（微生物与生化药学专业论文）重组人骨形态发生蛋白7工程菌的高密度发酵工艺研究.pdf

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6 h ，菌 体密度在1 8 0 3 5 0 ( a 6 0 0 ) 之间；在t b 培养基中的对数生长期为接种后1 0 1 4 h 菌体密度在4 1 0 - - 6 4 0 ( a 6 0 0 ) 之间；p l a c k e t t b u r m a n 实验设计法优化后的发酵 培养基各种成分的浓度分别为磷酸二氢钾1 3 3 9 l ，磷酸氢二铵4 9 l ，柠檬酸 3 4 9 l ，硫酸镁1 2 9 l ，维生素b 1 4 5 m g l ，微量元素2 0 m l l ，葡萄糖1 5 9 l ；适 于工程菌生长的p h 值为6 8 ，比生长速率可达0 5 5 h l ；适于目的蛋白表达的p h 值为7 6 ，r h b m p 7 的表达量可达菌体总蛋白的3 6 5 ；在发酵罐中升温诱导3 h r h b m p 7 表达量可达3 4 6 ；在通入富氧空气的条件下培养基溶氧水平可以保持 在较高水平有利于工程菌的生长：将比生长速率控制在较低水平可以避免代谢负 产物的大量产生；取t b 培养基培养的对数期种子，1 0 接种于优化后的发酵培 养基，控制溶氧在2 0 以上，诱导前调节发酵液p h 在6 8 7 0 之间，诱导后调 节发酵液p h 在7 4 7 6 之间，经过2 0 h 的发酵，工程菌的菌体密度( a 6 0 0 ) 达 到1 4 0 左右，湿重可达2 0 0 9 l ，r h b m p 7 的表达量达到3 0 以上。 3 离子交换层析法纯化后r h b m p 7 的纯度可达9 5 以上，经s d s p a g e 2 重组人骨形态发生蛋白7 工程菌的高密度发酵工艺 凝胶电泳和w e s t e r nb l o t 检测，复性后的r h b m p 7 二聚体比例可达4 0 并且能与 抗体特异性结合。 结论 经过探索研究，初步建立了r h b m p 7 工程菌高密度发酵的工艺，该工艺最 终菌体密度可达1 4 0 ( h 6 0 0 ) ，菌体湿重可达2 0 0 9 r e ，r h b m p - 7 的表达量达到3 0 以上，与文献报道的其他工程菌相当，该工艺基本能够满足工业化生产的需要。 经过优化的最佳工艺流程为：以t b 培养基中过夜培养的种子1 0 接种于发 酵培养基中，3 0 培养，调节转速或通入富氧空气控制溶氧水平在2 0 以上，诱 导前调节发酵液p h 在6 8 7 0 之间，诱导后调节发酵液p h 在7 4 7 6 之间， 当发酵罐内葡萄糖耗尽时补充补料培养基使工程菌的比生长速率保持o 1 2 h 1 ，当 发酵罐内的菌体浓度达到1 0 0 ( h 6 0 0 ) 时升温至4 2 ( 2 诱导，诱导后降低补料速率 使得工程菌的比生长速率保持在o 1 h ，诱导3 h 后结束发酵，最终菌体密度可达 菌体密度可达1 4 0 ( a 6 0 0 ) ，菌体湿重可达2 0 0 9 l ，r h b m p 7 的表达量达到3 0 。 关键词：重组人骨形态发生蛋白7 ；高密度发酵；离子交换层析；纯化；复性 h i g hc e l ld e n s i t yf e r m e n t a t i o no fr e c o m b i n a n te c o i lf o r p r o d u c t i o no fr e c o m b i n a n tb o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n 7 p o s t g r a d u a t e ：c h e nb a o 1 i t u t o r ：w a n gs h i l i m a j o r ：m i c r o b i o l o g ya n db i o c h e m i c a lp h a r m a c y a b s t r a c t b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n s ( b m p s ) ，a sv a l u a b l eg r o w t hf a c t o r sa r ea t t r a c t i n g m o r ea n dm o r e r e s e a r c h e r s a t t e n t i o n ，b m p 一7i sam o r ei n d e p t hr e s e a r c ho n e b m p 7 