（预防兽医学专业论文）河北省传染性法氏囊病病毒地方株的分离与鉴定.pdf

摘要 传染性法氏囊病病毒是引起鸡免疫抑制以及对其他病原体感染升高的急性传 染病，造成河北省鸡生产地区的严重损失。尽管使用疫苗但仍时有暴发，传统的灭 活苗和弱毒苗不能抵制变异株的攻击。抗原变异使河北省传染性法氏囊病变得更加 复杂。 本研究对河北省两株传染性法氏囊病病毒进行培养鉴定，通过在s p f 鸡胚上传 代，继而在鸡胚成纤维细胞上传代，适应细胞生长，使这两毒株产生轻微的病变， 电镜观察，病毒粒子约6 0 n m 。理化特性研究表明，该分离毒株对氯仿、乙醚有抵抗 力；耐p 1 2 0 处理；耐热性试验中，5 6 3 0 m i n 使该病毒感染力稍下降。 进行易感鸡的感染试验，鸡没有特征性的肉眼可见的病理变化，制作病理切片， 进行观察发现这两株病毒可引起免疫器官的损伤表现为法氏囊的萎缩、脾脏肿大。 感染后期出现淋巴细胞坏死，淋巴滤泡间隙有嗜中性粒细胞浸润，通过对两株河北 分离病毒的毒力测定致病性进一步验证了两毒株属于弱毒株。 反转录一聚合酶链式反应( r t p c r ) 被认为是最快速的检测i b d v 的方法，对这 两株病毒进行反转录一聚合酶链式反应( r t p c r ) ，成功的扩增出唯一的4 9 4 b p 的目 的条带，对其进行基因组的分析。 对v p 2 高变区核苷酸进行分析，h e b - b d j z ，h e b _ b d v ，与欧洲经典i 型弱毒株p 2 的亲缘关系较近，同源性达9 4 5 一9 7 9 ；其次是c u l 同源性达9 0 3 一9 5 2 而与其 它毒株关系较远；与美国标准株s t c 和0 0 2 7 3 的关系较远。 关键词：传染性法氏囊病毒；萎缩；分离：鉴定；反转录一聚合酶链式反应 l s o l a n 蛆釉di d 绷t 溺c a 6 0 珏硝l 划耋j o 珏sb 珏琳a id i s s e 主l l 珏e b e ip 阳v 如c e a u 岫e n w d w e i s 辫i a l i t y ：p f e v e n t i v e e 矗n a 叫m 。d i c i n e s u p e 州s o r ：s u nj g l l o a 瓤t r a c t l n f k t i o u sb u r s a ld i s e a s ev i r u 8 ( 1 b d v ) i st h ec a u s a t i v ea g c n to fah i 曲1 yc o n t a 颤o u s d 主s e a s ei ne h i c k 髓，t h eo u t c 啦n eo fi 栅t 玳i z a t i o nw a sp o o d yi d 曲虹曩e d 1 b di so n eo f m a j o rc o n t a 季o u sd j s e a s e st h a t 豫s t r a i nh e a l m yd e v e l 叩m 锄to ft l l ep o u l n yi n d u s t r yi n h e b e ip r o v i n c ew h i c hj sah e a v i l yc o n c t r a t 。db r o i l * p r o d u d n ga r e a s i b do u t b r e a k s w e r ec o n t i n u 越l yo b s 镪v o di nh e b e ip r o v 主尊c ea l 童量l o u 曲av a f i 吼yo fv a c c i n e sh a v eb e e n u s e dt od r e v e n ti b d a n di th a sb e d 锄0 n s 打a t e dt | l a li n a c t i v e 锄da t t e n u a t e dv a c c j n e s h a v eb e e n n f m n t e dw i t l it h et h r e a to fv a r j 明ts 扫r a j n s t h ea 口p e a r a n c eo fa n t i 2 e n i c v a r i 雒l so f l b d vc o u l db e 宅1 1 er e a s o 矬f o f 也o s e6 e l dl b do u t b l 诎s t h es 订a i no fi b d v 啪sa l s o o b t a i n e dm r o u 靠c u l t i 】i 噎n ga i l dr 印l i c a t i n 譬i ns p f e m b r y os e v e r a l 窟e n e r a t i o n sa n dc e fs e v e f a lg e n e r a b o n ss u c c e s s 如l l y t h ec h a r a c t e ro f t h ov i l l l si s 舀抵u n d e fd e c l nm i c r o s c 8 d e | ti st o l e l ! 