（生态学专业论文）蜘蛛体内wolbachia的分子检测及基于wsp基因的系统发育分析.pdf

摘要 沃尔巴克氏体( w o l b a c h i a ) 是广泛分布于节肢动物体内的一类细胞质遗传共生菌， 最早于1 9 2 4 年在尖音库蚊c u l e xp i p i e n s 的生殖组织内发现，并将其命名为w o l b a c h i a p i p i e n t i s 。w o l b a c h i a 参与了多种调控其寄主生殖活动的机制，包括诱导胞质不亲合、诱 导孤雌生殖、诱导雌性化、杀雄以及增强雌性繁殖力和雄性生育力等。研究w o l b a c h i a 对于了解节肢动物的生殖生物学、性别决定机制、物种进化及人工调控它们的生殖行为 等方面都有重大意义。 本研究以湖北省武汉地区常见的蜘蛛类群为试验对象，首次报道了中国蜘蛛体内 w o l b a c i a 的感染情况。采用w o l b a c h i a 的表面蛋白( w o l b a c h i as u r f a c ep r o t e i n ，w s p ) 基因w s p 的通用引物( 8 1 f 和6 9 1 r ) 对武汉地区1 1 个科共3 1 种常见蜘蛛体内w o l b a c h i a 的感染进行了分子检测。结果表明黄金肥蛛l a r i n i aa r g i o p i f o r m i s 、斜纹猫蛛o x y o p e s s e r t a t u s 、卡氏毛园蛛e r i o v i x i ac a v a l e r i e i 、八斑鞘腹蛛c o l e o s o m ao c t o m a c u l a t u m 、大腹 园蛛a r a n e u sv e n t r i c o s u s 、隐匿幽灵蛛p h o l c u sc r y p t i c o l e n s 和棒络新妇n e p h i l ac l a v a t a 共 7 种蜘蛛中有w o l b a c h i a 的共生。每种蜘蛛随机挑选3 0 头以测定它的个体感染率。个体 感染率最高的是斜纹猫蛛7 3 3 ( 2 2 3 0 ) ，最低的是八斑鞘腹蛛1 3 3 ( 4 3 0 ) 。通过 克隆测序，得到了7 条w s p 基因序列，递交到g e n b a n k 上并成功获得了注册号，分别为 e u 4 2 3 9 1 1 ，e f 6 1 2 7 7 1 ，d q 7 7 8 7 3 8 ，e u 4 2 3 9 0 9 ，e u 4 2 3 9 1 0 ，e f 6 1 2 7 7 3 和e f 6 1 2 7 7 2 。 将7 种蜘蛛的w s p 基因序列进行比对发现黄金肥蛛、大腹园蛛和卡氏毛园蛛这三种蜘蛛 的w s p 基因序列非常相似，彼此之间只有3 个碱基的区别。在已知有w o l b a c h i a 感染的 蜘蛛中，选取两组特定类群( a 和b 类群) 的w s p 基因特异性引物进行p c r 扩增，以确定 它们感染的类群，同时检测它们中是否存在超感染现象。使用的a 类群引物是1 3 6 f 和 6 9 1 r ，b 类群的引物是8 1 f 和5 2 2 r 。检测结果发现大腹园蛛、卡氏毛园蛛、黄金肥蛛 和隐匿幽灵蛛运用a 类群引物扩增出5 5 0 b p 左右的目的基因片段，说明以上蜘蛛体内的 w o l b a c h i a 属于a 类群。在斜纹猫蛛、八斑鞘腹蛛体内扩增出4 4 0 b p 左右的目的基因片 段，说明它们体内的w o l b a c h i a 属于b 类群。而运用a 类群和b 类群特异性引物均能 从棒络新妇体内扩增出目的片段，说明它被两种w o l b a c h i a 感染，棒络新妇体内存在超 感染现象。最后利用已获得的w s p 基因序列和g e n b a n k 上已发表的蜘蛛w o l b a c h i a 的 w s p 基因序列建立分子系统树，结果表明，7 种蜘蛛感染的w o l b a c h i a 分属a 、b 两个大 组。其中黄金肥蛛、卡氏毛园蛛、大腹园蛛和隐匿幽灵蛛属于a 大组，八斑鞘腹蛛、棒 络新妇和斜纹猫蛛属于b 大组，未发现有蜘蛛的w o l b a c h i a 属于线虫所在的c 组和d 组。此外也没有发现感染蜘蛛的w o l b a c h i a 与g 组亲缘关系较近，这种结果也与分组引 物的结果相一致。 关键词：蜘蛛；w o l b a c h i a w s p 基因；复合感染；系统发育分析 a b s t r a c t w o l b a c h i ai sac o m m o na n dw i d e s p r e a d g r o u po fs y m b i o t i cb a c t e r i af o u n d i n r e p r o d u c t i v et i s s u e so fa r t h r o p o d s t h e s eb a c t e r i aa r et r a n s m i t t e dt h r o u g ht h ec y t o p l a s mo f e g g sa n dh a