（分析化学专业论文）血清蛋白的直接化学发光成像分析方法研究.pdf

北京师范大学硕士论文 摘要s 3 7 3 3 主 本文建立了聚丙烯酰胺凝胶皂泳一化学发光成像技术检测血湾蛋白的方法。主要研究了血清中 的两种蛋白：结合珠蛋白( h a p t o g l o b i n ，h p ) 和白蛋白( h u m a n s e r u m a l b u m i n ，h s a ) ，优化了 电泳及化学发光成像的条件。 利用本方法，可以成功地检测到不同类型的结合珠蛋白，并对其多态性进行研究。由于结合 珠蛋白可以与含有f e ( 1 i ) 的血红蛋白( h e m o g l o b i n ，h b ) 形成h b h p 配合物，从而催化鲁米 诺，过氧化氢发光体系，园此在实验过程中。可弘用血红蛋自作为探针，将不同人的血靖进行电泳 分离，然后用化学发光成像法检测。同时还研究了c u “、z 一、n r 、m 矿等不同金属离子对于 此检测体系的增敏作用，发现这些离子对于该体系都有不同程度的增敏作用，而且c u ”对于蛋白 谱带的位置影响也很大。我们还尝试了t i 0 2 纳米粒子、碳纳米管、聚苯乙烯纳米粒子对于血清蛋 白聚丙烯酰胺凝胶电泳行为及化学发光成像行为的影响。由于白蛋白也可以与血红蛋白形成 h b - h s a 配合物。而且此配合物对于鲁米诺一过氧化氢化学发光体系的催饨作用远远强于血红蛋白 本身，因此用本方法可以很灵敏地检测到白蛋白的存在，开辟了一条检测人血清白蛋白的新途径。 我们还研究了金属离子与白蛋白形成的m ”- l i s a 二元配合物及m ”h s a h b 三元配合物对于鲁 米诺- 过氧化氢化学发光体系的催化作用，其中c 0 2 + 增敏作用比较强；其他离子对于后者有增敏 作用，对于前者增敏作用不明显。此方法不但建立了新的检测人血清白蛋白的方法，而且可以反 过来利用自蛋白对于血红蛋白的增敏作用，用白蛋白来检测痕量的血红蛋白，同时在血红蛋白和 白蛋白复合物中可以加入金属离子进一步增敏。 本文在最佳条件下，尝试了本方法在定量方面的应用，测锝结合珠蛋白和白蛋白的检测限分 别是0 2 5g t g m l 1 和o 1 5g t g m l 一，比传统的考马斯亮蓝r 2 5 0 灵敏度提高了十几倍。同时分析 速度提高了近一百倍。本方法是一种灵敏度高、简单快速、背景低的检溺方法，而且设备简单， 很容易在一般生化实验室普及， 本文还进行了手性商效液相色谱法拆分弘阻滞j f ! 类药物对映异构体钓研究，在酰胺型手性固 定相上直接拆分了美托洛尔和比索洛尔的对映体，优化了拆分条件，讨论7 z 元流动相中1 2 二 氯乙烷和甲醇含量对丁1 分离的影响，并研究了温度和流速对于分离的影响。对于美托洛尔对映体， 优化的流动相组成为：v ( 芷己烷) ：v ( 1 。2 - 二氯乙烷) ：v ( 甲醇) = 6 5 ：2 5 ：1 0 对于比索洛尔 对映体，优化的流动相组成为y ( 正己烷) ：v ( 二氯乙烷) ：v ( 甲醇) = 6 0 ：3 0 ：1 0 。比较合适的 拆分温度为1 5 0 。c ，合适的流动相流速为0 6 0 0 m l m i t t ，洗脱顺序为r s 。通过实验结果，讨 论了拆分机理。 关键词： 化学发先成像，聚丙烯酰胺凝胶电泳，结令珠蛋自，自蛋白，血红蛋白；手性拆分，p i r k e 型手性固定相，美托洛尔。比索洛尔，高效液相色谱 北京师范大学硕士论文 a b s t r a c t i nt h i st h e s i s ，an o v e lc h e m i l u m i n e s c e n t ( c l ) i m a g em e t h o dd i r e c t l y d e t e c t i n gp r o t e i n s i n p o l y a c r y l a m i d eg e l sa f t e re l e c t r o p h o r e s i si sp r o p o s e d 1 1 1 i sm e t h o do f f e r st h ea d v a n t a g eo fq u i c ka n d s e n s i t i v ep r o c e d u r e sc o m p a r e dw i t ht r a d i t i o n a lc o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u er 2 5 0 ( c a a r 2 5 0 ) s t a i n m e t h o d s e v e r a lp r o t e i n si nh u m a ns e r u mc o u l df o r i l l c o m p l e x e sw i t hh e i n e g l o b i n ，w h i c hc o u l d c a t a l y z et h er e a c t i o no f l u m i n o la n dh y d m g e np e r o x i d e ，t h e nt w op r o t e i n s ，i n c l u d i n gh a p t o g l o b i n ( h p ) ( h p l 1 ，h p 2 2a n dh p 2 - 1 ) a n dh u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a ) 。