氇n tt oa e 墩e ra n dc h l o r o f b n n i i tc a n e n d u r ed h 2 0 b u tm ev i n l l e n c eo f 如ev i n l s 删u c e sal “d ea t5 6 f o r3 0 m i n 1 h e r cw a sn ot y p i c ms y i n p t o n li n 也ei n f e c t e dc h i c k c n b u tl c s i o no fl 舯p h o c ”c si n b u r s 稿鞠ds 瞳e e nw e r ed e 姆c t e du l 稍e rl 窑h tm i c f o s c 。p e 。1 飞er e s u n ss 重1 0 w e db l 拄3 8 l a 昀曲ya n ds p i e n i ce d e m aa 最e ri n f e 硎o nb yi b d v b m p h o c y t en c c r o s i sa n dm a i i y n e u t r o p h i 】sa p p e a r e di n 龇i n t e r s t i 畦姗o fl ”1 p b o i df o l l i c l e sd u n ga i l a p h a s co f i | l f e c t i o n n ei 砖e xo f b 黼aa l s ob e c 0 撙c s 黜a l l e fa n 嚣i n 萎t i o n 强ed e 群e eo f d 印l e 畦o n w a sc o 删a t e dw i t l lv i r u l e f l c e t h e s ec h a r a c t e r si n d i c a t e 俄i b d v sa r co fl o w c r v i r u l e n c e 髓l e 豫v e r s et a n s c r i p 蛀o np o l y i n e f 辐ec h a 主nr e a c 耄i o 珏c 瓣l l a sb e e np f c v i 洲s l y a p p l i e da sas e i l s i t i v e r 印m d u c i b l ea 1 1 d 柏p i da p p m a c hf o rd e t e c t i o na 1 1 dq u a n t 描c a t i o no f n u d e i ca c ! i d 1 nt h i s 咖d y t h e 俐郴e 岫s c 一曲o np o l 炉e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( r t p c r ) w a sa 瓣l i 矗t od 瞳斌v p 2 器e 两et a f 髓s e g m 髓to f 4 9 娜i s 鼬翻i f i c ds u c c e s s l l y 1 n t h i ss t u d y ，t h cc o d i n 叠r e 妇o n sf o rv p 2o f2i s o j 甜e s a r ea i l a l y s 甜t h en u c l e o t j d ea i l d d e d u c e da m i n oa c 主ds e q u c c so ft l i e2i s o l a t e sw e r ec o m p a r e dt om ef e f b r e n c e s e q u e n c e s a c c o 皤i n gt o 斑es 打a i n so f 龇i 转d v 抟p o r t 醯，t 1 e 曲y l o g e n e t i et r e co fm e l b d va n dn l ea i l a l y s i so f 鲫e t i cv 撕a l i o nw e r eo b t a i n e d t h er e s i l l ti n d i c a t e dt l l a tt 1 1 e h o m o l o g o u sr a t ew i me w 啦 e a ns t a n d a f di i s9 4 5 - 9 7 9 ，m es e c o n do n ew i 幽c u li s 9 0 。3 9 5 2 孙ef a t e 弼伽。啦e r si sl o w 豇a n da m 醴c 锄s t 卸d a r ds t ca n d 2 7 3a s w d l k e yw o r d ：母d v ；8 t r 0 曲y ；i n d e xo f k r s a ；c u l 瀚e ；i d e l l t i 矗c a 鞋：r * p c r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 德入已经发表或撰写过的磷究成果，也不包含为获得遗燕塞壁盘鲎或其他 教宵机构的学位或证书而使用过的材料。