h a ss t r o n go s t e o i n d u c t i v ea c t i v i t y , a n db e e nu s e dt ot h et r e a t m e n to fc l i n i c a l 加c t u r e s i nb o n eh e a l i n ga n d s p i n eh e a l i n g ，a n da c h i e v e das i g n i f i c a n te f f e c t w i t ht h ed e p t hr e s e a r c ho fc l i n i c a l ，w en e e d s l a r g eq u a n t i t yo fb m p 7w i t hh i g h p u r i t ya n da c t i v i t y a l t h o u g hb m p 一7e x t r a c t e df r o mt h eb o n eh a sh i g ha c t i v i t y , b u tt h e c o m p l i c a t e ds t e p sa n dl o wy i e l d h i n d e r i n gi t su s e r e c o m b i n a n th u m a nb o n e m o r p h o g e n e t i cp r o t e i n - 7 ( r h b m p - 7 ) h a sb e e ne x p r e s s e db yi n s e c ta n dc h oc e l l s ，b u t l o wo u t p u ta n dh i g hc o s ta r ea l s oh i n d e r i n gi t sa p p l i c a t i o n s oo u r l a bf o c u sr e s e a r c h o np r o d u c t i o no fr h b m p - 7b yec o l ic e l l si no r d e rt oo b t a i nt h i s p r o t e i nw i t hh i g h p u r i t y , l o wc o s ta n dg o o da c t i v i t y o b j e c t i v e ： o u rl a bh a sc o n s t r u c t e dt h e p l a s m i do fr h b m p 7 p b v 2 21a n dd o n eal o to f r e s e a r c ho np r o d u c t i o no fr h b m p 一7b yg c o l i t h i se x p e r i m e n tw a sb a s e do np r e v i o u s e x p e r i m e n t st oe x p l o r et h ep r o d u c t i o no fr h b m p 一7b yh i g hc e l ld e n s i t yf e r m e n t a t i o n o f e c o f i ，i no r d e rt ol o wc o s ta n d a c q u i r em o r er h b m p 7 m e t h o d s ： 1 i no r d e rt or q u v e n a t i o nt h ee n g i n e e r i n ge c o l i ，w ee x t r a c t e dt h ep l a s m i do f r h b m p - 7 p b v 2 21a n dt r a n s f o r m e di n t oan e wh o s to fb l 2 1 ( d e 3 ) 2w e o p t i m i z e dt h ef a c t o r sw h i c hi n f l u e n c et h eg r o w t ho fe n g i n e e r i n ge c o l ii n 4 重组人骨形态发生蛋白7 工程菌的高密度发酵工艺 f l a s ka n df e r m e n t a t i o nt a n k i no r d e rk e e pe c o l ii naa p p r o p r i a t eg r o w t hc o n d i t i o n s ， w