（动物学专业论文）利用rapd和18s+rdna基因序列对几种索科线虫系统发育分析.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 中文摘要 索科线虫是一类昆虫寄生线虫，其形态多样而且具有较高的宿主特异 性。由于这类昆虫病原线虫具有重要的生防价值，所以有必要研究它们的遗 传变异和系统演化。本文首次报道了有关中国的索科线虫的分子系统发育关 系，对索科线虫中的部分分类混淆问题进行了分析，为更完善地构建索科线 虫系统进化树奠定了一定的理论基础。 本文采用r a p d 技术构建了索科线虫4 属5 种的指纹图谱。从4 7 个引物 中筛选出1 2 个稳定性好、多态性高的引物，共扩增出1 6 1 条谱带，其中1 5 0 条谱带具遗传多态性，占9 3 1 7 。所获片段长度大小为2 0 0 。3 2 0 0 b d ，单个引 物扩增的条带数在1 1 1 6 间，平均为1 3 4 2 条。采用r a p d i s t a n c e 软件及 m e g a 程序，计算n e i 氏相似系数和遗传距离，建立了u p g m a 和n j 聚类 图。两个聚类图拓扑结构基本相同，将5 种索科线虫可分为两大分枝：同属 于蚊幼寄生罗索属( r o m a n o m e r m i s ) 的食蚊罗索线虫( 冠c u l i c i v o r a x ) 与武 昌罗索线虫( 兄w u c h a n g e n s i s ) 亲缘关系最近，先聚在一起；再与同翅目 ( h o m o p t e r a ) 寄生长沙多索线虫( a g a m e r m i sc h a n g s h a e n s 括) 聚为一枝；鳞 翅目( l e p i d o p t e r a ) 寄生中华卵索线虫( o v o m e r m i ss i n e n s i s ) 和同翅目寄生 两索属线虫( a m p h i m e r m i ss p ) 亲缘关系较近，两者聚为一枝。从5 种索线 虫之间的遗传距离来看，属内种间的距离较小，食蚊罗索线虫与武昌罗索线 虫之间遗传距离仅为0 1 7 8 9 ；而属间的遗传距离较大，在0 4 4 7 1 0 5 4 8 8 之 间。结果表明：r a p d 技术可以应用于索科线虫亲缘关系的分析，能够反映 出不同线虫间的遗传差距，从而进行属、种的分类及进化问题研究。 本文比较了1 3 种索科线虫( 其中8 种索科线虫序列为本文所测定，5 种 索科线虫序列从互联网g e n b a n k 检索得到) 的1 8 sr d n a 的同源序列。计算 核苷酸的使用频率，并采用邻接法( n j ) 和最大简约法( m p ) 构建分子系统 发育树。在获得的7 7 3 b p 的序列片段中有2 0 0 个位点为多态性位点，大部分 的碱基改变是转换( t r a n s i t i o n ) 。研究结果表明：用两种方法构建的系统树结 果基本一致，索科线虫分为两大类群，第一大类群是以罗索属武昌罗索线虫 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 和食蚊罗索线虫与蜘蛛目( a r a n e a e ) 寄生蛛索线虫( a r a n i m e 朋括s p ) 亲缘 关系较近，先聚在一起，再与两索属线虫和直翅目( o r t h o p t e r a ) 寄生索属黑 色索线虫( m e r m i sn i g r e s c e n s ) 聚为一枝；第二大类群是以卵索属中华卵索线 虫与多索属长沙多索线虫亲缘关系较近，先聚在一起，再与蚊幼寄生八腱属 线虫( o c t o m y m e r m i ss p ) 聚为一枝。索科线虫属内种间差异明显小于不同属 间差异，食蚊罗索线虫与武昌罗索线虫同属于蚊幼寄生罗索属线虫，其种间 的差异仅为0 2 9 ，而各属问差异在4 3 3 1 4 8 7 之间。此外，本实验通过分 析索线虫未定种样品1 8 sr d n a 序列，有助于分析其在系统分类中的地位。 本实验选择两种分子标记，即r a p d 分子标记和1 8 sr d n a 序列标记， 对搜集的部分索科线虫进行了系统演化初步分析。研究结果显示，两种分子 标记在一定程度上均能反映索科线虫属种间的亲缘关系和系统发育地位。 r a p d 技术适合分析较低阶元的如属内种间或种内物种的多态性，而保守性 相对较高的序列标志位点1 8 sr d n a 序列则适宜分析高阶元如属间或目间 物种。 