（作物遗传育种专业论文）香蕉mumads2基因的功能鉴定.pdf

海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品或成果对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明 本声明的法律结果由本人承担 论文作者签名：匆j 啉 日期：如，年多月乡日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海 南大学 保密论文在解密后遵守此规定 论文作者签名： 知1 舻环 日期：沏，口年多月乡日 导师签名：专拿勘 日期：舢id 年g 月歹日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论 文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关 权益。回塞途塞埕銮唇澄厦i 旦坐生i 旦= 生i 睦生筮查 论文作者签名。刳护小 e i 簸j , 洳，o 年莎月多日 摘要 香蕉是世界上最重要的水果之一，被联合国粮农组织定为世界第四大粮食作物。香 蕉是一种典型的呼吸跃变型果实，其品质形成与调控是香蕉产业发展的关键科学问题， 对其生理学及分子生物学研究就成为研究的热点，对香蕉生产具有重要的理论和实践意 义。分离与果实成熟相关的基因进而对其进行功能鉴定就成为重要的研究手段，本研究 就是基于这一目的，在前期获得的一个m a d s - b o x 转录因子基因的基础上，利用模式植 物番茄进一步探讨该基因对果实以及其他重要农学性状的调控作用，从而揭示该转录因 子基因对香蕉生长发育、果实品质形成与调控的作用机理。 本实验室利用s s h 和e d n a 微列阵相结合的方法，首次克隆到香蕉果实中的一个 m a d s - b o x 基因，命名为m u m a d s 2 ( m u s am a d s - b o xg e n e ) 。生物信息学和芯片分析表 明，该基因编码的蛋白作为转录因子在果实采后早期上调表达。r t - p c r 分析表明，该 基因仅在香蕉生殖器官( 花和果) 中表达，在营养器官( 根、茎和叶) 中不表达，说明 m u m a d s 2 的表达具有器官特异性荧光定量p c r 分析表明，m u m a d s 2 在香蕉正常成 熟时，达到表达量最高值的时间在乙烯峰之前，说明该基因可能是乙烯的上游调控因子 所以，认为m u m a d s 2 可能在香蕉果实发育和乙烯生物合成过程中起作用 在此基础上将m u m a d s 2 克隆到植物表达载体p c a m b i a l 3 0 2 m g f p 上，在3 5 s 启动子驱动下，产生m u m a d s 2 g f p 融合蛋白。利用基因枪转化法将其转入洋葱表皮细 胞进行瞬时表达分析，结果表明，该基因所编码的蛋白主要定位于细胞核中，与亚细胞 定位的信息学预测结果相符，符合转录因子特性 为了进一步在植物体内研究m u m a d s 2 基因的功能，将该基因转入番茄，得到3 7 株t 0 代潮霉素抗性植株。抗性植株的p c r 检测结果表明，其中3 3 株表现为阳性。挑选 1 0 株表型变化明显的t o 代阳性植株进行s o u t h e r nb l o t 检测，共有8 株s o u t h e r nb l o t 检 测为阳性，而且获得的转基因植株插入的拷贝数也有所变化 选取转基因植株中的5 3 号株系( l 5 3 ) ，它代表了大部分转基因植株的形态特征 采用r t - p c r 的方法对m u m a d s 2 在l 5 3 不同器官的表达情况进行分析，结果显示，该 基因在转基因植株的根和叶中表达量最高，茎和果实中表达量较低，而在花和萼片中表 达量很低，甚至不表达进一步对l 5 3 的根系和不同时期的果实进行g f p 检测，结果 ” 显示，幼果果肉、绿熟果果肉、红熟果果肉和根系的细胞核中均能检测到不同程度的 g f p 荧光信号，但是根系中的荧光信号明显大于果肉。 