（海洋生物学专业论文）海带estssr标记开发及tps基因的克隆和比较遗传学研究.pdf

海带e s t - s s r 标记开发及乃咯基因的克隆 和比较遗传学研究 学位论文完成日期： 指导教师签字： u , o 。e 。 答辩委员会成员签字：至型 h 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 1 注! 垫遗查墓丝霞要挂别直盟的：奎拦互窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：王闯良签字日期：加加年月2 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下 事项： 1 、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。 2 、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学中 国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社一用于出版和编入c n k i 9 4 4 ) a n di na m i n oa c i d c o m p o s i t i o n ( 9 6 6 ) h o m o l o g ya l i g n m e n tf o rs e a w e e d 邢a n d t h et p sp r o t e i n s f r o mb a c t e r i a , y e a s ta n dh i g h e rp l a n t si n d i c a t e dt h a t ，u n l i k et h et p sg e n e sf r o ms o m e o t h e rp l a n t s ，t h e r ew a sn oi n t r o ne x i s t e di na l lo ft h et e ni s o l a t e ds e a w e e dt p sg e n e s a n dt h em o s tc l o s e l yr e l a t e ds e q u e n c e st os e a w e e dt p sg e n ew e r et h o s ef r o mh i g h e r p l a n t s ( o s t p sa n da t t p s 5 ，a b o u t4 0 s i m i l a r i t y ) ，w h e r e a st h em o s td i s t a n ts e q u e n c e w a st h eo n ef r o mb a c t e r i a ( e c o t s a b , a b o u t2 0 s i m i l a r i t y ) b a s e do nt h el i v i n g e n v i r o n m e n t ，l y t p sa n do t h e rs e a w e e dt p sg e n e sa r ec o n s i d e r e da sg o o dc a n d i d a t e g e n er e s o u r c e sf o rg e n e t i ci m p r o v e m e n to ft h ed r o u g h t - a n ds a l t - r e s i t a n c ei nc r o p s i f t h es e a w e e dt p sg e n e sa r et r a n s f o r m e di n t oc r o p s ，t h et r a n s g e n i cp l a n t sa r ee x p e c t e d t oi n c r e a s es a l t d r o u g h tr e s i s t a n c e t h a tw i l lb eu s e f u li nc r o pi m p r o v e m e n ta n dw i t h k e yw o r d s ：l a m i n a r i a ；e s t - s s r ；t r e h a l o s e 一6 一p h o s p h a t es y n t h a s eg e n e s ；g e n e c l o n i n g ；c o m p a r a t i v eg e n e t i c s 目录 o 引言1 1 文献综述3 1 1 海藻概述与海带3 1 1 1 海藻生物学特征与应用：3 1 1 2 海带研究概况4 1 2 分子标记技术及其应用9 1 2 1 遗传标记概述9 1 2 2 常用的分子标记1 0 1 2 3 分子标记的应用。