v ee v o l v e dv a r i o u sm e c h a n i s m sf o rm a n i p u l a t i n gr e p r o d u c t i o no ft h e i rh o s t s ， i n c l u d i n gi n d u c t i o no fc y t o p l a s m i ci n c o m p a t i b i l i t y ，p a r t h e n o g e n e s i s ，f e m i n i z a t i o n ，m a l e k i l l i n g ， f e c u n d i t yo rf e r t i l i t ym o d i f y i n g w o l b a c h i ai st h o u g h tt ob em a j o rf a c t o r si nt h ee v o l u t i o no f s e xd e t e r m i n a t i o n ，e u s o c i a l i t y ，a n ds p e c i a t i o n i ti san e wc l u ef o rt h o s er e s e a r c hf i e l d s t h i ss t u d yp r e s e n t e dt h ef i r s ts u r v e ya n dc h a r a c t e r i z a t i o no fw o l b a c h i ap i p i e n t i si n s p i d e r sc o l l e c t e df r o mw u h a n ，h u b e ip r o v i n c e ，c h i n a f i r s to fa l l ，w eu s e du n i v e r s a lp r i m e r s o fw s pg e n e ( w o l b a c h i as u r f a c ep r o t e i n ，w s p ) t oe x a m i n et h ei n f e c t i o no fw o l b a c h i ai n s p i d e r s w ef o u n dt h a t ，o u to f3 1 s p i d e rs p e c i e s ，7s p e c i e sw e r ei n f e c t e dw i t hw o l b a c h i a t h e y w e r el a r i n i a a r g i o p i f o r m i s ，o x y o p e ss e r t a t u s ，e r i o v i x i a c a v a l e r i e i ，c o l e o s o m a o c t o m a c u l a t u m ，a r a n e u sv e n 印i c o s u s ，p h o l c u sc r y p t i c o l e n s ，a n dn e p h i l ac l a v a t a t h i r t y i n d i v i d u a l sh a db e e ne x a m i n e dt oa t t a i nt h ei n f e c t i o nr a t e t h er e s u l t ss h o w e dt h a to x y o p e s s e r t a t u sh a dt h eh i g h e s tr a t eo fi n f e c t i o n ( 2 2 3 0 ) a n dc o l e o s o m ao c t o m a c u l a t u mw r et h e l o w e s t ( 4 3 0 ) u s e dt h ec l o n i n gm e t h o d sw eo b t a i n e d7w s pg e n es e q u e n c e s ，w h i c hh a db e e n s u b m i t t e dt og e n b a n k t h en c b ia c c e s s i o nn u m b e r sw r ee u 4 2 3 9 1 1 ，e f 6 1 2 7 7 1 ，d q 7 7 8 7 3 8 ， e u 4 2 3 9 0 9 ，e u 4 2 3 9 1 0 ，e f 6 1 2 7 7 3a n de f 6 1 2 7 7 2 c o m p a r e dt h e s es e v e nw s pg e n es e q u e n c e s t o g e t h e r ，w ef o u n dt h a tt h e r ea r eo n l yt h r e eb a s e sd i f f e r e n c ea m o n g l a r i n i aa r g i o p i f o r m i s ，e r i