关键词：索科线虫；r a p d ；1 8 sr d n a 序列；系统发育关系 1 1 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s a b s t r a c t m e r m i t h i d a ei sa g r o u p o fi n s e c t s p a r a s i t i c n e m a t o d ew i t hd i v e r s i f i e d m o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r sa n dh o s ts p e c i f i c i t y b e c a u s eo ft h eb i o l o g i c a l c o n t r o l v a l u eo ft h e s ee n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s ，i ti s n e c e s s a r yt os t u d yt h eg e n e t i c v a r i a t i o na n dp h y l o g e n e t i ce v o l u t i o no ft h e m i tw a st h ef i r s tr e p o r tt oi n f e rt h e p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p s o fm e r m i t h i d a ef r o mc h i n aa n d f i g u r e o u ts o m e c o n f u s i o n so f c l a s s i f y i n gs y s t e m i nm e r m i t h i d a e i nt h i ss t u d y , t h eg e n e t i cr e l a t i o n s h i p sa m o n gf i v es p e c i e sb e l o n g i n gt of o u r g e n e r ao fm e r m i t h i d a ew e r ed e t e c t e du s i n gr a p d t w e l v ep r i m e r sw e r es c r e e n e d f r o m4 7r a n d o mp r i m e r sa n da m p l i f i e d1 6 1b a n d s ( f r o m2 0 0 b pt o3 2 0 0b p ) 1 5 0 ( 9 3 1 7 ) o f t h e s eb a n d sw e r ep o l y m o r p h i cb a n d s t h en u m b e ro fo b t a i n i n g s e g m e n t so fi n d i v i d u a lp r i m e rw a sb e t w e e n1 1 - 1 6 ，t h ea v e r a g ew a s1 3 4 2 n e t s s i m i l a r i t yc o e f f i c i e n t sa n dg e n e t i cd i s t a n c ew e r ec a l c u l a t e du s i n g t h er a p d i s t a n c e a n dm e g as o f t w a r e s t h e p h y l o g e n e t i c t r e e sw e r ec o n s t r u c t e dw i t ht h em e t h o d so f u p g m aa n dn j t h er e s u l t sf r o mt w om e t h o d so fc l u s t e ra n a l y s i sw e r es i m i l a ri n g e n e r a l ，a n dt h er e l a t i o n s h i pi n d i c a t e d t h a tt h ef i v es p e c i e so fm e r m i t h i d a ec o u l db e d i s t i n g u i s h e dw i t hr a p d m a r k e r sa n dw e r eg r o u p e di n t ot w od i s t i n c tc l u s t e r s i n t h e p h y l o g e n e t i c t r e e s r o m a n o m e r m i sc u l i c i v o r a x a n d 兄w u c h a n g e n s i s ( a l l p a r a s i t e i nl a r v a eo f m o s q u i t o e s ) c l u s t e r e dt o g e t h e r , t h e nt h e y c l u s t e r e dw i t h a g a m e r m i sc h a n g s h a e n s i s0 a r a s i t e i n h o m o p t e r a ) i n t oo n eg r o u p o v o m e r r a i s s i n e n s i s ( p a r a s i t ei nl e p i d o p t e r s ) a n da m p h i m e r m i ss p ( p a r a s i t ei nh o m o p t e r a ) c l u s t e r e di n t oo