1 5 1 2 4 分子标记在海带等海藻研究中的应用1 7 1 3 海藻糖合成酶基因概况。1 9 1 3 1 海藻糖概述2 0 1 3 2 海藻糖合成酶基因研究2 2 2 海带e s t - s s r 标记开发与应用2 4 2 1 实验材料2 4 2 1 1 海带配子体材料2 4 2 1 2 主要仪器与试剂2 4 2 2 实验方法。2 5 2 2 1d n a 的提取与检测2 5 2 2 2e s t 序列获得2 6 2 2 3s s r 筛查2 6 2 2 4e s t - s s r 引物的设计2 6 2 2 5 海带e s t - s s r 引物扩增条件的优化2 7 2 2 6e s t - s s r 扩增分析2 8 2 2 7 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳2 8 2 2 8 数据统计及分析3 0 2 3 结果分析3 0 2 3 1 海带配子体d n a 提取与检测。3 0 2 3 2 海带e s t 获取31 2 3 3 海带e s t 中微卫星序列数量和分布3 1 2 3 2e s t - s s r 引物设计3 4 2 3 3e s t - s s r 引物扩增与遗传多样性分析3 6 i 2 4 讨论z l l 2 4 1 海带d n a 的提取4 1 2 4 2e s t - s s r 引物设计4 1 2 4 3e s t - s s r 验证与反应条件优化4 2 2 4 4 海带e s t - s s r 通用性及遗传多样性分析一4 2 3 海藻t p s 基因克隆和比较遗传学研究4 4 3 1 海藻t p s 基因克隆4 4 3 1 1 实验材料4 4 3 1 2 实验方法4 5 3 1 3 结果4 8 3 2 多种藻类t p s 基因的比较分析5 7 3 2 1 海藻t p s 的比较分析5 7 3 2 2 海藻t p s 基因与其他物种的豫s 基因的比较5 8 3 2 3 海藻刀峪基因( g + c ) 含量与其他物种的开s 基因( g + c ) 含量的比较。5 9 3 2 4 海藻t p s 功能域预测和二级结构分析6 0 3 3 讨论6 3 4 结论6 5 参考文献6 6 附录7 1 致谢7 2 海带e s t - s s r 标记开发及褐藻t p s 基因的克隆 o 引言 作为海洋中的大型藻类，海带是一种安全健康的海洋食蔬，也是医药保健、 海藻化工、农业肥料等工业的重要原料，具有重要的经济价值。海带是海洋初级 生产者，在海洋生态系统中进行光合作用，不仅对碳循环具有重要作用，释放出 的氧气对海洋动物、需氧细菌等的生存也是至关重要的，同时能够加速海水自净、 维持生态平衡等【l 】。 由于人们对海带等海藻的大量利用，自然资源远不能满足需求，人工养殖则 发展成为重要的海洋经济产业。二十世纪中期，我国科技工作者率先攻克了“夏 苗培育、“筏式养殖”等技术难关，实现了海带全人工养殖，形成了海水养殖“第 一次浪潮 【2 ，3 】；二十世纪七十年代末期以来海带品种培育工作的深入开展，扩 大了海带可栽培海域范围并进一步提高了养殖效益，促进了海带养殖迅速发展； 目前，海带年产量占我国藻类养殖总产量的5 7 5 ，居我国海水养殖品种产量排 位的第3 位【4 】。 二十世纪五十年代末期，我国最早进行了海带遗传育种理论、技术研究与实 践应用，开展了海带叶片长度、柄长、叶片厚度等数量遗传学研究【5 1 。通过数 量性状遗传特征建立了海带定向选择育种技术，此后，海带配子体克隆培养及杂 交育种技术的成熟以及海带单性生殖现象的发现，又促进了多个养殖品种的成功 培育，为我国现代海带养殖业的蓬勃发展奠定了重要的良种支撑技术。 现代技术在提高产量潜力的同时，使得海带养殖生产仅依赖于少数遗传基础 狭窄的品种。品种单一化不仅存在遗传脆弱性的巨大威胁，而且品种对养殖环境 的适应和对市场需求的符合性也较差。需要加强海带种质资源的引进、保存与遗 传资源开发工作，为海带养殖产业的可持续发展提供种质与技术支撑。因此，海 带遗传育种研究和良种选育日益受到重视，而海带分子标记的筛选和开发，对其 遗传多样性分析、遗传连锁图谱的构建及分子标记辅助育种则将起到重要作用。 简单重复序列s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t , s s r ) ，又称微卫星标记，是一种 由1 , - 6 个核苷酸为重复单元的串联重复序列，广泛分布于真核生物基因组的编 码区和非编码区【6 j 。s s r 标记具有多态性高、共显性、重复性好、数量丰富、技 术简单、特异性强等特点。绝大部分s s r 标记来源于基因组d n a 序列，被称之 为g e n o m i cs s r ，少部分s s r 标记来源于表达序列，被称之为e s t - s s r ( e x p r e s s e d s e q u e n c et a g s s s r ) 。