es e l e c t e di n d e xf e d - b a t c hf e r m e n t a t i o na n di m p o r to x y g e n e n r i c h e da i ri n t o f e r m e n t a t i o nt a n kt ok e e pd i s s o l v e do x y g e nl e v e la t2 0 3w bp u r i f i e dd l b m p 一7b yi o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n di d e n t i f i e db y w e s t e r nb l o t r e s u l t s ： 11 1 1 ee x p r e s s i o nl e v e lo fr h b m p - 7w a sr a i s e du pt o3 2 a f t e rr e t r a n s f o r m e d 2a f t e r2 0 ho ff e r m e n t a t i o n , t h ec e l ld e n s i t y ( a 6 0 0 ) w a su pt o14 0 ，t h e e x p r e s s i o nl e v e lo fr l 出m p 一7 w a sm o r et h a n3 0 3t h ep u r i t yo fr h b m p - 7w a su pt o9 5 a f t e ri o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y p u r i f i c a t i o n ，a n dt h e r ea r et w os p e c i f i cs t r i po nt h el5 l aa n d3 0 l aa f t e rw e s t e r n b l o t c o n c l u s i o n ： h i g hc e l ld e n s i t yf e r m e n t a t i o no fe c o l if o rp r o d u c t i o no fr h b m p 一7t e c h n i q u e h a sb e e nd e v e l o p e d k e yw o r d s ：r e c o m b i n a n th u m a nb o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n - 7 ；h i g l lc e l ld e n s i t y f e r m e n t a t i o n ；i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ；p u r i f i c a t i o n ；r e n a t u r a t i o n 5 山尔省医学科学院硕： ：学位论文 第一部分前言 l 骨形态发生蛋白- 7 1 1 骨形态发生蛋白7 的结构 1 9 6 5 年，u r i s t 在动物实验中有力地证实了盐酸脱钙异体骨有骨诱导能力， 进而发现了具有重要意义的骨形态发生蛋白( b o n e m o r p h o g e n e t i c p r o t e i n ，b m p ) ， 其后的大量研究表明：b m p 具有跨种属诱导成骨、新骨生成迅速且生成量与b m p 植入量正相关等特点。1 9 8 6 年u r i s t 首次将b m p 应用于临床修复内生软骨瘤刮 除术后骨缺损获得成功。通过对b m p s 氨基酸序列的比对可以看出在所有b m p s 的c 端都有一段相同的氨基酸序列，b m p s 在细胞内以前体形式合成，然后c 端经过加工产生一段约1 3 0 个氨基酸的成熟肽。大多数b m p s 在其成熟肽区域含 有一段7 个半胱氨酸残基的保守序列，每一个成熟的有活性的b m p 都是由二硫 键连接形成的同源二聚体或异源二聚体构成【1 】。 骨形态发生蛋白7 ( b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n - 7 ，b m p - 7 ) 又称o p l ，是 t g f 一口超家族中的一员，属于d p p v g l 亚群，和b m p 5 、b m p 6 、b m p 一2 关系 密切。