对转基因植株进行表型观察发现，大部分转基因植株表现出矮化、生长紧凑、节间 短缩、丛生芽、叶片褶皱，颜色暗淡等明显的性状变化转基因植株种子数显著低于对 照，且部分植株表现出高度不育，而且转基因番茄的可溶性固形物含量明显高于对照 综上所述，m u m a d s 2 基因在转基因番茄中控制多个性状表现，而且因其表达部位 不同所引起的性状表现也有所不同在营养器官中表达，表现为生长受到抑制，而在生 殖器官中表达则引起不育、可溶性固形物增加等 为了迸一步确认这些表型变化确实是由于m u m a d s 2 基因的表达所引起的，以 p c a m b i a l 3 0 2 载体为基础，将m u m a d s 2 反向插入到3 5 s 启动子下游，g f p 基因上游， 成功构建了m u m a d s 2 反义植物表达载体，为后续进一步转基因验证功能奠定了基础 关键词：香蕉( m u s aa c u m i n a t al a a ag r o u pc v b r a z i l i a n ) lm u m a d s 2 , 转基因；番 茄 ， a b s t r a c t b a n a l l ai s0 n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf r u i ti nt h ew o r l d ，a n d i sr a n k e da st h ew o r l d s f o u m lm o s ti m p o r t a n tf o o dc r o p b e i n gat r o p i c a lf r u i t ，b a n a n ai sat y p i c a lc l i m a c t e r i cf r u i t a n dh a sp o o rs t o r a g ec h a r a c t e r i s t i c s m a n yr e s e a r c h e sh a v eb e e nf o c u s e do n b a n a n a p o s t h a r v e s t ，s t o r a g ep h y s i o l o g ya n dm o l e c u l a r b i o l o g y s oi s o l a t i n ga n da n a l y s i so fg e n e f u n c t i o ni nt h ef r u i to f b a n a n a sr i p e n i n ga r eb o t haf u n d a m e n t a lb i o l o g i c a li s s u ea n da h i g h l y p r o m i s i n ga p p l i c a t i o n w i t ht h ec u r r e n td e v e l o p m e n to f m o l e c u l a rb i o l o g y , s t u d i e so ng e n e r e g u l a t i o na r em o r e i nd e p t h ，w h i l et h et r a n s c r i p t i o nf a c t o ri sa ni m p o r t a n ta s p e c t a nm a d s - b o xg e n en a m e dm u m a d s 2h a sb e e ni s o l a t e df r o m b a n a n af r u i tb ys s ha n d d n a m i c r o a r r a ym e t h o do fc o m b i n i n ga n d i t se x p r e s s i o nw a su p - r e g u l a t e di nt h ee a r l ys t a g e o f b a n a n af r u i ta f t e rp o s t h a r v e s t e d b i o i n f o r m a t i c sa n dm i c r o a r r a ya n a l y s i ss h o wt h a t m u m a d s 2g e n ee n c o d i n gt h ep r o t e i na sat r a n s c r i p t i o nf a c t o rm a yp l a ya r o l ei nt h eu p s t r e a m o fe t h y l e n es i g n a l i n g r e v e r s et r a n s c r i p t a s e - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( r t - p c r ) a n a l y s i s s h o w st h a tm u m a d s 2i se x p r e s s e di n t h er e p r o d u c t i v eo r g a n sl i k ef l o w e r sa n df r u i