h e 在绝大多数实验条件下不被激发，所以很少能观察到p h e 的发射。这样蛋白质的内源荧 光主要来自邱和聊残基。m 残基对微环境的变化很敏感，并且大多数蛋白质都含有几 个不同的研残基，因而常作为内源荧光探针来研究溶液状态下蛋白质的构象。除测定 蛋白质分子的自身荧光，即“内源荧光外，还可以利用荧光探针，即“外源荧光”。但是 其内源光谱的灵敏度很难满足痕量分析的要求，人们就借助于能与蛋白质发生作用的小 分子( 其中包括无机离子、有机小分子或络合物) 作为光谱探针，通过他们与蛋白质作用 时光谱的改变来提供蛋白质的信息。基于荧光剂和蛋白质的结合用于蛋白质的检测是最 为广泛的分析方法，它具有简便、快捷、经济等特点，越来越受到人们的普遍关注。 ( 2 ) 蛋白质荧光探针及主要类型。 蛋白质荧光探针的类型主要分为有机小分子、无机离子、金属离子配合物，量子点 等口引。荧光标记蛋白的原理是荧光标记试剂与蛋白所带的巯基、氨基及羧基等基团发生 置换或缩合反应连接在一起。常用的蛋白质荧光探针有：邻苯二甲醛( o p a ) ，4 氟7 硝 基苯并恶二唑( n b d f ) ，荧光素异硫氰酸酯( f i t c ) ，3 呋喃甲酰喹啉2 羰醛( f q ) ，4 氯7 硝基苯并恶二唑田d c 1 ) 【3 引。 ( 3 ) 探针的选择 在溶剂与蛋白质分子的作用过程中，有两种相互作用导致荧光发射谱的红移或蓝移 j ，即荧光基团与周围溶液中引发的反应场间的偶极矩相互作用、荧光基团与一个或多 个溶剂分子间特殊的化学作用。 作为一个好的荧光探针应满足以下条件：探针分子与蛋白质分子的某一微区必 6 第一章绪论 须有特异性的结合，并且结合比较牢固；探针的荧光必须对环境条件敏感；蛋白 质分子与探针结合后不应影响其原来的结构和特性。 1 4 本文研究的主要内容 ( 1 ) 在本文的工作中，拟采用市售冷烫精处理头发，通过采用一种对巯基敏感的荧 光探针4 氯7 硝基苯并恶二唑( 7 c 1 1 l o r o 4 m 仃o b e n z o 一2 o x a - 1 ，3 d i a z o l e ，n b d c 1 ) 【3 3 】与 头发表皮的蛋白质巯基相结合的方法，以超景深显微镜和荧光显微镜直接观察荧光探针 n b d - c l 附着在头发表面和浸入头发内部所产生的荧光，用吸附动力学曲线间接考察荧 光剂浸入头发内部的情况。 ( 2 ) 用荧光探针n b d c l 直接标定固体头发表皮二硫键断裂产生巯基的方法。采用 荧光光谱法对比了未冷烫发样和冷烫发样与n b d c l 反应，以及冷烫发样未与n b d c l 反应的荧光图谱。并用荧光光谱法直接测定了固体冷烫头发表面二硫键断裂产生巯基的 情况，研究p h 值、温度及时间对反应的影响，探讨n b d c 1 在固体头发表面与巯基反 应的最佳条件。 ( 3 ) 研究罗丹明b 和亚甲基兰两种荧光剂在头发表面的吸附隋况，从荧光探针与头 发蛋白质基团的特异性结合出发，根据头发蛋白质中的其它基团，选择合适的荧光剂作 为荧光探针，为全面的了解受损头发角蛋白各个基团的变化打下基础。 7 江南大学硕士学位论文 第二章4 _ 氯一7 一硝基苯并恶二唑( n b d - c1 ) 在头发表面吸附的研究 2 1 引言 头发毛干可分为毛小皮、皮质和髓质三层，其主要成分为角蛋白，头发毛小皮角蛋 白是由高硫蛋白组成。一旦高硫蛋白受到破坏，严重的可导致头发的断裂。在现实生活 中，城市环境污染、紫外线辐照、烫发剂、染发剂、漂白剂以及头发的梳理( 洗发、吹 风和整理) 等均会不同程度地造成头发的损伤。