n eg r o u p t h eg e n e t i cd i s t a n c e so ff i v em e r m i t h i ds p e c i e ss h o w e d t h a tt h er e l a t i o n s h i p so f i n t r a g e n u sw e r e n e a r e rt h a nt h a to fi n t e r - g e n u s ( t h eg e n e t i c d i s t a n c eb e t w e e n 足c u l i c i v o r a xa n d 兄w u c h a n g e n s i sw a s0 1 7 8 9 b u tt h eg e n e t i c d i s t a n c eb e t w e e ni n t e r - g e n u sw e r e0 4 4 7 1 加5 4 8 8 ) a l lt h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a t r a p dw a ss u i t a b l ef o ra n a l y s i so f p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p sa m o n g m e r m i t h i d a e n u c l e o f i d es e q u e n c e so f1 8 sr d n a ( 7 7 3b a s ep a i r s ) w e r ec o m p a r e da m o n g1 3 s a m p l e s r 8 s a m p l e s w e r e s e q u e n c e d i nt h i s s t u d ya n d5s a m p l e s w e r ef r o m g e n b a n k ) am o l e c u l a rp h y l o g e n e t i c t r e ew a sc o n s t r u c t e d b yu s i n gm a x i m u m p a r s i m o n y ( m p ) a n dn e i g h b o rj o i n i n g ( n j ) m e t h o d o l o g i e s t h es e q u e n c e d a t a r e v e a l e dc o n s i d e r a b l ev a r i a t i o ni n2 0 0n u c l e o t i d es i t e s a m o n gt h es e q u e n c e s n l 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s a n a l y z e d ，w i t h t r a n s i t i o n s o u t n u m b e r i n g t r a n s v e r s i o n s a l lt w o p h y l o g e n e t i c a n a l y s i sg e n e r a t e ds i m i l a ra f f i n i t i e s ，w i t h1 3m e r m i t h i ds p e c i e so f 7g e n e r a g r o u p e d i n t ot w od i s t i n c tc l u s t e r s t h e c o n g e n e r s r o m a n o m e r m i sc u l i c i v o r a xa n d 足 w u c h a n g e n s i sc l u s t e r e dw i t ha r a n i m e r m i ss p ( a r a n e a ep a r a s i t e s ) ，t h e nc l u s t e r e d w i t ha m p h i m e r m i ss l xa n dm e r m i sn i g r e s c e n s ( o r t h o p t e r ap a r a s i t e s ) as e c o n d c l u s t e rw a sf o r m e d b yo v o m e r m i ss i n e n s 括a g a m e r m i sc h a n g s h a e n s i s a n d o c t o m y o m e r m i ss p ( p a r a s i t i ci no fm o s q u i t ol a r v a e ) t h eg e n e t i cd i s t a n c e so ft h e s e 1 3m e r m i t h i ds a m p l e sr e v e a l e dc l o s e r i n t r a g e n e r i c d i s t