o v i x i a c a v a l e r i e ia n da r a n e u sv e n t r i c o s u s t h e nw eu s e dt h es p e c i f i cp r i m e r so faa n dbw o l b a c h i a s u p e r g r o u pf o rw s pg e n et oi d e n t i f yi ft h e r ea r es u p e r i n f e c t i o n si nt h e s ei n f e c t e ds p i d e r s t h e r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tn e p h i l ac l a v a t aw e r ei n f e c t e dw i t hs t a i n so faa n dbw o l b a c h i a ， t h eo t h e r sw e r ei n f e c t e dw i t hs t a i n sao rb n e p h i l ac l a v a t ai ss u p e r - i n f e c t i o n a tl a s t ，a l i g n e d t h eo b t a i n e ds e q u e n c e sw i t ht h ep u b l i s h e do n e s ，t h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p sa m o n g w o l b a c i af o u n di ns p i d e r sw e r ee s t a b l i s h e d t h ew o l b a c h i ai n f e c t e di nl a r i n i aa r g i o p i f o r m i s ， e r i o v i x i ac a v a l e r i e i ，a r a n e u sv e n t r i c o s u s ，p h o l c u sc r y p t i c o l e n s ，b e l o n gt oa g r o u p ，t h eo t h e r t w os p e c i e sb e l o n gt obg r o u p t h e r ew e r en ow o l b a c h i as t r a i n sb e l o n gt os u p e r g r o u pca n d dw h i c hr e s t r i c t e dt of f l a r i a ln e m a t o d e s ，a n dn os t r a i n sc l o s e l yr e l a t e dt og s u p e r g r o u p k e yw o r d s ：s p i d e r ；w o l b a c h i a ；w s pg e n e ；s u p e r i n f e c t i o n ；p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s i i i 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 论文作者签名： 互振宇 日期： 髫年6 月歹日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本，i 学校有权保存并向国家有关部门或 机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允许采用影 印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前提下，学校 可以公开学位论文的部分或全部内容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名：主张宇 指导教师签名：彩当 日期：桃，63 ， 日姆：硼8 ，6 7 7s 1 文献综述 1 文献综述 沃尔巴克氏体( w o l b a c h i a ) 最早是1 9 2 4 年h e r t i g 和w o l b a c h 在尖音库蚊c u l e xp i p i e n 的卵巢中发现的【。h e r t i g 为了纪念他的合作者w o l b a c h ，1 9 3 6 年将其正式定名为 w o l b a c h i ap i p i e n t i s 2 1 。从正式命名一直到7 0 年代以前，这种共生微生物丝毫未引起人 们注意，这期间有关w o l b a c h i a 的研究报道也很少。