从人b m p 7 的e d n a 序列可推测b m p 7 是一段由4 3 1 个氨基酸组成的多 肽( 见图1 1 ) ，起始序列为一段2 9 个氨基酸的信号肽，中问第2 9 2 9 2 位氨基酸 称为前肽，2 9 3 4 3 1 位氨基酸称为成熟肽。重组蛋白以成熟肽同源二聚体的形式 分泌，具体是由蛋白水解酶识别a r g xxa r g 加工信号后，在第2 9 2 位的精氨酸 和2 9 3 位的丝氨酸之间切割得到【2 j 。这种成熟肽形成的同源二聚体( 3 0 3 6k d a ) 含有2 个单体，每一个都含有1 3 9 个氨基酸。虽然在b m p 7 分子上有4 个潜在 的n 。糖基化位点( 见图1 2 ) ，其中3 个位于成熟肽上，一个位于前肽上，但实际 上只有位于成熟肽上的一个位点和前肽上的位点被糖基化f 3 】，人b m p 一7 的二聚 体三维结构呈蝴蝶状( 见图1 3 ) 。 6 l e n g t h ：4 m 3 1 e a a t h i s i st h e 警鬻u 篇嚣：4 9 3 1 3o a t h i 8 c r c 6 4 ：4 7 a 0 5 e 4 5 c 6 8 1 5 f 8 a r h i l e n g t h o f u n p r o c e s s e d sm u n p r o c e s s e d h i s m e i 廿1 ewo f t h e p r e c u r s o r p r e c u r s o r i sac h e c k s u mo nt h es e q u e n c e l l 旦 m h v r sl r a a a 2 2 p h s f v a l w a p 3 0 _ l f l l r 5 a l a d 4 旦 f s l d n e v h s s 5 o f ih r r l r s q e 迥 r r e m q r e i l 3 7 垒8 旦 9 0 _ z o o 1 1 0 _1 2 旦 i l g l p h r p r p h l q g k h n s a pm f m l d l y n a ma v e e g g g p g gq g f s y p y k a v f s t q g p p l a 。s 1 旦 l q d s h f l t d a l9 旦 z r e r f d n e t f 2 5 0 h n l g l q l s v e 3 l 旦 q n r s k t p k n q 1 4 旦 d m l n l s f v n l v 2 0 0 r i $ v y q v l q e 2 6 0 t l d g o s i n p k 3 2 _ o e a l r m a n v a 15 0 _ e h d k e f f h p r 2 i o h l g r e s d l f l 2 7 旦 i a g l i g r h g p 3 3 旦 n s s s d q r q a c 1 6 旦 y h m r e f r f d l 2 2 0 l d s r t l w a s e 2 8 一o q n k q p f e v a f 3 4 0 k k h e l y v s f r 1 7 旦 s k 二p e g e a v t 2 3 0 e g w l v f d i t a 2 9 0 f k a t e v h f r s 3 s 旦 d l g w q d w i i a 1 8 旦 a a w f r i y k d y 2 4 旦 r s n h 训 v v n p r 3 0 旦 i r s t g s k q r s 3 6 0 p e g y a a y y c e 3 7 0 3 8 旦3 9 0 _ 4 0 0 _ 4 1 0 4 2 0 g e c a f p l n s ym n a t n h a i v qt l v h f i n p e tv p k p c c a p t ql n a i s v l y 而d s s n v i l k k 一 43旦p18075i n r n m v v r a c g ch f a s l a f o n n a t 图l - 1 人骨形态发生蛋白7 ( h b m p 7 ) 的氨基酸排列顺序 f i g l - 1 a m i l l oa c i ds e q u e n c eo f b o n cm o r p h o g e n e t i cp r o t e i n7 轴yr 期t ol n g 蠕 沁i p n n z d s i g n a ll 2 92 9“，? t ：i p r o p e p 3 02 9 22 6 3 。?er：jjpro0 0 0 0 0 3 3 8 7 6 c h a i n2 9 34 3 1 1 3 9b o n em n r p h o q e n e t i cp r o t e i n7pro0 0 0 0 0 3 3 8 7 7 c a r s o h y d1 8 71 8 7 n - 1 i n k e di g l c n a c ) f p 。