a n c e sf o 2 9 n u c l e o t i d e d i s s i m i l a r i t y ) r e l a t i v e t o i n t e r g e n e r i cc o m p a r i s o n s ( 4 3 3 1 4 7 8 ) f u r t h e r m o r e ， p h y l o g e n e t i ca n a l y s i sb a s e do nt h e1 8 sr d n a o f4u n i d e n t i f i e dm e r m i t h i ds a m p l e s c a l lb eu s e dt or e s o l v er e l a t i o n s h i p sa m o n gm e r m i t h i d a e r a p da n d1 8 sr d n am a r k e r sw e r eu s e dt od e t e c tt h eg e n e t i cd i s t a n c ea m o n g s e v e r a lm e r m i t h i ds p e c i e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e s et w om o l e c u l a rm a r k e r s w e r ea l ls u i t a b l ef o r s t u d yp h y l o g e n e t i er e l a t i o n s h i p sa m o n gm e r m i t h i d a e i n a d d i t i o n ，r a p d m a r k e rw a s s u p e r i o r t o1 8 sr d n am a r k e rw h e n a n a l y s e r e l a t i o n s h i p so fi n t r a - g e n u sa n d t h el a t t e rw a ss u i t a b l ef o ri n t e r - g e n u s k e yw o l d s ：m e r m i t h i d a e r a p d ；1 8 sr d n a ；p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p s i v 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究 工作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和 集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：z 龛崖 日期：埘年月占日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 f z q 车n 借阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 作者签名：z 象秀 日期砖年6 月g 日 导师签名： 日瓤舻 易月p e l 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本 人的学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章 程”中的规定享受褶关权益。匿童盈塞握銮厦滥蜃! 旦圭生i 旦= 生! 笪三生 发! 篮。 作者签名：钍艿 日期：，弘呵年6 月8 目 导师签名：刁 日期：踟秽年6 月彦日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 前言 1 1 r a p d 标记检测基因组d n a 的多态性 r a p d 是由w i l l i a m se ta l ( 1 9 9 0 ) 和w e l s he ta l ( 1 9 9 0 ) 两个研究组同时 创建的一种新型的d n a 分子水平上的检测技术。它的基本原理是利用长度为 1 0 碱基的寡核苷酸作随机引物，对所研究生物基因组d n a 进行p c r 扩增。 一般说某一引物在真核基因组中可能有很多的结合位点，但只有在4 0 0 0 b p 之 内，存在反向平行的与该引物互补的双链d n a ，才能将合成的新链傲为下一 次合成的模板，经3 5 4 0 个循环，即可得到大量的d n a 扩增片段，扩增产物 经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭( e t h i d i u mb r o m i d e ) 染色，而后在紫外成像系 统下显示r a p d 谱带。 r a p d 技术的特点：( 1 ) 不需要d n a 探针；( 2 ) 使用随机引物，合成引物时 无需预知被研究生物的基因组序列，一套引物可用于不同生物的研究：( 3 ) r a p d 技术操作简便、快速，可免去r f l p 中的克隆制各、同位素标记、 s o u t h e r n 杂交等复杂步骤；( 4 ) 黜垤d 分析所需d n a 量少，每个反应仅需几十 纳克的d n a ，仅为r f l p 的1 1 0 0 0 1 2 0 0 ，这对生物早期取样鉴定或在d n a 样本受限制的情况下大有益处。 