p r e s e n ti nh u m a ns e r u mh a v eb e e n s e n s i t i v e l yd e t e c t e db y t h e p r o p o s e dm e t h o du s i n gh e m o g l o b i n ( h b ) 站ap r o b e w eh a v ea l s os t u d i e dt h ee f f e c to fs o m ec a t i o n so nt h el u m i n e s c e n c eo fh p ，h s aa n dt h e i r c o m p l e x e s c u 2 + h a sb e e nf o u n d t oh a v eg r e a te f f e c to nt h eb a n d s o f h b - h p a n dc 0 2 + h a s g r e a te f f e c to n t h el u m i n e s c e n c eo fh s a w e l l h b - h s a c o m p l e x t h ei n f l u e n c e so ft i o jn a n o p a r t i c l e s ，c a r b o n n a n o t u b e sa n dp o l y s t y r e n en a n o p a r t i c l a sh a v ea l s ob e e ns t u d i e d w ef o u n dt h a t t i n a n o p a r t i c l e sc o u l d i m p r o v e t h er e s o l u t i o no f s e r u m p r o t e i n si np a g e t h ec l i m a g i n gc o n d i t i o n si n c l u d i n gl u m i n e s c e n tr e a g e n t s , e x p o s u r et i m ea n dh bc o n c e n t r a t i o n h a v eb e e no p t i m i z e d 。u n d e rt h eo p t i m a l c o n d i t i o n s , t h ed e t e c t i o nl i m i t sw e r eo f 0 2 2u g m lf o rh pa n d 0 1 5p g n a f o r h s a c o m p a r i n g w i t h t h e t r a d i t i o n a l m e t h o d o f e b b - r 2 5 0s t a i n m e t h o d ，t h e s e n s i t i v i t y o f t h e p r o p o s e dm e t h o di sb e i n gi m p r o v e do v e r t e nt i m e sf o rh pa n dh s a t h e a n a l y s i st i m ed e c r e a s e d n e a r l yo n e h u n d r e dt i m e s d i r e c tl i q u i dc h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o n so ft h ee n a n t i o m e r so f m e t o p r o l o la n db i s o p r o l o lh a v e b e e nd e v e l o p e d ，u s i n g ( r ) - i - n a p h t h y l g l y c i n ea n d 3 , 5 d i n i t r o b e n z o i ca c i d 雒e h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e n e s e p a r a t i o n sw e r ea c h i e v e di nan o r m a lp h a s es y s t e me m p l o y i n gam o b i l ep h a s ec o n t a i n i n gn - h e x a n e ， l ，2 一d i c h l o r o e t h a n ea n dm e t h a n 0 1 c o l u m ne f f i c i e n c yw a s