t s ，w h e r e a s n 0e x p r e s s i o ni sd e t e c t e di nt h ev e g e t a t i v eo r g a n sl i k er o o t ，s t e ma n dl e a f t h e r e f o r e , t h eg e n e m a yb ea s s o c i a t e dw i t hb a n a n af r u i tr i p e n i n ga n de t h y l e n eb i o s y n t h e s i s a p l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp c a m b i a l 3 0 2 - m u m a d s 2w i t hg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n s w e r et r a n s f o r m e di n t oo n i o ne p i d e r m a lc e l l sb yg e n eg u nm e t h o d t h e r e s u l to ft r a n s i e n t e x p r e s s i o ns h e w e dt h a tm u m a d s 2g e n ew a sl o c a t e di nt h en u c l e u s w h i c hw a si nl i n ew i t ht h e s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o np r e d i c t i o na n dt h ec h a r a c t e r i s t i c so ft r a n s c r i p t i o nf a c t o r s t h ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp c a m b i a i3 0 2 - m u m a d s 2w a s t r a n s f o r m e di n t ot o m a t o - a sar e s u l t ，3 7g e n e t i ct r a n s f o r m a n tt op l a n t sw i t hh y g r o m y c i n - r e s i s t a n c e h a v eb e e n o b t a i n e d t h er e s u l to f p c rt e s ts h o w e dt h a t3 3g e n e t i ct r a n s f o r m a n tt op l a n t sw e r e p o s i t i v e s e l e c t i n gp l a n t so f o b v i o u sp h e n o t y p i cf o rs o u t h e r n b l o ta n a l y s i s ，t h er e s u l ti nt h e t r a n s g e n i cp l a n t sv e r i f i e dt h a tt h em u m a d s 2 h a sb e e ni n t e g r a t e di n t ot h eg e n o m e so ft o m a t o b yb o t hs i n g l e - c o p ya n dm u l t i c o p yi n t e g r a t i o no f t h et a r g e tg e n e r t - p c ra n a l y s i ss h o w st h a tm u m a d s 2e x p r e s s e si nr o o t s ，s t e m s ，l e a v e s ，f r u i t sp e t a l sa n d s e p a l so f5 3l i n eo f t r a n s g e n i et o m a t o t h ee x p r e s s i o nl e v e ri sh i g h e ri n r o o t sa n dl e a v e st h a n o t h e ro r g a n s 1 0 w e ri ns t e m sa n df r u i t s ，n oe x p r e s s i