与我一阔工作的同志对本研究所做的任 籍嚣献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：哥露卫签字日期：h 年月偿日学位论文作者签名：矿露卫签字日期：珈年6 月借日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑些盛些盘璺有关保觏、使用学位论文的规 定，有权保罄并肉国家有关部门或枫构送交论文煞复印l 牛鞠磁盘，允诲论文被套 阅和借阅。本人授权煎曼垦盘些蕉鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据痒送行捡索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段傈存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密厝适用本授权书) 学位论文作者签名：于豆要 导师签名： 劢继1 习 签字疆期：弘一f 年月堙日签字e 期：童p f 年善兵f 萝臼 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 郯编： 河北省传染性法氏囊病病毒地方分离株的培育和鉴定 1 引言 i b d v 是引起幼鸡的急性、高度接触性、杀淋巴细胞性疾病，主要发生于3 8 周龄的幼鸡， 也曾见于3 月龄以上的鸡。本病的特点是发病率高、病程短、可诱发多种疫病或使多种疫苗免 疫失败。本病遍布f 全球养禽地区，在工业化养鸡业发达的国家尤为严重【lj 。 l b d 于1 9 5 7 年首先在美国特拉华洲( d e 】a w a r e ) 的甘布罗镇( g w l b o r o ) 附近的一些鸡场发现， 人们把它称为甘布罗病。1 9 6 2 年，c 。s g m y e 首次详细报道了这种病，当时发现死于该病的鸡的 肾脏极度肿大，因此又称它为“禽肾病”口】。w i n t e r f i e l d 和h i t c l j l e r 描述了一个来自野外的与“禽 肾病”相似的病例他们从病鸡体内分离到一株病毒g r a y 株，认为它是“禽肾病”的病原。可是 后来的研究发现，用g r a y 病毒免疫过的鸡仍然可以患“禽肾病”，并且可引起特有的法氏囊病变。 后来，w i n t e r 6 e l d 成功地用鸡胚分离到该病的致病因子一一- 传染性法氏囊因子州删。1 9 7 0 年， 在世界禽病大会上，根据h i t c h n e r 盼建议将这种引起法氏囊特征性病变的噙肾病”命名为传染 性法氏囊病1 i ，其病原则统一称为传染性法氏囊病病毒。目前己知l b d v 分为血清l 型和i i 型 ”j 。血清i i 型株从火鸡中分离，对鸡和火鸡均无致病性m t 7 j 。血清i 型对鸡等多种禽类具有致病 性。血清i 型经典株、变异株和野毒株与现用疫苗存在差异m ，毒株之间的抗原性也不相同惮1 。 因此通过交叉中和试验又将i 型毒株分为多个亚型bj 。八十年代中期，在菱国首先分离到了抗 原性和致病性与标准株和经典株截然不同的变异毒株o “。在d e l m a r v a 家禽生产地区发现 i b d v 血清i 型变异株变异株可以突破标准株的母源抗体的保护，这些变异株的出现，增加 了i b d v 感染的复杂程度”l 。 a 1 l a n 等于1 9 7 2 年报道了i b d v 早期感染可以引起免疫抑制l i ”。m d v 感染引起免疫抑制 的确定，极大地增加了人们对控制本病的兴趣。血清】型的i b d v 遍布全世界的家禽主产区， c h e t t l e 等于1 9 8 9 年在荷兰分离到高致病力的i b d v 毒株【1 ”，在世界的许多地区，该毒株可以 引起i b d 的严重爆发并伴有高死亡率。我国于1 9 7 9 年先后在北京、上海、广州等地发现了本 病1 1 t 2 0 】。1 9 9 0 年以后，超强毒株( ( w l b d v ) 和变异株或舡清亚型的出现又使该病呈现了新的流 行特点口“，i b d 免疫鸡群常常发病，甚至出现死亡率达5 0 1 0 0 的病例。该病目前己成为危害 我国养鸡业最严重、最棘手的传染病之一，人们十分重视对该病的研究，尤其在病原的分子生 物学方面进行了深入的探讨。 1 1 传染性法氏囊病病毒的基本特性 1 1 1l b d v 的生物学特性 i b d v 为双r n a 病毒科，禽双m q a 病毒属。传染性法氏囊病病毒粒子为单层衣壳，衣壳 由3 2 个直径为1 2 n m 的壳粒组成，无囊膜，呈六角形，二十面体立体对称结构。除完整病毒粒 子外，还常见有空农壳，在感染细胞内，病毒常呈晶格状排列，病毒粒子直径为5 0 6 0 1 l m ， 适应于鸡胚成纤维细胞中繁殖的病毒粒子较小，约2 0 3 0 n m 。电镜观察发病鸡法氏囊病料，可 见感染的细胞胞浆内的病毒呈品格状排列。完整的病毒粒子在氯化铯中浮密度为 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 l - 3 1 1 4 3 幽m ，不完整病毒粒子低于这个密度馕范匿。梭衣壳内的棱酸为双节段双股r n a ， 其沉降系数为1 4 s ，在硫酸铯中的浮密度为1 + 6 2 咖m 。