但r a p d 技术也有自身的局限性，主要表现在：( 1 ) r a p d 标记为显性分 子标记，不能在f 2 代区分纯合体与杂合体，必须进行f 3 分祈：( 2 ) 存在共迁移 问题，凝胶电泳只能分开不同长度d n a 片段，而不能分开那些长度相同但碱 基序列组成不同的d n a 片段：( 3 ) 由于采用的引物短，t i n 值低，扩增结果易 受外界因素的影响，实验的重复性较差，因此在实验中要严格控制实验条 件，才能得到可重复、理想的扩增效果。 由于r a p d 技术具有简便、快速、实验费用较低等诸多优点，在自由生 活线虫、植物寄生线虫和部分昆虫病原线虫的种属鉴定、亲缘关系、遗传多 样性等方面的研究中，得到了广泛应用( b e n d e z ue ta l ，1 9 9 8 ；g u i r a oe ta l ， 1 9 9 5 ：h a h ne ta l ，1 9 9 6 ；u ue ta l ，1 9 9 5 ) ，但r a p d 技术在索科线虫种和属间 的分子系统学研究目前还未见报道。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 2r d n a 及其内部转录间隔区( 1 t s ) 序列测定分析 特异性p c r 标记所用引物是针对已知序列的d n a 区段而设计的，具有 特定核苷酸序列( 通常为1 8 - 2 4 b p ) ，可在常规p c r 复性温度下进行扩增， 对基因组d n a 的特定区域进行多态性分析( 王凯等，2 0 0 3 ) 。核酸序列分析 可以检测出比较序列中单碱基的变化，是研究生物遗传变异最灵敏的方法之 一，结合分子克隆或p c r 扩增，获得同源区域的序列，经同源性分析及比 较，在线虫的鉴定及系统发育分类中都能起到重要作用。由于研究目的不 同，在进行线虫d n a 序列分析时所选的区域存在差异( c u n a n ，1 9 9 1 ) 。目 前，线虫分类的研究大多集中在r d n a 及m t d n a 所编码的一些基因及i t s 区 域的同源性分析。 r d n a 是目前分子系统学普遍采用的分子标记基因之一，它是一种中等重 复并有转录活性的家族，每个重复单位由转录区和非转录区组成，两个内转 录间隔区i t s l 和i t s 2 将1 8 s ，2 8 s 弄n 5 8 sr r n a 基因分开。真核生物细胞的 r d n a 的重复片段中，i t s 区进化速度较快，适于近缘种或低级分类阶元的系 统发育研究，在植物寄生线虫( 如松材线虫b u r s a p h e l e n c h u sx y l o p h i l u s 等) 和 昆虫病原线虫斯氏属( s t e i n e r n e m a ) 和异小杆属( h e t e r o r h a b d i t i s ) 的分类鉴 定和种系发生关系等方面的研究报道多集中在i t s l 和i t s 2 区域( h o m i n i c ke t a l ，1 9 9 7 ；李一农，2 0 0 4 ；j o y c ee ta l ，1 9 9 4 ；张立海等，2 0 0 1 ) 。在高阶元 ( 目、属间) 线虫种类的系统发生研究中大多采用1 8 sr r n a 基因作为分子标 记，对生物亲缘关系进行分析。 原核生物的小亚基核糖体( s m a l ls u b u n i tr r n a ，s s ur r n a ) 为1 6 s r r n a ，真核生物的为1 8 sr r n a 。1 8 sr r n a 基因是一类编码核糖体小亚基 r n a ，长约1 8 0 0 b p 。真核生物核糖体的小亚基r n a 由染色体基因编码，称为 1 8 sr d n a 。在漫长的生物进化过程中，其一级结构和二级结构基本格局变化 甚少，是至今发现的d n a 序列中最为保守的一类。因其在生物体内含量较大 且在进化过程中非常保守，含有大量的可供统计运算的高度保守和部分保守 的基因碱基序列，因而它是探讨生物高级分类群系统演化的难得工具之， 并且近十多年来在后生动物的分子系统进化研究中得到广泛的应用( g i r i b e t e ta l ，2 0 0 0 ；郝家胜等，2 0 0 2 ：l i ue la l ，1 9 9 7 ；缪炜等，2 0 0 2 ；王瑛等， 1 9 9 9 ；张克云等，2 0 0 3 ) 。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s f i t c h 等人( 1 9 9 5 ) 利用1 8 sr d n a 序列对小杆科( r h a b d i t i d a e ) 9 属6 种线 虫的系统发育演化进行了探讨。在昆虫病原线虫方面，“u 等人( 1 9 9 7 ) 曾对 斯氏科线虫( s t e i n e r n e m a t i d a e ) 和异小杆科线虫( h e t e r o r h a b d i t i d a e ) 的1 8 s r d n a 序列进行了分析，探讨了他们之间的系统发生关系。