（水产养殖专业论文）近江牡蛎（Ostrea+rivularis）两个野生种群遗传多样性的研究.pdf

近江牡蛎( o s t r e ar i v u l a r i s ) 两个野生种群遗传多样性的研究 摘要 近江牡蛎( o s t r e ar i v u l a r i s ) 广泛分布在我国南北沿海，多栖息在河口附近盐度 较低的内湾，是我国主要的养殖贝类之一。作为经济贝类，通过对其分子遗传学水平 的研究可以让人们更好的保护、利用和开发这种资源，创造更好的经济效益。广东沿 海对近江牡蛎的养殖有三百余年的悠久历史，湛江官渡和阳江程村两地的近江牡蛎是 目前广东沿海具有规模性丌发和应用价值的两个天然种群，但是对它们在分子水平的 研究却很少。因此本实验以此两地的野生近江牡蛎为研究对象，以随机扩增多态性 ( r a p d ) 和r d n a i t s1 序列分析为实验技术手段，结合形态学特征统计分析对这两 个地理种群进行遗传多样性分析，结果表明： ( 一) 形态学特征分析： 为了评价种群间的差异，共测量了九个形态指标：总重( t w ) 、右壳长( r a p m ) 、 右壳高( i m v m ) 、右壳凸( i 盯) 、韧带长( h l ) 、左壳长( l a p m ) 、左壳高( l d v m ) 、 左壳凸( l t ) 和闭壳肌痕宽( s w ) 。湛江种群的九个形态指标平均值分别为2 3 。6 8 9 、 5 3 0 5 r a m 、7 9 8 0 m m 、2 0 5 0 r a m 、18 7 4 m m 、5 5 4 3 m m 、8 2 0 6 m m 、2 0 7 5 m m 和l5 2 7 m m ； 阳江种群的九个形态指标平均值分别为3 5 5 5 9 、6 0 5 8 m m 、9 7 6 2 m m 、2 3 5 3 m m 、 1 9 8 0 m m 、6 6 1l m m 、1 0 3 1 9 m m 、3 2 4 0 r a m 和1 7 9 0 m m 。 为了消除贝体规格大小对参数值的影响，将每只贝的所有参数分别除以左壳高 ( 左壳高除外) 予以校正，得出8 个形态学比例性状( x l x 8 ) 进行主成分分析。共 构建4 个主成分，其贡献率分别为3 4 8 、2 1 2 、1 5 3 和1 3 2 ，累积贡献率为 8 4 5 。 ( 二) 随机扩增多态性( 凡心d ) 分析： 选用1 2 个扩增效果好、稳定的引物进行扩增，共得到1 5 7 个位点，平均每个引 物可产生1 3 个位点，片段长度在2 0 0 2 2 0 0 b p 之间。分析结果显示：湛江、阳江两个 种群的多态位点比例为8 9 6 2 和8 9 5 7 ；遗传多样性指数为0 4 1 7 0 和0 4 3 3 4 ；种群 间平均遗传距离d 为0 0 3 2 7 、平均遗传相似性为0 9 6 8 1 以及平均遗传分化系数( g s t ) 为0 0 4 3 7 。 ( 三) r d n a i t s l 序列分析： 用合适的引物扩增了核糖体d n a 转录间隔子i 区间的序列，得到1 8 s 、5 8 s 部 分序列和i t s l 全部序列( 包含引物) ，其中i t s l 序列片段长度为4 7 8 - 4 8 5 b p ，共有 1 1 个变异位点，两个为转换( a g ) ，其他为插入缺失( 从、t ) 。湛江和阳江种群 1 各获得8 个基因型，其中两种群共享一个基因型。两个种群的a t 、c g 碱基平均含量 分别是4 1 7 1 、5 8 2 9 ( z j ) ；4 1 5 7 、5 8 4 1 ( y j ) ；两个种群间的平均遗传距离 0 0 0 0 4 。 关键词：近江牡蛎，湛江种群，阳江种群，遗传多样性分析，形态学特征，r a p d 标记，r d n a i t s l i i s t u d i e so ng e n e t i cd i b e r s i t yo ft w o w i l d p o p u l a t i o n so fo y s t e r 傩刀r e 4 兄r 班伍4 冗硌 a b s t r a c t o s t r e ar i v u l a r i si sak i n do fs e s s i l eb i v a l v e ，w h i c hd i s t r i b u t ea l o n gt h ec o a s tf r o mt h e n o r t ht os o u t ha n dm a i n l yi n h a b i t sa tt h el o ws a l i n i t yo fe s t u a r i n ei no u rc o u n t r y o y s t e ri s o n eo ft h ei m p