e s t - s s r 的分析结果反映出的是基因编码区域的信息，可直 i 海带e s t - s s r 标记开发及褐藻t p s 基因的克隆 接获得功能基因结构和表达的有关信息。在分子生物学研究较为深入并已经积累 了大量e s t 序列信息的物种中，从已有的e s t 序列中开发s s r 标记是一种快速 有效的途径【刀。 海藻糖( q d g l u e o p y r a n o s y l - 【1 ，1 】一0 【一d - g l u e o p y - r a n o s e ) 是一种广泛存在于自 然界中的非还原性双糖，由两个分子葡萄糖构成，存在于包括细菌、真菌、酵母、 海藻和许多动植物中【引，能够稳定细胞内的生物结构，研究表明它能提高生物体 抵抗温度、p h 、干旱盐碱等逆境的能力，被认为是一种很有前景的食品药品添 加剂、农作物抗逆的保护剂。目前很多研究者正设法分离有关海藻糖合成酶的基 因，并引入植物表达，提高其抗干旱、盐碱的能力，这对培育抗盐耐旱的新品种 具有重要意义，因此海藻糖的相关研究越来越引起人们的关注。 本研究中，一方面利用本实验室在构建海带e d n a 文库和e d n a 克隆测序 得到的e s t 序列和n c b i 数据库中已公布的海带e s t 序列信息进行s s r 筛选和 引物设计，经过实用性鉴定和应用验证，开发出一批e s t - s s r 标记，可以用于海 带的的分子生物学研究；另一方面利用同源克隆和r a c e 技术从海带中克隆了 刀咯基因( l j t p s ) ，将，珊与已经报道的其它生物的刀峪基因以及我们随后从 其它九种海藻中克隆的t p s 基因进行比较遗传学分析，为深入了解海藻刀峪基 因的结构和功能提供了基因资源；也为通过遗传转化培育农作物抗旱耐盐新品种 提供了候选目标基因。 2 海带e s t - s s r 标记开发及褐藻t p s 基因的克隆 1 文献综述 1 1 海藻概述与海带 1 1 1 海藻生物学特征与应用 藻类植物是具有叶绿素、能进行光合作用，营自养生活的无维管束、无胚的 孢子植物【9 1 。海洋藻类是生活于海洋中的所有藻类植物的统称。海藻是海洋植物 中的重要组成者，除了给人类提供蛋白质、能量、医药以及多种维生素等，还可 以生产各种化工产品，如褐藻胶、琼胶、卡拉胶、甘露醇等。 藻类因内部构造没有维管束组织的分化，所以不具有真正的根、茎、叶等器 官，虽然有许多种类具有特化的细胞，但其分化并不完全，那些类似根的固着器 除了有附着作用之外，整个藻体大多可从环境中直接吸收养分或交流物质。所有 的藻类都不会开花结果，其生殖构造基本上是由单细胞个体自身变成配子或孢 子，或由多细胞藻体的某一细胞形成配子囊或孢子囊。细胞内均含有叶绿素a 。 所有藻类因含有叶绿素a ，可以进行光合作用而获得养分。此外，不同种类的海 藻含有不同型式及含量的辅助色素，如叶绿素b 、叶绿素c 、叶绿素d 、胡萝卜 素、藻蓝素、藻红素、藻褐素、叶黄素等，这些辅助色素之间的组合及含量比例 不同，也是藻类分类研究的一个重要依据。 目前，世界各国藻类学家对藻类的分类并没有统一的认识，中国藻类学者把 藻类分为1 2 个门：蓝藻门( c y a n o p h y t a ) ，红藻门( r h o d o p h y t a ) ，隐藻门 ( c r y p t o p h y t a ) ，黄藻门( x a n t h o p h y m ) ，金藻f - j ( c h r y s o p h y t a ) ，甲藻门 ( p y r r o p h y t a ) ，硅藻门( b a c i l l a r i o p h y t a ) ，褐藻f - j ( p h a e o p h y t a ) ，原绿藻门 ( c h l o r o x y b a c t e r i a p h y t a ) ，裸藻门( e u g l e n o p h y t a ) ，绿藻门( c h l o r o p h y t a ) 和轮 藻门( c h a r o p h y t a ) 。它们的分类主要根据其所含的不同色素及与色素相关的光 合作用的产物、储藏物质、细胞壁成分、藻体生长型式、分枝型式、固着器、孢 子囊种类、果胞枝和囊果等特征。 根据藻体类型的大小，海藻可分为两类：大型海藻和微藻。大型海藻是指长 在潮间带或潮下带岩礁上、具有假根、可固着生长的藻类，其结构比较复杂，形 态多样，有些海藻如巨藻长度可达几十米以上。微藻则多为单细胞藻类，主要为 浮游生活，有的种类具有鞭毛并能在水中游动，其数目与种类很多，常见的有硅 藻、甲藻等。 3 海带e s t - s s r 标记开发及褐藻t p s 基因的克隆 大型海藻主要包括褐藻、绿藻、红藻三大类群。 褐藻门( p h a e o p h y t a ) ，大约有2 5 0 属1 5 0 0 种。