b l a x t e r 等人 ( 1 9 9 8 ) 对涵盖4 8 属共5 3 种线虫的1 8 sr d n a 序列进行了分析，得出了非常有 意义的结果。但有关索科线虫1 8 sr d n a 部分序列目前仅有少量报道 ( a y l 4 6 5 4 4 ，a y l 4 6 5 4 3 ，a y 3 7 4 4 1 7 ，a y 3 7 4 4 1 6 ，a y 3 7 4 4 1 5 ，a h ) 3 6 6 4 1 g e n b a n k ) ，其中有两种为已知种序列。 1 3 线粒体d n a 在线虫系统分类中研究进展 线粒体d n a ( m t d n a ) 是双链核外遗传物质，在动物体内含量丰富，具 有分子量小、分子进化速度快、结构基因保守性强等特性，被广泛应用于分 子遗传进化、分类鉴定、发育生物学及其变异与一些疾病相关性的研究。近 十年来，随着分子生物学技术的发展，国际上对线虫线粒体d n a 的研究取得 了不少成绩，但国内有关线虫线粒体d n a 的研究较少。 1 3 1 线虫线粒体d n a 结构 线虫线粒体d n a 为环状闭合双链，长度约为1 3 1 6 k b ，结构具有较高保 守性，有一个富合a t 核苷酸二聚体的非编码序列。其基因组包括3 6 个基因 ( 1 2 个蛋白质基因、2 个r r n a 基因和2 2 个t r n a 基因) ，不对称分布在l 链和h 链上。各基因排列紧密，并且基因内不含内含子。与脊椎动物线粒体 d n a 相比，线虫线粒体d n a 基因排序有较大的差异性，且极不稳定 ( s a c c o n ee ta l ，1 9 9 9 ) 。 线虫线粒体的1 2 个蛋白质基因也是一般后生动物所共有的。它们编码的 蛋白质与呼吸链中电子传递和氧化磷酸化有关。线虫线粒体基因组不包含 a t p 酶的另一个亚基基因a t p a s e 8 ，这与一般后生动物线粒体基因组有所区 别。线虫线粒体基因组中有2 2 个t r n a 基因，以满足线粒体蛋白质翻译过程 中的需要。不同种线虫的t r n a 二级结构存在着差异。线虫线粒体t r n a 基因 氨基酸接受臂和反密码子臂较保守，而t w c 环和d h u 臂变异较大。线虫线 粒体r r n a 基因比一般后生动物的要小。s r r n a 基因和1 - r r n a 基因都是由线 粒体d n a 的h 链上的碱基序列所编码。r r n a 的二级结构保守性较强，具有 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 多个大小不一的茎环结构。线虫线粒体基因组中存在一段主要的非编码序 列，即可变区，具有较高的突变率。o k i m o t o 等( 1 9 9 2 ) 研究发现，食蚊罗索 线虫( r o m a n o m e r m i sc u l i c i v o r a x ) 、猪蛔虫( a s c a r i ss u u m ) 和秀丽新小杆线 虫( c a e n o r h a b d i t 括e l e g a n s ) 的线粒体d n a 都有一个明显的富含a t 二聚体 的非编码序列，包含有正向和反向的重复序列。线虫线粒体d n a 多态性的主 要原因就在于非编码序列中重复序列的不同拷贝数。 1 3 2 线虫线粒体d n a 分子生物学特性 1 ) 线粒体d n a 多态性：线虫线粒体d n a 大小有很大的差异性。食蚊罗 索线虫线粒体d n a 为2 6 3 2 k b ，是已报道的最大的后生动物线粒体d n a 。 食蚊罗索线虫线粒体d n a 如此之大，主要是由于含有大量富含a t 的正向串 联重复序列和散在的反向重复序列( h y m a ne ta l ，1 9 8 8 ) 。线虫线粒体d n a 多态性研究分析对于研究线虫种群的系统分类、种群遗传和系统演化等有较 大意义。 2 ) 线粒体d n a 碱基偏倚性：后生动物线粒体d n a 碱基组成具有明显的 偏倚性( b i a s ) ，这种特性在线虫线粒体中表现尤为显著。s a c c o n e 等 ( 1 9 9 9 ) 研究发现，线虫线粒体d n a 中g c 含量仅为2 6 1 7 2 1 5 ，而哺 乳动物线粒体d n a 中g c 含量达到4 0 2 8 3 0 8 。h y m a n 等( 1 9 9 6 ) 从食 蚊罗索线虫线粒体d n a 中获得两个单拷贝结构基因，分析发现两者a t 含量 都达到了8 0 ，而g c 含量明显偏低。 线虫线粒体d n a 遗传密码子也具有比较显著的a t 偏倚性。食蚊罗索线 虫线粒体d n a 的3 个密码子碱基位点都表现出较强的t 代替c ，a 代替g 的 趋势( h y m a n e ta l ，1 9 9 6 ) 。 3 ) 线粒体d n a 变异性及其保守性：与脊椎动物线粒体d n a 基因序列具 高度保守性不同，线虫线粒体d n a 基因排序具较大的差异性。并且线虫线粒 体d n a 的突变率相当高，极不稳定，其碱基替代率是单拷贝核基因的1 0 倍。线虫线粒体d n a 的高突变率是由于它暴露于大量的氧自由基中，而这些 来自氧化磷酸化过程的氧自由基具较强诱变能力，同时它又缺乏组蛋白的保 护和完整的修复系统。 