直到1 9 7 1 年，y e n 和b a r 发现在蚊 子中形p i p i e n t i s 引起杂交不亲和现象，即没有w o l b a c h i a 共生的雌蚊的卵与含w o l b a c h i a 的雄蚊的精子受精后，受精卵不能存活，有关w o l b a c h i a 的研究才逐渐引起了一些生物 学家的兴趣，特别是当发现w o l b a c h i a 的侵染及其对宿主的影响还存在于其他种类的节 肢动物中，w o l b a c h i 才在世界范围内引起较为广泛的关注，也使得相关的研究逐渐开展 起来【3 1 。目前有关w o l b a c h i a 的研究主要集中在以下几个方面：( 1 ) w o l b a c h i a 在节肢动 物各种群中的分布及感染特点；( 2 ) w o l b a c h i a 对宿主的生殖调控作用及生化机理；( 3 ) w o l b a c h i a 水平传播的途径。( 4 ) 如何利用w o l b a c h i a 的生殖调控特点进行生物防治。 1 1 肋l b a c h i a 的形态与分布 1 1 1w o l b a c h i a 的形态 早在1 9 3 6 年h e r t i g 就对w o l b a c h i a 的形态学有过详细的描述。w o l b a c h i a 具有立克次 氏体的一般特征。它有两种形态：一种是不规则杆状，长约0 5 1 3 1 a m ；另一种是球孢状， 直径约0 。1 5 i t m 的小球孢与直径1 1 8 肛l 的大球孢相邻，大球孢内含1 到若干个小球孢。 w o l b a c h i a 的这种多型性水平随宿主细胞年龄的增长而增长【4 】。电镜下观察w o l b a c h i a 存在于一个由三层膜包被的小室中，最外层的膜来自宿主组织，次外层是细菌的细胞外 壁，最内层由细菌质膜组成【5 1 。细胞内的共生细菌一般都有多层膜的包被，这些膜可能 在宿主对原核生物的控制中起作用【4 】。 1 1 2w o l b a c h i a 在宿主体内的分布 研究表日) w o l b a c h i a 大量存在于宿主生殖组织中( 卵巢和精巢) 。在卵巢中，w o l b a c h i a 丰度最高的是滋卵细胞，是发生复制的所在【5 , 6 1 。滋卵细胞的内容物通过胞质桥进入发育 中的卵，在卵细胞中，w o l b a c h i a 与微管相关，这种相关被认为对w o l b a c h i a 引起的胞质 不亲和和孤雌生殖非常重要川。1 9 9 9 年d o b s o n 等发现w o l b a c h i a 不仅存在于生殖组织 湖北大学硕十学位论文 中，也存在于非生殖组织中。他在果蝇成虫的头、胸、中肠、马氏管和血淋巴等组织中 发现了w o l b a c h i a l 8 1 。在一些物种，如果蝇d r o s o p h i l as i m u l a n s l 5 1 、叶蜂达博寡节小蜂 d a h l b o m i n u s 丘s c i p e n n i s t 9 】和木重- - q , a r m a d i l l i d i u mv u l g a r e l l o 】的神经组织中也发现了 w o l b a c h i a 。与神经组织的这种密切相关有可能使w o l b a c h i a 直接影响宿主的行为。 此外，w o l b a c h i a 在不同种的宿主中数量变化相当大，一个雌性木虱中的w o l b 口c h i a 数量约为6 6 0 0 0 1 6 4 0 0 0 1 0 1 。在赤眼蜂属小型蜂种的单头卵中可有2 5 0 6 7 0 个w o l b 口c h i a 。 果蝇的单粒卵中可有5 0 0 0 0 0 个w o l b a c h i a ，雄蝇中估计有3 6 5 1 0 7 个w o l b 口c h i n i n 。 1 1 3w o l b a c h i a 在自然界中的分布 w o l b a c h i a 在自然界中的分布极为广泛。w e r r e n 发现来自巴拿马的昆虫样本中，新 热带区昆虫1 6 的种都被w o l b a c h i a 感染；对北美昆虫w o l b a c h i a 的感染率作调查时， 发现有1 9 3 的昆虫感染，几乎涉及到昆虫中所有主要的目，包括鞘翅目、双翅目、半 翅目、同翅目、膜翅目、鳞翅目和直翅目等。此外w o l b a c h i a 在蛛形纲的蜘蛛判1 2 1 、螨 类【1 3 】、甲壳纲【1 4 】的等足目中有较广的分布范围，还有研究表明在线虫纲中也有w o l b a c h i a 的感染【1 5 】，这就将w o l b a c h i a 的分布扩展到节肢动物以外的其他门系。目前国内在稻褐 飞虱、白背飞虱和灰飞副1 6 1 、尖音库蚊【1 刀、三色书虱【1 8 1 、赤眼蜂【1 9 1 、二斑叶螨【捌、烟 粉虱【2 1 】、金小蜂【2 2 】和栗瘦蜂吲中都发现有w o l b a c h i a 的感染。 1 2w o l b a c h i a 的传播方式 一 垂直传递是w o l b a c h i a 在宿主种内的基本传递模式【2 4 】，但有趣的是，w o l b a c h i a 在同 种宿主的不同个体间也有水平传递。