o ni sd e t e c t e di nt h eo r g a n sl i k es t e ma n d l e a g f pd e t e c t i o ni sa l s or e a c h e dt h es a n l er e s u l t m o s to ft h et r a n s g e n i ct o m a t oh a v eb e e nm a n i f e s t e dp h e n o t y p e ss u c ha ss h o w e dd w a r f , c o m p a c tg r o w t h ，i n t e m o d es h o r t e n i n g ，l e a f f o l d sa n dp a l e t r a n s g e n i ct o m a t os e e d sw e r e s i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h ec o n t r o l ，a n ds o m ep l a n t ss h o wa h i g hd e g r e eo fs t e r i l i t y , a n d s o l u b l es o l i d sc o n t e n tw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h ec o n t r 0 1 h i o nt h eb a s eo f p c a m b i a l 3 0 2 ，m u m a d s 2i sr e v e r s ei n s e r t e dd o w n s t r e a mo f 3 5 s p r o m o t e r , u p s t r e a mo fg f pg e n e t h ec o n s t r u c t e dv e c t o ri sn a m e dp c a m b i a l 3 0 2 - m 岫s 2 k e y w o r d s ：m u s aa c u m i n a t ala a a g r o u pc v b r a z i l i a nm u m a d s 2t r a n s g e n i ct o m a t o 摘要 a b s t r a c t 。 1 前言 目录 i i i i 1 1 香蕉产业的重要性。l 1 1 1 香蕉的食用价值1 1 1 2 香蕉的经济价值：。l 1 1 3 对我国热带农业的带动作用1 1 2 香蕉果实生长发育与品质形成的研究进展l 1 2 1 香蕉果实生长发育的基本规律l 1 2 2 香蕉果实品质的形成与成熟的关系2 1 2 3 香蕉果实生长发育相关基因的克隆情况。2 1 3m a d s - b o x 基因的研究概况。3 1 3 1 植物转录因子的结构及功能3 1 3 2m a d s - b o x 基因的分布：3 1 3 3m a i 岁s - b o x 基因的结构和分类4 1 3 4 植株m a d s - b o x 的功能。：。4 1 3 4 1 对花器官的发育调控4 1 3 4 2 控制开花时间。5 1 3 4 3 调控胚珠发育6 1 3 4 4 调控果实发育7 1 , 3 a 5 其它方面的作用。7 1 3 4 6 香蕉m a d s - b o x 基因的最新研究进展8 i a 番茄作为模式植物在研究植物果实中的作用8 1 4 1 番茄作为模式植物的特点8 1 4 2 植物转基因技术在鉴定基因功能上的应用8 1 5 本研究的目的意义9 1 6 技术路线：；9 2 材料1 0 2 1 植物材料。1 0 2 2 植物表达载体的构建1 0 2 3 菌株10 2 a 酶和其他试剂l l 3 方法l i 3 1 基于生物信息学m u m a d s 2 基因的亚细胞定位预测1 l v 3 2p c a m b i a l3 0 2 - m u m a d s 2 转化农杆菌；1 l 3 3 洋葱表皮细胞的分离。1 2 3 4 基因枪法转化洋葱表皮细胞_ 1 2 3 5 农杆菌介导番茄的遗传转化：1 3 3 6 转基因番茄总d n a 的提取- 1 3 3 7 转化番茄p c k 检测1 4 3 8 转基因番茄总r n a 的提取及c d n a 的合成：1 4 3 9 转基因番茄的s o u t h e r nb l o t 检测1 5 3 10i i - p c r 15 3 1 1 激光共聚焦观察g f p 在转基因植株的分布：1 6 3 1 2 转基因植株的表型观察、生理指标测定及数量性状统计分析表型观察1 6 3 1 3m u m a d s 2 反义植物表达载体的构建。