s t r o n g l yd e p e n d e n to nt h ec o m p o s i t i o no f t h e m o b i l ep h a s e ，1 1 1 ee l u e n tc o n t e n t so f m e t h a n o la n do f1 , 2 - d i c h l o r o e t h a n nw e r e o p t i m i z e d a n ds ow e r e f l o w - r a t ea n dc o l u m n t e m p e r a t u r e w ea l s od i s c u s s e d t h es e p a r a t i o nm e c h a n i s m t h r o u g hc o m p a r i n gt h e r e s u l t s k e y w o r d s ： c h e m i l u m i n e s c a n ti m a g i n g , p o l y a c r y l a m i d eg e te l e c t r o p h o r e s i s ( p a o e ) , h a p t o g l o b i n 。h u m a ns e t u n l a l b u m i n ，h e m o g l o b i n ；e n a n t i o m e r i cs e p a r a t i o n ，p i r l d e - t y p es t a t i o n a r yp h a s e ，m e t o p r o l o l ，b i s o p r o l o l ， h p l c 第一部分第一章文献综述 第一部分聚丙烯酰胺凝胶电泳直接化学发光成像法检测血清蛋白 第一章文献综述 一聚丙烯酰胺凝胶电泳概述 1 聚丙烯酰胺凝胶电泳( p o l y a c r y l a m i d e g e le l e c t r o p h o r e s i s ，p a g e ) 简介 p a g e 电泳是一种生物分离技术，它是用人工合成的凝胶作为支持介质的区带电泳方法。s r a y m o n d 和l w e i n t r a u b 在六十年代最早建立了此方法- 后来l o m s t e i n 和b j d a v i s 从理论和 实验技术上作了进一步的阐明和改进。其凝胶的单体为丙烯酰胺，交联剂为n n - 甲叉双丙烯酰胺， 单体通过人工控制聚合形成不同交联度的具有一定孔径大小的凝胶，从而对分子量及电荷不同的 生物大分子进行分离【l 】。 聚丙烯酰胺凝胶在电泳过程中有两个作用：a 作为一种支持物对抗电流；这些介质都是化学 惰性的，不会与样品发生反应，而且由于其高粘度和高摩擦力，可以将对流减到最小，有效地防 止扩散。b 主动参与样品的分离过程。由于聚丙烯酰胺凝胶是多孔物质，具有网状结构，其孔径 大小和生物大分子具有相似的数量级，因而具有分子筛效应。因此，用聚丙烯酰胺凝胶进行分离， 不仅取决于大分子的电荷密度，而且取决于分子尺寸大小。 p a g e 的基本方式有两种：圆盘电泳( d i s ce l e c u o p h o t e s i s ) 和平板电泳( s l a b e l e c t l o p h o r e s i s ) 。 平板型p a g e 又分为水平平板和垂直平板两类。蛋白质的等电聚焦和免疫电泳常采用水平板电泳 型式，而蛋白质的其他型式的区带电泳则采用垂直板电泳型式。根据凝胶浓度及凝胶缓冲液的口h 值又可以分为连续体系的凝胶电泳和不连续体系的凝胶电泳。前者凝胶孔径相网。矾值恒定， 只是离子强度不同，一般用于分离组分比较简单的样品，分辨率较低，但制胶快速简单，而且在 均一系统的电泳中，缓冲体系的精细组成已知且p h 值恒定，有利于分离对p h 敏感的化合物， 可以防止样品进入凝胶以后，由于p h 变化而发生凝聚和沉淀；此外，它不需要计算不同离子之 间的迁移率变化，所以对于任何不同的酸和碱都适用。不连续缓冲体系是指不同孔径和不同缓冲 系统的电泳，一般包括浓缩胶和分离胶由于浓缩胶的浓缩作用。样品在浓缩胶和分离胶的界面 上先形成一条窄带，然后在一定浓度或者一定浓度梯度的凝胶中进行分离。由于不同孔径凝胶的 分子筛作用，使不连续体系电泳的分辨率大大高于连续体系电泳。 2 不连续体系p a g e 的基本原理 不连续体系的凝胶浓度不一样，缓冲溶液的p h 值不一样。在不连续体系的电泳中。含有3 种离子、2 种不同孔径的凝胶、2 种或者2 种以上不同p h 的缓冲溶液前导离子一般常用c l 、 k + ；尾随离子和前导离子带相同电荷，但是迁移率较小；缓冲平衡离子是和前两种离子带相反电 荷的离子。前导离子只存在于凝胶中，尾随离子只存在于电极缓冲液中。凝胶体系包括浓缩胶 ( s t a c k i n gg e l ，上层或称为堆积胶) 和分离胶( s e p a r a t i n gg e l ，下层) 。分离胶的组成、孔径大 小和p h 值与浓缩胶不同，两层胶之间保持一个不连续的界面，上下两个电极的设置必须使样品 向下移动。