h u i g e n s 等( 2 0 0 0 ) i 宙过试验证实，当蚬蝶赤眼蜂 t r i c h o g r a m m ak a y k a i 的含菌个体和未含菌个体共享同一食物源时，w o l b a c h i a 可由含菌个 体传染给未含菌的同种个体，而且经水平传播的w o l b a c h i a 可在新宿主中垂直传递给其 后俐2 5 1 。 w o l b a c h i a 在不同种的宿主间亦有不同程度的水平传递。w e r r e n 等首次报道了 w o l b a c h i a 在不同种间的水平传递：金小蜂n a s o n i ag i r a u l t i 和它的寄主丽蝇体内都有 w o l b a c h i a ，尽管这两种寄主的亲缘关系较远，但它们所共生的w o l b a c h i a 的系统遗传关 系非常接近【掬。这个发现不仅表b 刃w o l b a c h i a 在不同种间的水平传递，而且显示寄生蜂 与其寄主是w o l b a c h i a 种间传递一个可能的传播机制【1 6 1 。甘波谊等( 2 0 0 2 ) 的研究是 w o l b a c h i a 通过寄生蜂实现种间水平传递的又一证据。灰飞砒口d 如f p j l 麟s t r i a t e l l u s 、褐 2 1 文献综述 飞虱m 缸胛舢细l u g e n s 、白背飞虱s 唧纪砌f u r c i f e r a 是属于不同属的昆虫，而它们感染的 w o l b a c h i a ：具有完全一样的唧基因序列。而且在能同时感染这3 种昆虫的寄生蜂稻虱红 螯蜂中发现了同种w o l b a c h i a 的共生，说明寄生蜂有可能是w o l b a c h i a 横向水平传播的一 种常见机制。 此外通过人工方法成功地将w o l b a c h i a 转移到不同的宿主中也可以说明w o l b a c h i a 是能够进行水平传播。g r e n i e r 等通过微注射法将w o l b a c h i a 从感染的赤眼蜂 t r i c h o g r a m m a p r e t i o s u m 中转染到了未感染的松毛虫赤眼蜂中吲。w o l b a c h i a 所能忍受的 寄主环境，事实上具有多样性。一般而言，w o l b a c h i a 与其寄主共同演化的历史越悠久， 与其他物种之间发生水平感染的几率就越低，反之，其可能性则越高。 1 3w o l b a c h i a 的基因组结构及与宿主的相互作用 对于w o l b a c h i a 基因组结构，目前所知较少。在d r o s o p h i l as p p 的分子遗传学研究中 偶然得到两个w o l b a c h i a 的基因，剃冽和砌以【2 9 1 。b e n s a a d i m e r c h e r m e k 等明确了 w o l b a c h i a 近乎完全的1 6 sr d n a 和2 3 sr d n a 序列。和其他大多数细菌不同，w o l b a c h i a 的1 6 sr d n a 和2 3 sr d n a 并不定位在同一区域【3 0 】。 m a s u i 等报道了从w t a iw o l b a c h i a 品系中分离到一种插入序列，将其命名为i s w l t 3 。 周伟国等采用p a ) h ( r e p r e s e n t a t i o n a ld i f f e r e n c ea n a l y s i s ) 方法分析不同表型w o l b a c h i a 的基 因组差异，发现在强烈诱导胞质不相容性的w o l b a c h i a 品系w r j 的基因组中，存在一个潜 在的可转移遗传因子，将其命名为w l s e ( w o l b a c h i ai n s e r t i o ns e q u e n c ee l e m e n t ) t 3 2 1 。还不 知道w o l b a c h i a 是否携带质粒，但是，间接的证据表明w o l b a c h i a 中可能有一种病毒性物 体的侵染【3 3 1 。这些w o l b a c h i a 基因组中的插入序列和可转移遗传因子有可能成为 w o l b a c h i a 的理论研究和遗传改造工程中的有力工具。 w o l b a c h i a 与宿主体内系统之间会有一定的相互作用，而这方面的研究非常缺乏。 目前仅有b o u r t z i s 等对w o l b a c h i a 与宿主免疫系统之间的相互作用进行研究，结果显示 w o l b a c h i a 的存在与否并不影响宿主d r o s o p h i l as i m u l a n sj j ；f l a e d e sa l b o p i c m s 抗菌基因的 转录【3 4 1 。 1 4w o l b a c h i a 的多样性与系统分化 w o l b a c h i a 家族中的成员属于p r o t e o b a c t e r i a 的a 亚门【3 5 】。