头发受到上述各种物理化学因素的影响， 也会导致头发中c m c 含量的减少，结果会使毛小皮细胞脱落，毛鳞片翘起。在一定条件 下，这些因素会损伤毛发。从头发的化学组成和化学键角度来说，其中最为明显的改变 是表皮二硫键的断裂例，表现为胱氨酸含量的降低，及半胱氨酸含量的增加。因此头发 角蛋白二硫键断裂的情况一直被作为头发受损程度的评价标准。 n b d c 1 是稳定的无荧光淡黄色固体【3 3 ，3 4 1 ，易溶于有机溶剂。q l o s h & w k t e h o s e 1 9 6 8 年首次提出用n b d c l 做为氨基化合物的荧光衍生试剂 3 4 】，并且指出它与其它亲核 试剂特别是与巯基反应产生弱的荧光【3 4 ，3 5 1 。n b d c l 能够用于蛋白质中巯基，氨基和酪 氨酸羟基基团的改性，与半胱氨酸巯基基团反应并在一定区域内产生弱的荧光，可以通过 改变介质的p h 值来区分不同的反应，并且比以往的试剂更有优势【3 3 枷】。n b d c 1 与半 胱氨酸的反应机理见图2 1 。 本文采用冷烫损伤方式处理正常人头发，使角蛋白二硫健断裂产生巯基，用一种对 蛋白质巯基敏感的荧光探针n b d c l 【3 3 】来直接标定固体头发表面二硫键断裂产生巯基的 情况。 c y s t e i n e s u i f h y 山了in b d c 1 2 2 材料与方法 2 2 1 实验药品及仪器 ( 1 ) 实验药品 ， 恤i o e 也e r n 0 + 时+ c i - 旷 图2 1 半胱氨酸与n b d c l 反应 f i g 2 一lr e a c t i o no fc y s t e i n ea n dn b d c l 8 第二章n b d c l 在头发表面吸附的研究 表2 一l 药品及生产厂家 t a b 2 1 d r u gs n dm a n u f a ct u r e r ( 2 ) 实验仪器 表2 2 实验器材及生产厂家 t a b 2 2t h ee x p e r i m e n t a le q u i p m e n ta n dm a n u f a c t u r e r 器材生产厂家 s h z 8 8 a 往复式水域恒温振荡器 a l l 0 4 电子天平 荧光光扫描显微镜 i f d 一单人医用超净工作台 移液枪 p h 计 索式提取器 江苏太仓市实验设备厂 梅特勒公司 奥林巴斯 苏州吴江华宇净化设备有限公司 美国t o m o s 公司 s p e c 订c 1 1 i c sc o r p o r a t i o n ( u s ) 无锡精细玻璃仪器厂 2 2 2 头发样本的制备 ( 1 ) 头发的清洗 无任何美发或人为损伤史的黑色发样先用足量去离子水冲洗，去除头发表面灰尘等 污物，然后放于锡箔纸上晾干；干发适量采用索氏提取器用无水乙醚萃取4 小时，去除 头发表面油污后用超纯水清洗，置超净台中于室温下干燥，备用。操作中均带手套，头 发以塑料镊子拿取。 ( 2 ) 冷烫头发 用冷烫精处理醚洗过的未受损的头发，先取适量头发放于直径9c m 培养皿中用去离 子水完全润湿后，沥干多余的去离子水，加入适量的冷烫精，使头发均匀的浸于冷烫精 中，盖好培养皿，用保鲜膜将培养皿包裹严实，模拟一般的冷烫环境置于3 5 恒温水浴 中冷烫1 5 2 0 分钟，用去离子水冲净头发上的冷烫精，并在培养皿中自然晾干。 ( 3 ) 玻璃仪器的清洗 实验过程中所使用的玻璃仪器第一次使用都需用重铬酸浸泡。