病毒基因缀由两个片段的取链r n a 组 成，片段a 和b 的分子量分别为2 5 1 0 6 d 和2 2 1 d 6 d ，c + g 约占r n a 总量的5 5 3 ，解链 湛菠1 谯) 为9 5 5 。 基因组中核酸含量分别为c ( 2 7 8 呦a ( 2 3 4 ) g ( 2 7 5 煳 u ( 2 1 3 ) 。i b d v 非常稳定，对低 p h ( p h 2 ) 氯仿、乙醚等脂溶剂不敏感，对热和午燥有相当的抵抗力，5 6 5 小时或6 0 3 0 分钟 仍有活力。p h l 2 或7 0 3 0 凳铮或n 5 氯化氨作壤l o 分锋能杀灭瘸毒。 l b d v 在体内增殖的靶器官是鸡的中枢免疫器官洼氏囊组织，对法氏囊中未成熟的b 淋 巴细胞或b 涝巴细胞前体细胞具有锻强的亲囔性f 。瘸毒在辫巴细胞中增越的同时，会使细 胞发生变性、坏死，从而发挥其致病作用。 i b d v 可通过鸡胚培养和细胞培养实现体外增殖。鸡l i e 培养是l b d v 增嫩的最好手段，实 践证踞，绒毛尿囊膜( c a m ) 接种途径最为敏感。鸡胚通常在感染盾4 6 天死亡，感染鸡胚发育 阻滞，水肿和出斑，鸡胚和c a m 中含有大量病毒，尿囊液中病毒禽量较低。尿囊腔途径接种 比o m 途径接种病毒滴度( e i d ) 低1 5 2 o 个演度。适应于鸡艇的l b d v 可在鸡胚成纤维细胞 ( c e f ) 上增殖，并产生臻显的细耱病交，形成岗鼹可见的蚀斑。l b d v 也辘在鹏蕊法氏囊细胞、 肾细胞中增殖，产生细胞瘸变和形成蚀斑。 1 1 2i b d v 的壤养特性 洚多l b d v 毒株鑫适应予鸡艇漂缨耱培养物。殷多浍用鸡菸、鸡胚法氏囊细胞( c e b ) 、 鸡胚肾细胞( c e k ) 、鸡胚成纤维细胞( c e f ) 的程序分离m d v ，这也反映了几种细胞分离i b d v 的 难易程度。l k e r t 和d a v i s 用鸡胚法氏囊细胞分离野毒，井用病理缀织学和免疫荧光法作了检 测。i b d v 可在培养豹c e k 中生长并予3 5 d 瑟产生细胞病变( c p 琶) ”，c e f 用于培养i b d v 托 鸡胚或乳鼠更敏感，已被大多数实验室用于增骥i b d v ，接种c e f 后5 h 可观察到蚀斑的形成m “。大蚀斑( 1 两毙小蛙斑s p ) 克隆化毒藩在c e f 上更易予艇长增殪，因两滴麈鞍赢，l p 毒e 其 父母毒株对鸡胚的致病性强，中和试验表明这些克隆毒株与原毒抹在抗原性上有差异“。但并 不是所有分离株都能适应于c e l 水w 。l ( o n n i n e 等用i b d v 母源抗体封阻i b d v 在c e f 上的吸附 并认为c e f 上有l b d v 豹受体存在网。鸡单核细胞也支持l b d v 豹螬殖 刈。o i n e 等还报道了 i b d v 可在鸡脾脏粘附细胞( c h i c k 曲s p j o ma d l l e 瑚t ，c s a ) 中增殖p “。但i b d 不影响鸡外周血液 和脾脏中c d 和c d 缨胞的比例。i 沁：r 等囊内接种l b d v 骺餍电镜硬究其致病性聪发现，除淋 巴细胞和巨噬细胞外，法氏囊内异嘈性网状细胞和网状上皮细胞中也有病毒存在。 1 1 1 3 流行瘸学l 搭床症状疑瘸理变化 传染性法氏囊痫的自然感染仅发生于鸡釉火鸡，各釉潞种的鸡都能感染。瘸鸡是主要传染 源，病毒通过其粪便、污染的饲辩、饮承、垫料、用具、人员等，直接接触和闻接传播。病毒 可持续存在于鸡会中，污染环境中的病毒可存活1 2 2 天。小粉甲虫蚴是本病传播媒允，由鸡舍 采集的掣虫蚴磨碎制成悬渡嚷易感鸡琊；i 起发病。 本病往往突然发生，传播迅速，当鸡舍发现有被感染鸡时，在短时间内该鸡舍所有鸩都可 2 河载省传染经法氏囊病瘸毒姥方分离株的培育和鉴定 被感整，通常在感染后第3 炙开始死亡，5 7 天选到高峰，以后很快平怠，表现为高峰死亡和 迅速康复躲盏线。死亡率整并很大，蠢的龊为3 5 ，一般为1 5 2 0 ，严重发病群琵亡率可达 以上。据不少国家报道发现有l b d 越强毒毒株存在，死亡率对高达7 缸本病索与大酾释德瘸、 新城疫、鸡支原体瘸混合感染，导致死亡率上升。 传染性法氏囊瘸潜伏期为2 3 夭，疑初发现有些鸡睬自己的泄殖腔。病鸩羽毛蓬松，精神 萎顿，常扎堆在一起，出现腹泻，捧出白色粘稠和水样稀粪，泄磺腔周围的羽毛被粪便污染。 严重的痛鸡头豢蟪，阈暇呈昏睡状。在舜期体温低于正常，严重脱水，极度虚弱，最后死亡。 近，l 每来，发现由i b d v 的甄型毒株或变异毒株感染的鸡，表现为亚l 巍藤症状，炎症授应弱， 法氏囊萎缩，死亡率较低，但由于产生免疫抑制严重，故危害性更大。死亡鸡剖检可见腿部和 胸部肌肉出血，法氏囊的病变其有特征性，可觅法氏囊内粘液增多，法氏囊永辨和出血，体积 增大，后新珐氏囊萎缩，粘膜多混浊不清，粘膜表面有点状m 血或弥漫性出盘。严莺者法氏囊 内有千懿挥渗出物，蟹魅鸯不同程发的辨胀，艨胃和舰霹交界处封条状出盘点。 1 2 传染性法氏囊病病毒的分子生物学特性 1 2 1 转d v 基嚣继豹缩梅黪征 l b d v 在分类上蒇双链双节段r n a 病毒辩( b i m “证d a e f ”) 3 j ”。