o r t a n te c o n o m i cm a r i n es p e c i e sf o rb r e e d i n g a sa ne c o n o m i cs p e c i e s ， s t u d i e so ng e n e t i cd i v e r s i t ym a yb er e a l i z e dt ob ep r o t e c t e d ，u t i l i z e da n de x p l o i t e db e t t e r o s t r e ar i v u l a r i sw a sb r e da b o u tt h r e eh u n d r e dy e a r si ng u a n g d o n g ，w h i l en a t u r a l p o p u l a t i o n si ng u a n d u o fz h a n j i a n ga n dc h e n g c u no fy a n gj i a n ga r e a sh a v ed e v e l o p m e n t a n da p p l i c a t i o na ti n d u s t r i a ls c a l ea l o n gt h ec o a s ta r e ai ng u a n g d o n gp r o v i n c e p r e s e n t l y s t u d i e sa b o u tt h ew i l do s t r e ar i v u l a r i so ng e n e t i cd i v e r s i t ya r ep o o r t h e r e f o r e ，t h i sp a p e r r e p o r t st h es t u d i e so ng e n e t i cd i v e r s i t yo fw i l do s t r e ar i v u l a r i s ，w h i c hw e r ec o l l e c t e df r o m z h a n j i a n ga n dy a n g j i a n g ，b yc o m p a r i n gt h e i rm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r s ，a n a l y z i n gt h e i r g e n e t i cd i v e r s i t yu s i n gr a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a m a r k e r sa n dt h e i ri n t e r n a l t r a n s c r i b e ds p a c e r1s e g m e n t t h er e s u l t ss u g g e s tt h a t ： ( 1 ) m o r p h o l o g i c a l l y ：f o rc o m p a r i s o no ft h e d i f f e r e n c e si nm o r p h o l o g i c a lt r a i t s b e t w e e nt h et w op o p u l a t i o n s ，t h em e a s u r e dc h a r a c t e r sw e r ei n v o l v e di nt o t a lw e i g h t ( t w ) ， l e n g t ho ft h er i g h tv a l v e ( r a p m ) ，h e i g h to ft h er i g h tv a l v e ( r d v m ) ，d e g r e eo fc u p p e do f t h er i g h tv a l v e 呷) ，l e n g t ho ft h eh i n g ep l a t e ( h l ) ，l e n g t ho ft h el e f tv a l v e ( l a p m ) ，h e i g h t o ft h el e f tv a l v e ( l d v m ) ，d e g r e eo fc u p p e do ft h el e f tv a l v e ( l t ) a n dw i d t ho ft h ea d d u c t o r m u s c l es c a r ( s w ) t h em e a nv a l v e so ft h en i n