1 6 4 结果1 7 4 1m u m a d s 2 蛋白定位特征：“；：1 7 4 2m u m a d s 2 转化番茄的结果1 9 4 3 转基因番茄的分子检测结果 4 4 胁删d 在转基因番茄l 5 3 不同器官的差异表达乙2 0 4 5 转基因番茄i , 5 3 的g f p 检测。2 l 4 6 转基因番茄1 , 5 3 的性状表现2 2 4 7 d 铂d 船反义植物表达载体的构建2 3 5 讨论。 2 4 5 1m u m a d s 2 蛋白定位于细胞核2 4 5 2m u m a d s 2 转基因番茄中营养器官的形态变化。：2 5 5 3m u m a d s 2 转基因番茄中生殖器官的变化2 5 5 4m u m a d s 2 转基因番茄中表达的时空特点2 6 5 5p c 心b 队1 3 0 2 讹 翻d s ：2 - a n t i 反义植物表达载体构建的目的与意义2 6 6 结论 参考文献 2 6 2 8 缩写词( a b b r e v i a t i o n ) 。= 4 j$c谢一。一一一一35 v l - j 上- l - l 刖舌 1 1 香蕉产业的重要性 1 1 1 香蕉的食用价值 香蕉果实皮色鲜黄，味芳香，无种子，剥食方便，适合大众需求，其食用价值主要 体现在：第一，香蕉含有丰富的维生素a 、b 、c 。据分析，香蕉的1 0 0 9 可食部分含维 生素( 2 2 4 7 r a g ，维生素b 1 0 0 2 m g ，维生素b 2 0 0 5 m g 。第二，香蕉具有重要的药用价值， 香蕉果实是低脂肪、低胆固醇和低盐的食物，对过度肥胖者、年老病人十分有利，对胃 溃疡、幼儿腹泻和结肠炎也有疗效。第三，中医利用香蕉治病。香蕉性冷，具滑大肠， 通大便的作用。它可以止咳润肺，通血脉，解酒毒，合金疮等。第四，香蕉可制成各种 加工产品，如香蕉炸片、香蕉粉、香蕉汁、香蕉酱及糖水罐头等。 1 1 2 香蕉的经济价值 香蕉和大蕉是热带、亚热带发展中国家的最重要作物之一，其经济价值主要体现在： 第_ ，香蕉是全球约四亿人的日常食物，被联合国粮农组织列为世界第四大粮食作物 ( p e n a r r u b i ae ta 1 1 9 9 2 ) 。第二，香蕉贸易是产蕉国家和地区换取外汇的主要方式。据统 计，2 0 0 2 年全世界香蕉的产量为6 9 5 1 万吨，其中大约2 0 8 用于出口贸易，比1 9 9 7 年增长5 ，出口值约4 3 亿美元。第三，香蕉的营养价值很高，含有丰富的维生素a 、 c 、b 6 以及大量的钙、钾和磷。第四，香蕉已成为热带农业的支柱产业香蕉在印度、 巴西、中国等地区大面积种植。 1 1 3 对我国热带农业的带动作用 目前，中国香蕉生产位于世界第三，占全球总产量的1 1 0 ，产地主要集中在华南地 区，分布在广东、广西、福建、海南、云南等省( 区) 。自2 0 0 0 年，我国香蕉产量维持 在5 0 0 万吨左右，已发展成为我国热区农业的重要组成部分，同时成为热区农民脱贫致 富的主要途径。进入w t o 以后，在国际竞争中，热带水果表现出比其它大宗粮食作物 及其产品更突出的竞争优势。因此热带水果的发展，可扩大出口或代替进口的潜力很大， 可能带动热带地区将农业的重心逐步向以热带水果为代表的热带作物转移。 1 2 香蕉果实生长发育与品质形成的研究进展 1 2 1 香蕉果实生长发育的基本规律 香蕉果实的生长模式属于单“s ”型，该类型的果实在开始生长时速度较慢，以后 逐渐加快，直至急速生长，达到高峰后又渐变慢，最后停止生长。这种慢快一慢生长 节奏的表现是与果实中细胞分裂、膨大、分化以及成熟的节奏相一致的。 香蕉果实生长发育主要分为以下几个阶段：第一阶段，自受精后到细胞分裂速度急 剧下降时。此阶段果实中的高分子物质和有机酸类物质迅速积累并达到最高浓度，低分 子物质含量极少，叶绿素具有一定光合作用，但同化产物不足自给，所需碳水化合物依 靠贮藏营养和初生叶供给。第二阶段，果实生长旺盛期直到呼吸跃变前呼吸值最低时为 止。此阶段细胞伸长，干物质增多，有机物质大量积累，碳水化合物和有机酸含量稳定 增加。成熟开始，淀粉含量下降，到采收时完全降解。第三阶段，生长基本结束。此阶 段完成一系列生理变化，如果肉软化、上色及产生芳香物质等。香蕉果实在此阶段呼吸 强度迅速达到高峰，称为呼吸跃变期( 金志强主编2 0 0 6 ) 。 1 2 2 香蕉果实品质的形成与成熟的关系 成熟是果实生长发育的一个特定阶段，一般是指果实生长停止后发生的一系列生理 生化变化达到可食状态的过程，它是影响果实品质和商品价值的关键因素。