与w o l b a c h i a 关系最近的是 一些立克次氏体，包括：马埃里希氏体鳓r l i c h i ae q u i i 、犬埃里希氏体鳓，矗曲砌c a n i s 、反 3 湖北大学硕十学位论文 刍类考德里氏体c o w d r 勋r u m i n a t a 和边缘无形体a n a p l a s m am a r g i n a l e ，它们由节肢动物传 带而寄生于哺乳动物血液中：腺热埃里希氏体e h r l i c h i as e n n e t s u 和里氏埃里希氏体 e h r l i c h i ar i s t i c i i 与w o l b a c h i a 关系较远，也是哺乳动物的病原菌；立克次氏体属( r i c k e t t s i a l 的细菌与w o l b a c h i a 关系相对更远些【蚓。 1 6 sr d n a 序列的研究结果表明【3 7 ，3 8 1 ，不w o l b a c h i a 的1 6 sr d n a 序列的差异很小 ( 1 2 ) ，说明1 6 sr d n a 的进化速度很慢，不适用于对w o l b a c h i a 多样性进行较精细的 研究。近期研究中用进化速度较快的一些编码蛋白基因的序列进行小尺度系统分化关系 的分析，如细胞分裂蛋白基因剧3 9 】；细菌热击蛋白基因g 眦乒柏】和细菌表面蛋白基因 w s p 4 0 , 4 1 1 。基于n 昭基因序列系统发育分析表明：肋舾口c i i l 砌分为a f 7 个组( g r o u p s ) 4 2 4 3 1 。 其中昆虫、螨类和甲壳类感染的w o l b a c h i a 属于a 和b 组；而丝状线虫感染的w o l b a c h i a 属于c 和d 组；弹尾虫感染的w o l b a c h i a 属于e 组，而白蚁感染的w o l b a c h i a 属于f 组。根据 同义替换率( s y n o n y m o u ss u b s t i t u t i o nr a t e ) 的计算推断a 组和b 组的分化大约始于 6 0 m y a 4 2 1 ，而c 组和d 组的分化大约始于i o o m y a 4 3 1 。在w s p 序列分析的基础上，a 组和 b 组的肋舾口幽缸又被细分为1 2 个亚群( s u b g r o u p s ) 。a 组中有m e l ，a l b a ，m o r s ，r i v ，u n i ， h a w ，p a p 和a u s8 个亚群，b 组中有c o n ，d e i ，p i p 和c a u b4 个亚群( 4 l 】。 1 5w o l b a c h i a 对宿主生殖的调控 w o l b a c h i a 参与了多种调控其宿主生殖活动的机制，包括诱导细胞质不亲和 ( c y t o p l a s m i ci n c o m p a t i b i l i t y ，c i ) 、诱导孤雌生殖( p a r t h e n o g e n s i s - i n d u c e ，p i ) 、杀雄 作用( m a l e k i l l i n g ) 和雌性化( f e m i n i z a t i o n ) 等。 1 5 1 诱导细胞质不亲和( c i ) y e n 和b a n 首次提出w o l b a c h i a 是引起c i 现象的主要因子【3 1 。w o l b a c h i a 诱导的 c i 指精子和卵子间的生殖不亲和，它导致二倍体物种受精卵死亡或单倍二倍体物种受 精卵发育成雄性个体或胚胎死亡【3 9 , 4 4 , 4 5 1 。c i 有两种情况，一是典型的单向( u n i d i r e c t i o n a l c i ) ，即感染w o l b a c h i a 的雄性与未感染w o l b a c h i a 的雌性间杂交不亲和，但反交却是 亲和的【3 9 】；二是双向的( b i d i r e c t i o n a lc i ) ，即感染不同w o l b a c h i a 菌株的雌雄间的交配 不亲和，两者均不产生后代或产生数目很少的后代 4 6 , 4 7 。尽管目前c l 的分子机理尚未 明确，但现在流行的“修饰一矫正 ( m o d i f i c a t i o n r e s c u e ) 模型已经可以解释部分c i 现象 【鸫1 。该模型假定存在两种截然不同的细菌功能：精子中共生菌的修饰( m o d i f i c a t i o n ) 和 4 1 文献综述 受精卵中共生菌的营救( r e s c u e ) 。有两个原因能使精子产生修饰：分泌的w o l b a c h i a 蛋白，它可以修饰父本染色体；去除对受精卵( z y g o t e ) 形成或形成前父本染色体组正 常浓缩解浓缩必不可少的宿主蛋白。同样，卵子中相同w o l b a c h i a 株的存在将导致产生 或分泌营救因子，或选择地补充有能力营救精子的宿主分子。根据这个模型，卵巢中的 共生菌对发育中的精子进行修饰( 可能是通过染色体结合蛋白) ，只有卵中存在相同的 共生菌，这种父本染色体的修饰才能被营救。如果没有被营救，就导致卵和精子的不亲 和。