et r a i t si nz h a n ji a n gp o p u l a t i o nw e r e2 3 6 8 9 ， 5 3 0 5 m m ，7 9 8 0 m m ，2 0 5 0 m m ，18 7 4 m m ，5 5 4 3 m m ，8 2 0 6 m m ，2 0 7 5 m ma n d15 2 7 m m ， w h i l et h o s ei ny a n g i i a n gp o p u l a t i o nw e r e3 5 5 5 9 ，6 0 5 8 m m ，9 7 6 2 m m ，2 3 5 3 m m ， 1 9 8 0 m m ，6 6 1l m m ，1 0 3 1 9 m m ，3 2 4 0 m ma n d1 7 9 0 m m t oe l i m i n a t et h ee f f e c to ft h es i z eo nt h ei n d i v i d u a l ，t h ec h a r a c t e r s ( e x c e p th e i g h to f t h el e f tv a l v e ) w e r es e p a r a t e l yd i v i d e db yh e i g h to ft h el e f tv a l v ea n da n o t h e re i g h t c h a r a c t e r sw e r eo b t a i n e d p r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i sw a sc o n d u c t e dt oi n v e s t i g a t et h e m o r p h o l o g i c a lv a r i a t i o no nb a s i so ft h ee i g h t c h a r a c t e r s at o t a lo faf o u rp r i n c i p a l c o m p o n e n t sw e r eo b t a i n e d ，t h er a t eo fc o n t r i b u t i o nb e i n g3 4 8 ，21 2 ，15 3 a n d13 2 r e s p e c t i v e l y , t h ec u m u l a t i v er a t eo f c o n t r i b u t i o ni s8 4 5 ( 2 ) a m o n g12 0r a n d o mp r i m e r ss c r e e n e d ，1 2p r i m e r sr e v e a l e dc l e a ra n ds t a b l e i ! i 、一“9 p 一 p o l y m o r p h i s m sw e r es e l e c t e dt oa m p l i f y at o t a lo f15 7p o l y m o r p h i cl o c iw e r eo b t a i n e d t h el e n g t ho fa m p l i f i e db a n d sr a n g e df r o m2 0 0 b pt o2 2 0 0 b pa n do n ep r i m e ra m p l i f i e d a v e r a g e l y13l o c i t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h ea v e r a g eg e n e t i cd i v e r s i t yi n d e x ( di s0 417 0 i nz h a n j i a n gp o p u l a t i o na n d0 4 3 3 4i ny a n g j i a n gp o p u l a t i o n t h ea v e r a g er a t eo f p o l y m o r p h i cl o c u si nz h a n j i a n gp o p u l a t i o na n di ny a n g j i a n gp o p u l a t i o ni s8 9 6 2 a n d 8 9 5 7 ，r e s p e c t i v e l y t h ea v e r a g eg e n e t i ci d e n t i t y ( d ，g e n e t i cd i s t a n c e ( d ) a n dg e n e t i c d i v e r g e n