同时它也是 一个置于特定基因调控之下的有序代谢过程( g r i e r s o ne ta 1 1 9 8 5 ) ，涉及了一系列相互独 立的生化途径的协同工作( b r a n de ta 1 1 9 8 7 ) 。 香蕉是典型的跃变型果实( 曾骧等1 9 9 2 ) ，在呼吸跃变过程中，果实会发生一系列 生理生化变化，比如果肉中淀粉向糖的转化( h i l le ta 1 1 9 9 5 ) ，结构碳水化合物的酶促降 解( k o j i m ae ta 1 1 9 9 4 ) ，多酚的降解( m e n d o z ae ta 1 1 9 9 4 ) ，异戊二酸含量升高( h a r a d ae t a 1 1 9 8 5 ) 以及叶绿素的降解等。这些变化直接影响着果实的品质，如果实硬度、涩味、 香味、色泽及货架期( g i o v a n n o n ie ta 1 2 0 0 4 ) 。因此调控果实成熟对于改善果实品质具有 重要的作用。 1 2 3 香蕉果实生长发育相关基因的克隆情况 c l e n d e n n e n 等人通过差异筛选的方法，已经分离出一些在香蕉采后成熟不同阶段差 异表达的m r n a ，结果表明，采后成熟过程中下调的基因有与淀粉粒结合的淀粉合成酶 ( g b s s ) 基因，几丁质酶基因，凝集素基因和i i 型金属硫蛋白基因( c l e n d e n n e ne t a 1 1 9 9 7 ) ，而在成熟过程中上调的基因有：内切几丁质酶基因，b 1 ，3 葡聚糖酶基因， 类奇甜蛋白基因，抗血酸过氧化酶基因等( c l e n d e r m e nc ta 1 1 9 9 7 ) 。 m e d i n a 等分离到了与香蕉采后成熟相关的c d n a 编码的一些酶，这些酶涉及乙烯 生物合成，呼吸作用和细胞壁降解等( m e d i n ae ta 1 1 9 9 7 ) 本实验室利用s s h 和c d n a 微列阵相结合的方法，分离得到2 6 个在香蕉采后成熟 早期表达上调的基因( b ie ta 1 2 0 0 7 ) ，例如，克隆了谷氨酸脱羧酶( m a g a d l ) 基因的 c d n a 全长，组织特异性和果实采后正常成熟不同阶段表达结果显示，该基因在香蕉根、 茎、叶、花、果实中均有表达，果实中的表达量较高，正常成熟表达量的增加可能受内 源乙烯诱导并促进乙烯生物合成，推测该基因可能与果实成熟及乙烯生物合成密切相关 ( 胡伟等，2 0 0 9 ) 。 克隆了香蕉柠檬酸合酶基因( m a g c s ) 的c d n a 序列，在采后成熟早期的表达差 异分析，推测该酶可能与香蕉果实品质的形成有关( 迟光红等，2 0 0 9 ) 2 克隆了一个a s r 基因，命名为m a a s r l ，通过生物信息学分析表明，该基因可能在 植物的糖代谢、生长衰老、果实发育及非生物胁迫过程中起着重要作用( 赵宏亮等 2 0 0 6 ) ，利用基因枪导入洋葱表皮细胞瞬时表达分析结果显示，该基因所编码的蛋白作 为转录因子，具有核定位特性( 宁文彬等，2 0 0 8 ) 克隆了两个m a d s - b o x 基因，分别命名为m u m a d s l 和m u m a d s 2 ，并系统研究 了它们与乙烯之间的关系，结果表明，两个基因在果实采后成熟过程中，均受内外乙烯 诱导，且与乙烯生物合成有关，其中m u m a d s 2 基因的表达具有器官特异性，r t - p c r 分析结果显示，该基因仅在香蕉生殖器官( 花和果) 中表达，在营养器官( 根、茎和叶) 中不表达( l i ue ta 1 2 0 0 8 ；杨晓颖等，2 0 0 8 ) 。 - 1 3m a d s b o x 基因的研究概况 1 3 1 植物转录因子的结构及功能 转录因子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r , t f ) 也称反式作用因子，是指那些具有真核生物启动子 特定d n a 序列结合活性的蛋白质分子，或者是具有已知d n a 结合域结构特征的蛋白 质分子，其主要功能是激活或抑制基因的转录效应。植物各种诱导型基因的表达主要受 特定转录因子在转录水平上的调控。转录因子不仅在调节植物的生长发育及对外界环境 的反应等方面起着重要的作用，并且可以调控与之相关联的一系列功能基因的表达( 黄 泽军等2 0 0 2 ) 典型的转录因子含有d n a 结合区、转录调控区、寡聚化位点及核定位信号区等功 能区域，这些功能域决定转录因子的功能、特性、核定位及调控作用等。当环境条件发 生变化时，植物通过一系列信号传递，激发转录因子，转录因子与相应的顺式作用元件 结合后，激活r n a 聚合酶i i 转录复合物，从而启动特定基因的转录表达，最后通过基 因产物的作用对内、外界信号作出的调节反应。