l b d v 基函组有两个双股 r n a 片段”o ，分别为a 片段( 大片段) 霹 b 靖段夺片段) ，包括5 端非编码区、编码嚣和3 端 j # 编码送。a 片段长约3 2 0 0 3 3 0 0 划，包括两个完整的翔读框架o p r e a d i n g 轴a m e ，o r f ) ， 小o r f 在前，大o r f 在后。小o r f 与大o r f 部分重簌，分剐编码v p 5 和v p 2 一v p 4 v p 3 ，b 片段长约2 8 0 0 + 2 9 0 0 b p ，编码v p l 。m a 曙m 等测得b 片段长2 7 9 5 b p ，含有一个o r f 起始于1 5 b p 处，终止于2 6 3 4 b p 娃。在- 5 b p 处发现l ( o k 保守序列，裘骥一5 b p 是转译起始点。编硝产物为 9 0 k d 豹多肢( v p ) ，是病毒的r n a 聚合酶。 1 2 2l b d v 蛋囱及萁作粥 l b d v 的4 种瘸毒蛋白v p l ，v p 2 ，v p 3 和v 料，其分子量分别为姗4 l k d ，3 2 k d 和2 8 x d ， 新发瑷的另一种病毒蛋白v p 5 ，分子鬃为2 l ) a ，v p 2 含量最高，如在i 型l b d v 中售总蛋白 含量的5 1 ；v p 3 是另一种主要蛋匀占总蛋白含量的4 0 ：v p l 、v m 为微量蛋白，分别占 蛋白总量的2 和6 。v p 2 ，v p 3 ，v p 4 先被a 片段大o r f 编码成分予量缍为1l 甜的兹体蛋白 ( n h 2 。v p 2 v p 4 v p 3 o ( ) h ) 精，在病毒成熬过程巾耱工成v p 2 ，v p 3 ， 4 。i b d v 各蛋在成熬 过程中均束被糖基化。在融合蛋白中，从8 位氨基酸到4 9 8 位氨基酸为v p 2 ，从7 7 6 位氨基酸 到9 9 7 位氨基酸为v p 3 ，中闻的一段为珥。 v p 2 ，v p 3 是病毒的主要结构蛋白，构成病海核农壳的主臻成分。v p 2 具有一个构象依赖性 ( 不连续) 的中和抗蘸决定簇 3 s 】其诱导的中和抗体能被动圭| 熟僳护宿主不受l b 】) v 譬染，故一 般试为v p 2 是l b d v 豹宿主保护性抗原。v p 3 其寄一个嚣构象依羧性f 连续) 的抗原决定蔟，早 期曾报道v p 3 具有血清型特异性抗原决定簇”，但后来豹研究发现这些抗原决定簇位于v p 2 3 河北农韭大学壤士学位( 毕攮) 论文 主( 删。攒b e c h t 的研究，针对v p 2 的擎瘫隆抗体w 以区分瘸毒的两个血清型，而针对v p 3 的单 克隆抗体能识别两个血清型中一个特异性抗原。b a y l i s s 等l 对4 株血渍i 型株的a 片段v p 2 的可变聪研究发现，该区赢接影响中和抗体的产生，弗与单克凝抗体之恻有结合位点1 4 2 “，主 要决定病毒的撬原性。v p 2 还具有两种盎涛型共有的诱导非中和性抗体的抗原位点| 3 越。g a 壕v 等发现6 株中和性荦克隧抗体中有2 株能与交| | 生届的v p 2 结合，从这点表明v p 2 上存在 诱导中和性抗体的穿列依赖性位点。所叛对v p 2 中和挫抗巍位点结构与功麓的深入研究必将对 l b d 免疫预防提供理论基础。不露毒株氨基酸的差异主要位于v p 2 的2 0 6 至3 5 0 个氨基酸，称 之谤v p 2 高变区形成3 个重要的结构，即分别由2 1 2 - 2 2 4 位、3 1 4 3 2 4 位氨基酸残基组成的 两个亲承区，和第二个亲水区之莲( 3 2 $ 3 3 2 ) 的七默送( 1 l 印l a p e p l i d e ) l ”。赫两者与病毒的抗原效 有关，后者与稿毒的毒力有关。1 9 9 0 年，b a y l i s s 等人对靼株l b d va 片段序列进行了e e 较，发 现2 3 9 3 3 2 位氨摹酸的差异，占攘个多凝莉体蛋白中氨基酸差异的5 0 ，而其歉度只占总长艘 9 ，这一区域被称为v p 2 高变区( h r p e r v a 痢潮er e 西o n ) 。为礤究之便，将其定位于a c c l $ p ei 巍 个酶切位点之间，包括2 0 6 3 5 0 位共1 4 5 个氮基酸残基1 7 。”这段隧域内不同毒株间的变昴很大。 如我国山东5 抹l b 8 i v 野毒株v p 2 基因离变区的 w + p c 黼分橱，并与疫葫株和其他变爨拣 的比较，短示这s 个分离株与常觏疫苗株在r e 位点土有很大差异，而这种变异则有可糍使野 毒拣逃脱疫罄保护作用，导致受疫失败剐。v p 2 离交区内所包禽的三个十分燕要的结构中，第 一个亲永区与构象依赖性抗原表位鹃构象稳定相关，第二个亲永医为中和抗体结台位点1 7 ，删 去两个萦水区中任意一个都会导致中和单抗i7 8 2 无法与v p 2 站台咿j 。经典i 型株中这个亲水 区的氨基酸序列是完全保守的，可以逃避j b d v 经典毒株免疫的傈护，美国变异抹a ，e g l s 等 在这题个嚣域中都弩l _ 2 个氨基毅的渡变隅剐。