c ei n d e x ( g s t ) b e t w e e nt h et w op o p u l a t i o n si s0 9 6 81 、o 0 3 2 7a n d0 0 4 37 r e s p e c t i v e l y ( 3 ) t h er i b o s o m a li n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r1s e g m e n ti no y s t e ro s t r e ar i v u l a r i sw a s s t u d i e db yp c rw i t hap a i ro fv e r yu n i v e r s a lp r i m e r t h ep c r p r o d u c tc o n t a i n s18 sg e n e 、 5 8 sg e n e ，p a r t i a ls e q u e n c e ，a n di t s1 ，c o m p l e t es e q u e n c e ( c o n t a i n st h ep r i m e r s ) t h e l e n g t ho fi t s 1 s e g m e n tv a r i e sf r o m4 7 8 b pt o4 8 5 b pw i t h1 1v a r i a b l es i t e s ，i n c l u d i n gt w o t r a n s i t i o ns i t e s ( a g ) a n dn i n ei n s e r t i o n d e l e t i o ns i t e s ( a 一、t _ ) e i g h tg e n o t y p i cs e q u e n c e s w e r eg o ti nt w op o p u l a t i o n s ，i n c l u d i n go n eg e n o t y p es h a r e d e l i m i n a t et h e18 sa n d5 8 s r d n at h ea v e r a g eg cc o n t e n t so f i t s la r e5 8 2 9 a n d5 8 4 1 i nz h a n j i a n gp o p u l a t i o n a n di ny a n g ji a n gp o p u l a t i o nr e s p e c t i v e l y t h ea v e r a g eg e n e t i cd i s t a n c eb e t w e e nt h et w o p o p u l a t i o n si s0 0 0 0 4 k e yw o r d s ： o s t r e ar i v u l a r i s ，z h a n j i a n gp o p u l a t i o n ，y a n g j i a n gp o p u l a t i o n ，g e n e t i c d i v e r s i t y ，m o r p h o l o g y ，r a p dm a r k e r ，r d n a i t s1 i v r 广东海洋大学 学位论文独创性及知识产权声名 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含他人已经发表或撰写过的研究成 果。对本试验有过任何帮助的个人或集体均已在论文中作了明确的说明并表达了我最诚挚的谢 意。 本学位论文成果! j j “东海洋人学所有。 指导教师 研究生签名：冲锣i 叶陂 浙易年6 月垆 广东海洋大学硕士学位论文 1 1 牡蛎概述 第一章前言 近江牡蛎( o s t r e ar i v u l a r i sg o u l d ) ，俗称蚝，隶属于瓣鳃纲( l a m e u i b r a n c h i a ) ( 或 双壳纲( b i v a l v i a ) ) ，牡蛎目( o s t e r o i d a ) ，牡蛎科( o s t r e i d a e ) l l j 。 牡蛎是一种营养价值很高的珍贵海产品，目前已发现有1 0 0 多种，全世界濒海各 国几乎都有分布。我国沿海分布的牡蛎约有二十种，作为主要的养殖种类有近江牡蛎 ( c r a s s o s t r e ar i v u l a r i sc r o u l d ) 、褶牡蛎( c r a s s o s t r e ap l i c a t u l ag m e l i n ) 、长牡蛎 ( c r a s s o s t r e ag i g a st h u n b e r g ) 、大连湾牡蛎( c r a s s o s t r e at a l i e n w h a n e n s i s ) 和密鳞牡 蛎( o s t r e ad e n s e l a m e l l o s al i s c h k e ) 等。