一j cj dj ， c a r b o h y d3 0 23 0 2 n - l i n k e d g i c n a c jf ，：f - ? i d ： c a r b o h y d3 2 i3 2 l n - l i n k e d g i c n a c ) ( p c ：口 c j3 ， c a r b o h y d 3 7 23 7 2 n 1 i n k e dl g l c n a c ，f i ，r ? p 1 ii j d i s u l f i d3 3 0 3 9 6 b 1 s u l f ld 3 5 94 2 8 d l s u l f ；d3 6 3 4 3 0 d i s u l f i o 3 9 53 9 5 i n t e r c h a l n s t r a n d 3 2 93 3 3 5 s t r a n d 3 3 63 3 93 h e l i x3 3 9 3 4 24 t u r n 3 4 53 4 73 s t r a n d 3 4 83 5 03 s t r a n d 3 5 23 5 54 s t r a n d3 5 8 3 6 25 h e l l x3 6 93 7 1 3 h e l 】x3 7 5 3 8 6z 2 t u r n 3 8 83 9 03 s t r a f e d3 9 64 0 9 1 日 s t r a n d4 154 3 0i 6 图1 - 2 人丹形态发生蛋白7 的氨基酸位点信息 f i g l - 2 t h ea m i n oa c i ds i t e si n f o r m a t i o no fb o n em o r p h o g e n e t i c p r o t e i n7 7 山东省医学科学院硕士学位论文 图l - 3 人骨形态发生蛋白7 的二聚体三维结构 f i g l - 3t h r e e - d i m e n s i o n a ls 眦t t t r eo f b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n7d i m e r s 1 2b m p 7 的生物学功能 b m p 7 具有重要的生物学功能，能在体内外诱导未分化的间充质细胞向软 骨细胞和成骨细胞分化，促进骨源性碱性磷酸酶( a l p a s e ) 和i i 型胶原的表达【4 1 ， 有广泛临床应用前景。 1 2 1 治疗新鲜骨折 某些骨折发生骨不连的可能性较大，应用b m p - 7 的高效成骨活性，可以降 低其骨不连的发生率。如治疗新鲜胫骨骨折、股骨骨折、尺骨骨折和桡骨骨折， b m p 7 在治疗新鲜长骨骨折方面是安全有效的。 1 2 2 治疗骨缺损、骨不连 骨缺损、骨不连是骨科棘手的难题之一。复合b m p 7 的骨移植效果优于骨 移植治疗的金标准一自体骨移植，或二者比较差异无显著性。近年来，国内外一 些研究者已着手b m p 7 在骨缺损、骨不连患者上的临床研究。目前f d a 已批准 b m p 7 在美国多中心、大规模治疗胫骨骨不连的临床实验【5 1 ，为b m p 7 早日上 市提供实验依据。 1 2 - 3 治疗股骨头缺血性坏死 股骨头缺血性坏死是骨科临床的难点和热点，传统的治疗方法无论是非手术 还是手术，大多以关节废用为结局，而不得不行人工关节置换术。然而对中青年 患者而言，人工关节的使用年限不能满足患者的要求。由于b m p 7 治疗骨折和 骨缺损的疗效明确，b m p - 7 应该能够修复股骨头坏死清除死骨后形成的缺损。 8 重组人骨形态发生蛋白7j i ：程菌的高密度发酵1 ：艺 2 重组大肠杆菌高密度发酵技术 2 1 高密度发酵技术定义 高细胞密度培养是一个相对的概念，一般指细胞干重在5 0 l 以上，利用高 密度培养技术可相应的缩小生物反应器的体积和降低生物量的分离费用，还可以 缩短生产周期、减少设备投资，从而降低生产成本，是工程菌能否以尽可能低的 成本实现规模生产的关键因素。 2 2 影响重组大肠杆菌高密度发酵的几个因素 m a r k l 等【6 】考虑到实际情况中的条件限制认为大肠杆菌最高密度为干重2 0 0 9 l 左右，迄今文献报道的最高值干重达n - f2 1 0 9 l 【7 】，然而高密度培养过程中 的限制因素很多，要达到如此高的密度并不容易。