其中绝大多数是在海水中 生活的，根据褐藻繁殖和生活史的不同特点，分为3 个纲，即褐子纲、不动孢子 纲、圆子纲。褐藻门的物种多呈褐绿色、棕褐色或褐色，这是由于色素体内除了 叶绿素、胡萝卜素类色素外，还含有叶黄素类色素的缘故。褐藻门均为多细胞体， 没有单细胞体或群体结构的物种。常见的种属：有水云属( e c t o c a r p u s ) 、海带 属( l a m i n a r i a ) 、马尾藻属( s a r g a s s u m ) 等等。大多数褐藻的生活史中，都有明显的 世代交替现象，有同型世代交替和异型世代交替。同型世代交替即孢子体与配子 体的形状、大小相似，如水云属( e c t o c a r p u s ) ；异型世代交替即孢子体和配子 体的形状、大小差异很大，多数种类是孢子体较发达，如海带。少数是配子体较 发达，如萱藻属( s c y t o s i p h o n ) 。贮藏物质为褐藻淀粉、甘露醇和脂类等。有的 种类如海带，细胞内含有大量碘。 绿藻i - j ( c h l o r o p h y t a ) ，约3 5 0 属8 0 0 0 余种，根据生殖细胞的形态结构和生 殖方式的不同分为绿藻纲和接合藻纲。多数生长于淡水，少数在海水中生长。石 莼目与管藻目是常见的海洋绿藻。藻体通常草绿色。细胞壁含有纤维素，色素体 所含色素为叶绿素a 、b ，胡萝卜素和叶黄素等，此外色素体内还含有淀粉核， 光合作用产物主要是淀粉。这些特征与高等维管束植物类似，因此很多藻类学家 认为绿藻门比其他藻类与高等植物的亲缘关系更接近。常见绿藻有石莼属 ( u n d a r i a ) 、礁膜属( m o n o s t r o m a ) 、松藻属( c o d i u m ) 等。 红藻植物i ( r h o d o p h y t a ) ，约有5 5 8 属3 7 4 0 种。藻体通常呈红色，这是因为 色素体不仅含有叶绿素、叶黄素、胡萝卜素，还含有辅助色素藻红素、藻蓝素， 一般前者含量多后者含量少。因藻红素含量较高，故藻体呈紫红、红、褐等色。 藻红素能吸收透入深海的短波光、蓝光和绿光，进行光合作用，故红藻在较深的 海里也能生活。除个别种类藻体为单细胞和群体外，大多为多细胞体。生活史中 大多有世代交替现象。常见的有紫菜属( p o r p h y r a ) 、江蓠属( g r a c i l a r i a ) 等。 1 1 2 海带研究概况 海带( l a m i n a r i a j a p o n i c a ) ，分类学上属于褐藻门( p h a e o p h y t a ) 游孢子纲 ( p h a e o s p o r e a e ) 海带目( l a m i n a r i n l e s ) 海带科( l a m i n a r i a c e a c e ) 的海带属 ( l a m i n a r i a ) 1 1 1 ) ：作为海洋中的大型藻类，海带也是一种世界性的经济海藻。 4 海带e s t - s s r 标记开发及褐藻t p s 基因的克隆 目前，海带增养殖种类主要有真海带( l a m i n a r i a j a p o n i c a ，我国一般称为海带) 、 狭叶海带长叶变种( l a m i n a r i aa n g u s t a t av a rl o n g i s s i m a ) 和利尻海带( l a m i n a r i a o c h t a n s i s ) 等少数几个物种，我国海带养殖种类主要是海带及其与糖海带和长叶 海带的杂交种。 海带是一种经济价值很高的大型海藻，它富含铁、钙、蛋白质、维生素等人 体所需的营养成分，可以作为营养丰富的海洋食蔬。海带的含碘量达3 5 ， 在历史上曾作为提碘的主要原料。另外，海带富含的褐藻胶、甘露醇、盐藻多糖 等经济成分，目前已成为医药、海藻化工和农业肥料等行业的重要原料。 1 1 2 1 海带生活史 海带属藻类为异型世代( 不等世代) 交替，其生活史由大型的叶状孢子体( 图 1 1 ) 世代和微小的配子体世代构成。自然界中的海带寿命为跨3 个年度的两年 生活，第一年夏季叶片大部分腐烂脱落，仅残留固着器、柄部和少量的叶片基部 ( 生长点部位) ；待秋季水温下降后，基部细胞不断分裂，重新生长出叶片，至 第二年秋季叶片死亡。每年秋季叶片表皮细胞可分化形成孢子囊，并放散孢子。 在人工养殖情况下，海带生命周期为跨2 个年度的1 年生活，在夏季水温达到 1 6 c 左右即可大量收获，水温在1 8 2 0 c 之间时开始大量产生孢子囊。 i 嗣稿器2 柄& 叶片 4 纵沟5 中带帮6 叶绿部 图1 1 海带孢子体的外部形态模式图( 引自海藻养殖) 海带孢子体为居间生长，生长点位于叶片靠近柄的基部【l l 】，随着发育过程， 海带孢子体的外部形态和内部组织结构也随之逐渐变化和发展，可以分为幼龄 期、凹凸期、脆嫩期、厚成期、成熟期和衰老期。 