日本的牡蛎大部分与中国相同，欧美各国的 牡蛎主要有食用牡蛎( o s t r e ae d u l i s ) 、美国牡蛎 o s t r e a ( c r a s s o s t r e a ) v i r g i n i c a g m e l i n 、欧洲牡蛎( o s t r e aa n g u l a t a ) ，其总产量在贝类中居首位【2 1 。广东沿海分靠的 有近江牡蛎、长牡蛎、褶牡蛎等。其中以近江牡蛎数量较多，分布较广，是经济价值 比较高的品种。 牡蛎的分布受海水温度和比重的限制，不同种类所适宜的温度和比重也不同。大 连湾牡蛎对温度适应范围较小，只分布在黄海、渤海海域；近江牡蛎、长牡蛎、褶牡 蛎和密鳞牡蛎对温度适应范围较广，全国沿海均有分布。大连湾牡蛎、密鳞牡蛎对盐 度的适应范围较窄，一般的在2 5 3 4 0 的高盐度海区栖息：长牡蛎和近江牡蛎生活 的盐度范围很广泛，前者可以在盐度1 0 - 3 7 o ，后者可以在盐度1 0 3 0 o 的海区栖息， 而且多分布在河口附近的低盐度海区；褶牡蛎多分布于环境多变的潮间带。牡蛎营固 着生活，以左右壳固着岩石或其他物体上生长，一旦固着后，即永远不能移动，足部 逐渐退化。它的消化系统大部分埋在内脏团之中，海水从进水孔流进，从出水孔流出， 由此获得饵料和进行呼吸、排泄【引。 牡蛎是名贵海珍，被称作“海中牛奶”，牡蛎作为一种优质的海产养殖贝类，不 仅具有肉昧鲜美的食用价值，而且其肉与壳均可入药，具有较高的药用价值，其所含 之牛磺酸和活性离子钙的开发利用已经展现了良好的前景。牡蛎干肉中含有蛋白质 4 5 - - 5 2 ，脂肪7 1 l ，总糖1 9 - - 3 8 ；丰富的维生素a 、b l 、b 2 、d 和g 等； 此外，还富含多种矿物质及微量元素，其中钙含量为4 0 9 4 0 4m g g ，铁为5 5 0 8 0 0 m g g ，硒为4 9 0 0m g g ，锌为2 2 5 4m g g 【2 1 。 牡蛎壳也已经改变了其只能充当废品的角色，牡蛎壳中含有9 0 以上的碳酸钙是 一种宝贵资源，可应用于诸多领域，如医药、食品保健及制作各种添加剂( 饲料添加 1 近江牡蛎( o s t r e ar i v u l a r i s ) 两个野生种群遗传多样性的研究 剂、肥料添加剂、水泥添加剂、涂料添加剂) 等并逐渐走向前台在医药食品、化工及 农学领域得以充分的利用，如其作为土壤调理剂的研究已经达到产业化水平且取得了 较好的经济效益和社会效益【2 1 。 1 2 国内外研究概况 牡蛎不仅肉味鲜美，而且具有较高的经济价值，一直都是国内外学者关注和研究 的对象，现主要介绍以下几个方面。 1 ) 染色体核型分析：染色体数目与核型分析是物种分类、遗传育种研究的重要 基础，对牡蛎的染色体有较多研究，除d e n d r o s t r e a f o l i u m 具有2 n = 1 8 的染色体数外1 4 j ， 其他种类均为2 n = 2 0 5 1 。董宝贤等【6 j 以大连湾牡蛎的早期胚胎为材料，经染色体数目 分析，首次提出大连湾牡蛎的染色体数目为2 n = 2 0 ；许伟定等【7 j 以担轮幼体为材料， 研究了太平洋牡蛎的核型，得出2 n = 2 0 ，n f = 4 0 的；陈木等【8 1 以鳃为材料，对僧帽牡 蛎进行了染色体组型研究，结果表明，僧帽牡蛎2 n = 2 0 ，n f - 4 0 ，有9 种对中部着 丝点染色体，1 对亚中部着丝点染色体；沈亦平等【9 】在近江牡蛎染色体中还观察到一 些核型多态现象，一是个别分裂相中出现一条亚端部着丝粒染色体，二是个别分裂相 的一对染色体上出现随体。这与食用牡蛎的某些中部着丝粒染色体变成端部着丝粒染 色体的现象相类似，可能是牡蛎类型分化的迹象【1 0 】。另外，l o n g w e l l 等【】和 r o d r i g n e z r o m e r 掣1 2 j 在美洲牡蛎染色体的最长一对染色体上发现有次缢痕。 2 ) 同工酶分析：同工酶电泳技术主要是在蛋白质水平上来对物种进行定性、定 量的遗传多样性和遗传结构差异的研究。 w i l k i n s ”j 最早检测到欧洲扁平牡蛎( o s t r e ae d u l i s ) 同工酶位点的多态性后，关 于牡蛎发育过程中同工酶变化、杂合子缺失、多态位点平均杂合度等相关研究得到了 迅速发展。g o s l i n ge m d t 。