一般来说，p h 值选择必须使迁移率满足下述条件： 前导离子 样品离子 尾随离子 第一部分第一章文献综述 开始电泳后，由于前导离子的迁移率大，在浓缩胶和电极缓冲液之间的界面上，前导离子很 快离开了尾随离子并向下迁移，同时在这两种离子之间造成一个低电导区，其结果是迫使尾随离 子加速迁移，而出现高电位梯度和低电位梯度之间一个稳定的并且向下移动的界面，样品的有效 迁移率正好介于前导离子和尾随离子之间，因此，在高低两个电位梯度的交界面上被浓缩成一薄 层。起始时，所加电压很大，由于浓缩胶孔径较大，所有样品分子迅速在浓缩胶中形成一个薄层。 随着电泳的进行。夹有浓缩样品薄层的稳定界面也开始向下移动，一旦进入分离胶，由于p h 值 不同，尾随离子的解离度变大，有效迁移率也随之变大，与前导离子的迁移率大致相同。此时前 导离子和尾随离子所夹的界面产生了新的电位梯度，被浓缩的样品的各个组分也就从这两层不连 续的凝胶界面开始，在一个固定的电场强度下，进行电泳迁移，按照各自分子的大小和电荷的不 同而获得分离。以上所述原理如图1 1 所示： 僻 “) l i l 诛哥始时i ( h 棒品进入琅拣麟麓 盎翦艟一俸基lt e 棒蕊遭入分嘏眭敞仆霹 图1 1 不连续体系电泳原理示意图 f i g u r e1 1 t h es c h e m a t i c o f t h e p r i n c i p l e f o r d i s c o n t i n u o u s e l e c t r o p h o r e s i s 3 p a g e 的特点和应用 使用聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白质的分离，由于分子筛效应，大大提高了电泳的 分辨率，不仅可以用于分离各种生物大分子的混合物，而且可以研究生物大分子的特性，比如电 荷、分子量、等电点以至于构象。 常规的p a g e ( c o n v e n t i o n a lp a g e ) ，是恒定的、非解离的电泳，在电泳过程中仍保持生物大 分子的天然构象、亚基之问的相互作用及其生物活性【2 】，用途广泛。与其他的电泳支持介质相比， p a g e 具有很多独特的优点：( 1 ) 由于凝胶本身是固态，而且其孔径很小，和蛋白质分子在同一个 数量级上，因此样品分子不易扩散。( 2 ) 可以随意控制凝胶浓度，根据需要制成不同孔径的凝胶。 由于样品分予尺寸不同，因此若妥达到一定的分离度，需要根据样品分子尺寸来确定凝胶浓度。 当样品分子尺寸比较大时。可以用浓度比较小的凝胶，这样凝胶孔径比较大；相反，当分子尺寸 比较小时，可以用浓度比较大的凝胶，小孔径的凝胶对样品分子可以达到更有效的分离。如果是 未知样品，可以选用浓度比较大的7 5 的均匀胶来进行初试。如果是复杂的混合样品，而且样 品尺寸相差比较大，还可以用有一定梯度( 可以是线性梯度或者是指数梯度) 的凝胶进行电泳， 通常从阴极到阳极，凝胶浓度逐渐增大，孔径变小，利用分子筛作用提高分辨率。表1 1 列出了 一些分子量和所选凝胶浓度的参考数据。( 3 ) 分子筛效应和电荷效应结合在同种方法中，使其 2 第一部分第一章文献综述 比任何一种单一效应更能提高分辨率。在连续缓冲系统中，主要取决于电荷密度，在不连续缓冲 系统中，主要取决于蛋白质的尺寸和形状，即分子筛效应。( 4 ) 电泳时不产生电渗，化学惰性比 较强。而且只要合成用的原料( 单体) 纯净，制成的多聚物重现性高，样品分离的重复性也比较 高。( 5 ) 可以根据需要把带有一定电荷的基团作为共聚体掺入其中，制成有一定特性的凝胶- 而 且在一定浓度范围内透明性好，机械强度好有弹性。( 6 ) 所需样品量极少，l 1 0 0 p g 已经足够 如果采用更灵敏的检测方法甚至可以检测出纳克级的样品。( 7 ) 用途广泛，可以对蛋白质、核 酸等生物大分子进行分离、定性、定量、少量制备、分子量测定以及等电点测定等( 8 ) 所需设 各简单、便宜。 表1 1 分子量和凝胶浓度的关系 t a b l e1 1t h er e l a t i o n s h i p b e t m e e n m o l e c u l a r w e i g h t a n d g e l c o n c e n t r a t i o n t ( c = 2 6 )t ( c = 5 ) 其中 r = 警x l o o c = 击x l o o a ：丙稀酰胺单体的量( g ) ；b ：甲叉双丙稀酰胺的量( g ) ； m t 缓冲液体积( 札) 4 p a g e 检测方法及其特点 ( 1 ) 染料染色法 常用的有氨基黑染色法和考马斯亮蓝染色法氨基黑染色法氨基黑是种含有两个 s o 担基团的酸性重氮化合物，能被结合到蛋白质的阳离子基团上但是使用氮基黑染色会给定 量测定带来一定的问题。这是因为：不同的蛋白结合不同量的染料【3 】。可以呈现不同的颜色，妇 兰黑色或者棕色【4 】，因此每个组分都要有自己的标准曲线；而且染色的不均一性和高背景使得氨 基黑染色得到的扫描面积不仅取决于蛋白量，而且也取决于迁移距离及周围的背景f 5 ，6 】。考 马斯亮蓝染色法。在各种蛋白质染色方法中。以考马斯亮兰染色最为常用，其检测灵敏度为0 2 o 5 p g 7 】。