变异毒株v p 2 蒸因可变嚣氨基酸组成与古蒸毒 椽钉明最不同，如变茹毒株a 的v p 2 可变愿鸯6 个甄基酸残基发生了燮化，变昴毒株 d s 3 2 6 ，e ，龇和g l s 的第二亲承区有l o 个氨基蘸残蒸发生了变化，而且所有交异毒株在v p 2 可变区第2 4 9 位l 。y s 替代了g l n ，很多学者认为这些变化可以使变异株逃避被古典涛株抗体所 中乖产】。亲水性分析结果显示，亲水隧肉个别氨基酸的政变，可以使亲水区的疏水性增加，从 | i 改变整个 奄象。这可能是变异株抗原性发生变异的主要擐嗣“”“。对亮交区甄基酸组成豹 进一步分析表明，除上述联个犬的亲承隧之外，商交区内还有两个小的亲农部位可能也参与形 成中和抗乐表位，不弼毒株在这蹶夸嚣域肉氨基酸的变异导致的亲承饿静变化，逝会；i 起抗琢 的变异滞i 。1 9 9 6 年，d 咖稍耐。等人研究表明，两个亲水区氮萋酸的蘼异可哉不是毒株抗原的 决定西索。网对提出，2 5 4 位静s 才燕变异椿的特征氨基酸。瞢永长分析拢较了多株国d v _ v p 2 基嗣后提出2 个亲承区蘸基酸的麓异可貔不是毒株抗原型的决定嚣索。同时提出2 4 9 位k 和2 5 4 位s 是变异株的特征氨基酸l 删。蘸今，l b d ，毒力相关基因还不十分清楚。不同毒椿v p 2 基因 及其氮蒸酸廖列比较显示：与m d v 毒力有关瓣区域可能燕v 挖基因可交区，尤其是第二个襄水 嚣之嚣的七歃区( s 。w s 糠s g s ) 多年来被试为是l b e i v 毒力强弱的标恚硐。强毒株具有保守的 富禽丝氨酸侮) 的s w s a s g s 序列，弱毒株其育较少豹丝氨酸聊彤l ，不具致病力的盘漓i i 型o h 株崔七肢区内有兰个氨基酸发生了变舅l 嗣。在m d ，离变区内寄一黪位点是较为重簧的。致弱 后的弱毒株可作为活疫苗，病毒致弱的前提是能够适应细胞，r b d v 高变区上的n 2 7 9 和t 2 8 4 便建适应c e f 细胞的芙键性氨基酸黼州。不能适应细胞驰靼种w i b d v ：h “6 、o k y m 、d 6 蛳8 、 u k 6 6 l 在这两个髓点发生了相同瓣交化( n 2 7 9 d ，t 2 8 4 a ) 可以说明这一点”。 4 河北省传染性法氏囊病病毒地方分离株的培育和鉴定 v p 3 蛋白存在于a 片段前体蛋自加工成熟病毒蛋白的过程中，v p 3 含有群特异性的抗原决 定簇，这些抗原决定簇是线性依戆性的，其诱导的抗体只有很微弱的病毒中和能力p ”埘。用病 毒免疫机体后最早出现的血清抗体是针对v p 3 的。v o l k e r ，o p p l i n g 等1 用抗m 清i 型和i l 型 菲中和性单克隆抗体证明v p 3 存在巍个独立的菲重叠的抗摄决定簇，其中一个是嚣摊虞清型共 有的：另一种是血清型特异的。v p 3 含有群特异性的抗原决定簇，具有一定的免疫保护性，但 是由其抗原决定簇诱导产生的抗体只有微弱的病毒中和能力。不同_ 【i 珏清亚型的v p 3 基因棚对保 守，毽也有研究认为，1 8 d v 经典毒椿和强毒撩的最大差荆在丁v p 4 和v p 3 而嚣v p 2 ，b t 等的蜜验说明了这一点，因此对v p 3 基因的研究同样不可忽视。在国内姜平等人9 ”首次扩增 和亮隆_ 并以大肠杼蠹赢效袭达了l b d v 野毒株v p 3 基因，为研究我国l b d 分子流行病学特点 及探讨j b d 有效防治措施奠定了良好基础。此外，v p 3 的c 端区域可能与病毒的包装和稳定病 毒r n a 有关p ”。 v p 4 是一种其有蛋白酶活性的嫡毒多歉，在病毒成熟过程中能将a 片段编弼的融台蛋白抽 工形成v p 2 v p 3 4 纠”。关于v p 4 在i b d v 免疫中的作用知道很少。小o r f 与大o r f 重盎部分 编鹑v p 5 鬣自，v p 5 蛋自对病毒在体外复制是必需的，健在i b d ，感染的细胞中有v p s 蛋囊， 其功能尚不清楚1 5 渊+ ”1 l 。 v p l 由b 片段编码，蛋自分子量为9 0 k d a ，- 圩病毒蛋向总量3 ，是依赖r n a 的r n a 聚合 酶( 船r p ) ，与病毒d s 姒a 复铜有关。，l 在宿主体里台艘釜少置赘台进病毒粒子时分子餐不 发生变化。v p l 还能通过与基因组末端紧密结台而使其环化。 i 3l b d v 疫菌的研究进震及存在洄题 灭活疫莛出l b d v 全瘸毒经灭活后辘以浊佐帮制成，安全可靠丽娶易于售造，对接种者不 引起感染，不引起敝毒，不带来对环境的不利影响和对机体的免疫压力。但却能够有效刺激免 疫系统，产生免疫力，抵抗外来病毒的侵袭。灭活疫糟主要刚于开产前种鸡。使其产生高滴度 的主动抗体移行绘螽代予鸡，使子鸡带有母源抗体，获得被动保护，对雏鸡的翠期感染有报盎 的预防作用。油饺剂灭活苗用于加强和延长种鸡群的免疫力或对接种过活疫苗或感染过野毒的 鸡十分有效”。以翦认为，感染的s p f 鸡的法氏囊组织瘸毒的灭活苗 b 来源予鸡胚活细脓培养 病毒的灭活苗效果好，但最近的研究表明，来源于组织培莽的灭活苗与法氏囊匀浆灭活苗都含 有相似的抗原颗 宜，诱导产生的中和抗体没有滴度上的差别9 ”。 活疫茁是在实验室将徽戋勃在动物体肉或，在缀织培葬基中跃期传代嚣再感染个体嚣不g l 起 严重疾病的毒株，经培养、纯化、冻干后制成。