4 1 用电泳技术分析了人工孵化的长牡蛎的1 9 个等位基因酶 位点，平均杂合度为o 1 7 6 ，认为人工孵化的牡蛎杂合度较低，可能与亲贝数量少、 易发生近交有关；f o l t z 等【l5 】报道cv i r g i n i c a 生长速度与多态位点杂合度之间具正相 关性，并发现有杂合子缺失现象，其原因可能是有哑基因的存在；沈琪等【1 6 】检测了 de d u l i s 的自然种群和养殖种群1 1 个多态位点，发现在a l d h 1 、e s t - 1 、e s t - 2 和 m e 1 位点都存在杂合子缺失，尽管自然种群稀有等位基因数和等位基因平均数高于 养殖种群，但平均杂合度观察值( 0 0 8 1 ) 明显低于养殖种群( 0 1 4 4 ) ，说明人为增大 育苗亲本数可提高群体的遗传变异性；j o h a n n e s s o n 等f l7 】发现大西洋沿岸de d u l i s 各 种群与其他海洋双壳类相比，具很低的同工酶变异水平，群体之间遗传差异也很小。 这种现象可能是由于各种群的分布区相近或重叠，加上海洋环流对牡蛎幼体的漂浮作 用，导致相当程度近交造成的。杨锐等【l8 】研究了山东沿海莱州( l z ) 、俚岛( l d ) 2 广东海洋大学硕士学位论文 和青岛( q d ) 三地的褶牡蛎c r a s s o s t r e a p l i c a t u l a 自然群体及荣成( t p ) 的太平洋牡 蛎养殖群体的等位基因酶遗传变异。进行测试的9 种酶中共检测到2 0 个位点，平均 杂合度观察值l z 和q d 群体的遗传变异水平高于l d 和t p 群体，同时，各群体中 普遍存在杂合子缺失现象。太平洋牡蛎群体与其它3 个褶牡蛎群体的遗传距离很小， 甚至小于莱州和青岛的两个褶牡蛎群体间的遗传距离( 0 0 5 0 0 ) ，尤其是与俚岛褶牡 蛎群体遗传相似度最大，遗传距离小于其它各群体之间的距离，仅为0 0 0 9 9 。黄荣莲 等【1 9 】在近江牡蛎的同工酶分析中，得到官渡种群与阳江种群之间的遗传距离为 0 0 4 5 1 ，处于种群问遗传距离正常变动范围，而汕尾种群和官渡、阳江种群之间的遗 传距离则达到0 11 2 5 和0 1 0 8 8 。 3 ) 分子遗传标记分析：分子遗传标记是随着分子生物学技术的发展而出现的遗 传学标记技术，它突破了形态和细胞水平上遗传标记的局限性，发挥着独特的优势。 在这方面国内外学者对牡蛎的研究有比较多的报道，如b a n k s 等1 2 0 j 通过1 6 sr d n a 序 列对cg i g a s 和cs i k a m e a 这二个相近种成功进行了区分；h e d g e c o c k 等1 2 i j 利用1 6 s r d n a 和i t s ld n a 序列分析了a r i a k e 海区三种牡蛎，证实了该海区c r a s s o s t r e a s i k a m e a 的存在。b o u d r y 等【2 2 】和l a m 等【2 3 】对产于香港的一种牡蛎进行了16 sr d n a 和c o i 序列的研究，确定这种牡蛎为一个新种，并命名为c r a s s o s t r e ah o n g k o n g e n s i s 。 刘必谦等【2 4 】用r a p d 标记对大连湾牡蛎、褶牡蛎、近江牡蛎三种自然种进行了分类， 他认为这三种牡蛎同属巨蛎属( c r a s s o s t r e a ) ，大连湾牡蛎、褶牡蛎和太平洋牡蛎 ( c r a s s o s t r e ag i g a s ) 互为姊妹种，近江牡蛎与它们互为非姊妹种；刘必谦等瞵j 对c t a l i e n w h a e n s i s 的4 个分布区种群进行了r a p d 分析，表明各种群间遗传变异性随地 理距离远近而有所差异，并形成了区域性种群。k l i n b u r g a 等1 2 6 j 运用r a p d 对泰国5 种牡蛎进行特异性标记筛选，并克隆、测序了其中一种牡蛎( cb e l c h e r i ) 的特异性 位点，设计引物扩增泰国其他本地种及引进种基因组，均无扩增产物，从而为c b e l c h e r i 繁殖群体选择、幼体鉴定提供了种特异性标记；a h u v e t 等1 27 c r a s s o s t r e ag i g a s 和c r a s s o s t r e aa n g u l a t a 的胚胎进行了微卫星分析；h i r s c h f e l d 2 s j 运用r a p d 分析了密 西西比河沿岸cc i r g i n i c a 的四野生群体和一养殖群体，发现其中3 个野生群体的遗 传多样性显著高于养殖群体，而另一个与养殖群体没有差别，并分别筛选到了种群特 异标记；孔晓瑜等1 2 9 1 对太平洋牡蛎核糖体d