最常用的有考马斯亮蓝r 2 5 0 和( 3 2 5 0 j 考马斯亮蓝与不同蛋白质结合呈现褶同的颜色， 可以在比较宽的线性范围内与蛋白的量呈线性关系。染色过程一般需要3 1 2 小时。脱色过程6 2 4 小时。加温和搅拌可以加速染色和脱色过程。如果要得到背景脱色干净的结果。则脱色时间需 要更长。这种方法灵敏度比氮基熙染色法有所提高，而且简便，但是难以适应灵敏度要求较高的 检测，而且所需时间太长，难以适应快速检测的要求。其他染料染色法。苯胺黑和2 ，4 二硝基 氟苯，可以用于糖蛋白的染色【8 j ，阳离子碳化青可 ；主用于磷蛋白的染色【9 】。苏丹黑可以用于脂蛋 白的染色【l o 】，4 , 7 一二苯- 1 ，1o 菲咯啉可以用于血红蛋白等含铁蛋白的染色【1 1 】，茜素蓝s 可以检测 含铜蛋f i l l 2 。但是这些染色法都有一定的局限性。而且灵敏度都不是很高。 ( 2 ) 银染色法 第一部分第一章文献综述 银染色法在8 0 年代初由s w i t z e r 和m e m l 首先在“a n a l b i o c h e m 1 3 上介绍，后经o a k l e y 1 4 】 进一步发展，灵敏度比考马斯亮蓝染色法提高了1 0 0 倍。柳荣【1 5 】等报道了复合银染的方法，在 l m m 厚的聚丙烯酰胺凝胶上至少可检测出5 p g m m 2 的蛋白质。后来o h s a w a 等报道了【1 6 卜一种改 进的银染法，可检测1 0 。5 9 的蛋白，大大提高了蛋白检测的灵敏度。而且用改进的银染法，全过 程最短可以缩至1 5 2 小时，大大缩短了检测时间。但是银染法需要用到硝酸银，价格昂贵，代 价较高，而且很多蛋白用银染法染色后颜色不一样，所以定量时每种蛋白都要作出一条标准曲线， 比较麻烦。银染法对于染色过程控制严格，背景不容易做好，这在一定程度上影响了检测的灵敏 度，银染法还有一个缺点就是选择性不强。 ( 3 ) 同工酶染色法 常规p a g e 在电泳过程中可以保持蛋白的生物活性，包括酶活性，所以可以用同工酶染色法 检测。本方法适合大体积样品的分析，而且要分离度较大时方可使用。如果活性带紧靠，则会影 响检测。由于酶的活性容易丧失，所以电泳过程中一定要严格控制条件，选择合适的缓冲体系。 本方法局限性比较强，适用于特定的蛋白，而且步骤繁琐。 ( 4 ) 荧光探针法 荧光探针法实际上也是一种蛋白染色法，其特点是本身或者反应产物必须能发出荧光。这种 方法分为电泳前预标记和电泳后再标记两种方法。电泳前预标记一般用荧光胺，游离的荧光胺和 它的水解产物都不发荧光，只有它的蛋白标记物可以发出荧光，这样就不会有荧光背景的问题， 所以其灵敏度比较高，可以检测到5 r i g 的蛋白。它的缺点是会改变常规电泳和s d s 电泳中的迁移 率，而且荧光最多可以保持2 4 小时。荧光探剂2 甲氧基- 2 。4 - 二苯3 ( 2 h ) 峡喃( m d p f ) 1 7 1 标记蛋白时荧光可以保持几个月，而且线性范围比较宽。马来酰亚胺( d a c m ) 和p 邻苯二甲酸 二醛( o p a ) 【1 8 】也可以作为蛋白的预荧光标记，灵敏度比荧光胺提高了1 0 倍。o p a 和荧光胺【1 9 】 可用于电泳后再标记；o p a 和l 苯胺一8 - 蔡磺酸盐( a n s ) 【2 0 】可用于制备凝胶电泳后蛋白带的迅 速定位；【双( 8 - 对甲基氨基- l - 萘磺酸盐) 】( b i s - a n s ) 2 1 1 已被报道在s d s 电泳后检测比a n s 灵敏，特别是当有阳离子存在时o 5 1 t g 蛋白便能检测到；o p a 更灵敏，约0 2 5 t t g 的蛋白便可以 在紫外灯下见到顽且酶的活性可以被保持虽然荧光染色法是一种灵敏而且简便的方法，但是 应用并不广泛，主要原因是保存结果困难而且受扫描设备限制。 ( 5 ) 免疫方法 对于具有单特异性抗体的蛋白，使用免疫方法检测是比较简便而又具有专一性的方法。免疫 法有三种：免疫复制、免疫印迹、免疫转移。免疫法灵敏度较高，而且选择性很好。但是过程十 分繁琐，而且过程中要用到价格昂贵的专一性的抗体及作为标记的酶最重要的是。每种蛋白与 膜结合的能力不一样，在转移的过程中，不同的蛋白转移的效率不同，因此膜上的蛋白并不能完 全代表凝胶上的电泳模式。这给准确定量带来了困难 ( 6 ) 电泳印迹法 t o w b i n 等【2 2 】提出用电泳方法将凝胶中的蛋白转移到膜上。首先将蛋白质在固定化基质上固 定化，然后将非特异活性分子封阻固定在基质上未吸附蛋白质的区域。接着用探针检出固定基质 上感兴趣的蛋白，这是一个多步过程。但是至少有一步是携带用于随后检测的“报告”基团，最 后用标记在探针上的“报告”基团检测感兴趣的分子。电泳转移法速度快，效率高，转移条件容 易控制，重复性比较好，并可保持凝胶的分辨率。它的转移效率取决于分离蛋白的凝胶系统和蛋 白质的分子量但是这种方法同样存在着不同蛋白转移效率不同的问题，膜上的蛋白并不能完全 代表凝胶上的电泳模式，这给准确定量带来了困难。而且本方法步骤复杂繁琐，需要专门的设备， 4 第一部分第一章文献综述 给检测带来了不便。 ( 7 ) 放射自显影法 用具有放射性的同位素标记某种待检测的蛋白，然后测定蛋白在某变化过程中的放射性这 种方法灵敏度极高，可以检测到n g 甚至p g 级的蛋白【2 3 】而且可以用于蛋白作用过程的动态研 究。但是需要有特殊设备，成本昂贵，而且容易在测定的过程中带来放射性污染。 二纳米材料概述 1 纳米材料简介 纳米技术是- - f 在0 1 l o o n m 空间尺度内操纵原子和分子。对材料进行加工、制造具有特 定功能的产品、或者对某物质进行研究、掌握其原子和分子的运动规律和特性的崭新的高技术学 科。当粒子尺寸进入纳米量级时，其本身具有量子尺寸效应、小尺寸效应、表面效应和宏观量子 隧道效应因此，表现出的许多特有性质在催化、光吸收、生物医药、磁介质及新材料方面具有 广阔的应用前景 2 4 1 。到目前为止，纳米科技几乎涉及到现有科学技术的所有领域p s i ( 1 ) 纳米 材料方面的研究主要集中于纳米材料的性能、纳米材料的特殊规律、建立描述和表征纳米材料的 新概念和新理论以及发展新型的纳米材料。( 2 ) 纳米器件方亟的研究主要集中于纳米化工厂、生 物传感器、生物分子计算机、纳米分子马达等方面。( 3 ) 纳米结构的检测与表征。扫描探针显微 镜( s p m ) 为微观尺度的探索提供了一种全新的工具，是目前纳米科技中最重要的研究手段。s p m 包括原子力显微镜( a f m ) f 2 6 】和扫描隧道显微镜( s t m ) 【2 7 】，前者可以通过检钡0 样品表面和 针尖相互作用力的变化来获得样品表面信息，适于研究导电样品和非导电样品，后者是通过观测 物质表面原子和分子的几何分布和态密度分布，来确定物体局域光、电、磁、热和机械特性。 2 纳米材料应用前景 纳米材料作为一种新型的材料，未来的研究领域将越来越广泛【2 5 1 。在生命及环境方面的应 用主要集中在以下几个方面( 1 ) 材料和设备方面。在纳米尺度上。通过精确控制尺寸和成分来 合成材料单元，在纳米层次上构筑特定性质的材料和自然界不存在的材料、生物材料和仿生材料。 ( 2 ) 发展绿色能源和环境处理技术，制成孔径i n m 的纳米膜材料作为催化剂的载体，有序纳米 孔材料和纳米膜材料( 孔径1 0 1 0 0 r i m ) 用来消除水和空气中的污染；成倍提高太阳能电池的能 量转换效率。( 3 ) 在医药卫生方面 2 8 1 。纳米材料更是应用广泛纳米粒予将使药物在人体内的 传输更为方便，用数层纳米粒子包裹的智能药物进入人体后，可主动搜索并攻击癌细胞；在人工 器官外面涂上纳米粒子可预防移植后的捧斥反应：可以研制早期诊断的纳米传感器。( 4 ) 在生命 科学中。可以在预定的纳米尺度上按照预定的对穆性和捧列制各具有生物活性的蛋白质、d n a 等，在纳米材料和器件内置入生物材料使其兼具生物功能和其他特殊功能，生物仿生化学药品和 生物可降解材料：动植物的基因改善和治疗，测定d n a 的基因芯片等。 3 纳米材料在生物工程方面的研究及进展 纳米材料在生物工程方面的研究主要包括纳米生物医学工程、纳米生物技术和纳米生物材 料。 ( 1 ) 生物医学工程是现代生命科学和医学、工程学相结合发展起来的边缘学科，纳米技术可 以为医学工程中的生物材料、生物医学工程机械、远程医疗系统和生物医学康复工程诸方面提供 物质基础和技术保障。在纳米生物分子机器人和纳米信息处理系统方面【2 9 ，3 0 1 、生物大分子的研 究、药物载体的研究领域【3 1 3 3 1 以及疾病诊断和疾病检测方面【3 4 】有广泛的应用。 未来纳米技术与生物医学工程的联系将更紧密，将用于分子之间的相互作用、分子配合物和 5 第一部分第一章文献综述 分子组装的研究，将在大分子病毒结构、细胞器结构细节和自身装备机制上取得进展，有助于生 物大分子各级结构和功能的破译；生物相容性物质将逐渐开发，并用于i 临床实验阶段：纳米机器 人将注入血管，进行全身检查和治疗；药物研究方面提高药效，实现特定器官的靶向化，纳米生 物材料作为药物的控释系统具有广阔的应用前景；还将介入治疗、诊断和检测技术向微型、微观、 微量、实时、遥距、动态、功能化和智能化的方向发展。 ( 2 1 纳米生物技术是纳米技术和生物技术相结合的产物。可以用于生物医学也可以用于其 他方面，研究比较多的有以下几个方面：a 生物芯片技术。可以在很小的表面积上，用微量的 生物或者生理样品，可以同时研究不同的生物细胞、生物分子和d n a 的特性以及它们之间的相 互作用，可以分为细胞芯片、蛋白质芯片( 生物分子芯片) 和基因芯片( d n a 芯片) 。近年来， 基因芯片发展迅速，可以快速分析大量的基因信息，可用于基因组中遗传信息的分析：也可以用 于人体细胞和基因组织表达的检测，在临床诊断、药物开发和人类遗传诊断方面应用前景广阔。 b 用生物大分子可以制成分子马达，利用化学能进行机械做功的纳米系统。这种技术仍处于研 制初期，将来有可能完成在人体细胞内发放药物等医疗任务。c 纳米探针是可以探测单个细胞 的纳米传感器，探头尺寸仅为纳米量级，当它插入活细胞时，可探知会导致肿瘤的早期d n a 损 伤。 ( 3 ) 纳米生物材料包括适合于生物体内的纳米材料和利用生物分子的特性而发展的新型纳 米材料，前者易于被生物体接受而不引起不良反应，后者可以用于其他纳米技术或者微制造。 