这一模型与单向不亲和( 未感染w o l b a c h i a 的卵不能营救感染w o l b a c h i a 的雄性被 修饰的精子) 和双向不亲和( 不同的w o l b a c h i a 株系其修饰营救系统不同) 是一致的。 目前已经有证据阐明w o l b a c h i a 在精子发生( 成熟的精子不含有细菌) 过程能够修饰父 本的染色体，从而影响第一次有丝分裂父本染色体的行为，导致有丝分裂同步性的丧失 【4 9 】 o 胞质不亲和的表现强度与很多因素有关，如w o l b a c h i a 品系、双侵染或单侵染、共 生菌密度、寄主基因型和龄期以及环境因素。这些因素相互作用，构成宿主地理种群间 复杂的不亲和关系【5 0 , 5 1 5 2 5 3 1 。对两种飞虱口d 如盘娩a xs t r i a t e l l u s 并 s o g a t e l l af u r c i f e r a 的研究 表明宿主的c i 水平与雄性个体体内的w o l b a c h i a 含量呈正相关1 5 4 1 。 1 5 2 诱导孤雌生殖( p i ) 孤雌生殖是节肢动物常见的生殖方式，如蜂类、蚜虫和象甲等。按其子代的性别， 可把孤雌生殖划分为产雄孤雌生殖( a r r h e n o t o k y ) 、产雌孤雌生殖( t h e l y t o k y ) 及产雌雄孤雌 生殖( a m p h i t e r o t o k y ) 。一部分产雌孤雌生殖的昆虫，偶尔也有雄虫的出现，特别是在高 温条件下，更易出现雄虫。由于细胞质是通过雌虫遗传给子代的，s t o u t h a m e r 等把赤眼 蜂t r i c h o gr a m m a 孤雌生殖系统的雌虫和两性生殖系统的雄虫进行反复交配，将两性生殖 系统的核遗传物质导入孤雌生殖系统，可是，所得个体的特性与孤雌生殖系统完全相同。 这说明删砌明r a m m a 的上述特性与核遗传无关，其原因在于某种细胞质因子。继而，对 t r i c h o gr a m m a 进行抗生素处理，从孤雌生殖系统产生了雄虫，证实其孤雌生殖是由共生 微生物引起的。经1 6 sr r n a 的序列分析证实引起t r i c h o gr a m m a 孤雌生殖的微生物就是 w o l b 口c h i a 【5 5 , 5 6 1 。 w o l b a c h i a 诱导的孤雌生殖主要发现于膜翅目的昆虫，除赤眼蜂外，还军f f l e p t o p i l i n a a u s t r a l i s 5 7 1 ，d i p l o l e p i sr o s a e 5 8 1 ，a p h y a sd i a s p i d i s 5 9 和m u s c i d i f u r a xu n i r a p t o r 6 0 l 等。目前 还不清楚w o l b a c h i a 是否能诱导除膜翅目之外其他昆虫的孤雌生殖。 5 湖北大学硕士学位论文 内含p iw o l b a c h i a 的雌性个体所产的卵不经受精即可发育为雌性后代。这是通过对 第一次减数分裂的调控实现的【砌。内含p iw o l b a c h i a 的卵，其第一次减数分裂的后期是 不正常的，导致未受精的卵具有双倍体核。膜翅目和其他一些昆虫类群有着特殊的性决 定系统：单倍体卵发育为雄性，双倍体卵发育为雌性。不含p iw o l b a c h i a 的卵受精后成 为二倍体，发育为雌性：未受精的卵为单倍体，发育为雄性。而内含p iw o l b a c h i a 的卵不 经受精，全部发育为雌性，即孤雌生殖。在一些物种中，内含p iw o l b a c h i a 的个体和不 含p iw o l b a c h i a 的个体共同存在，内含p iw o l b a c h i a 的雌性仍能与不含p iw o l b a c h i a 的雄 性交配，在这种交配的情形下，w o l b a c h i a 不干涉正常的减数分裂过程，单倍体卵受精 后成为双倍体【6 1 】。在膜翅目中，已证实w o l b a c h i a 参与至少4 0 多个物种的孤雌生殖【6 2 1 。 p iw o l b a c h i a 不仅影响减数分裂过程，也影响着后代的产量。内含p iw o l b a c h i a 的雌 个体一般比同物种不含p iw o l b a c h i a 的雌个体的产卵量少【6 3 1 。在一些物种中，p i w o l b a c h i a 的承递随雌个体的龄期、产卵量而减小。而且p iw o l b a c h i a 的表达受母体孵育 温度的影响。雌性个体养育在高温下产生的雄性个体增多【鲫，某些物种的内含p i w o l b a c h i a 的雌性个体养育在2 8 。c 下，产生一些间性个体1 6 2 1 。 1 5 3 杀雄作用( m a l e k i l l i n g ) 一些微生物能引起节肢动物雄性宿主胚胎或幼虫的死亡，被称为杀雄( m a l e k i l l i n g ) 现象。杀雄现象被划分为两种类型：早期杀雄( e a r l ym a l e k i u i n g 广引起雄性胚胎的死亡， 晚期杀雄( 1 a t em a l e k i l l i n 酚一引起雄性幼虫或蛹的死亡。