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 猪蛔虫和秀丽新小杆线虫的线粒体d n a 基因序列与脊椎动物的线粒体 d n a 基因序列有较大差别，但是与食蚊罗索线虫的线粒体d n a 基因序列也 存在着差异。h y m a n 等( 1 9 9 0 ) 研究发现，食蚊罗索线虫的线粒体d n a 基因 序列中存在长度约为3 0 k b 的串联重复序列，而且容易发生基因重排。 通过对线虫线粒体d n a 序列中保守性较强的功能基因的比较分析，有助 于线虫亚纲、目和科等较高阶元及一些分类模糊种的分类鉴定和系统发生学 的研究。运用线粒体d n a 序列比较的分子生物学方法在系统演化理论研究领 域中将会发挥越来越重要的作用，对于传统的形态学分类方法则是一个非常 有益的补充。 1 4 昆虫病原索科线虫分类概况 昆虫病原线虫寄主范围广，能主动寻找寄主，对人畜及环境安全无毒。 是2 0 世纪发展起来的一静有潜能的生物防治因子。目前农药污染日益严重， 害虫抗药性愈来愈强，利用昆虫病原线虫进行生物防治已成为农业可持续发 展的迫切需要，在国际生防领域受到高度重视。保护利用昆虫病原线虫的自 然控制作用，可以减少甚至不使用农药，因而具有巨大的生防潜力和广阔的 应用前景( 王国秀等，2 0 0 1 ) 。 目前，国内外学者已对索科线虫的形态分类、生物学特性、生理生化、 区系分布、体内外培养、商品化生产及投放应用等方面进行了大量而富有成 效的研究( 鲍学纯，1 9 9 6 ) 。2 0 世纪7 0 年代，我国学者开始在索科线虫领域 进行有益的工作，主要对鳞翅目( l e p i d o p t e r a ) 、双翅日( d i p t e r a ) 、同翅 目( h o m o p t e r a ) 和直翅目( o r t h o p t e r a ) 等昆虫寄生索科线虫的资源分布、 形态分类、生物学特性、体内外培养和保护利用等进行了研究( 王国秀等， 2 0 0 1 ：钟玉林等，2 0 0 1 ) 。 索科线虫( m e r m i t h i d a e ) 是昆虫病原线虫中的一个大类群，属于无尾感 器纲( a p h a s m i d i a ) 、嘴刺亚纲( e n o p l e a ) 、索线虫目( m e r m i t h i d a ) 。迄 今，国际上己报道的索科线虫有8 0 余属，3 0 0 0 余种，但有些属种描述依据不 足，故能被多数线虫学家接受的仅6 0 余属。我国现已报道的索科线虫有1 0 属、3 0 余种，其中2 1 种为新种或新亚种，约占世界已知属数的1 8 ，即两索 属( a m p h i m e r m i s ) 、六索属( h e x a m e r m i s ) 、卵索属( o v o m e r m i s ) 、罗索 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 属( r o m a n o m e r m i s ) 、多索属( a g a m e r m i s ) 、八腱索属( o c t o m y m e r i s ) 、 脆索属( t h r a u s t o m e r i s ) 、索属( m e r m i s ) 、新四倍体索属 ( n e o q u a d r i m e r m i s ) 、宽索属( e u r y m e r m i s ) ( 鲍学纯，1 9 9 6 ；王国秀等， 2 0 0 1 ；钟玉林等，2 0 0 1 ；周克夫等，2 0 0 1 ) 。 长期以来，索科线虫的分类鉴定主要以某些特定的形态结构特征为依据 ( p o i n a r ，1 9 7 9 ：r o b z o v ，1 9 9 1 ) ，如线虫的体长、头到神经环或泄殖孔的距 离、雄虫交合刺和生殖乳突的特征等。但是，由于宿主营养、环境温度和感 染强度等因素的不同，即使同种的不同个体也可能在上述形态结构特征上产 生较大差异，从而造成分类上的一些混乱。此外，索科线虫的种类繁多，生 态环境和地理分布差异大，宿主范围广，生活史复杂，某些属级的分类到目 前为止还存在一些争议。目前，国际上有两大索科线虫分类系统，其中一个 是以前苏联r u b z o v ( 1 9 9 1 ) 为代表的分类系统，另外一个是以美国p o i n a r ( 1 9 7 9 ) 为代表的分类系统，我国学者大多沿用前者。这两大索科线虫分类 系统对于属的分类性状描述存在较大差异，如r u b z o v ( 1 9 9 1 ) 认为索属线虫 ( m e r m i s ) 寄生后期幼虫有发达的尾附器，而p o i n a r 认为其缺乏尾附器( 鲍 学纯，1 9 9 6 ；p o i n a r ，1 9 7 9 ) ，但经其他学者观察发现后者观点符合客观事实 ( 鲍学纯，1 9 9 6 ：n i c k l e ，1 9 8 4 ) 。而且这两大分类系统对索科线虫各属问的 亲缘关系都没有很明晰地阐述。