科学家们1 虹利用从动物体内分离的自然减毒株 制备活疫箧。目蘸，毒力最强的疫苗已逐渐被市场淘汰，较普遍应用的是中等毒力疫苗和低毒 力疫苗。据报道强毒力、中等毒力和低毒力的毒株突破母源中和抗体的滴度分别是l ：5 0 0 ，l ：2 5 0 和小于l ：1 0 0 m 5 5 】：中等毒力毒株常常母致1 日龄健康鸡和3 周龄s p f 鸡的法氏囊萎缩和免疫抑 杀f 蚓。当母源撬体洚魔小于l ：l o o o 时，废绘雏鸡注射免疫无毒力疫苗，疫莛毒哥在法氏囊、瘸 腺、脾脏中复制，并持续存在两周【”，”1 。母源抗体一消失，持续存在的疫苗毒即可以引起初次 的主动抗体反应。免疫的干扰依然存在。表达i b d v v p 2 蛋自的重组病毒疫苗，如禽瘟病毒 ( b a y l i s s c d ，1 9 9 1 潮e i n c 挎1 9 9 3 ) 、火鸡疱疹病毒( n a r t e 潞，1 9 9 5 ；t s u k a m o t o k l 9 9 回或禽腺痛毒 s 河l b 农业大学硕士学位( 毕业) 论文 ( s h 印p a r d m ，1 9 9 8 ) 等，由于窃们对抗m d 、，母源抗体的中和作用不敏感，因此，在未来诱导生 动免疫应答上可能会发挥巨大作用。d n a 疫苗也可以考虑，但有一定的局限性，特别是成本离、 应答的个体差异犬、总豹体滚免疫应答水平骶，这些可缝会制约其在实验室的疆制 ( f o d o r l ，1 9 9 9 ；v 粕d e n b e r g r p ，1 9 9 9 ) 。火鸡疱疹病毒疫苗的有效性和安全性都不错 ( j o h n s t o n p a ，1 9 9 7 ) ，因而这一重组技术托其他方法更有优势。最近，有一个新概念即病毒抗体 复合物疫菇h a d d a 越e 1 9 9 7 该技术应用特异性豹裹免中和抗血清或瘸毒中和因子) 与疫藩病毒 在不足以中和疫苗病毒但足以延迟单独使用疫苗引起的病理作用的情况f 进行 ( j e 商s s s h ，1 9 9 8 ) 。这使褥雏鸡在存在被动免疫甚至存在根强毒力的病毒的情况下，来进行更 为宥效的免疫接种。新型疫楚包括基因工程疫苗、强单位疫茁、载体疫装、v 黔蛋囊缺失l b d v 毒拣、d 1 q a 疫苗等。通过近几年的研究，新型疫苗虽然取得了很大进展，但由于受表达璧、疫 营实用性及毒株变异等方弼的影响，离实爝还有一定距离，如何解决这些问题是今后的研究方 向。 l 。4 传染性法氏囊病病毒的检测方法 1 4 - l 原代病毒的缁胞分离培养 常用c e f 和b g m 7 0 两种细胞培养，来自瘸料的i b d v 原始病毒不能直接适应干细胞生长， 两必须先经9 一ll 嚣龄鸡籁连续传代若干次后，对鸡瓤表现出规律性的致病作用，然后再遗应予 细胞培养，在选用来源于法氏囊的原代细魅或b 细腿源的传代细胞系分离效果好，并且在国内 外一些学者对用细胞培养直接进行原代m d v 的分离进行了广泛研究【8 ”。日本学者k e n i i ( 1 9 9 5 ) 等筛选到一株好的细簸系帮禽淋巴肉癌病鸡的b 辩薯细胞l s c c 也k 3 细胞橡【嚣】，不仅可用于原 始病毒的初次分离，弼且适用予各种m d v 毒株，为大规攘分离壤养l b d v 原代辅毒找到了一 种简便、有效的细胞学方法。 1 4 2 琼脂扩散试验 该法简便快速，在感染5 每天后，取瘸鸡法氏囊米摹作悬渡( 1 ：2 ) ，离心去取上清，再用阳 性血清按常规琼扩法进行。魇之也可用已知抗原测定康复鸡群的l b d v 的群特异性抗体。 1 4 3 荧光抗体技术 取痰薅的法氏囊组织幸筝触片或抹骧切片，豫特异的荧光抗体染色姓理后镜捡。为降低非特 异性荧光可先将荧光抗体用s p f 鸡的法氏囊匀浆吸收处理。 1 4 4e l l s a 双夹心抗体e l i s a 检测l b d v 抗蒹是快速、敏感和特舅的盘滴学方法，其有能检测大批样 品，操作规程化，设备简单、易操作，还具有特冥性强，敏感度勰，重复性好等优点，蕊且实 6 河北省传染性法氏囊病病毒她方分离株的培育和鉴定 验所需时间短，2 _ 4 小时完成。目前，广泛地应用于鸡群内i b d v 抗体的评价，尤其适用于较 大规模的血清流行病学调查。单抗抗原捕获一e l l s a ( a c e l l s a ) 的敏感性和特异性更离，对不 同毒株l b d 、，抗原检测，得知变异株与标准株不嗣的原因建交异株的抗原位点发生了缺失和变 异。此外日本学者( n a l c a m c1 9 9 8 ) 等利用聚苯乙烯微球连接单抗对1b d v 抗原进行检测， 结果更敏感，快速，室温下用玻跨作凝集反盔，5 分钟授如现结果，而且不霜特殊仪器。 】4 5 中和试验 此方法能够鉴别不同的l b d v 血清型，区分i b d v 分离株之间的麓异。常用细胞适应毒在 c e f 上进行微量中和试验。 1 4 6 核酸( r n a ) 电泳 墩病变法氏囊或感染鸡胚的维织巍剂戳及感染细胞，提取核酸，电泳整剐。 1 4 7 核酸探铥技拳 核酸探针技术一般是用人工合成及重组质粒的方法获得所需要的探针。