n a 转录间隔子进行了序列分析，并对其 潜在的应用做了分析；l i 等【3 0 】从cg i g a s 基因组文库分离到7 9 个微卫星标记；l a p e g u e 等1 3 l j 对南美洲和非洲的cr h i z o p h o r a e 、cb r a s i l i a n a 和cg a s a r 进行了1 6 sr d n a 序列分析，证明了南美洲也存在cg a s a r ，而且这种牡蛎应起源于非洲；f o i g h i l 等p 2 j 通过1 6 sr d n a 序列分析，认为地理分布区连续的cv i r g i n i c a 大西洋沿岸和墨西哥湾 沿岸两大集群可再细分为遗传上完全不同的亚种群。y u 等1 3 3 j 构建了cv i r g i n i c a 的 a f l p 连锁图和cg i g a s 的微卫星连锁图；d e n n i s 等【3 4 j 也构建了cg i g a s 的微卫星连 锁图，且两种牡蛎雌雄图谱密度不同，同时d e n n i s 使用6 个三倍体诱导家系( 抑制 近江牡蛎( o s t r e ar i v u l a r i s ) 两个野生种群遗传多样性的研究 第二极体排出) 确定了5 2 个位点的基因着丝粒距离图谱。李莉和郭希明p 5 j 利用r a p d 和a f l p 标记，初步构建了太平洋牡蛎( c r a s s o s t r e ag i g a s ) 雄性和雌性遗传连锁图 ：监 l , l z lo 4 ) 多倍体育种：研究表明，三倍体牡蛎由于相对不育性，可以避免因性成熟和 排精产卵引起的生长停滞、消瘦和死亡，提高了成活率，具有较大经济效益而备受人 们的关注。贝类三倍体人工诱导和培育技术在国内外己渐趋成熟，并在太平洋牡蛎 1 3 6 , 3 7 】、美洲牡蛎等应用于规模化生产中；国内外学者还对太平洋牡蛎【3 9 。4 8 1 、食用牡 蛎( 0 s t r e a e d u l i s ) 4 9 】、美洲牡蛎( cv i r g i n i c a ) 1 5 0 】、近江牡蛎( cr i v u l a r i s ) 5 1 】等 的四倍体育种进行了研究。此外，有关多倍体诱导方法、倍性鉴定、生物学、生产性 状等方面文献报道也很多1 5 2 ，5 3 j 。 5 ) 作为海洋污染的监测生物：牡蛎由于其合适的生活环境、地理分布、生长的 生活周期、足够的生长丰度、合适的大小以及易于采集等特性，和贻贝一起作为贻贝 监测( 南海贻贝观察) 计划的重要指示生物已经被广泛地应用于海洋污染的生物监测 5 4 - 6 2 。七十年代以来，世界上许多沿海国家，通过长期连续地监测牡蛎软体中的污染 物，特别是重金属的含量，来评价沿海的环境质量，并预测未来环境质量的变化【6 3 。 贾晓平等【6 4 , 6 5 1 对广东沿海1 2 个地点牡蛎体p b 、c d 含量进行了连续监测。p r e s l e y l 6 6 】 对牡蛎软体、贝壳和沉积物中c d 、c r 、c u 、f e 、m n 、p b 、z n 等重金属元素进行了 分析；陆超华等【6 7 _ 7 0 】对珠江口深圳湾近江牡蛎的研究表明其可作为重金属c u 、p b 、 c d 、z n 污染的监测生物，等等。 1 3 研究的目的和意义 生物多样性( b i o d i v e r s i t y ) 是生物及其环境形成的生态复合体以及与此相关的各 种生态过程的总和，它包括数以百万计的动物、植物、微生物和它们所拥有的基因以 及它们与生存环境形成的复杂的生态系统。它是一个内涵十分广泛的概念，包括多个 层次，主要有遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性和景观多样性【7 。它既是生 物之间以及与其生存环境之间复杂的相互关系的体现，又是生物资源丰富多彩的标 志。它是对自然界生态平衡基本规律的一个简明的科学概括，也是衡量生产发展是否 符合客观规律的主要尺码。广义的遗传多样性( g e n e t i cd i v e r s i t y ) 就是生物所携带遗 传信息的总和，一般而言遗传多样性是指种内的遗传多样性，或遗传变异【7z 。研究生 物的遗传多样性对于合理的保护和利用遗传资源具有重要的意义，也是保护生物学的 核心之一。只有弄清种类遗传变异的大小，时空分布及其与环境之间的关系，才能采 取科学有效的保护措施来保护人类耐以生存的遗传资源r 7 2 7 引。随着生物学科理论的逐 步发展，研究水平的逐步提高，实验手段的逐步丰富，仪器设备的逐步改进，生物遗 传多样性的检测方法得以不断提高和丰富，主要可以分为形态学水平、细胞学水平、 4 广东海洋大学硕士学位论文 蛋白质水平和d n a 水平四个层次。检测遗传多样性最简便最快速的方法是运用表型 性状进行研究【7 创。