s a s k a t c h e w a n 大学的研究者们发现了将d n a 发展成新一代生物传感器和半导体导线的途径 3 5 1 ， j e r e m yl e e 等人发现d n a 很容易将锌、镍、锰等离子并入它的双螺旋中心，并且在高p h 值等基 本条件下，稳定d n a 含有金属离子的状态，获得了新的d n a 导电体，而且此类金属d n a 仍然 保持选择性结合其他分子的能力这种d n a 可以应用于遗传畸变探测生物传感器。类似于其他 的d n a 探测，在此传感器上装备所要探测的特制d n a 序列。 4 将n 仉纳米粒子及碳纳米管用于p a g e 的尝试 t i c h 纳米粒子由于具有量子尺寸效应和小尺寸效应。对于凝胶聚合物的结构性能有一定的影 响同时具有光催化效应，可以在材料内部吸收激发电子，产生电子空穴对，迅速迁移到材料表 面，激活材料表面的物质，产生活性自由基。从而可以催化化学发光，所以将w i t h 纳米粒子用于 化学发光成像法中，理论上对化学发光有增强作用。而且很多蛋白尺寸在l 矿米的数量级，与纳 米材料数量级相当，可以发生相互作用，改变蛋白分子的立体结构，从而改交蛋白的电泳行为。 本文初步探索了t i 0 2 纳米粒子、碳纳米管及聚苯乙烯纳米粒子在血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳中 的应用。 三直接化学发光成像法概述 1 直接化学发光成像法( i n f e c tc h e m u u m i n e e e n t i m a 暑l n 易d c l i ) 简介 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，c l ) 是通过化学反应产生的发光现象，是在一些特殊的化 学反应中，吸收了反应所释放的化学能而使处于电子激发态的反应中间体或者反应产物由激发态 回到基态时所产生的一种光辐射【3 6 】。c l 技术是一种高灵敏度的检测技术，适用于多种物质诸如 无机离子、普通有机化合物、药物以及生物大分子等的分析测定，近年来有关c l 的报道有很多 3 7 - - - 4 7 ，c l 法得到了迅速发展c l 技术的发展表现为新体系、新技术和新试剂的不断提出，使 该方法更具特点。c l 的种类有很多，生物体内的发光和有酶参与的化学反应产生的光称为生物 发光( b i o c h e m i l u m i n e s c e n c e ，b l ) ；利用电化学发光的办法产生的光，称为电致化学发光 ( e l e c t r o g e n e r a t c dc h e m i l u m i n e c e n c e ，e c l ) ，它们都是c l 的重要分支。d c l i 是基于化学发光 反应而建立起来的分析方法，它是利用感光胶片将化学发光的信号捕获而进行定性定量分析的方 6 第一部分第一章文献综述 法，这种技术在生物大分子的分析测定中，优点非常突出，是一种新型的高灵敏度的检测方法， 在生命科学的研究方面具有重要意义 4 8 - 5 0 。 c l 在生物学领域中的迸展主要分为六个方面：细胞学检测、分子生物学、卫生学检测、脂 质过氧化检测和药物筛选。其中细胞学检测主要是利用细胞内a t p 导致的虫荧光素酶生物化学发 光进行活细胞计数，目前已经实现快速、动态、单细胞分析：同时也发现了一些新的与c l 有关 的细胞学指标。d o r o h i n a 等将人外周白细胞所导致鲁米诺发光用于评价儿童免疫机能及其注射疫 苗后的变化。在分子生物学方面，化学发光分子主要用于基因报告和分子杂交。s c h a a p 等分别利 用辣根过氧化酶( h r p ) 及碱性磷酸酶( a p ) 标记了两种探针，同时用于d n a 指纹图谱分析， 大大提高了分辨率【5 1 】；l o r i m i e r 等还建立了c l 免疫组织化学技术，并与荧光免疫组化比较， 证明在检测肺癌细胞与淋巴细胞混和培养时的细胞代谢时，其灵敏废高于荧光法。近年来又有人 推出了b l 实时d n a 测序技术。在卫生学检测方面，主要是利用分子杂交或者a t p 导致的b l 检测生物污染。另外有人利用分子生物学技术，如以吖啶酶标记基因探针，以液相杂交、杂交保 护方式检测c l 信号，以检测食物中的多种致病菌。基于c l 的生物传感器主要有三类：酶固化 传感器、免疫分子传感器和特异调控因子诱导的报告基因传感器。研究较多的是免疫分子传感器， 如r u b t s o v a 等分别将抗体、h r p 固定于多孔膜上，构成生物传感器，用于测定过氧化氢、人微 球蛋白等o s i p o v 等将抗体固化，用于测定农药残留。e g o r o v 等还将多种抗体固定于膜上，构成 多通道生物传感器，用多参数法同时测定多种农药残留【5 2 】。脂质过氧化检测方面，主要是利用 c l 检测自由基等活性物质，如单线态氧、自由基、活性氧族等。u r s i n i 等利用c l 动力学分析法 建立了测定人血浆总脂质过氧化水平的方法【5 3 】。t o j e k 等通过测定器官移植后与细胞吞噬有关 的活性氧族物质，以评价免疫捧斥反应。y a v o 等用c l 法涮定血清拟胆碱脂酶【5 4 】。