当藻体进入成熟期时，叶片皮层细胞分化为孢子囊，并形成连片的孢子囊群， 海带e s t - s s r 标记开发及褐藻t p s 基因的克隆 孢子囊成熟后，大量放散出游孢子。初期放散出来的游孢子在水中作迅速的波浪 式运动，经过一段时间，游孢子附着到基质上，并逐渐萌发成配子体。配子体形 成后便结束了无性世代，配子体具有雌、雄两种性别的分化。海带雌配子体多数 为一个细胞的藻体，为梨形或球形，直径一般为1 1 p m 2 2 p m ，最初几天，色素 较淡以后逐渐加深，变为棕褐色；雄配子体一般由多个细胞组成，细胞较雌配子 体的小，直径多为5 p m 8 p m ，色素较雌配子体的浅。雌、雄配子体可分化出卵 囊和精子囊，分别排卵、排精，卵子受精形成合子，合子继而萌发形成孢子体( 图 】2 ) 。 图1 2 海带的生活史( 实验室资料) 1 1 2 2 海带配子体克隆分离培养技术 在2 0 世纪7 0 年代之前，许多藻类学家和藻类遗传学家都认为海带不是进行 科学研究的理想材料。海带的孢子体世代特别是成熟的孢子体长度可达几米，很 难在实验室内养殖。而配子体世代是短暂的，在适宜的条件下，两周就能成熟， 不能长期保存【1 2 1 。海带以配子体形式存在时间短，在很大程度上限制了对于海 带的科学研究。而2 0 世纪7 0 年代方宗熙等建立的海带配子体克隆技术为海带的 深入研究提供了便利和支撑，即采用细胞单独分离培养技术，经过连续光照，较 高温度( 1 8 2 2 ) 、维生素c 的条件下进行培养，成功地培育出海带配子体 无性繁殖系( 即海带配子体克隆) 1 3 】。海带配子体克隆是从单个雌配子体或单 个雄配子体分别长成的多细胞的复杂的分枝体或簇状体。但是，配子体克隆具有 6 海带e s t - s s r 标记开发及褐藻t p s 基因的克隆 发育的全能性，还是较难实现克隆的长期保存。1 9 7 9 年崔竞进等通过低温( 4 ) 和弱光 1 2l , t m o l ( m 2 s ) 来抑制海带配子体克隆细胞的生长和发育，使其进行缓 慢的有丝分裂，实现了种质资源的长期保存【l4 1 。海带配子体克隆分离技术和低 温弱光保存技术的建立和应用，为海带种质资源保存及研究奠定了基础。 中国海洋大学海洋生物遗传育种研究室在1 9 7 5 年率先建立了海带配子体克 隆种质资源库，到目前为止，已保存了海带属8 个种，近5 0 0 个品系的克隆，其 中部分克隆已保存超过3 0 年，仍保持着较好的生长和发育能力【l 引。 1 1 2 3 海带遗传育种工作和需要解决的问题 早期海带主要来源于自然增殖。二十世纪中期，我国科技工作者率先攻克了 “夏苗培育 、“筏式养殖 等技术难关，实现了海带全人工养殖，形成了海水养 殖“第一次浪潮”；二十世纪七十年代末期以来海带品种培育工作的深入开展， 扩大了海带可栽培海域范围并进一步提高了养殖效益，促进了海带养殖迅速发 展，养殖面积从1 9 7 8 年的1 8 万公顷发展到目前的3 3 万公顷，养殖产量也提高 至2 0 0 8 年的7 9 7 万吨以上【4 】，海带年产量占我国藻类养殖总产量的5 7 5 ，居 我国海水养殖藻类产量排位的第1 位。在全球海藻养殖业，海带也有着非常重要 的地位，首先其总体养殖产量占全球海藻养殖总量的2 9 8 ，其次，也是全球许 多行业所需的褐藻胶的主要生产原料。我国以海带为原料生产的褐藻胶年产量约 3 5 0 0 0 吨，占全球总产量的6 0 。 优良品种对养殖产业的发展有至关重要的作用。随着海带养殖技术的不断成 熟，海带养殖产量由1 9 5 3 年1 2t 亩，提高至1 9 5 8 年的1 6 t 亩，再经过2 0 世纪 8 0 年代以来海带良种的大规模推广应用，海带养殖产量现已达到2 0 t 亩的水平 ( 鲜品，按照每亩4 0 0 根养殖绳折算) 。中国是最早开展海带遗传育种理论、技 术研究与实践应用的国家。从二十世纪五十年代末期，海带叶片长度、柄长、叶 片厚度等数量遗传学研究即已开展，建立了海带育种的基本理论与方法，并且通 过定向选育，培育出世界首例海洋生物新品种“海青一号 海带，这种根据数量 性状遗传特征建立的海带定向选择育种技术，为此后海带育种工作所广泛采用。 二十世纪七十年代中期，海带配子体克隆技术的成熟和海带单性生殖现象的发 现，开辟了海带细胞工程育种新时期，以海带配子体克隆为育种材料，先后建立 了单倍体育种、种间和种内杂交育种、杂种优势利用等育种技术，培育出单海一 7 海带e s t - s s r 标记开发及褐藻t p s 基因的克隆 号、单杂十号、荣海1 号、远杂1 0 号等新品种，也为我国现代海带栽培业的蓬 勃发展奠定了重要的良种支撑技术。二十世纪八十年代以来，海带遗传资源的收 集与保存，尤其是国外优良种质资源的引进为海带杂交育种研究提供了丰富育种 的亲本材料，以配子体克隆杂交创制育种素材以及直接应用于杂种优势利用的研 究不断得到突破发展，9 0 1 、东方2 号、荣福、东方3 号等新品种培育与应用， 使得海带栽培业实现了良种化。