有五类细菌被证实能引起早期杀 雄：s p i r o p l a s m a 属，引起d r o s o p h i l aw i l l i s t o n i 和l a d a l i a b i pu n c t a t a 杀雄；f l a v o b a c t e r i a 类，引起a d o n i av a r i e g a t a 和c o l e o m e g i l l am a c u l a t a 的杀雄；r i c k e t t s i a 属，引起a 如讹 b i p u n c t a t a 的杀雄；e n t e r o b a ct e r i a c e a e 类，引起s o n i av i t r i p e n n n i s 的杀雄；w o l b a c h i a 属，引拟如砌b i p u n c t a t a ，a c r a e ae n c e d o n ，d r o s o p h i l ab i ：a s c i a t a 和h o m o n am a g n a n i m a 的杀雄【6 5 鹄】。而晚期杀雄现象仅在一些蚊类中有报道，一些蚊类种群因垂直传播的微孢 子虫的感染而引起4 龄以后幼虫的死亡【叫。 共生微生物引起的杀雄现象比较复杂，一种昆虫雄性胚胎的早期死亡可能与一种微 生物有关，也可能是数种微生物共同引起的。有关w o l b a c h i a 弓i 起杀雄现象的研究还不 够深入，迄今为止，仅在两种昆虫中发现了杀雄的w o l b a c h i a 。一种是二星瓢虫a 砌砌 b i p u n c t a t a 。在二星瓢虫中，除存在w o l b a c h i a ：勿：，还发现了另外两种杀雄细菌。另一个 有杀雄w o l b a c h i a 共生的物种是一种非洲蝴蚂l 4 c r a e a 绷c 砒，l 【7 0 l 。w o l b a c h i a 是这种蝴蝶中 6 1 文献综述 发现的惟一杀雄因子。具杀雄w o l b a c h i a 的这两种宿主的性决定系统迥然不同：二星瓢 虫是雄性异配型，而蝴蝶是雌性异配型。这说明杀雄w o l b a c h i a 不受性决定系统的限制， 所以普遍存在的可能性很大，至少在昆虫中是这样的。 已发现的杀雄w o l b a c h i a 都属于w o l b a c h i a 的b 群，h u r s t 等( 1 9 9 9 ) 根据w s p 序列的分析 认为二星瓢虫中有两种杀雄w o l b a c h i a 的共生。这两种杀雄w o l b a c h i a 的w s p 序列有差异但 在系统进化上是同一起源，h u r s t 的研究进一步说明w o l b a c h i a 可能是驱动节肢动物进化 的重要因素【7 1 1 。 c i 和p i 的调控只与w o l b a c h i a 这一种细菌相关，而杀雄这种生殖调控与多种因子相 关，杀雄因子的多样化使得这种调控更易发展和进化。目前有关细菌导致雄性胚胎死亡 的详细生化过程的研究很少，并且有关使宿主雄性致死的w o l b a c h i a 的研究也还刚刚起 步。 1 5 4 雌性化( f e m i n i z a t i o n ) 具有雌性化作用的共生物，如一些细菌和原生生物，能改变其寄主正常的性别决定 方式，使原本应发育为雄性的个体发育成为雌性。目前己在陆生等足目的甲壳类动物和 某些鳞翅目、同翅目等昆虫( 如亚洲玉米螟o s t r i n h zf u r n a c a l i s ，木盂- l , a r m a d i l l i d i u m 讼枷叫 中发现具有雌性化作用的共生物【7 2 , 7 3 】。这两类生物中的雌性化特性可被抗生素“治愈”， 而且与w o l b a c h i a 的共生有关f 7 4 】。 雌性化最佳的例子是甲壳纲等足目中一种叫球鼠妇p o r c e l l i os c a b e r 的土鳖，它的雌 性化性别决定受雌性化寄生性别因子( e m i n i z i n gp a r a s i t i cs e xf a c t o r s ，以下简称p s f ) 控制。 其中有一个p s f 为w o l b a c h i a ( 简称d ；另外其它所有的因子( 简称f ) 则是随机整合进入寄主 基因组的f - w o l b a c h i ad n a 。鼠妇大多数的野生种群都带有p s f ，所有的个体从原则上 都为遗传雄性池) ，只有当p s f 存在并制服z 染色体上携带的雄性决定子时，才产生雌性 子代。但鼠妇常染色体上的显性雄性化基因( m a s c u l i n i z i n gg e n e ，以下简称m ) 却能通过 $ t j 服f 的雌性化作用而恢复雄性性别；只有当其与f - w o l b a c h i a 竞争时才不能恢复。进一 步研究发现在p s c a b e r 体内共有两种f - w o l b a c h i a 品系即w v u l c 和w v u l m ，这两种 w o l b a c h i a 品系都可以诱导p s c a