影响重组大肠杆菌高密度培养 的因素主要有以下几个方面：宿主菌的选择，培养基组成，溶氧水平，培养过程 中抑制性代谢产物的积累等。 首先不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在着很大差 别，因此，不同宿主菌的选择对表达产物的积累以及下游分离纯化有至关重要的 作用。有的菌种在培养中可达到较高的菌体密度，有的则产酸较多。如e e o l i k 和e c o l ib 及其它们的衍生菌株是较为常用的宿主菌，这两类菌株有着不同 的生长特征，其中与高密度培养相关的很显著的一点区别就是e c o l ib 菌株在 高密度培养中产生的乙酸要远远少于e c o l ik 【8 加】。因此在高密度培养时要考虑 宿主菌的因素，选取最合适的表达宿主菌。 溶解氧是细菌培养中常用的概念，指培养液溶解的氧的浓度。不影响细胞呼 吸的最低溶解氧称为临界氧。由于氧在水中的溶解度非常低，因此很容易成为细 菌培养的限制因素，提高溶氧的办法主要有增大搅拌速度、提高氧分压、提高罐 压、提高通风量、改进气体分布器和搅拌浆的设计等。另外应用基因工程技术在 细胞中表达透明颤菌血红蛋白【1 3 ，1 4 】也可以提高溶氧水平。当然溶氧水平也不是 越高越好，s h i l o a c h 等【 】认为发酵系统中通入纯氧，溶解氧将不再成为限制因素， 然而，在大规模培养过程中，使用纯氧容易导致大肠杆菌氧中毒。因此，为了正 确控制溶解氧浓度，有必要考察每一种培养产物的临界溶氧浓度和最适溶氧浓 度，并使其在培养过程中保持在最适溶氧浓度。 为了达到高密度培养的目的，通常选用合成培养基作为高密度培养的培养 9 t 山东省医学科学院硕士学位论文 基，其主要成分包括磷酸缓冲液的盐溶液系统、由葡萄糖或甘油充当的碳源和由 氨水充当的氮源等。高细胞密度培养的生物量能达到2 0 0 9 l ，需要投入几倍于 生物量的机质才能满足细胞快速生长及大量表达基因产物的需要，但机质中营养 物质的浓度不能过高，超过一定的限度可使生长抑制物质大量积累使大肠杆菌的 生长繁殖和目的基因的表达受到抑制，从而降低生产效率。根据r i e s e n b e r g t l 的报道，培养基中各种成分抑制菌体的生长的限制浓度分别为葡萄糖( 5 0g l ) 、 氨( 3g l ) 、铁( 1 1 5g l ) 、镁( 8 7g l ) 、磷( 1 0g l ) 、锌( o 0 3 8g l ) 。由于培养基 中含有众多的可能影响因素，要得到适宜的高密度培养的培养基对各组分进行优 化是必不可少的，为了通过较少的的实验次数获得所需的结果，常采用一些合理 的实验设计方案，如正交设训17 1 、响应面分析1 9 】等。 在高密度培养过程中会产生一些有害代谢产物，如有机酸、c 0 2 等。对大 肠杆菌而言，主要的抑制性代谢产物的是乙酸。重组大肠杆菌培养过程中乙酸的 产生原因主要有两个【2 0 1 ，即供氧能力不足使得细菌的呼吸受到限制，和葡萄糖 的摄入速率大于重组菌的有氧呼吸能力，这两种情况都会导致底物通过乙酰磷酸 途径转化为乙酸。过重的代谢负荷又会降低重组菌的摄氧能力，将直接加剧前两 种情况的出现，在表达过程中也更容易积累乙酸，不利于重组大肠杆菌的生长， 也会影响到重组蛋白的高效表达。b a b a e i p o u r 等【2 1 ，2 2 】通过控制比生长速率在乙酸 积累的临界值以下极大的提高了生产率，另外l u o 等【2 3 】用甘油代替葡萄糖同样 达到了减少乙酸产生的目的。 2 3 重组大肠杆菌高密度发酵的培养方式 2 3 1 透析培养是通过半透膜有效去除代谢抑制物，同时向培养液中提供充 足营养物质的培养方式。采用这种培养方式可以显著减少抑制细胞生长的代谢产 物的浓度，得到相当高的菌体浓度【6 7 ，2 4 1 。但是，由于反应器本身需要内嵌的透 析膜或外在的透析组件、辅助泵及其他设备等，透析培养的设备投资较大。 2 3 2 连续培养是是指在培养过程中不断向反应器中流加培养基，同时以相 同流量从反应器中取出培养液，保持反应器中培养液体积恒定，使培养物在稳定 状态下生长。主要有一般连续培养、细胞循环连续培养，膜分离连续培养。这种 培养技术具有生产效率高、可控性好等特点。缺点是菌种容易退化、易污染杂菌、 培养基使用效率低等。 1 0 重组人骨形态发生蛋白7 工程凶的高密度发酵工艺 2 3 3 补料分批培养技术已被广泛应用于重组大肠杆菌的高密度培养，控制 类型主要包括预设参数的非反馈控制补料和反馈控制补料。 其中预设参数的非反馈补料控制又包括恒速补料、变速补料和指数补料。