植物许多基因的表达都是由特定的转录 因子与特定的顺式作用元件相互作用调控的( 刘强等2 0 0 0 ) 。 其功能主要包括两个方面：其一是决定花分生组织的特性；其二是决定花器官的特 性。另外，还有一些植物的m a d s b o x 转录因子的功能是通过联合作用的方式，决定不 同花轮器官的特性( k a n g e ta 1 1 9 9 5 ) 。 1 3 2m a d s - b o x 基因的分布 m a d s - b o x 基因作为转录因子，最先确定的4 个成员基因分别是m c m l ( m i n i c h r o m o s o m em a i n t e n a n c e1 ) 、ag ( a g a m o u s ) 、d e f ( d e f i e i e n s ) 和刷矿( s e r u m r e s p o n s ef a c t o r ) ，取其首字母即构成m a d s 。m a d s b o x 基因广泛存在于动物、植物 和真菌中，是一个序列特异的调节基因家族，所编码的m a d s b o x 蛋白质是一种转录因 子，在生物体中通过调节其他基因的转录来发挥其调控作用。m a d s - b o x 基因是一个庞 大的家族，分布于整个基因组。例如，拟南芥中有1 0 7 个m a d s - b o x 基因，水稻中有 3 7 0 多个m a d s - b o x 基因( p a r e n i c o v a le ta 1 2 0 0 3 ；n a me ta 1 2 0 0 4 ；c a u s i e re ta 1 2 0 0 5 ；i r i s h e ta 1 2 0 0 5 ) ，番茄中有3 6 个m a d s - b o x 基因( h i l e m a ne ta 1 2 0 0 6 ) 。在多数植物基因组 中，存在着数量不等的m a d s - b o x 重复基因。拟南芥、金鱼草和矮牵牛的m a d s - b o x 基因家族最早得到深入的研究。此外，从其他处于不同进化地位的物种中也分离到了大 量的m a d s - b o x 基因。 1 3 3m a d s - b o x 基因的结构和分类 m a d s - b o x 基因家族成员根据序列结构特性可以分为t y p ei 和t y p e i i 两种类型 ( a 1 v a r e ze ta 1 2 0 0 0 ) ，包括a r g8 0 基因家族、m e f2 基因家族和m i k c 基因家族三大 家族( b e c k e re ta 1 2 0 0 3 ) 。其中，i 型基因只含有m a d s b o x 结构域( n a mc ta 1 2 0 0 4 ) ， 仅在真菌、动物中发现；而i i 型基因是由m a d s ( m ) 结构域、i n t e r v e n i n g ( i ) 结构域、 k e r a t i n - l i k e ( k ) 结构域和c a r b o x y l - t e r m i n a l ( c ) 结构域组成，属于结构域蛋白，称 为m i k c 类m a d s b o x 基因，并且是植物所特有的( m u n s t e re ta 1 19 9 4 ；f i s c h e re t a 1 1 9 9 5 ) 。 其中m a d s - b o x 区由5 0 6 0 个氨基酸残基组成的高度保守的结构域，位于基因编码 区的n 端，具有结合d n a 、蛋白质二聚化以及与其它因子结合的功能( s h o r e e ta 1 1 9 9 5 ) ， 是与d n a 结合的主要决定因子。k 区作为一个次级保守区域，含有7 0 个氨基酸，其一 级结构与角蛋白( k e r a t i n ) 同源而得名，二级结构分析表明k 结构域有3 个a 螺旋( k 1 、 k 2 和k 3 ) ，能在蛋白二聚体中形成两亲和性螺旋结构( y a n g e ta 1 2 0 0 3 ) 。在m a d s - b o x 区和k 区之间存在一段3 1 3 5 氨基酸的i 区，其保守性较低，含有较多亲水残基，可以 促进转录因子的蛋白二聚体与d n a 结合形成复合体。k 区下游是非保守的c 区，主要 由3 0 个氨基酸长度的疏水残基组成，可能作为m a d s - b o x 基因的转录激活区域，与 m a d s b o x 蛋白复合体的形成有关( e g e ae ta 1 1 9 9 9 ；h o n m ae ta 1 2 0 0 1 ) 。