先用自来水冲洗干 净，再用去离子水冲洗，晾干，用重铬酸浸泡4 个小时，然后用自来水冲洗干净，最后 9 江南大学硕士学位论文 再用去离子水荡洗干净，收集在柜中留用。 2 2 3 船h l 溶液的标准曲线 实验中n b d c l 为c 1 = 1 o 1 0 。5m o ：，c 2 = 2 0 1 0 。5m o 。，c 3 = 5 o 1 0 。5m o 。， c 4 = 1 1 0 4 m o 儿，c 5 = 2 0 1 0 4 m o 儿的五种不同浓度的标准溶液，使用t u 1 9 0 1 双光束紫 外可见光光度计测定吸光度作出n b d c 1 溶液的标准曲线，如图2 2 所示。 c ( 1 l o 一5 m 0 1 l ) 图2 2n b d c l 溶液的标准曲线 f i g 2 2s t a n d a r dc u r y eo fn b d c ls 0 1 u ti o n 2 2 4 用超景深显微镜观察头发表面荧光剂的分布 用超景深显微镜观察前面用不同p h 值，不同温度，不同时间处理过的冷烫头发表面， 通过观察头发表面荧光剂的分布位置，来判断荧光剂浸入头发的途径。 2 2 5 用荧光显微镜观察头发的横断面 取头发用羊毛包裹，将其固定在纤维切片机上。调节切片厚度旋钮，涂上火胶棉， 固定头发与羊毛的横截面。待火胶棉完全干透后，用薄刀片快速切出纤维的横截面，固 定在载玻片上。应用荧光显微镜观察头发横截面的切片并拍照。 2 3 结果与讨论 2 3 1p h 对n b d - c 1 在头发表面吸附的影响 取n b d c 1 母液，分别配成p h = 2 o ，4 5 ，6 o 的工作液，每一种p h 的工作液各取三份， 每份6 0m l 于1 2 5m l 棕色广口瓶中，分别在温度为2 0 ，4 0 ，6 0 恒温水浴振荡器 中与0 2g 未受损和冷烫受损的发样反应1 0m i n ，3 0m i n ，5 0m i n ，7 0m i l l 。将反应后的发 样置于用铝箔纸包裹外表面的培养皿中，冰浴，防止头发与残余的荧光剂的进一步反应， 在通风处自然阴干。 头发经冷烫将导致角蛋白氨基酸残基发生不同程度的量或结构的改变。选择合适的 荧光剂作为探针，利用其与头发表面蛋白质问的相互作用，间接获知冷烫对受损头发表 1 0 第二章n b d c l 在头发表面吸附的研究 皮的影响。为了研究荧光搡针在头技表皮上吸附后对头发荧光光谱的改变，以期间接获 知冷烫对头发表皮的影响，通过使用紫外- 可见分光光度法，研究不同p h 值的荧光剂在 冷烫处理过的头发上的吸附动力学，以期找出不同p h 值下的吸附动力学曲线的差异。 冷烫头发样本与不同p h 值下n b d c l 反应不同时间所产生的吸附动力学曲线如图 2 3 所示。由图中可以看出在同一时刻p h5 时反应的吸附动力学速率比p mo 和 口h = 60 都快，其中p h = 6o 的吸附动力学速率最低，可见p h 值过高时半胱氨酸可能与 n b d - c 1 形成s n b d ，n 柚d 和n ，s b i s _ n b d 三种衍生物，致使s n b d - 半胱氨酸浓度减 少；p h ；2 0 时可能由于p h 比较低导致了酸变性；因此p m5 是一个合适的选择性比较高 的p h 值。 mm 国2 3 不同p h 下n b 卜c l 在头发表面的吸附动力学曲线 f i g 2 3n n e t i c so f b d c 1s o r p t i o no nh a ir s u r f & c ei nd l f f e r e n t 口h 2 3 2 期d _ c l 浸入头发表皮的逢程 f 【g 2 40 p t l c a l ic r o s c o p eo fl i b d _ c l a d s o r 口c i o n0 nt h e h a ir s u r f a c e 用超景深显微镜观察冷烫处理过的头发表面吸附荧光剂的情况，如图所示。