最近还有人 分别提出了基于报告基因和细胞增殖的生物发光药物筛选系统。例如利用荧光素酶柞为报告基 因，或者利用转基因动物技术建立的肿瘤动物模型及感染动物模型。 2 c l 反应的类型 i 化学发光反应从发光的能量转化机制上可以划分为两类：直接化学发光和间接化学发光。当 化学反应能量传递的结果是生成某种激发态产物时。这种激发态产物分子直接回到基态以辐射 光的形式释放能量，这种过程称为直接化学发光。若激发态分子本身不发光或者发光微弱，但可 将其能量转移给另一种发光体。使之变为激发态，在退回基态的过程中以光的形式释放出能量 这种发光称为间接化学发光，也可称为活化化学发光或能量传递化学发光在c l 分析中，许多 荧光化合物常被用作能量接受体【5 5 】。接受激发态产物的能量而发光，以提高化学发光分析的灵 敏度。常用的能量接受体有罗丹明b 、荧光素、曙红y 、吖啶橙、吖啶酮、维生素b ：、二甲基胺 苯甲醛、烟鲁绿b 、酚藏花红等f 5 6 】 i i c l 反应从反应机理上可以划分七类：过氧化物化学发光、酚类化学发光、气相化学发光、电 致化学发光、生物化学发光以及其他的一些化学发光类型 ( 1 ) 过氧化物化学发光 有机过氧化物的离解是一种放能过程，多数化学发光反应都有过氧化物参加或者中间有过氧 化物型化合物生成酰肼类( h y d r a z i d e s ) 。酰肼类化合物的c l 分析中。鲁米诺类化合物的研 究最多，已经可以用来直接检测过氧i i 滢 5 7 1 ， 闻接检测水中的亚硝酸盐等【5 o 】。新型的鲁 米诺类化合物在不断研究，p d i q ( 3 - 丙基7 ，8 - 双氢化哒嗪酮【4 ，5 - g 喹喔琳2 ，6 ，9 ( 1 h ) 三酮) 和d b p h ( 4 - ( 5 ，6 - 二甲氧苯并噻唑基) 邻苯二甲酰肼) 的发光效率都高于鲁米诺，还可以用于c l 免疫检 测中。基于些生物样品分子、有机物、无机物对于鲁米诺化学发光反应的增强作用或者抑止作 用可以对其进行测定。如可以利用白蛋白对于金属卟啉- 鲁米诺过氧化氢体系的增强作用来测定 7 第一部分第一章文献综述 血清中的白蛋f l 6 h 。基于氨基酸对于金属卟啉在鲁米诺- 过氧化氢的反应中催化活性的抑止作用 对其进行检测 6 2 1 ，h u a n g 等利用亚硫酸盐对于鲁米诺一过氧化氢c l 具有抑止作用检测酒中的亚 硫酸盐f 6 3 1 ，利用有机磷化合物及氨基甲酸酯对乙酰胆酸酯酶具有抑止作用来检测含有机磷的化 合物和含有氮基甲酸酯的农药【6 4 】，利用含硫醇的药物对次氯酸盐的还原抑止可以用鲁米诺- 次氯 酸盐c l 反应来检测这些药物等 6 5 1 。某些金属离子可以催化( 或增敏) 或者抑止鲁米诺- 过氧化 氢的化学反应，如c u ( 1 1 ) 【6 6 、c r ( m ) 6 7 ，6 s 、o s ( 1 1 1 ) 6 9 、m n ( i i ) 、c o ( i i ) 【7 0 、c r ( v i ) 【7 i 一7 3 1 、 f e ( i i ) 、f e ( i i i ) 7 4 ，7 5 、药物s n p ( 硝普纳) 【7 6 】、药物中的z n ( i i ) 、c d ( i i ) f 7 7 、m o ( i i i ) 7 s 、a u ( i i i ) f 7 9 等。另外，还可以利用金属离子对于鲁米诺c l 反应的催化作用对某些物质进 行间接测定。如利用抗坏血酸将f e ( 1 i d 还原为f e ( u ) ，f e ( i i ) 对鲁米诺c l 反应的催化作用 对抗坏血酸进行检测【8 0 】。c l 交换树脂已经被研制出来，如l u 等将鲁米诺固定在a m b e r l y s t a 2 7 阴离子交换树脂上、铜离子固定在d 1 5 1 大孔阳离子交换树脂上，制成了监测自来水及工业废水 中c n 。的传感器【8 1 】章竹君等发展了一种新型的全固态模式的消耗型锰离子c l 传感器，用于水 样中痕量锰离子的测定【8 2 】。光泽精c l 反应。光泽精c l 反应也可以直接测定过氧化氢及其 超氧化物。许多物质可以诱发光泽精发光，如利用胆固醇，胆固醇氧化酶反应产生过氧化氢来间接 测定血清中的胆固醇【8 3 】：基于光氧化抗坏血酸的产物为过氧化氢来间接测定血清中的抗坏血酸 【8 4 。另外，利用光泽精c l 反应可以被一些金属离子催化来检测这些金属离子。亚胺类c l 反应。在碱性介质氧化剂存在下，大量芳基咪唑化合物能产生c l 。洛粉碱衍生物在氯化羟胺增 敏剂的存在下可以被过氧化氢氧化而产生c l 。这类化合物还包括o d i ( 1 ，l ，乙二酰双咪唑、吲 噤及吲哚衍生物，这些物质都可以被过氧化氢氧化。从而产生c l 。过氧化草酸酩c l 反应。 这类化合物可以在化学反应中产生过氧化氢从而与c l 试卉司反应如抗坏血酸在胶束介质中可 以被部分地转化为过氧化氢，然后与溶解在阳离子可逆胶柬中的代p o ( - - ( 2 ，4 ，6 - - - 氯苯草酸醅) 芘) 进行c l 反应，对抗坏血酸进行闻接测定【8 5 】n a k a s h i m a 合成出了溶解度较好的芳香草酸酯 并用于丙二醛的测定f 8 6 】。 ( 2