首先通过重级质粒 来获取有关嚣基因片段或者鼠已知驰法氏囊病毒基鞫序弼中，筛选一莰序列并以人： 方法台成 与其互补的一段寡核菅酸作为探针，蒋采用不同的标记方法以构成核酸探针。成用该技术可对 法氏囊病毒r t _ p c r 扩增产物进行捡测，也可以梭测病璃斑液里的l b d v 。 1 4 8i 藏转录一聚台酶链反应技术似r - p c r ) 逆转泶一聚合酶链( r 1 w c r ) 是以r n a 为起始材料经逆转录反应产生c d n a ，再以c d n a 为模板进行p c r 扩增，而获取耳的基因或检测基因表达。法氏囊病毒为双股r n a 病毒，它必 须经反转录后才能进行p c r 扩增。大整研究表骥：r t p c r 技术豹阳牲捡出率髓著离子聚胡聚 丙烯酰胶凝胶电泳( p a g e ) 检测的阳性率，且检测时间短，敏感性高，能从仅含1 个拷贝的样品 中捡出s 的核酸。嚣且对被检样品貘处理要求不赢。因此特别适合子含毒量极少的感染组织诊 断，包括翠期感染的m d 诊断。 1 。4 9 套式- p c r 技零轴e s t 。d - p c r ) 套式_ p c r 技术( n 嚣蚺p c 】置) 是应用两对引物先后扩增靶片断的一种技术，即先应用外侧引 物进行第一次扩增，再将第一次扩增声c 物作为模板，孀另一对s l 耪对其扩增，献面保证了结果 的特异性和敏感性，以达到从很少的模板中获得商浓度和黼纯度的靶片段的目的( 9 1 i ae la 1 1 9 8 8 ) 。比常援p c r 灵敏1 髂以上。国内，陈短英等( 陈红英等，1 9 9 9 ) 拜j 反转录一套式p c r 方法检测了法氏囊瘸毒。套式i 汀p ( 聚技术还可以结台限南性酶切片段长度多态性( 砌也p ) 分析 技术运用于l b d v 变异株与经典株、致病株与疫苗株的区分( j a c k w 0 0 dd j 等，1 9 9 7 1 。 7 渑北农监大学硕士学经( 毕业) 论文 1 5 本课题研究的目的意义 近年来，l b d v 毒株毒力不断出现变异，其中也有不少关予中国m d v 变异株豹研究报道。 为了孬漓河北保定流行的i b d v 致病性，掌握河北保定地区耳前的l b d v 漉幸亍现状，本实验采 集来自河北保定的2 个i b d v 野毒株进行培育鉴定井比较对鸡以及鸡胚的致病性。将这两株 i b w 进行病毒核苷酸测定螽，蒋遗嚣阚源性的眈较研究，用以确定l b d 在河就地区的致病 特点。 许多学者证实。m d v 的免疫抑制效应因病毒株而表现不同。i b d v 对法氏囊组织损伤程度 主要决寇予毒株毒力瓣强弱，强毒株能导致免疫捧剁，弱毒株能激活免疫系统产生抵抗力 9 4 娜。本研究基于免疫学方面的知识进行了探索，希望为免疫机理的验证提供材料。 上墩纪八十年代沫，自从欧湖发现致死率很高的w j b d v 以来1 删，很快传播至亚洲和世界 其宅地区，传染性法氏囊病的危害进一步显现出来了。诲多研究都试隧进一疹阐明l b d v 病毒 的核酸分子结构与其致病性的关系，但是这臻报道中。均着重于序列的比较，而没有对致病燃 本身做很多的比较研究。本研究选择2 个i b d v 野毒株，将它们的致病性和v p 2 基因高变区4 9 4 个碱基序列分拆，比较硬究。 同时，为探索省内l b d v 毒株的特性，随机选取国外的毒力不同的m d i v 与本实验中分离 的毒株进行核萌酸的比较，希望可以就分离培养病毒感染所造成的危害及感染的作用机理迸彳亍 分子水平魄探讨。 8 河北省传染性法氏囊病病毒地方分离株的培育和鉴定 2 1 材料 2 材料和方法 2 1 1 s p f 种蛋：购自北京梅里亚维通实验动物有限公司 2 1 2 毒株：两株疑似传染性法氏囊病病毒株席研究室分离保存 2 1 3i b d v 琼扩标准抗原及血清：购自中国兽药监察所 2 1 4i b d v 抗体：免疫鸡采血清 2 2 所需主要试剂 胎牛血清 r p m i 一1 6 4 0 胰酶( 1 、聊s i n ) 蛋白酶k ( p l 咄e j n a s ek ) 乙二胺四乙酸二钠( e d t a ) 琼脂糖 十二烷基磺酸钠( s d s ) 水饱和酚 焦炭酸二乙酯( d e p c ) p e g 6 0 0 0 异戊醇 氯仿 三羟甲基氨基甲烷( 瓢s ) 丙烯酰胺( a c r ) n ，n 一哑甲基双丙烯酰胺( b i s ) 四甲基乙二胺( t e m e d ) 过硫酸铵( a p ) 硼酸 蔗糖 溴酚兰 d n t pm i x t u r c 杭州四季青生物工程材料有限公司 g l b c o b r l d i f c o m e r c k 北京化工厂 s j g i n a p r o m e g a 北京鼎国生物技术发展中心 a m r e s c o 苏州正兴化工研究所 北京化工厂 北京化工厂 s i 舯a s i g m a s i g l n a 北京化工厂 北京化工厂 天津市天大化工实验厂 北京化工厂 s i 舯a t a k a r a 9 河北农娩大学硕士学位( 毕业) 论文 l 讣l a 酶抑制期 m _ m l v 逆转录酶 t a q 脚q a 聚合酶 澳化乙锭( e b ) d n am a f k 耐删a 偿ri + h i n d i l l l 低分子量蛋白m a r