从图2 4 可以看出冷烫后头发磷片基本完整，相互交叠，如鱼鳞或瓦片一样重叠覆盖，自由端均 指向毛尖方向并包覆在人发纤维的表面。如以纤维表面完整磷片上的光亮作为基准的 臣 o 江南大学硕士学位论文 话，沿着磷片边缘有些分布杂散的特别亮的区域，结果发现荧光剂吸附并浸入头发内部 是沿着表皮鳞片边缘和细胞膜复合体( c m c ) 区域浸入头发内部的，与文献h 14 3 1 报道的一 致。 2 3 3 仰d _ c l 与受擅头发丘应并在其横断面上产生的荧光 n b d - c 1 浸入受损头发并在横截面上所产生的荧光如图2 - 5 所示。由图可见从左 到右，荧光发生的区域不断扩大。从a 图可见冷烫受损头发与n b d - c i 反应所产生的荧 光只发生在头发的外沿一圈：b 图可见冷烫受损头发与n b d - c 1 反应所产生的荧光已到 达头发内部；c 图可见冷烫受损头发的整个横截面都产生了荧光。 图2 5 受损头发用n b d c l 处理后其横断面切片的荧光显微镜观察 f l b 2 5f 1 u o r e s c e n t 叭c r o s c o 口yo b s e r v a t i o n o ft f a ns v e r s a i s e c o n s o fh a i ft r e a 【e dw ，t hn b d _ c l 头发主要是由不溶性的角质蛋白所组成。角质蛋白是由低硫蛋白和高硫蛋白组成， 舍有色氨酸、胱氨酸、谷氨酸等1 8 种氨基酸。荧光探针分子浸入头发表皮，经由内表 皮和c m c 到达皮脂，并最终到达头发的中心髓质口j 。冷烫头发组成结构的受损程 度不同，则n b d c l 浸入头发与巯基反应的程度也不同9 】。用荧光显微镜观察头发横断 面上n b d c l 与巯基反应所产生的荧光发射状况，来判断冷烫头发受损的区域和程度， 以及n b d c l 浸入头发表皮的情况。如果巯基与n b d c l 反应所产生的荧光只发生在表 皮，则冷烫头发的表皮受损，只有表皮上的胱氨酸的二硫键断裂：如果巯基与n b d c i 反应所产生的荧光发展到皮脂，则冷烫损伤进一步发展到头发的内部，内部胱氨酸的二 硫键也发生了断裂；如果巯基与n b d c l 反应所产生的荧光发展到髓质唧，则整个头发 受损。 2 4 小结 ( 1 ) 考察n b d - c i 在p h = 20 ，4 5 ，60 三种p h 值下与冷烫头发样本反应所产生的吸附 动力学，得出在同一时刻p h = 45 时反应的吸附动力学速率比p i - 2o 和p h = 6o 都快，其中 p h = 60 的吸附动力学速率最低，因此p h5 是一个合适的选择性比较高的p h 值。 ( 2 ) 用荧光显微镜观察头发横断面上产生荧光的情况。如果冷烫受损头发与n b d c i 反应所产生的荧光只发生在头发的外沿一圈，说明只有头发表皮受损；如果冷烫受损头 发与n b d - c l 反应所产生的荧光发展到头发皮脂，则损伤进一步发展到头发的内部；如 果头发的整个横截面都产生了荧光，说明整个头发受损。从超景深显微镜下我们也能观 察到荧光荧光剂分子是沿着表皮鳞片边缘和细胞膜复舍体( c m c ) 区域浸入头发内部的。 