恒 速补料是营养流加速率预先设定的一种补料方式，细菌在生长过程中比生长速率 逐渐下降，菌体密度里线性增加，w a n g 等【2 5 】应用恒速补料成功的将人表皮生长 因子的生产率提高了1 5 0 。变速补料可以在菌体密度比较高的情况下加入更多 的营养物质促进细胞生长，有利于产物的形成【2 6 1 。指数补料是一种简单而又有 效的补料技术，可以大大溅少乙酸等有害代谢物的生成，菌体以一定比生长速率 成指数形式增加，还可以通过控制进料的速率控制细菌的生长速率，使菌体稳定 生长的同时有利于重组蛋白的充分表达指数补料是目前应用最为广泛和成熟的 补料方式，有很多成功的案例。1 9 9 5 年，k o r z 等【2 7 1 应用指数补料使以葡萄糖和 甘油为碳源的重组大肠杆菌的菌体密度分别达到了1 2 8 和1 4 8 9 l 。另外 b a b a e i p o u r 等【2 l 2 2 1 也成功的利用指数补料实现了高密度培养的目的。 由于料液的添加程序是预先设定的，随着时间变化，微生物的生长方式与预 想不一致时，非反馈补料法就不能对其进行有效的调节。因此，非反馈补料法对 环境的适应性和可调节性不强，不能根据发酵环境的变化和菌体生长的具体情况 作出反馈调节，控制不好会引起乙酸的严重积累，造成菌体高密度条件下的外源 基因低表达。 反馈补料控制策略主要包括基于溶氧恒定的反馈控制策略、基于p h 恒定的 反馈控制策略、基于葡萄糖浓度的反馈控制策略、基于c 0 2 释放速率的反馈控 制策略。当发酵液中底物几乎耗尽时，氧消耗速率会下降，这样溶解氧会突然升 高，因此溶解氧的突然变化就可以成为底物补料开始的指示性标志。基于溶氧恒 定的反馈控制策略就是针对具体的发酵过程，预先设定一个溶解氧临界值，当溶 解氧高于这个设定值时，系统自动加入底物，从而控制底物浓度在设定范围内， k i m 等【2 8 】应用溶氧恒定反馈控制补料策略将表达肿瘤坏死因子工程菌密度 ( a 6 0 0 ) 提高到1 0 0 以上，实现了高密度培养。当培养物中碳源耗尽时，细胞产 生的铵离子浓度会增加，导致p h 值上升，因此p h 值变化可以成为需要补料的 标志。基于p h 恒定的反馈控制补料策略就是将某一p h 值作为补料控制的临界 值，当培养物p h 值大于该设定值时，开始补料，将底物浓度控制在合适的范围 山东省l 基学科学院硕十。化论文 内，如t i n g 2 9 等利用p h 反馈补料使菌体的密度( a 6 0 0 ) 达到了4 0 以上，但是 p h 值变化并不完全是葡萄糖代谢的结果，容易造成补料体系的错误。基于葡萄 糖浓度的反馈控制策略是利用葡萄糖浓度的离线或在线分析的数据，维持培养基 中较低的残糖浓度的补料方式，k l e m a n 等【3 0 】应用葡萄糖反馈控制系统，将发酵 液中葡萄糖浓度控制在( 0 4 9 + 0 0 4 ) g l ，3 2 c 培养9 h 茵体浓度达到6 5 9 l ，实 现了高密度培养，但化学法、酶法分析葡萄糖耗时过长，葡萄糖电极技术尚未成 熟，对流加的控制较为滞后，菌体密度不够理想。通过检测二氧化碳的释放速率， 估计碳源的利用情况，控制营养机质的流速。对于成分复杂的培养基，这种方法 很难实现精确控制，需要建立相关数学模型来控制。 用于反馈控制的附属设备比较昂贵，并且反馈式调节有一定的滞后性，不能 完全避免糖浓度的波动和代谢副产物的积累，因此，寻找新的一种补料方式，既 能避免反馈式补料法的滞后性，又能克服非反馈式补料对环境的适应性和可调节 性差，不能根据发酵环境的变化和菌体生长的具体情况作出反馈调节的缺点，具 有非常重要的现实意义。 2 3 4 重组大肠杆菌高密度培养中基因工程技术的应用 乙酸是重组大肠杆菌高密度培养过程中的主要代谢抑制物，传统的减少乙酸 的办法，如限制比生长速率、透析培养等，由于经济性较差在生产上难以得到广 泛的应用。近年来，应用基因工程技术减少乙酸产生越来越受到重视。 葡萄糖摄入的增加将导致乙酸的形成，因此减少乙酸形成最直接的途径就是 限制葡萄糖摄入率，如敲除控制葡萄糖吸收的相关基因。l a r a 掣3 1 】构建的磷酸 转移酶系统( p t s ) 缺失的v h 3 2 菌株在葡萄糖浓度达1 0 0 9 l 时，乙酸的浓度只 有2 9 l 。过表达限制p t s 系统的m l c 蛋白同样可以限制葡萄糖摄入，c h o 等【3 2 】 研究发现，在摇瓶复合培养基中培养的过表达m l c 基因工程菌，乙酸产量减少 5 0 的同时，重组产物有了明显的增加。 另一个减少乙酸产生的途径是切断碳源生成乙酸的代谢通路。大肠杆菌产生 乙酸的途径有两条：一是在丙酮酸氧化酶的作用下直接由丙酮酸产生乙酸，但在 大肠杆菌中此酶的