近年来，已有一些学者尝试用其他方法对索 科线虫分类进行探讨，如蔡庆等( 1 9 9 3 ) 应用同工酶和蛋白质电泳技术对罗 索属的两种线虫进行研究，探讨其应用于索科线虫分类的可行性；鲍学纯等 ( 1 9 9 2 b ) 应用数值分类法对索科线虫进行了探讨，通过将索科线虫的属种间 性状差异转换为属种间的离散增量，进行相似性比较，反映属、种间的相似 程度。但就我国有文献记载的索科线虫的属种间亲缘关系及其在索科线虫系 统分类中的地位等研究尚未见报道。 近十几年来，分子生物学技术的发展和应用为线虫的分类学及系统亲缘 关系研究提供了一种强有力的辅助手段和工具( 李菁菁等，2 0 0 2 ；l i uc ta l ， 1 9 9 9 ；n g u y e ne ta l ，2 0 0 1 ；s t a c ke ta l ，2 0 0 0 ；张立海等，2 0 0 1 ；张路平等， 2 0 0 2 ；丘雪红等，2 0 0 3 ) 。目前，国内外运用分子生物学技术对索科线虫系 统发生及演化进行研究还处于起步阶段。在索科线虫领域，仅食蚊罗索线虫 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 等少数几种索科线虫的m t d n a 及核d n a 进行了分析研究，而对整个索科线 虫种群的遗传多样性和系统演化还缺乏研究( - l y m a ne ta l ，1 9 9 0 ；1 9 9 6 ；王 国秀等，1 9 9 8 ) 。这个问题已开始引起国内外有关学者的重视，国际著名线 虫学家p l a t z e r 和h y m a n 博士( 教授) ( 美国加利福尼亚大学河滨分校， u n i v e r s i t yo fc a l i f o r n i a ，r i v e r s i d e ) 就曾来函邀请本实验室参加他们的科研项 目，合作开展蚊子寄生罗索属线虫的利用及其系统演化等方面的研究。本研 究的目的是参与国际合作，保护我国索科线虫的物种资源和基因资源，利用 我国索科线虫特有资源优势，构建索科线虫分子系统进化树，填补该领域的 空白，为我国索科线虫的进一步研究奠定基础。现将结果报道如下。 7 硕士学位论文 v i a s t e r st h e s l 5 2 材料和方法 2 1 实验材料 2 1 1 索科线虫的来源 本研究共收集供试索科线虫8 个样品，其来源和样品编号见表1 。其中， 食蚊罗索线虫由美国c a l i f o r n i a 大学p l a t z e r 教授惠赠；长沙多索线虫 ( a g a m e r m i sc h a n g s h a e n s i s ) 和两索线虫( a m p h i m e r m i ss p ) 采自湖北枣阳的 稻田；两种八腱属线虫( o c t o m y m e r m i ss p ) 分别采自湖北武汉的五里界镇、 广东徐闻县的稻田；编号为湖北蝗虫线虫的样品采自湖北广水市，由蝗虫体 内脱出，以上样品均保存于9 5 乙醇中；中华卵索线虫( o v o m e r m i s s i n e n s i s ) 和武昌罗索线虫( r o m a n o m e r m i sw u c h a n g e n s i s ) 分别在河南上蔡的 麦团和湖北武汉的稻用采得，经本实验室传代培养的雌雄成虫，4 冰箱内活 体贮存备用。其他索科线虫序列均从互联网g e n b a n k 检索得到。 2 1 2 主要试剂 引物：由上海生工生物工程技术服务有限公司( 简称上海生工) 合成 t a q 酶：华美生物工程公司( 简称华美) ，上海生工，b b i 公司提供 d n t p ：a m r e s c o 公司提供 d n a 提取试剂盒：d 3 4 7 3 0 1o m e g a 公司提供 d n a m a r k e r l ：华美公司提供 d n am a r k e r 2 ：上海生工提供 其他药品均为国产a r 级或进口分装a r 级。 2 1 3 主要仪器 台式高速离心机：t g l l - 1 8 g 型( 上海医用分析仪器厂) 基因扩增仪( p c r 仪) ：e p p e n d o r f a g ( 德国e p p e n d o r f 公司) 电泳仪：d y y - 5 型( 北京六一仪器厂) 电热恒温鼓风干燥箱：d h g 9 0 7 0 a 型( 上海精宏实验仪器有限公司) 凝胶成像系统：g e l p r o a n a l y z e r 凝胶成像系统( 美国) 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s 表1 本文所涉及的分类群 t a b l e1 s p e c i e so f m e r n d t h l d l l ea n do u t g r o u p si nt h i ss t u d y # 外类群t 本研究测序序列 9 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 2 2 实验方法 2 2 1 索科线虫r a p d 扩增_ 及数据处理 1 ) 实验用索科线虫模板d n a 的提取 取供试线虫成虫3 巧条，用灭菌双蒸水冲洗三次；加适量消化液于5 5 水浴5 h 左右：然后用酚氯仿抽提，加入适量灭菌t e 溶解，2 0 冰箱保存备 用。用1 琼脂糖凝胶电泳检测所提取d n a 的质量。 2 ) r a p d 反应体系的