第三章头发表面化学性质的光谱学研究 第三章头发表面的化学性质的光谱学研究 3 1 前言 由于美发之需要，有相当一部分人选择了烫发。但毛发对沸水、酸、碱、氧化剂与 还原剂比较敏感。头发的成分主要是角蛋白质，比起别的蛋自质，毛发角蛋白质是比较不 活泼。但毛发对沸水、酸、碱、氧化剂与还原剂比较敏感。在一定条件下，这些因素会 损伤毛发。从头发的化学组成和化学键角度来说，其中最为明显的改变是表皮二硫键的 断裂 2 】，表现为胱氨酸含量的降低，及半胱氨酸含量的增加【8 】。固体头发表面二硫键断 裂产生巯基，这可能预示着二硫键数量和位置的改变，同时巯基基团对蛋白质构结构构 象非常重要，因此头发角蛋白二硫键断裂的情况一直被作为头发受损程度的评价标准。 一般头发机械性能的改变要求纤维结构大量的改变，如二硫键的大部分断裂或结晶0 【 螺旋相对含量减少，所以以往的机械的或膨胀测试对确定纤维表面的损伤度都不够灵 敏。本文首次建立了用荧光探针n b d c 1 直接标定固体头发表皮二硫键断裂产生巯基的 方法。 本文应用了一种对蛋白质巯基敏感的荧光探针n b d c l 【矧来直接标定固体头发表面 二硫键断裂产生巯基的情况。n b d c l 是稳定的无荧光淡黄色固体【3 3 ，3 4 1 ，易溶于有机溶 剂，比d n s c 1 易溶于水，是由b o u h o n 等人合成的，g h o s h & w h i t e h o s e1 9 6 8 年首次提 出用n b d c l 做为氨基化合物的荧光衍生试剂【3 4 1 ，并且指出它与其它亲核试剂特别是与 巯基反应产生弱的荧光 3 4 ，35 1 。尽管产生的荧光强度很弱，n b d c l 仍被b i r i 【e t t 等在1 9 7 0 年作标记巯基的荧光探针，用来研究磷酸化酶b 和3 磷酸甘油醛脱氢酶，并且它随后以 同样的方式用于其它的研究。s t l l c h b u 巧等人表明一种包含二分之一2 一吡啶n b d c 1 的 复合二硫化物衍生物，克服了n b d c 1 作为巯基基团荧光标记试剂的特异性和低荧光强 度的缺点【3 4 1 。1 9 7 1 年b 酞e t t 等和r n d a 分别以n b d c l 的反应作为一种烷基化试剂， 用于表现磷酸化酶b 的构象特征，同时1 9 7 3 年a l l e n & l o w e 研究表明它很可能成为一 种特别有用的反应探针1 3 4 1 。 n b d c 1 能够用于蛋白质中巯基，氨基和酪氨酸羟基基团的改性，与半胱氨酸巯基 基团反应并在一定区域内产生弱的荧光，可以通过改变介质的p h 值来区分不同的反应， 并且比以往的试剂更有优势【3 3 4 0 1 ，因此本实验用n b d c 1 做荧光探针，用来标记头发在 冷烫精处理后胱氨酸二硫键断裂所产生的半胱氨酸所含的巯基。n b d c l 与半胱氨酸的 反应机理见图2 1 。 本文采用市售冷烫精处理头发，确定荧光试剂n b d c l 与胱氨酸二硫键断裂后产生 的含巯基半胱氨酸的反应条件。 3 2 实验啷分 3 2 1 药品及主要仪器 ( 1 ) 实验药品 1 3 江南大学硕士学位论文 表3 1 药品及生产厂家 t a b 3 1 d r u g sa n dm a n u f a c t u r e r s ( 2 ) 实验仪器 表3 2 实验器材及生产厂家 t a b 3 2t h ee x p e r i m e n t a le q u i p m e n ta n dm a n u f a c t u r e r 器材生产厂家 s h z 8 8 a 往复式水域恒温振荡器 s h