由于表型和基因型之间存在着对应关系，因此可以根据测定表型上 的差异来反应基因型上的差异。细胞学水平的遗传多样性主要是指染色体变异所导致 的遗传变异【7 列。真核生物以染色体作为遗传信息的载体，因此染色体的变异必然引起 遗传变异的发生。在蛋白质水平研究生物的遗传多样性主要是利用同工酶技术 ( i s o z y m e ) 。同工酶分析常用的酶包括：乳酸脱氢酶( l d h ) 、苹果酸脱氢酶( m d h ) 、 碱性磷酸酶( a l p ) 、过氧化歧酶( s o d ) 、酯酶( e s t ) 、苹果酸酶( a c p ) 、醇脱氢 酶( a d h ) 、异柠檬酸脱氢酶( i d h ) 等等。d n a 是遗传物质的载体，d n a 的碱基 排列顺序决定了d n a 所携带的遗传信息。因此研究生物遗传多样性的最直接最有效 的方法是研究d n a 序列的变异。从其研究方法来看，主要有分子细胞学( m o l e c u l a r c y t o g e n e t i c s ) 、d n a 分子杂交( d n a d n ah y b r i d i z a t i o n ) 、核酸限制性内切酶酶切 位点分析( r e s t r i c t i o ns i t ea n a l y s i s ) 和核酸序列分析等研究手段。分子细胞学的方法 主要是采用分子手段来研究染色体的特征和差异来研究物种的遗传关系；d n a 杂交 技术是利用d n a 杂交方法分析物种间d n a 差异的大小；限制性内切酶是通过分析 d n a 酶切片段的长度研究物种序列的差异，如r f l p ；而直接测序的方法则是对物 种特定基因的核苷酸序列进行分析，通过统计和比较序列碱基差异来研究其遗传关 系，如m t d n a 和r d n a 。分析d n a 序列变异克服了表现性状、等位酶法的不足， 能够获得大量的遗传标记，成为目前最有效的遗传分析方法。 牡蛎在我国的海水养殖业中处于比较重要的地位，全世界最大年产量在8 0 万吨 以上。随着海水渔业的不断发展，资源的可持续利用和环境保护已成为人们关心的焦 点，生物多样性( 包括种类多样性、生态多样性及遗传多样性) 的保护则是资源的可 持续利用和环境保护的核心。作为经济贝类，通过对其分子遗传学水平的研究可以让 人们更好的保护、利用和开发这种资源，创造更好的经济效益。当前国内牡蛎的养殖 业管理和引种养殖比较混乱，一些养殖户在经济利益的驱动下盲目地引种和不科学的 育种养殖，造成养殖品种种质退化等现象【7 7 】。近年来，随着牡蛎养殖业的发展，养殖 品种的性状改良越来越受到重视，不论是从养殖品种的改良还是从自然种的种质保护 的目的出发，都需要对我国水域牡蛎品种或种群的基因库有所了解，这样才能为品种 改良提供理论依据。广东沿海对近江牡蛎的养殖有三百余年的悠久历史【1 1 ，湛江官渡 和阳江程村两地的近江牡蛎是目前广东沿海具有规模性开发和应用价值的两个天然 种群，但是对它们在分子水平的研究却很少。根据本实验室实际情况以及工作时间的 安排，本实验以此两地的野生近江牡蛎为研究对象，以随机扩增多态性( r a p d ) 和 r d n a i t s1 序列分析为实验技术手段，结合形态学特征统计分析对这两个地理种群进 行遗传多样性分析，以期从分子生物学的角度为该物种的资源保护、利用和开发提供 基础的理论参考。 近江牡蛎( o s t r e ar i v u l a r i s ) 两个野生种群遗传多样性的研究 2 1 实验材料 第二章形态特征分析 本实验的样品为2 0 0 3 年3 月1 2 同和4 月7 同分别采自湛江宫渡、阳江程村的野 生近江牡蛎，采样地点见示意图2 1 。样本经过清洗去除附着物以降低测量误差，取 闭壳肌于7 0 。c 保存。 墨越雕旺市 注：划“一”为采样地点 2 2 实验方法 图2 - 1 采样地点示意图 f i g 2 - 1c o l l e c t i o nl o c a t i o n so fs a m p l e s 每个种群随机取样度量5 0 1 0 0 个个体，测量的参数参照- d a y 7 8 的方法，如图 2 2 。测量参数包括：总重( t w ) 、右壳长( r a p m ) 、右壳高( r d v m ) 、右壳凸( r t ) 、 韧带长( h l ) 、左壳长( l a p m ) 、左壳高( l d v m ) 、左壳凸( l t ) 、闭壳肌痕宽( s w ) 。 用游标卡尺测量长度，为了减少误差，所测个体读数均由同一个人来完成。用j a 2 0 0 3 型分析天平测量总重( t w ) 。用e x c e l 计算各种特征参数的平均值，根据测量参数之 间的分布做回归分析。 为了消除贝体规格大小对参数值的影响，将每只贝的所有参数