另外，目前凯普、三海等多个海带新品系已进入 到养殖测试阶段，有望成为当前海带养殖业的新的良种，持续提升着我国海带栽 培业的生产能力与效益( 引自实验室资料) 。 我国海带种质资源遗传基础较为狭窄是海带育种研究的难点之一。海带最早 出现在我国的时间为1 9 1 4 年前后，原始群体源自于日本。该种群曾于1 9 1 4 , - , 1 9 2 5 年期间分三批引入我国，但其引种规模较小，仅能视为海带( l a m i n a r i a j a p o n i c a ) 的“小群体。因自然种群的衰退，1 9 3 0 年，日本人又从日本北海道引进了一批 种海带在大连沿海进行绑苗投石海底自然繁殖试验。我国的海带遗传育种工作者 利用有限的海带种质资源，创造性地培育出了多个优良品种，并在2 0 世纪8 0 年代先后从日本、德国、加拿大等地引进了9 个海带物种，进一步丰富我国海带 遗传资源量，并为后期的海带杂交育种奠定了重要的种质基础【l 剐。2 0 世纪九 十年代以来，“单杂十号 、“远杂1 0 号”、“9 0 1 、“荣福”、“东方3 号 等高产 杂交种的培育成功，进一步推动了我国海带养殖业的蓬勃发展。此外，杂交种的 大面积推广养殖，也导致了原有选育品种群体遗失和遗传混杂，早年育成的自交 品种群体没有完整的保留下来，实质上削弱了我国海带遗传资源量。我国目前生 产应用海带品种的遗传来源中，2 3 均是由海带( l a m i n a r i aj a p o n i c a ) 遗传分化 得到的，而其余品种的杂交亲本之一也源自该群体，现有品种的遗传基础较为狭 窄。养殖品种种质近缘性以及异质性也增加形态学和遗传学鉴定的难度。尽管海 带分子标记研究已经取得了长足的发展，r a p d 、a f l p 、s s r 、i s s r 等分子标 记以及i t s 、r b cl 、c o i 等基因序列扩增与分析技术在遗传多样性检测和物种鉴 定方面得到了较多地应用，但是，s s r 标记的开发和应用刚刚起步，并且尚未应 用于性状辅助选育和数量性状位点分析。相信随着研究的深入，以分子辅助选择 为基础的海带数量性状遗传育种工作也将会进一步发展。 8 海带e s t - s s r 标记开发及褐藻t p s 基因的克隆 1 2 分子标记技术及其应用 1 2 1 遗传标记概述 遗传标记( g e n e t i c sm a r k e r s ) 是指可追踪染色体、染色体某一节段或某个基因 座在家系中传递的任何一种遗传特性，是表示遗传多样性的手段【1 9 j 。遗传标记 具有两个基本特征：可遗传性、可识别性。遗传标记在遗传学的建立和发展过程 中具有举足轻重的作用，同时也是研究生物遗传育种的重要工具。到目前，遗传 标记主要包括形态标记、细胞学标记、生化标记、分子标记等四种类型。其中 前三种遗传标记都是以基因表达的结果为基础的，是对基因的间接反映；分子标 记则是d n a 水平遗传变异的直接表现和遗传多态性的直接反映。 1 2 1 1 形态标记 形态标记是生物的外部形态特征，并且最早应用于生物的分类。它主要是肉 眼可见的外部特征，如矮秆、白化、叶形等，也包括色素、生理特性、生殖特性 等，具有简单直观、数量少、经济方便、多态低、受环境影响大、并常与不利的 性状连锁等特点。由于形态标记数量有限制，加上基因多效作用，因而形态标记 不适于需要完整的基因组测试的数量性状位点分析。另外，许多形态标记还受到 环境、生育期等因素的影响，使得形态标记在植物育种中的应用受到限制。尽管 如此，用直观的形态标记研究质量性状的遗传显得更为简便，并且仍是生物品种 分类研究的一种有效手段，同时为生物遗传育种奠定基础。 1 2 1 2 细胞学标记 细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征，如染色体结构和数目 特征等。又可以分为染色体标记和细胞化学标记。细胞学标记受环境影响小，染 色体研究的实验条件相对简单，可以快速获得结果。与形态标记相比，细胞学标 记的优点是能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。但是细胞学标记材 料需要投入较多的人力、时间来培养，且难度大，还有些变异难以用细胞学标记 进行检测。另外对于染色体数量多、染色体小的物种如海带，染色体核型不易区 分清楚，从而暂时限制了细胞学标记的应用。 1 2 1 3 生化标记 生化标记是在蛋白质多态性的基础上发展起来的标记方法，包括储藏蛋白、 同工酶标记、等位酶标记、免疫学标记等。蛋白质是基因表达的产物，与形态标 记、细胞学标记相比，数量上更丰富，能提供更多的差异信息；受环境影响更小， 9 海带e s t - s s r 标记开发及褐藻t p s 基因的克隆 能更好地反映遗传多态性。编码各种非酶蛋白和同工酶的基因能被定位于染色体 上，并建立与其它标记连锁的关系。随着已定位同工酶座位数的增加，就可利用 它们作为一种遗传标记确定未定位的其它基因。