， 1 3 4 植株m a d s - b o x 的功能 m a d s b o x 基因在植物发育过程中起着重要的调控作用，特别是与植物花器官的发 育密不可分。在经典的植物花器官发育a b c 模型中，绝大多数的参与者都是m a d s - b o x 基因。另外，m a d s b o x 基因还在胚珠发育、春化、开花时间、分生组织特性、根分化、 叶的发育过程、果实成熟等方面起作用。 1 3 4 1 对花器官的发育调控 上个世纪九十年代，在对模式植物拟南芥、金鱼草、矮牵牛突变体和基因功能研究 的基础上，c o e n 和m e y e r o w i t z ( 1 9 9 1 ) 提出了花器官发育的a b c 模型( a b c m o d e l ) ( c o e n e ta 1 1 9 9 1 ) ，是控制双子叶植物花器官特征的3 组基因( f l o r a lo r g a ni d e n t i t yg e n e s ) ，其中 绝大多数是m a d s b o x 基因。a 类基因单独决定萼片，a 和b 类基因共同决定花瓣，b 和c 类共同决定雄蕊，c 类基因单独决定心皮的发育，而a 和c 类基因的作用是互相 拮抗的。在拟南芥中，a 类基因有a p i ( a p e t a l 4 1 ) 和a p 2 ( a p e t a l 4 2 ) ( m a n d e le ta 1 1 9 9 2 ； g o t oe ta 1 1 9 9 4 ) ，但是a p 2 并不属于m a d s - b o x 基因( p a r e n i e o v 矗e l ；a 1 2 0 0 3 ) ，而是一种属 4 于植物特异的小基因家族，其编码的蛋白也是一种转录因子( r i e c h m a n ne ta 1 1 9 9 8 ) ；b 类基因有4 p 3 ( 刎晒t a l a 3 ) 和用碑骆t i z z a t a ) ( g o t oc ta 1 1 9 9 4 ) , c 类基因有 a c ( a ：g 肼o u s ) ( y a n o v s k ye ta 1 2 0 0 0 ) 。在金鱼草中，a 类基因有s q u a ( s q u a m o s a ) ； b 类基因有d e f ( d e f i c i e n s ) 和g e d ( g l o b a s a ) ；c 类基因有p l e ( p l e n a ) 。在矮牵牛 中，b 类基因有p m a d s i 、p m a d s l f b p 3 和f b p lc 类基因有p m a d s 3 ( e c k a r d te t a 1 2 0 0 3 ) 。 在a b c 模型提出后，人们又在矮牵牛中发现了两个与胚珠发育相关的基因：f b p 7 和f b p l l ( a n g e n e n t e ta 1 1 9 9 5 ；c o l o m b oe ta 1 1 9 9 5 ) ，将其命名为d 类基因，作为胚珠 发育的主控基因( m a s t e rc o n t r o lg e n e ) ，而a b c 模型扩展为a b c d 模型( a n g e n e n te t a 1 1 9 9 2 ；c o l o m b oe ta 1 1 9 9 5 ) 。在拟南芥中，d 类基因为a g l i i ( s t k ) ( r o u n s l e yc ta 1 1 9 9 5 ； p i n y o p i c he ta 1 2 0 0 3 ) 。后来，m a n 等在研究拟南芥中s e p l 、s e p 2 、s e p 3 三个基因时发 现，除了在拟南芥花发育早期表达( m ae ta 1 1 9 9 1 ；f l a n a g a ne ta 1 1 9 9 4 ；m a n d e le ta 1 1 9 9 8 ) 以外，还决定各轮花器官的发育。分子遗传实验证明，s e p 3 的异位表达能够异位激活 么丹和a g ，说明s e p 3 具有激活b 基因及c 基因的功能( c a s t i l l e j oe ta 1 2 0 0 5 ) 。d i t t a 等 ( 2 0 0 4 ) 研究指出，a g l 3 在调控萼片及分生组织特性方面与s e p l 、s e p 2 、s e p 3 有功能 冗余，故将a g l 3 命名为s e p 4 。s e p l 、s e p 2 和s e p 3 三突变体的各轮花器官均转变为 萼片；而s e p i 、s e p 2 、s e p 3 和s e p 4 四重突变体的全部花器官被叶状体取代，这些结 果表明，s e p 基因对于a b c 类基因功能的表达是必需的，且在很大程度上作为桥梁连 接m a