生化标记具有方便、经济的优点， 但也具有数量少、翻译后能被修饰、需要特殊的显色方法和技术等缺点，因而制 约了其发展。生化标记已被广泛应用于物种起源与进化研究、种质鉴定、物种分 类和抗病性筛选等领域。 1 2 1 4 分子标记 分子标记是指以生物大分子的多态性为基础的一种遗传标记。广义上是指 可以传递的并可检测的d n a 或蛋白质，狭义的则指d n a 分子标记，常提及的 是指后者。d n a 序列差异是由单碱基突变和插入、缺失、易位、倒位或转座等 引起的碱基差异所造成的。d n a 分子标记具有许多明显的优越性：直接以d n a 的形式出现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测，不受季节、环境 限制；数量极多，几乎遍及整个基因组；多态性高，自然界存在许多等位变异； 非等位的标记之间不存在上位效应及其它形式的基因互作；表现为中性标记， 不影响目标性状的表达；部分分子标记可分析微量的d n a 样品；结果稳定可 靠，重复性好等等。因而被广泛地应用于植物的遗传育种、基因组作图、基因 定位、基因克隆、遗传多样性分析及系统进化等方面。 1 2 2 常用的分子标记 迄今，已发展了多种多样的以d n a 为基础的分子标记，d n a 分子标记是 直接在d n a 分子水平检测生物间的差异。d n a 分子标记自从它诞生之日起， 在经历了短短几十年的迅猛发展后，该技术日趋成熟。现在己出现的d n a 分子 标记技术，基本上都是建立在d n a 杂交、p c r 及单核苷酸多态性基础上，大致 可以分为以下几类： ( 1 ) 基于杂交的分子标记，如r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ) 、v n t r ( v a r i a b l en u m b e rt a n d e mr e p e a t s ) 、原位杂交( i ns i r e h y b r i d i z a t i o n ) 等。 ( 2 ) 基于p c r 的分子标记，如r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) 、 c a p s ( c l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i i cs e q u e n c e ) 、a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n t 1 0 海带e s t o s s r 标记开发及褐藻t p s 基冈的克隆 l e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 、s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，又称为m i c r o s a t e l l i t e ) 、s c a r ( s e q u e n c e - c h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n ) 、s t s ( s e q u e n c e - t a g g e ds i t e ) 、s r a p ( s e q u e n c e - r e l a t e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ) 、t r a p ( t a r g e tr e g i o na m p l i f i e d p o l y m o r p h i s m ) 等。 ( 3 ) 基于m r n a 的分子标记技术，主要有，表达序列标签e s t ( e x p r e s s e d s e q u e n c et a g ) 、差异显示( d i f f e r e n t i a ld i s p l a y , d d ) 、逆转录p c r ( r e v e r t t r a n s c r i p t i o np c r , r t - p c r ) 、差异显示逆转录p c r ( d i f f e r e n t i a ld i s p l a yr e v e r s e t r a n s c r i p t i o np c d d r t - p c r ) 、特征性差异分析( r e p r e s e n t a t i v ed i f f e r e n c e a n a l y s i so rr e p r e s e n t a t i o n a ld i f f e r e n c ea n a l y s i s 。r a d ) 等。 ( 4 ) 基于核酸序列和芯片的分子标记，如s n p ( s i n g l en u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m ) 等。 当然这种分类也存在一定的交叉，例如e s t 也可以归类于基于核酸序列的 分子标记。 1 2 2 1 基于d n a d n a 杂交的d n a 标记。 基于d n a d n a 杂交的d n a 标记主要包括r f l p 标记和v n t r 标记。这类 标记是利用限制性内切酶酶解不同生物体的d n a 分子后，用同位素或非同位素 标记的随机基因组克隆、e d n a 克隆、微卫星或小卫星序列等作探针与酶切后的 d n a 杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来显示d n a 的多态性。 r f l p 标记 r f l p 即限制性片段长度多态性，这种多态性是由于限制性内切酶酶切位点 或位点间d n a 区段发生突变引起的，是应用最早的分子标记技术【2 0 】。其原理 为当用限制性内切酶处理不同生物体的d n a 时，所产生的d n a 片段长度可能 不相同，这种限制性片段长度的差异就是限制性片段长度多态性，当这些长度不 同的片段通过凝胶电泳时，就在不同的位置形成不同的谱带，显示出多态性。如 果用特异的d n a 探针进行s o u t h c m 杂交和放射自显影后，即获得反映个体特 性的r f l p 图谱。r f l p 标记具有共显性、信息完整、重复性和稳定性好等优点， 但检测昂贵，技术复杂，须用放射性同位素标记探针，即使使用非放射性的 s o u t h e r n 杂交技术，仍然耗时费力，而且很多探针检测不到遗传基础狭窄的物种 的多态性。主要适用于研究进化关系较近的物种之间的系统发生关系。 v n t r 标记 海带e s t - s s r 标记开发及褐藻t p s 基因的克隆 v n t r 是d n a 可变串联重复数标记，它包括小卫星和微卫星两种。通常将 以1 5 7 5 个核苷酸为基本单元的串联重复序列称为小卫星( m i n i s a t e u i t e s ) ，总长 度为几百到几千个碱基，主要分布于染色体的近端粒处。以2 - 6 个核苷酸为基 本单元的简单串联重复序列称为微卫星( m i c r o s a t e l l i t e s ) 或简单序列重复 ( s s r ) 。用限制性内切酶消化后切下核心串联重复序列，继而用重复序列探针杂 交，放射自显影，显示串联重复序列长度多态性。与r f l p 不同的是，此标记 技术所用的探针为重复序列。在此研究基础上，进一步开发利用p c r 进行扩增， 所得p c r 产物通过电泳比较其长度多态性，大大简化了过程的复杂性。由于小 卫星序列太长，无法通过p c r 扩增获得满意的结果。目前小卫星标记仍需利用 d n as o u t h e m 杂交和放射性标记探针来检测。这些探针与植物基因组有较高的 同源性，因此可以用于植物基因组的小卫星研究。微卫星序列常常比较短，利用 p c r 进行扩增可以得到满意的结果。现在的微卫星标记技术可归类于基因p c r 技术的d n a 标记。 1 2 2 2 基于p c r 的分子标记 聚合酶链式反应( p c r ) 是m u l l i s 2 1 1 于1 9 8 7 年发明的一种体外快速扩增 d n a 序列的技术。其简便、快速和高效的特点使之迅速成为分子生物学研究的 有效工具。1 9 8 8 年s a i k i t 2 2 1 利用耐热的t a q d n a 聚合酶取代k l e n o w 酶，使p c r 技术实现了自动化。基于p c r 的分子标记也随之发展起来。 r a p d 标记 r a p d 即随机扩增多态性d n a ，是1 9 9 0 年发展起来的一种分子标记技术 2 3 , 2 4 1 。其原理是以一系列不同的随机排列碱基顺序的寡核苷酸单链( 一般为1 0 个碱基) 为引物，对所研究的基因组d n a 进行单引物双向扩增，扩增产物用琼 脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色来检测扩增产物d n a 片段的多态性。 r a p d 技术可以在对物种没有任何分子生物学研究的情况下，对物种的基因组 进行d n a 片段多态性分析。它的优点是：引物通用，不同生物或同一生物的整个 基因组都可以使用；分析速度陕、操作简单；所需d n a 模板较少、且质量要求不高； 不需放射性同位素。但是r a p d 标记稳定性差、重复和可靠性不高，因而限制了其使 用。为了提高其稳定性和重复性，可以将此类标记转化成s c a r 标记。若某r a p d 片 段不是重复序列，也可以将其转化为r f l p 标记。 c a p s 标记 1 2 海带e s t - s s r 标记开发及褐藻t p s 基因的克隆 c a p s 技术又称p c r